資源簡介

基因工程：
第2節(jié)　基因工程的基本操作程序
學有目標——新課程標準必明 記在平時——核心語句必背
1.闡明基因工程的基本操作程序主要包括哪些步驟。 2．闡述基因工程每個操作步驟涉及的技術(shù)和方法。 3．利用聚合酶鏈式反應擴增DNA片段并完成電泳鑒定。 1.PCR每次循環(huán)都包括變性、復性和延伸三步。 2．基因表達載體的構(gòu)建是基因工程的核心，基因表達載體的組成包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。 3．目的基因?qū)胫参锛毎Ｓ没ǚ酃芡ǖ婪ê娃r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，導入動物細胞常用顯微注射法，導入微生物細胞常用感受態(tài)細胞法(Ca2＋處理法)。 4．檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因或目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA常用PCR等技術(shù)，檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)常用抗原抗體雜交技術(shù)。
一、理清主干知識
基因工程的基本操作程序
→→→
一、目的基因的篩選與獲取
1．目的基因：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產(chǎn)物等的基因就是目的基因，它主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。
2．篩選合適的目的基因
從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。
3．利用PCR獲取和擴增目的基因
(1)PCR(聚合酶鏈式反應)：是一項根據(jù)DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術(shù)。
(2)PCR反應的條件：一定的緩沖溶液、DNA模板、2種引物、4種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶，以及能自動調(diào)控溫度的儀器。
(3)PCR擴增的過程
(4)PCR產(chǎn)物的鑒定：常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。
二、基因表達載體的構(gòu)建
1．目的
(1)使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代。
(2)使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。
2.組成及作用(連線)
三、將目的基因?qū)胧荏w細胞
1．轉(zhuǎn)化的概念：目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。
2．將目的基因?qū)氩煌荏w細胞的方法(連線)
四、目的基因的檢測與鑒定(連線)
二、診斷自學效果
1．判斷下列敘述的正誤
(1)表達載體的復制和胰島素基因的表達均起始于啟動子(×)
(2)目的基因?qū)腚p子葉植物細胞一般采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(√)
(3)為培育抗除草劑的作物新品種，導入抗除草劑基因時只能以受精卵為受體(×)
(4)抗蟲基因即使成功地插入植物細胞染色體上也未必能正常表達(√)
(5)檢測目的基因是否導入受體細胞可用抗原抗體雜交技術(shù)(×)
2．下列有關(guān)PCR的敘述，錯誤的是(　　)
A．PCR反應是一種酶促反應
B．PCR反應所需要的引物，化學本質(zhì)為DNA或RNA片段
C．PCR反應所需要的DNA聚合酶與細胞內(nèi)DNA復制所需的酶相同
D．PCR反應需要在一定的緩沖溶液中進行
解析：選C　PCR反應需要DNA聚合酶催化，是一種酶促反應，A正確；PCR反應所需要的引物，化學本質(zhì)為單鏈的DNA片段或RNA片段，B正確；PCR反應所需要的酶為耐高溫的DNA聚合酶，以適應高溫下的反應，與細胞內(nèi)DNA復制所需的DNA聚合酶不同，C錯誤；為保證pH的穩(wěn)定，PCR反應需要在一定的緩沖溶液中進行，D正確。
3．下列關(guān)于基因表達載體的說法，錯誤的是(　　)
A．基因表達載體的構(gòu)建是基因工程的核心步驟
B．基因表達載體包含啟動子、目的基因、終止子、標記基因等
C．啟動子位于目的基因的上游，能夠啟動翻譯
D．不同的目的基因所需的啟動子不一定相同
解析：選C　基因表達載體使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并且遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用，是基因工程的核心步驟，A正確；基因表達載體包括啟動子、終止子、目的基因、標記基因等，B正確；啟動子位于目的基因的上游，是驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的一段DNA，C錯誤；不同的目的基因具有不同的核苷酸序列，其啟動子也不盡相同，D正確。
4．目的基因?qū)胧荏w細胞后，是否可以維持穩(wěn)定和表達其遺傳特性，只有通過檢測和鑒定才能知道。下列不屬于目的基因檢測和鑒定的是(　　)
A．檢測受體細胞是否有目的基因
B．檢測受體細胞是否有致病基因
C．檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA
D．檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)
解析：選B　目的基因的檢測包括：檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，可以用PCR等技術(shù)；檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA，也可以用PCR等技術(shù)；檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，方法是進行抗原抗體雜交。
[在探究中學明]
1．獲取目的基因是實施基因工程的第一步，目前獲取目的基因的常用方法有利用PCR獲取和擴增目的基因、通過構(gòu)建基因文庫來獲取目的基因等。聚合酶鏈式反應簡稱PCR，是一種體外迅速擴增DNA片段的技術(shù)，這項技術(shù)中DNA復制的過程和細胞內(nèi)DNA復制的過程是類似的。請結(jié)合已學過的DNA分子結(jié)構(gòu)和復制的相關(guān)知識，回答下列問題：
(1)什么是引物？DNA復制時為什么需要引物？
提示：所謂引物是指兩段與待擴增的DNA序列互補的一小段DNA或RNA片段。在DNA擴增時，DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從引物的3′端延伸DNA鏈，因此克隆DNA時應加入兩種引物。
(2)PCR擴增目的基因需要知道目的基因的全部核苷酸序列嗎？
提示：不需要，只要知道目的基因兩端的部分核苷酸序列即可(以便根據(jù)這部分序列合成兩種引物)。
(3)PCR過程中需要解旋酶嗎？所需要的DNA聚合酶應具有什么特點？
提示：PCR過程中，DNA雙鏈解開是在高溫下完成的，不需要解旋酶；由于PCR過程溫度較高，所以需要能耐高溫的DNA聚合酶。
2．基因表達載體的構(gòu)建是實施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其目的是使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。填圖并回答下列問題：
(1)完善基因表達載體構(gòu)成圖
(2)基因表達載體的構(gòu)建需要限制酶和DNA連接酶。
(3)目的基因的插入位點是隨意的嗎？為什么？
提示：不是。基因表達需要啟動子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應插入啟動子與終止子之間，若目的基因插入啟動子內(nèi)部，啟動子將失去原有的功能。
(4)啟動子和終止子與起始密碼子和終止密碼子相同嗎？
提示：不相同。啟動子和終止子位于DNA上，是基因表達必需的部分；起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，決定翻譯的開始和結(jié)束。
[在深化中提能]
1．聚合酶鏈式反應(PCR)
(1)PCR反應的過程
PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性、復性和延伸三步。在循環(huán)之前，常要進行一次預變性，以便增加大分子模板DNA徹底變性的概率。
①變性：當溫度超過到90 ℃時，雙鏈DNA解聚為單鏈。
②復性：當溫度下降到50 ℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。
③延伸：當溫度上升到72 ℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。
(2)PCR反應的結(jié)果
從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結(jié)合，進行DNA的延伸，這樣，耐高溫的DNA聚合酶只能特異地復制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)式擴增。
2．生物體內(nèi)DNA復制與PCR反應的比較
比較項目 體內(nèi)DNA復制 PCR反應
解旋 在解旋酶作用下，細胞提供能量，部分DNA雙鏈解開 90 ℃以上高溫下解旋，DNA雙鏈全部解開，不需要解旋酶
酶 解旋酶、DNA聚合酶、DNA連接酶 耐高溫的DNA聚合酶
引物 一小段RNA 可以是RNA或單鏈DNA分子片段
合成子鏈 在引物基礎(chǔ)上，一條鏈連續(xù)合成；另一條鏈不連續(xù)合成，再由DNA連接酶連接 分別從兩條鏈的引物的3′端開始延伸，都是連續(xù)合成
過程
循環(huán)次數(shù) 受生物體自身控制 30多次
產(chǎn)物 完整DNA 兩個引物之間的DNA片段
相同點 都需要DNA模板、4種脫氧核苷酸、分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物；都是半保留復制，嚴格遵循堿基互補配對原則
3．構(gòu)建基因表達載體的過程
目的基因與載體的結(jié)合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。其過程大體為用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出黏性末端。用同一種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子(重組質(zhì)粒)(如圖)。
　如圖是利用基因工程技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因植物，生產(chǎn)可食用疫苗的部分過程示意圖，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ為四種限制酶。下列說法錯誤的是(　　)
A．圖示對質(zhì)粒和目的基因切割用到了兩種限制酶
B．抗卡那霉素基因的存在有利于將含有抗原基因的細胞篩選出來
C．構(gòu)建基因表達載體時需要用到限制酶SmaⅠ
D．除圖示組成外，表達載體中還應該含有啟動子和終止子等結(jié)構(gòu)
[解析]　為防止酶切后單個含目的基因的DNA片段及質(zhì)粒自身連接成環(huán)狀，圖示對質(zhì)粒和目的基因切割用到了兩種限制酶，A正確；抗卡那霉素基因作為標記基因，主要作用是篩選含有目的基因的受體細胞，B正確；限制酶SmaⅠ的識別序列和切割位點位于目的基因上，因此構(gòu)建基因表達載體時不能用限制酶SmaⅠ，應用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，C錯誤；基因表達載體一般包括目的基因(抗原基因)、標記基因(抗卡那霉素基因)、啟動子和終止子等，D正確。
[答案]　C
構(gòu)建基因表達載體時限制酶的選擇
(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類
①應選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。
②不能選擇切點位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。
③為避免含目的基因的外源DNA片段和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶；但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點。
(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點確定限制酶的種類
①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶一致，以確保具有相同的黏性末端。
②質(zhì)粒作為載體必須具備標記基因等，所以選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中限制酶SmaⅠ會破壞標記基因。
　　　
[在應用中落實]
1．在基因表達載體的構(gòu)建中，下列敘述錯誤的是(　　)
A．基因表達載體的構(gòu)建方法不完全相同
B．有了啟動子才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA
C．終止子的作用是終止翻譯過程
D．基因表達載體的結(jié)構(gòu)包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等
解析：選C　因為受體細胞有植物、動物、微生物細胞之分，且目的基因?qū)胧荏w細胞的方法不同，因此，基因表達載體的構(gòu)建方法是不完全相同的；啟動子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需要的蛋白質(zhì)；終止子的作用是使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止，終止密碼子的作用是使翻譯在所需要的地方停止；基因表達載體包括啟動子、終止子、目的基因、標記基因等。
2．(2020·濟南期末)PCR是將某一特定DNA片段在體外酶的作用下，復制出許許多多相同片段的一種方法，利用它能快速而特異地擴增任何要求的目的基因或DNA分子片段。 它的基本過程如下：
注：圖中“”表示每次擴增過程中需要的引物。每個引物含20個脫氧核苷酸，并分別與DNA片段兩端堿基互補，其作用是引導合成DNA子鏈。
請據(jù)圖分析回答下列問題：
(1)PCR的原理是模擬生物體內(nèi)__________的過程。
(2)PCR擴增過程中對DNA片段進行高溫加熱處理，其目的是________________________，其作用相當于細胞內(nèi)________酶的作用。
(3)在③適溫延伸過程中，必須加入一種特定的DNA聚合酶，從圖示中可判斷，該酶與一般人體細胞中的DNA聚合酶相比，最主要的特點是________。
(4)假如引物都用3H標記，從理論上計算，DNA片段經(jīng)3次擴增所得的8個DNA分子中，含有3H標記的DNA分子占________%。
(5)假如DNA片段含200對脫氧核苷酸，經(jīng)3次擴增，從理論上計算，除需要引物14個外，還需要游離的脫氧核苷酸________個。
解析：(1)PCR是指在體外模擬生物體內(nèi)DNA分子復制的過程，因此其原理是DNA復制。(2)PCR擴增過程中對DNA片段進行高溫加熱處理，其目的是使DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)打開，形成單鏈DNA分子，而在生物體內(nèi)DNA分子解旋形成單鏈是在解旋酶的作用下完成的。(3)在③適溫延伸過程中，必須加入一種特定的DNA聚合酶，從圖示中可判斷，該酶與一般人體細胞中的DNA聚合酶相比，最主要的特點是耐高溫。(4)DNA分子的復制方式為半保留復制，如果引物都用3H標記，從理論上計算，所得所有DNA分子中都含有3H標記。(5)DNA片段含200對脫氧核苷酸，經(jīng)3次擴增，形成了8個DNA分子，其中只有兩條DNA單鏈上沒有引物，因此該過程中需要的游離脫氧核苷酸數(shù)是200×2×(8－1)－14×20＝2 520(個)。
答案：(1)DNA復制　(2)使DNA雙鏈解開成為單鏈　解旋　(3)耐高溫　(4)100　(5)2 520
[在探究中學明]
1．將目的基因?qū)胧荏w細胞是實施基因工程的第三步。目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程，稱為轉(zhuǎn)化。結(jié)合圖1、圖2、圖3，根據(jù)教材相關(guān)內(nèi)容完成下列問題：
(1)將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ㄓ修r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和花粉管通道法等，其中由我國科學家獨創(chuàng)的一種方法是花粉管通道法，適用于雙子葉植物和裸子植物的是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。
(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法利用了農(nóng)桿菌的什么特性？
提示：農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒上的TDNA(可轉(zhuǎn)移的DNA)可轉(zhuǎn)移至受體細胞，并且整合到受體細胞的染色體DNA上。
(3)為什么植物基因工程常用的受體細胞可以是體細胞，而動物基因工程一般只用受精卵？
提示：植物體細胞的全能性較高，可經(jīng)植物組織培養(yǎng)過程形成完整植物體，因此受體細胞可以是體細胞；動物體細胞的全能性受到嚴格限制，因此動物基因工程中的受體細胞一般只用受精卵。
(4)從細胞器的功能上分析，若通過基因工程生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌作受體細胞嗎？
提示：不可以。因為糖蛋白上的糖鏈是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加工完成的，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體存在于真核細胞中，大腸桿菌是原核生物，細胞中不含有這兩種細胞器。
2．目的基因?qū)胧荏w細胞后，是否可以維持穩(wěn)定和表達其遺傳特性，只有通過檢測與鑒定才能知道。這是基因工程的第四步工作，也是檢查基因工程是否成功的一步。結(jié)合相關(guān)內(nèi)容，回答下列問題：
(1)目的基因能否在真核生物中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵是什么？如何檢測？
提示：目的基因是否插入受體細胞的染色體DNA上，這是其能否在真核生物中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵。可以用DNA分子雜交、PCR等技術(shù)進行檢測。
(2)檢測棉花中導入的抗蟲基因是否表達的最簡便的方法是什么？
提示：用葉片飼喂棉鈴蟲，觀察棉鈴蟲是否死亡。如果棉鈴蟲死亡，說明抗蟲基因已經(jīng)表達；否則，抗蟲基因沒有表達。
[在深化中提能]
1．目的基因?qū)氩煌荏w細胞的過程
項目 植物 動物 微生物
常用方法 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 顯微注射技術(shù) 感受態(tài)細胞法
受體細胞 體細胞或受精卵 受精卵 原核細胞
轉(zhuǎn)化過程 將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的TDNA上→農(nóng)桿菌→導入植物細胞→整合到受體細胞染色體的DNA上→表達 將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物 Ca2＋處理細胞→感受態(tài)細胞→重組表達載體與感受態(tài)細胞混合→感受態(tài)細胞吸收DNA分子
2．目的基因的檢測與鑒定的方法
類型 檢測內(nèi)容 方法 結(jié)果顯示
分子水平檢測 目的基因是否插入轉(zhuǎn)基因生物的DNA上 DNA分子雜交技術(shù)(DNA和DNA之間)或PCR等 是否成功 顯示出雜交帶
目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA 核酸分子雜交技術(shù)(DNA和mRNA之間)或PCR等
目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì) 抗原抗體雜交(蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間)
個體生物 學水平 鑒定　 是否具有抗性及抗性程度 對轉(zhuǎn)基因生物進行抗性的接種實驗 是否賦予了 預期抗性或 蛋白質(zhì)活性
基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能活性是否相同 比較基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能活性
　　　下列關(guān)于目的基因檢測與鑒定的敘述，錯誤的是(　　)
A．可以根據(jù)受體細胞是否具有某種抗性來判斷受體細胞是否獲得了目的基因
B．受體細胞必須表現(xiàn)出目的基因控制的特定性狀，才能說明目的基因完成了表達過程
C．目的基因檢測的第一步是檢測目的基因是否插入到轉(zhuǎn)基因生物的(染色體)DNA上
D．檢測到受體細胞含有目的基因就標志著基因工程操作成功
[解析]　目的基因成功導入受體細胞只是基因工程操作成功的必要一步，基因工程操作成功的標志是目的基因在受體細胞中成功表達。
[答案]　D
[在應用中落實]
1．在將目的基因?qū)胧荏w細胞的相關(guān)操作中，敘述正確的是(　　)
A．導入植物細胞時均采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
B．轉(zhuǎn)基因動物的獲得多數(shù)運用基因槍法
C．大腸桿菌作為受體細胞時通常需要使用Ca2＋處理
D．導入目的基因的動物受精卵在培養(yǎng)液中發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物
解析：選C　將目的基因?qū)胫参锛毎捎米疃嗟姆椒ㄊ寝r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；顯微注射法是將目的基因?qū)雱游锛毎凶顬橛行У姆椒ǎ淮竽c桿菌作為受體細胞時通常需要使用Ca2＋處理，使其成為感受態(tài)細胞；導入目的基因的動物受精卵在培養(yǎng)液中發(fā)育成早期胚胎，再經(jīng)胚胎移植進入母體子宮內(nèi)，其在母體子宮內(nèi)發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物。
2．(2020·濟寧期末)2019年6月17日，新華社發(fā)布《屠呦呦團隊放“大招”：“青蒿素抗藥性”等研究獲新突破》，屠呦呦團隊近期提出應對“青蒿素抗藥性”難題的切實可行治療方案，并在“青蒿素治療紅斑狼瘡等適應癥”方面取得新進展。某課題組為得到青蒿素產(chǎn)量高的新品系，讓青蒿素合成過程中的某一關(guān)鍵酶基因fps在野生青蒿中過量表達，其過程圖如下：
結(jié)合圖示回答下列問題：
(1)酶1是________。利用PCR擴增目的基因時，使反應體系中的模板DNA解旋為單鏈的條件是加熱至90～95 ℃，目的是破壞DNA分子中的________鍵。
(2)在構(gòu)建重組Ti質(zhì)粒的過程中，需將目的基因插入Ti質(zhì)粒的________中。
(3)檢驗目的基因是否整合到青蒿基因組中，可以將放射性同位素標記的________________________做成分子探針與青蒿基因組DNA雜交。理論上，與野生型相比，該探針與轉(zhuǎn)基因青蒿DNA形成的雜交帶的量________(填“較多”或“較少”)。
(4)判斷該課題組的研究目的是否達到，必須檢測轉(zhuǎn)基因青蒿植株中的____________。
解析：(1)據(jù)圖示可知，酶1催化逆轉(zhuǎn)錄的過程，故為逆轉(zhuǎn)錄酶；利用PCR擴增目的基因時，使反應體系中的模板DNA解旋為單鏈的條件是加熱超過90℃，目的是破壞DNA分子中的氫鍵，使DNA解旋為單鏈。(2)在構(gòu)建重組Ti質(zhì)粒的過程中，需將目的基因插入Ti質(zhì)粒的TDNA中，以使目的基因轉(zhuǎn)移到受體細胞的染色體DNA上。(3)檢驗目的基因是否整合到青蒿基因組中，可用DNA分子雜交法，即將fps基因、fps基因的mRNA做成分子探針與青蒿基因組DNA雜交。由于青蒿素產(chǎn)量增高，故與野生型相比，該探針與轉(zhuǎn)基因青蒿DNA形成的雜交帶的量較多。(4)判斷該課題組的研究目的是否達到，必須檢測轉(zhuǎn)基因青蒿植株中的青蒿素產(chǎn)量，若產(chǎn)量增高，則說明達到了目的。
答案：(1)逆轉(zhuǎn)錄酶　氫　(2)TDNA　(3)fps基因、fps基因的mRNA　較多　(4)青蒿素產(chǎn)量
[在探究中學明]
1．實驗原理
(1)PCR反應的原理
PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合， PCR儀實質(zhì)上就是一臺能夠自動控制溫度的儀器。
(2)電泳鑒定的原理
①DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。
②PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。
③凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300_nm的紫外燈下被檢測出來。
2．實驗操作
[在深化中提能]
1．PCR過程中用到的重要儀器
(1)PCR儀：該儀器能自動調(diào)控溫度，實現(xiàn)DNA的擴增。如果沒有PCR儀，可用3個恒溫水浴鍋代替，操作時按程序在3個水浴鍋中來回轉(zhuǎn)移PCR反應的微量離心管。
(2)微量離心管：總?cè)莘e為0.5 mL，實際上是進行PCR反應的場所。
(3)微量移液器：用于向微量離心管中轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體。
2．DNA片段的擴增及電泳鑒定的注意事項
(1)為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。
(2)緩沖液和酶應分裝成小份，并在－20 ℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。
(3)在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。
(4)在進行操作時，一定戴好一次性手套。
　　下列關(guān)于PCR操作過程的敘述，錯誤的是(　　)
A．PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌
B．PCR所用的緩沖液和酶應分裝成小份，并在－20 ℃儲存
C．PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化
D．在微量離心管中添加反應成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換
[解析]　在冰箱中放置的緩沖液和酶，取出后應放在冰塊上緩慢融化，而不能迅速融化。
[答案]　C
　(2020·揚州一模)二倍體新疆野生油菜(P1)具有低芥酸、抗病蟲等特性，為了改良二倍體甘藍型油菜(P2)，研究人員將兩種植物的體細胞進行融合獲得了屬間雜種F1，然后加入1對引物進行PCR鑒定，電泳結(jié)果如圖所示。下列敘述錯誤的是(　　)
A．雜種F1的形成依賴細胞膜的流動性和細胞的全能性
B．雜種F1含4個染色體組
C．引物能與DNA上多個不同位點結(jié)合
D．電泳結(jié)果表明F11具有P1、P2的全部遺傳信息
[解析]　植物體細胞的融合依賴細胞膜的流動性，形成新的植株依賴細胞的全能性，A正確；雜種F1為二倍體與二倍體的體細胞雜交體，因此F1含4個染色體組，B正確；從圖中的電泳結(jié)果可以看出，電泳結(jié)果圖上出現(xiàn)了多種DNA片段，這表明引物能與DNA上多個不同位點結(jié)合，C正確；從電泳圖結(jié)果能夠看到F11只具有P1、P2的部分遺傳信息，D錯誤。
[答案]　D
[在應用中落實]
1．獲取目的基因的方法有多種，其中利用PCR可特異性地擴增目的基因，以下對PCR操作過程的敘述，正確的是(　　)
A．PCR擴增DNA時必須使用解旋酶和Taq DNA聚合酶
B．PCR過程中引物的作用是保證新鏈的合成方向為3′端→5′端
C．在95 ℃、55 ℃和72 ℃的溫度下，Taq DNA聚合酶都有活性
D．高壓滅菌的微量移液器槍頭每吸取一種試劑后不需要更換
解析：選C　PCR中通過高溫解旋，因此不需要解旋酶；新鏈合成的方向是5′端→3′端；Taq DNA聚合酶耐高溫，所以在上述三個溫度下該酶均有活性；微量移液器槍頭每吸取一種試劑后都需要更換。
2．用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因植株是否成功導入目的基因時，得到以下電泳圖譜。其中1號為DNA標準樣液(Marker)，10號為蒸餾水，PCR時加入的模板DNA如圖所示。據(jù)此作出的分析，不合理的是(　　)
A．PCR產(chǎn)物的分子大小在250～500 bp之間
B．3號樣品為不含目的基因的載體DNA
C．9號樣品對應植株不是所需的轉(zhuǎn)基因植株
D．10號確定反應體系等對結(jié)果沒有干擾
解析：選B　PCR過程中，可以通過設計特定的引物來擴增特定的DNA片段。4～9號是轉(zhuǎn)基因植株，理論上都應包含目的基因，結(jié)合2號野生型和10號蒸餾水組的結(jié)果，推測包含目的基因的片段大小應為250～500 bp，A正確；3號PCR結(jié)果包含250～500 bp片段，應包含目的基因，B錯誤；9號PCR結(jié)果不包含250～500 bp片段，所以不是所需轉(zhuǎn)基因植株，C正確；10號為蒸餾水，可排除反應體系等對結(jié)果的干擾，D正確。
　　　　[課堂鞏固落實]
1．下列對基因工程的敘述，正確的是(　　)
A．基因工程必須使用的工具酶是限制酶、DNA連接酶和RNA聚合酶
B．基因工程的核心步驟是將目的基因?qū)胧荏w細胞
C．載體上的標記基因可用于檢測目的基因是否導入受體細胞
D．目的基因是否表達可通過PCR來檢測
解析：選C　基因工程使用的工具酶是限制酶和DNA連接酶，其核心步驟是基因表達載體的構(gòu)建；標記基因的作用是鑒別和篩選含目的基因的細胞；目的基因是否表達可通過PCR和抗原抗體雜交來檢測，因為基因表達包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個過程。
2．下列有關(guān)PCR的敘述，錯誤的是(　　)
A．變性過程破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對之間的氫鍵
B．引物的設計要有一段已知目的基因的核苷酸序列
C．延伸過程中需要耐高溫的DNA聚合酶和四種核糖核苷酸等
D．利用DNA雙鏈復制的原理
解析：選C　變性過程破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對之間的氫鍵，A正確；引物的設計要有一段已知目的基因的核苷酸序列，B正確；延伸過程中需要耐高溫的DNA聚合酶和四種脫氧核糖核苷酸等，C錯誤；PCR的原理是DNA雙鏈復制，D正確。
3．如圖為科學家利用耐鹽堿植物中的耐鹽基因培育耐鹽水稻新品系的過程。下列相關(guān)說法錯誤的是(　　)
A．階段Ⅰ、Ⅱ應用的技術(shù)分別是重組DNA技術(shù)、植物組織培養(yǎng)技術(shù)
B．對耐鹽基因表達產(chǎn)物的檢測可采用抗原抗體雜交技術(shù)
C．可用抗生素抗性基因作為探針來檢測受體細胞中是否導入了目的基因
D．可用PCR檢測受體細胞中的耐鹽基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA
解析：選C　階段Ⅰ將目的基因?qū)胨炯毎枰捎弥亟MDNA技術(shù)，階段Ⅱ?qū)⑺炯毎囵B(yǎng)成完整植株需要采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，A正確；耐鹽基因表達產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，可用抗原抗體雜交技術(shù)檢測，B正確；可以用含有耐鹽基因的DNA探針檢測細胞中是否插入了目的基因，而不能用抗生素抗性基因作為探針來檢測目的基因，C錯誤；可用PCR檢測受體細胞中的耐鹽基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA，D正確。
4．(2019·全國卷Ⅰ，節(jié)選)基因工程中可以通過PCR擴增目的基因。回答下列問題。
(1)生物體細胞內(nèi)的DNA復制開始時，解開DNA雙鏈的酶是________。在體外利用PCR擴增目的基因時，使反應體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是________________。上述兩個解鏈過程的共同點是破壞了DNA雙鏈分子中的________。
(2)目前在PCR反應中使用Taq酶(耐高溫的DNA聚合酶)而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是______________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)生物體細胞內(nèi)的DNA復制開始時，通過解旋酶解開DNA雙鏈。在體外利用PCR擴增目的基因時，通過高溫(超過90 ℃)使反應體系中的模板DNA解聚為單鏈。上述兩個解鏈過程的共同點是破壞了雙鏈DNA分子中的氫鍵。(2)大腸桿菌DNA聚合酶不耐高溫，在高溫下會失活，而PCR反應體系中加入的聚合酶需耐高溫，故在PCR反應中要用能耐高溫的Taq酶。
答案：(1)解旋酶　加熱超過90 ℃　氫鍵　(2)Taq酶熱穩(wěn)定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活

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