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細胞工程：
第2節 動物細胞工程 第2課時 動物細胞融合技術與單克隆抗體
學有目標 ——新課程標準必明 記在平時——核心語句必背
1.闡明動物細胞融合的原理及方法。 2．概述單克隆抗體制備的過程及臨床應用。 1.動物細胞融合技術是使兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的技術。 2．動物細胞融合常用的誘導方法有PEG融合法、電融合法和滅活病毒誘導法等。 3．制備單克隆抗體過程中第一次篩選是為了獲得雜交瘤細胞，第二次篩選是為了獲得能產生特定抗體的雜交瘤細胞。 4．單克隆抗體最主要的優點是特異性強、靈敏度高，并可大量制備。
[理清主干知識]
一、動物細胞融合技術
1．概念：使兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的技術。
2．誘導方法：PEG融合法、電融合法和滅活病毒誘導法等。
3．結果：形成的雜交細胞具有原來兩個或多個細胞的遺傳信息。
4．意義
(1)突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能。
(2)是研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段。
(3)為制造單克隆抗體開辟了新途徑。
二、單克隆抗體及其應用
1．單克隆抗體的制備
(1)
(2)解決思路：將B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合為雜交瘤細胞，既能大量增殖，又能產生特定抗體。
(3)制備過程
2．單克隆抗體的優點
特異性、靈敏度，并可大量制備。
3．單克隆抗體的應用
(1)作為診斷試劑，在多種疾病的診斷和病原體鑒定中發揮重要的作用。
(2)用于運載藥物和治療疾病。
[診斷自學效果]
1．判斷下列敘述的正誤
(1)滅活的病毒能促進動物細胞融合，也能促進植物細胞融合(×)
(2)體細胞雜交技術可用于克隆動物和制備單克隆抗體(×)
(3)將抗原注入小鼠體內，是為了獲得能產生相應抗體的B淋巴細胞(√)
(4)將B淋巴細胞與骨髓瘤細胞進行誘導融合，培養液中融合后的細胞即為雜交瘤細胞(×)
(5)雜交瘤細胞進行體內培養，是為了獲得能產生單克隆抗體的胚胎(×)
(6)單克隆抗體診斷試劑提高了診斷的準確性、靈敏性(√)
2．動物細胞融合主要的用途是(　　)
A．克服遠緣雜交不親和　　 B．制備單克隆抗體
C．培育新物種 D．生產雜交細胞
解析：選B　植物體細胞雜交技術主要是為了克服遠緣雜交不親和，以培育新物種。動物細胞的全能性受到限制，目前只見到高度分化的細胞核在去核卵母細胞中表現出全能性，還未見到融合細胞表現出全能性的例子，因此動物細胞融合不能用來培育新物種。生產雜交細胞，不是細胞融合的主要目的，雜交細胞只是細胞融合完成后所形成的結構的名稱。動物細胞融合最主要的用途是制備單克隆抗體。
3．(2020·邢臺期末)下列不屬于單克隆抗體的應用的是(　　)
A．作為診斷試劑　　　　 B．用于治療疾病
C．用于基因治療 D．用于運載藥物
解析：選C　單克隆抗體最廣泛的用途是作為診斷試劑；單克隆抗體可用于治療疾病；基因治療屬于基因工程的應用；單克隆抗體可用于運載藥物，如生物導彈。
4．下列有關單克隆抗體制備及其應用的敘述，錯誤的是(　　)
A．制備單克隆抗體運用的技術有動物細胞融合和動物細胞培養
B．給小鼠注射抗原，是為了獲得能產生相應抗體的B淋巴細胞
C．需要從雜交瘤細胞中篩選出能產生特定抗體的細胞
D．利用生物導彈治療癌癥就是利用了單克隆抗體清除癌細胞
解析：選D　制備單克隆抗體運用的技術有動物細胞融合和動物細胞培養，A正確；給小鼠注射抗原，是為了獲得能產生相應抗體的B淋巴細胞，B正確；需要從雜交瘤細胞中篩選出能產生特定抗體的細胞，C正確；利用生物導彈治療癌癥就是利用了單克隆抗體的定位導向作用將藥物帶到癌細胞所在的位置，D錯誤。
[在探究中學明]
植物體細胞雜交技術，可以跨越植物種屬間生殖隔離的屏障，培育出新的作物類型。科學家經過長期的探索，也實現了用不同種動物的體細胞進行雜交。參考圖示，回答問題。
1．動物細胞融合與植物原生質體融合所依據的原理是什么？
提示：細胞膜的流動性。
2．與誘導植物原生質體融合相比，誘導動物細胞融合特有的方法是什么？
提示：動物細胞融合特有的誘導方法是滅活病毒誘導法。
3．動物細胞完成融合的標志是什么？
提示：動物細胞融合時，先是細胞膜發生融合，然后是細胞核的融合。當兩個細胞核融合后形成具有單核的雜交細胞，則標志著動物細胞融合的完成。
4．融合形成的雜交細胞在遺傳上有什么特點？
提示：雜交細胞具有兩個(或多個)細胞的遺傳信息，能表現出兩個(或多個)親本的性狀。
[在深化中提能]
1．滅活的病毒誘導動物細胞融合的過程
細胞融合的過程包括細胞膜融合、細胞質融合和細胞核融合，其中細胞膜融合是細胞融合的先導，在細胞膜融合中體現出細胞膜具有一定的流動性。
2．植物體細胞雜交和動物細胞融合的比較
比較項目 植物體細胞雜交 動物細胞融合
原理 細胞膜的流動性、細胞的全能性 細胞膜的流動性、細胞增殖
融合前處理 除去細胞壁 使細胞分散開
相關酶 纖維素酶和果膠酶 胰蛋白酶或膠原蛋白酶
誘導方法 物理法：電融合法和離心法等； 化學法：聚乙二醇融合法、高Ca2＋高pH融合法等 PEG融合法、電融合法和滅活病毒誘導法等
結果 雜種植株 雜交細胞
應用 培育植物新品種 主要用于制備單克隆抗體
意義 突破遠緣雜交不親和的障礙，打破了生殖隔離，擴展了雜交的親本組合
相同點 原生質體融合原理相同，原生質體融合的方法相似
　(2020·南昌期末)下列關于動物細胞融合的相關說法，錯誤的是(　　)
A．動物細胞融合也稱細胞雜交，是指兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的過程
B．融合后形成的具有原來兩個或多個動物細胞遺傳信息的單核細胞，稱為雜交細胞
C．滅活的病毒中“滅活”是指用物理或化學手段破壞它的抗原結構
D．細胞融合技術突破了有性雜交方法的局限，使遠緣雜交成為可能
[解析]　動物細胞融合也稱細胞雜交，是指兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的過程，A正確；融合后形成的具有原來兩個或多個動物細胞遺傳信息的單核細胞，稱為雜交細胞，B正確；動物細胞融合過程中通常用滅活的病毒作為誘導劑，這里的“滅活”是指用物理或化學的手段使病毒失去感染力，但不破壞其抗原結構，類似于疫苗的處理，C錯誤；細胞融合技術突破了有性雜交方法的局限，使遠緣雜交成為可能，D正確。
[答案]　C
[在應用中落實]
1．下列有關植物體細胞雜交與動物細胞融合的比較，敘述正確的是(　　)
A．兩者應用的原理都完全相同
B．兩者都可用電融合法或聚乙二醇(PEG)融合法誘導細胞融合
C．兩者融合完成的標志都是形成融合細胞核
D．兩者的目的都是用于大量生產分泌蛋白
解析：選B　植物體細胞雜交的原理是細胞膜具有流動性和植物細胞具有全能性，動物細胞融合的原理是細胞膜具有流動性和細胞增殖；電融合法或聚乙二醇(PEG) 融合法既可誘導動物細胞融合，也可誘導植物原生質體融合；植物原生質體融合完成的標志是雜種細胞再生出細胞壁，動物細胞融合完成的標志是形成融合細胞核；植物體細胞雜交的目的是產生雜種植株，動物細胞融合可用于大量生產分泌蛋白等。
2．如圖可表示細胞融合技術的一些過程，請據圖回答下列問題：
(1)若A、B細胞為動物細胞，體外初次在培養瓶中的培養叫________培養；從A、B細胞到C細胞的過程中，常用的生物方法即用____________來誘導融合。此過程說明了細胞膜具有____________的結構特點。
(2)若A、B細胞為植物細胞，那么這樣的細胞已經用________________酶降解脫掉了________；A、B細胞到C細胞的過程中，常用的化學方法是____________，融合完成的標志是____________________，形成的D細胞還要應用____________技術把D培養成植株。
(3)若該過程是制備單克隆抗體的過程，則A細胞為骨髓瘤細胞，B細胞為________細胞；用來培養的D細胞應該稱為____________，再最終篩選出能分泌____________的雜交瘤細胞。
解析：(1)若A、B細胞為動物細胞，體外初次在培養瓶中的培養叫原代培養；從A、B細胞到C細胞的過程中，常用的生物方法即用滅活的病毒來誘導融合，此過程說明了細胞膜具有一定的流動性。(2)若A、B細胞為植物細胞，那么這樣的細胞屬于原生質體，已經用纖維素酶和果膠酶降解脫掉了細胞壁；A、B細胞到C細胞的過程中，常用的化學方法是聚乙二醇(PEG)，植物細胞融合完成的標志是形成了新的細胞壁，形成的雜種細胞還要應用植物組織培養技術把雜種細胞培養成雜種植株，其原理是植物細胞的全能性。(3)若該過程是制備單克隆抗體的過程，則A細胞為骨髓瘤細胞，B細胞為已免疫的B淋巴細胞；用來培養的D細胞應該是用特定的選擇性培養基篩選出的雜交瘤細胞；再經過克隆化培養和專一抗體檢測過程最終篩選出能分泌單克隆抗體(或特異性抗體)的雜交瘤細胞。
答案：(1)原代　滅活的病毒　一定的流動性　(2)纖維素酶和果膠　細胞壁　聚乙二醇(PEG)融合法　形成了新的細胞壁　植物組織培養　(3)(已免疫的)B淋巴　雜交瘤細胞　單克隆抗體(或特異性抗體)
[在探究中學明]
1975年，英國科學家米爾斯坦(C.Milstein)和德國科學家科勒(G.K hler)設計了一個極富創造性的實驗方案，得到了大量的單克隆抗體，制備過程如圖所示。根據圖示回答下面的問題：
1．填出圖中序號所表示的內容：
①雜交瘤，②單一抗體，③體外培養。
2．為什么要對小鼠注射抗原？
提示：以獲得能產生相應抗體的B淋巴細胞(漿細胞)。誘導融合的B淋巴細胞是經免疫產生的，未經免疫的B淋巴細胞不能產生抗體。
3．B淋巴細胞和骨髓瘤細胞經聚乙二醇處理后，培養液中存在哪幾種細胞？(不考慮多個細胞相互融合的情況)
提示：未融合的B淋巴細胞、未融合的骨髓瘤細胞、BB融合細胞、瘤瘤融合細胞、B瘤融合細胞。只有B瘤融合細胞才是所需要的雜交細胞。
4．選擇雜交瘤細胞的兩步篩選的目的各是什么？
提示：第一步篩選的目的是獲得雜交瘤細胞；第二步篩選的目的是獲得能產生所需抗體的雜交瘤細胞。
5．“生物導彈”是用單克隆抗體及相關物質制成的，“生物導彈”中起治療作用的物質是什么？單克隆抗體的作用是什么？
提示：“生物導彈”中真正發揮治療作用的物質是相關“藥物”，單克隆抗體所起的作用在于將藥物定向帶到靶細胞所在位置，借助其導向作用，在原位殺死癌細胞，這樣既不損傷正常細胞，又減少了用藥劑量。因此，“生物導彈”可作為一種療效高、毒副作用小的新型藥物。
[在深化中提能]
1．血清抗體與單克隆抗體的比較
名稱 產生 特點
血清抗體 由漿細胞分泌 一般從血清中分離，產量低、純度低、特異性差
單克隆抗體 由雜交瘤細胞分泌 特異性強、靈敏度高，能大量制備
　　
2.單克隆抗體制備過程中兩次篩選的方法及目的
項目 第一次篩選 第二次篩選
篩選原因 誘導融合后會得到多種雜交細胞，另外還有未融合的細胞 由于小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激，所以經選擇性培養獲得的雜交瘤細胞中有能產生其他抗體的細胞
篩選方法 用特定的選擇培養基篩選：未融合的細胞和同種細胞融合后形成的細胞(BB細胞、瘤瘤細胞)都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞(B瘤細胞)才能生長 用多孔培養皿培養，在每個孔只有一個雜交瘤細胞的情況下開始克隆化培養和抗體檢測，經多次篩選得到能產生特異性抗體的細胞群
篩選目的 得到雜交瘤細胞 得到能分泌所需抗體的雜交瘤細胞
　下面是制備單克隆抗體的過程示意圖，相關敘述錯誤的是(　　)
A．①表示從已免疫的小鼠的脾臟中提取B淋巴細胞
B．②常用滅活的病毒促進融合，不可用聚乙二醇
C．④中的篩選是通過抗原抗體反應進行的
D．⑤是經過兩次篩選后，得到的既能無限增殖又產生特定抗體的細胞群
[解析]　①表示從小鼠的脾臟中提取B淋巴細胞，A正確；②促進細胞融合的方法可以利用聚乙二醇作介導，也可以用滅活的病毒，B錯誤；④如果要篩選能產生特定抗體的雜交瘤細胞，可以通過檢測抗原抗體反應，如果有反應說明表達了抗體，C正確；⑤是經過兩次篩選后得到的雜交瘤細胞，既能無限增殖又能產生單一抗體，D正確。
[答案]　B
[在應用中落實]
1．(2020·鎮江期末)下列關于單克隆抗體制備的敘述，正確的是(　　)
A．誘導B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合時，可用秋水仙素作為促融劑
B．篩選出雜交瘤細胞后，需利用特定培養基再次篩選分泌單克隆抗體的細胞
C．人鼠雜交瘤細胞大規模培養時，細胞中染色體組數最多是4個
D．雜交瘤細胞大規模培養時，只有編碼抗體的基因可以獲得表達
解析：選B　誘導B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合時，常用滅活的病毒或聚乙二醇促融，秋水仙素不能作為促融劑，A錯誤；篩選出雜交瘤細胞后，需利用特定培養基再次篩選分泌單克隆抗體的細胞，B正確；人鼠雜交瘤細胞大規模培養時，細胞中染色體組數最多是8個，C錯誤；雜交瘤細胞大規模培養時，編碼抗體的基因和其他相關基因都可以表達，D錯誤。
2．如圖為利用小鼠制備抗登革熱病毒的單克隆抗體過程示意圖，圖中A～F分別表示生物技術名稱或細胞名稱。請回答下列問題：
(1)過程A是指將________(填“抗原”或“抗體”)類物質注入小鼠體內，一段時間后，取小鼠的脾臟組織，剪碎后用____________________處理使其分散成單個細胞，以獲得相應的________細胞；圖中細胞B一般選用________細胞。
(2)如果僅考慮兩兩融合的細胞，則最多可形成________種類型的細胞C，需用特定的選擇培養基篩選出雜交瘤細胞；再對雜交瘤細胞進行克隆化培養和抗體檢測，經多次篩選，就可獲得足夠數量的細胞D，該種細胞的特點是
________________________________________________________________________。
(3)雜交瘤細胞的體外培養時，在5%________培養箱中培養，為防止培養過程中的污染，培養基中需要加入適量的________。
(4)與傳統方法生成的抗體相比，單克隆抗體最主要的優點是________________________________________________________________________。
紫杉醇能阻止腫瘤細胞有絲分裂，促進其凋亡，用單克隆抗體與紫杉醇結合研制而成的“生物導彈”，對于晚期低分化型的甲狀腺瘤患者有較好的療效，這利用的是單克隆抗體的____________作用。
解析：(1)過程A是指將抗原類物質注入小鼠體內，一段時間后，取小鼠的脾臟組織，剪碎后用胰蛋白酶(或膠原蛋白酶)處理使其分散成單個細胞，以獲得相應的B淋巴細胞；圖中細胞B具有無限增殖的能力，一般選用骨髓瘤細胞。(2)如果僅考慮兩兩融合的細胞，則可能形成雜交瘤細胞、骨髓瘤細胞自身融合細胞、B淋巴細胞自身融合細胞3種類型的細胞C，需用特定的選擇培養基篩選出雜交瘤細胞；再對雜交瘤細胞進行克隆化培養和抗體檢測，經多次篩選，就可獲得足夠數量的細胞D，該種細胞的特點是既能迅速大量增殖，又能產生所需抗體。(3)雜交瘤細胞體外培養時，在5%CO2 培養箱中培養，通入CO2的目的是維持培養液的pH；為防止培養過程中的污染，培養基中需要加入適量的抗生素。(4)與傳統方法生成的抗體相比，單克隆抗體最主要的優點是特異性強、靈敏度高，可大量制備。用單克隆抗體與紫杉醇結合研制而成的“生物導彈”，對于晚期低分化型的甲狀腺瘤患者有較好的療效，這利用的是單克隆抗體的導向(或靶向)作用，將紫杉醇定向帶到甲狀腺瘤細胞所在位置，以便在原位殺死甲狀腺瘤細胞。
答案：(1)抗原　胰蛋白酶(或膠原蛋白酶)　B淋巴　骨髓瘤　(2)3　既能迅速大量增殖，又能產生所需抗體　(3)CO2　抗生素　(4)特異性強、靈敏度高，可大量制備　導向(或靶向)
　　　　[課堂鞏固落實]
1．下列關于動物細胞融合與單克隆抗體制備的敘述，正確的是(　　)
A．動物細胞經PEG誘導融合后再通過培養能得到優良動物個體
B．動物細胞融合最主要的目的是制備單克隆抗體
C．雜交瘤細胞實質上就是癌變的漿細胞
D．單克隆抗體和傳統方法生產的抗體化學本質不同
解析：選B　由于動物細胞的全能性受到限制，動物細胞融合形成的雜種細胞不能培育成動物個體，A錯誤；動物細胞融合在多個方面都有應用，但最重要的應用是制備單克隆抗體，B正確；雜交瘤細胞是由骨髓瘤細胞和漿細胞融合形成的，不是漿細胞癌變的結果，C錯誤；單克隆抗體和傳統方法生產的抗體化學本質相同，都是蛋白質，D錯誤。
2.右圖為細胞融合的示意圖，下列敘述正確的是(　　)
A．若a細胞和b細胞是植物細胞，需先去分化再誘導融合
B．a細胞和b細胞之間的融合需要促融處理后才能實現
C．c細胞的形成與a、b細胞膜的選擇透過性都有關
D．c細胞將同時表達a細胞和b細胞中的所有基因
解析：選B　若a細胞和b細胞是植物細胞，應先用纖維素酶和果膠酶去除細胞壁，然后再誘導融合。a細胞和b細胞之間的融合需要促融處理，使植物細胞融合的促融方法有離心法、電融合法、聚乙二醇融合法等；使動物細胞融合的促融方法有聚乙二醇融合法、滅活病毒誘導法、電融合法等。細胞的融合與細胞膜的流動性有關。融合后的c細胞中的基因進行選擇性表達，只能表達a、b兩細胞的部分基因。
3．如圖為雜交瘤細胞制備示意圖。骨髓瘤細胞由于缺乏次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT－)，在HAT篩選培養液中不能正常合成DNA，無法生長。下列敘述錯誤的是(　　)
A．可用滅活的仙臺病毒誘導細胞融合
B．兩兩融合的細胞都能在HAT培養液中生長
C．雜交瘤細胞需進一步篩選才能用于生產
D．細胞膜的流動性是細胞融合的基礎
解析：選B　誘導動物細胞融合可用滅活的仙臺病毒、聚乙二醇、電激等，A正確；兩兩融合的細胞包括免疫B細胞與免疫B細胞的融合、骨髓瘤細胞與骨髓瘤細胞的融合、免疫B細胞與骨髓瘤細胞的融合，其中骨髓瘤細胞與骨髓瘤細胞的融合細胞因缺乏次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶，不能在HAT培養液中生長，B錯誤；雜交瘤細胞還需要進行克隆化培養和抗體檢測，經過多次篩選才能用于生產，C正確；細胞融合的基礎是細胞膜的流動性，D正確。
4．雙特異性單克隆抗體是指可同時與癌細胞和藥物結合的特異性抗體。如圖是科研人員通過雜交瘤細胞技術生產能同時識別癌胚抗原和長春堿(一種抗癌藥物)的雙特異性單克隆抗體的部分過程。據圖分析回答下列問題：
(1)過程①后，從小鼠的脾臟中得到________________，說明小鼠體內形成了相應的B細胞。制備雙特異性單克隆抗體的過程中用到的技術有__________、__________。
(2)過程②誘導細胞融合的方法是______________________________________________
(化學法)，過程②選用的骨髓瘤細胞________(填“能”或“不能”)在HAT培養基上生長。
(3)經過程③篩選得到的細胞還需轉移至多孔培養板中進行過程④，目的是篩選出足夠數量的能____________的雜交瘤細胞。
(4)獲得的單克隆雜交瘤細胞在體外條件下做大規模培養或注射到小鼠________內增殖均可。
(5)對比血清抗體，單克隆抗體的優點是____________________________ (至少答出3條)。
解析：(1)過程①是給小鼠注射癌胚抗原，其目的是從小鼠的脾臟中得到能產生抗癌胚抗原抗體的B細胞。制備雙特異性單克隆抗體的過程中，用到的技術有動物細胞融合和動物細胞培養。(2)過程②誘導細胞融合的化學方法是聚乙二醇(PEG)融合法，過程②選用的骨髓瘤細胞不能在HAT培養基上生長。(3)經過程③篩選得到的細胞還需轉移至多孔培養板中進行過程④，目的是篩選出足夠數量的能分泌所需抗體的雜交瘤細胞。(4)獲得的單克隆雜交瘤細胞在體外條件下做大規模培養或注射到小鼠腹腔內增殖均可。(5)對比血清抗體，單克隆抗體的優點是特異性強、靈敏度高、可大量制備。
答案：(1)抗癌胚抗原的抗體　動物細胞融合　動物細胞培養　(2)聚乙二醇(PEG)融合法　不能　(3)分泌所需抗體　(4)腹腔　(5)純度高、特異性強、靈敏度高、可大量制備

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