資源簡介

(共66張PPT)
3.2 基因工程的基本操作程序
2019版新教材高中生物
選擇性必修3精品學案
目 標 素 養
1.運用歸納與概括、模型與建模等方法,分析基因工程操作的四個步驟。
2.通過對基因工程案例的分析,理解基因工程基本操作程序的常用方法和基本原理,培養科學思維和科學探究能力。
3.嘗試用PCR技術擴增目的基因,并通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR產物,培養動手能力。
知 識 概 覽
一、目的基因的篩選與獲取
1.目的基因
在基因工程的設計和操作中,用于改變受體細胞　性狀　或獲得　預期表達產物　等的基因。目的基因主要是指　編碼蛋白質　的基因。
2.篩選合適的目的基因
從相關的已知　結構　和　功能　清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。
3.利用PCR獲取和擴增目的基因
(1)原理:根據　DNA半保留復制　的原理,在體外提供參與DNA復制的　　各種組分與反應條件　　,對目的基因的核苷酸序列進行大量復制。
(2)組分和條件:緩沖溶液、　DNA模板　、2種　引物　、4種　脫氧核苷酸　、耐高溫的　DNA聚合　酶,同時控制溫度。
(3)過程:
①　變性　:當溫度超過90 ℃時,雙鏈DNA解聚為　單鏈　。
②　復性　:當溫度下降到50 ℃左右時,兩種　引物　通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。
③　延伸　:當溫度上升到72 ℃左右時,溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的　DNA聚合酶　的作用下,根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。
如此重復循環多次。
(4)特點:成　指數　形式擴增。
4.在獲得轉基因產品的過程中,還可以通過構建基因　文庫　來獲取目的基因。
微點撥用PCR技術擴增DNA不需要解旋酶;PCR技術需要的DNA聚合酶能耐高溫,具有熱穩定性。
二、基因表達載體的構建
1.構建基因表達載體的目的
(1)讓目的基因在受體細胞中　穩定存在　,并且遺傳給下一代。
(2)使目的基因能夠　表達　和發揮作用。
2.基因表達載體的組成
3.基因表達載體的構建過程
首先用一定的　限制酶　切割載體,使它出現一個切口;然后用同種限制酶或能產生　相同末端　的限制酶切割含有　目的基因　的DNA片段;再利用　DNA連接酶　將目的基因片段拼接到載體的切口處,形成一個　重組DNA　分子。
微思考1目的基因表達時,RNA聚合酶識別和結合的部位在哪里
提示:目的基因表達時,RNA聚合酶識別和結合的部位是啟動子。
三、將目的基因導入受體細胞
1.導入植物細胞
(1)常用:　農桿菌轉化　法。
(2)我國獨創:　花粉管通道　法。
2.導入動物細胞
(1)方法:　顯微注射　技術。
(2)常用受體細胞:　受精卵　。
3.導入微生物細胞
(1)常用方法:先用　Ca2+　處理受體細胞,使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態,然后再將重組的基因表達載體導入其中。
(2)常用受體細胞:原核細胞,最廣泛的是　大腸桿菌　細胞。
微判斷1將目的基因導入動物細胞最常用的方法是顯微注射技術。( )
√
四、目的基因的檢測與鑒定
1.分子水平的檢測
(1)通過　　PCR　　等技術檢測生物體的染色體DNA上是否插入了目的基因或檢測目的基因是否轉錄出了　mRNA　。
(2)從轉基因生物體中提取蛋白質,用相應的抗體進行　　抗原—抗體雜交　,檢測目的基因是否翻譯成相應的蛋白質等。
2.個體生物學水平的鑒定
例如,通過采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲來確定Bt基因是否賦予了棉花抗蟲特性以及抗性的程度。
微思考2基因工程操作的四個步驟中,哪些步驟沒有發生堿基互補配對
提示:只有第三步“將目的基因導入受體細胞”沒有發生堿基互補配對。第一步,堿基互補配對發生在PCR擴增目的基因的過程中。第二步,堿基互補配對發生在目的基因片段相互拼接的過程中。第四步,堿基互補配對發生在目的基因的導入檢測和轉錄檢測過程中。
微判斷2抗蟲基因即使成功地插入植物細胞染色體上,也未必能正常表達。( )
√
五、DNA片段的擴增及電泳鑒定
1.原理
(1)PCR利用了DNA的　熱變性　原理,通過調節溫度來控制DNA雙鏈的　解聚與結合　。PCR儀實質上就是一臺能夠自動　調控溫度　的儀器。一次PCR一般要經歷　30　次循環。
(2)DNA分子具有　可解離的基團　,在一定的pH下,這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下,這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動,這個過程就是電泳。
(3)PCR的產物一般通過　瓊脂糖凝膠電泳　來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的　濃度　、　DNA分子的大小　　和構象等有關。凝膠中的DNA分子通過
　染色　,可以在波長為300 nm的紫外燈下被檢測出來。
2.方法步驟
一 目的基因的篩選與獲取
重難歸納
1.目的基因的篩選是根據基因的有關信息,包括基因的核苷酸序列、基因的位置、基因的表達產物等,借助測序技術、序列對比工具以及序列數據庫的輔助進行篩選。
2.PCR反應過程
特別提醒 關于引物的三點提示
(1)引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸,作為DNA復制的起始點,只能結合在DNA母鏈的3'端。
(2)在細胞外的條件下,只有通過引物,DNA才可以開始進行復制。
(3)引物決定PCR擴增產物的特異性和長度。
探針是指以放射性同位素、生物素或熒光染料等進行標記的已知核苷酸序列的核酸片段。在核酸分子雜交技術中,常常使用已知序列的單鏈核酸片段作為探針,用于檢測目標核苷酸序列是否存在。為了獲得某DNA單鏈作探針,可應用PCR進行擴增。PCR與生物體內DNA復制有區別嗎 請列表格進行比較。
提示:
典例剖析
下列有關PCR的敘述,正確的是(　　)
A.作為模板的DNA序列不能在每次擴增中重復使用
B.作為引物的脫氧核苷酸序列不能在每次擴增中重復使用
C.反應需要的DNA聚合酶不能在每次擴增中重復使用
D.反應需要的DNA連接酶不能在每次擴增中重復使用
答案:B
解析:PCR中作為模板的DNA序列可反復在每一次循環中用作模板,A項錯誤。反應過程中需要的DNA聚合酶可重復使用,C項錯誤。反應過程中不需要DNA連接酶,D項錯誤。
學以致用
下列關于PCR的敘述,錯誤的是(　　)
A.可在短時間內大量擴增目的基因
B.利用的是DNA半保留復制的原理
C.目的基因的核苷酸序列需全部已知
D.每一次循環后目的基因的量可以增加一倍
答案:C
解析:知道要擴增的目的基因及其兩端的核苷酸序列,就可通過PCR擴增目的基因。
二 基因表達載體的構建
重難歸納
1.基因表達載體的構建過程
特別提醒 質粒和重組質粒是兩個不同的概念,插入目的基因的質粒稱為重組質粒。
2.需要注意的問題
(1)表達載體不等于載體:表達載體在載體的基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結構。
(2)啟動子不等于起始密碼子,終止子不等于終止密碼子:啟動子和終止子位于DNA片段上,分別控制轉錄的啟動和終止;起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上,分別控制翻譯的啟動和終止。
(3)目的基因的插入位點不是隨意的:基因表達需要啟動子與終止子的調控,所以目的基因應插到啟動子與終止子之間的部位。目的基因的插入不能破壞標記基因。
特別提醒 (1)完成基因表達載體的構建需要限制酶和DNA連接酶,由兩個DNA片段連接的產物有目的基因—目的基因、目的基因—載體、載體—載體三種。
(2)切割質粒和獲取目的基因的限制酶必須產生相同的末端。這樣形成的末端的堿基之間互補,便于連接。
(3)為了避免目的基因與目的基因連接、載體與載體連接以及目的基因自身環化,可以同時用不同的限制酶切割。
科學家構建了含有大洋鱈魚抗凍蛋白基因啟動子和大鱗鮭魚生長激素基因的表達載體,并將其導入了大西洋鮭的細胞中,獲得了生長速度加快的轉基因大西洋鮭。
(1)在構建基因表達載體時,用限制酶切割載體和獲取目的基因時需注意哪些問題
提示:①獲取目的基因和切割載體時,使用同一種限制酶(也可使用能切出相同末端的不同限制酶),目的是產生相同的黏性末端或平末端。
②選擇限制酶切割位點時,必須保證標記基因的完整性。限制酶切割位點應位于標記基因之外,不能破壞標記基因,以便于檢測。
③獲取一個目的基因需要限制酶切割兩次,共產生四個黏性末端或平末端。
(2)切割質粒和獲取目的基因是不是只能用同一種限制酶
提示:不是。如果用兩種不同限制酶切割后形成的末端相同,在DNA連接酶的作用下,目的基因與載體也可以連接起來。
典例剖析
下列關于構建基因表達載體的敘述,錯誤的是(　　)
A.基因表達載體的構建是基因工程的核心
B.基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子、標記基因等部分
C.目的基因主要是指編碼蛋白質的基因
D.構建的基因表達載體都是相同的
解析:由于受體細胞不同,基因表達載體的構建也會有差別,不可能都是相同的。
D
學以致用
下圖為基因表達載體的模式圖。若結構X是表達載體所必需的,則X最可能是(　　)
A.氨芐青霉素抗性基因 B.啟動子
C.限制酶 D.DNA連接酶
答案:B
解析:啟動子是該表達載體所必需的,其功能是驅動基因的轉錄過程。
三 將目的基因導入受體細胞
重難歸納
1.目的基因導入受體細胞的過程
特別提醒 (1)目的基因在受體細胞內能否穩定維持并表達的關鍵是目的基因是否插入受體細胞的染色體DNA上。圖中過程b與過程a相比,過程b會使目的基因的遺傳特性得以穩定維持和表達,而過程a細胞分裂時,細胞質是不均分的,子細胞中不一定含有目的基因。
(2)目的基因進入受體細胞內,并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程,稱為轉化。
2.將目的基因導入受體細胞的方法
(1)常用方法:
受體 類型 植物 動物 大腸桿菌
轉化 過程 將目的基因插入Ti質粒的T-DNA上→轉入農桿菌→導入植物細胞→目的基因插入植物細胞中的染色體DNA中 提純含目的基因的表達載體→顯微注射→受精卵發育→獲得具有新性狀的轉基因動物 先用Ca2+處理大腸桿菌細胞,使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態,然后再將重組的基因表達載體導入其中
特別提醒 (1)將目的基因導入植物細胞,常采用農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法。
(2)用Ca2+處理細胞,使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態,這種細胞稱為感受態細胞。
(2)農桿菌轉化法分析:
①完成基因表達載體的構建,需要限制性內切核酸酶和DNA連接酶。
②由棉株細胞形成抗蟲棉需要運用植物組織培養技術。
特別提醒 農桿菌轉化法適用于向雙子葉植物和裸子植物導入目的基因。向單子葉植物導入目的基因可用基因槍法。
某研究所的研究人員將生長激素基因通過質粒介導進入大腸桿菌細胞內,使其表達產生大量生長激素,應用于侏儒癥的早期治療。而α1-抗胰蛋白酶缺乏癥是一種單基因遺傳病,患者成年后會出現肺氣腫及其他疾病,嚴重者甚至死亡。利用基因工程技術將控制該酶合成的基因導入羊的受精卵,最終培育出能在乳腺細胞表達人α1-抗胰蛋白酶的轉基因羊,從而更容易獲得這種酶。
基因工程技術中受體細胞的選擇有什么原則
提示:①植物:由于植物細胞具有全能性,植物體細胞經過植物組織培養能夠形成生物體,所以植物基因工程的受體細胞一般是體細胞。
②動物:由于動物細胞沒有全能性,所以動物基因工程的受體細胞不是體細胞,而是受精卵。
③微生物:常用原核生物,因為原核生物繁殖快,多為單細胞,遺傳物質相對較少。
④如果要合成有生物活性的蛋白質如胰島素等,則必須用真核生物酵母菌(需內質網和高爾基體的加工、分泌)作為受體細胞,不能用哺乳動物成熟的紅細胞,原因是無細胞核,也不能合成蛋白質。
典例剖析
采用基因工程的方法培養抗蟲棉,下列導入目的基因的做法正確的是(　　)
①將Bt抗蟲蛋白注射到棉花受精卵中　②將編碼Bt抗蟲蛋白的DNA序列注射到棉花受精卵中　③將編碼Bt抗蟲蛋白的DNA序列與質粒重組導入細菌,用該細菌感染棉花體細胞,再進行組織培養　④將編碼Bt抗蟲蛋白的DNA序列與質粒重組,注射到棉花子房,并進入受精卵
A.①②　　B.②③ C.③④　　D.①④
C
解析:將Bt抗蟲蛋白直接注射到棉花受精卵中,受精卵沒有獲得目的基因,子代細胞不會有抗蟲性狀,①錯誤。將編碼Bt抗蟲蛋白的DNA序列直接注射到棉花受精卵中,而沒有將目的基因與載體結合,目的基因很容易被水解掉,②錯誤。在植物基因工程中,利用農桿菌轉化法將目的基因導入受體細胞,然后通過植物組織培養技術將植物細胞培養成完整植株,③正確。在植物基因工程中,可以利用花粉管通道法將目的基因導入棉花受精卵中,然后發育為轉基因植株,④正確。
學以致用
下列有關將目的基因導入受體細胞的敘述,錯誤的是(　　)
A.將目的基因導入棉花細胞內常用花粉管通道法
B.將目的基因導入小鼠受精卵內常用顯微注射技術
C.將目的基因導入大腸桿菌內常用Ca2+處理法
D.將目的基因導入小麥細胞內常用農桿菌轉化法
答案:D
解析:小麥是單子葉植物,農桿菌對它沒有侵染能力。
四 目的基因的檢測與鑒定
重難歸納
目的基因的檢測與鑒定
類型 步驟 檢測內容 方法
分子 水平 檢測 第一步 轉基因生物的DNA上是否插入了目的基因 PCR等技術
第二步 目的基因是否轉錄出了mRNA PCR等技術
第三步 目的基因是否翻譯成蛋白質 抗原—抗體雜交技術
1997年,我國政府首次批準商業化種植轉基因抗蟲棉。到2015年,我國已育成轉基因抗蟲棉新品種100多個,減少農藥用量約40萬噸,增收節支社會經濟效益約450億元。
(1)檢測棉花中導入的抗蟲基因是否表達,最簡便的方法是什么
提示:用棉花葉片飼養棉鈴蟲,觀察棉鈴蟲是否死亡。
(2)用什么方法檢測棉花的染色體DNA上是否插入了Bt基因或檢測Bt基因是否轉錄出了mRNA
提示:PCR等技術。
(3)如果棉花中插入的Bt基因轉錄成功,是否就一定能夠翻譯出相應的蛋白質呢 如何從分子水平進行檢測
提示:不一定翻譯出相應的蛋白質。可從轉基因棉花中提取蛋白質,用相應的抗體進行抗原—抗體雜交,檢測Bt基因是否翻譯成Bt抗蟲蛋白等。
知識拓展 DNA分子雜交技術,即將轉基因生物的基因組DNA提取出來,在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作標記,以此作為探針,使探針與基因組DNA雜交,如果顯示出雜交帶,就表明目的基因已插入染色體DNA中。
典例剖析
下列哪一種方法不能用于檢測目的基因是否成功導入或表達 (　　)
A.顯微鏡下直接觀察受體細胞中是否含有目的基因
B.在含某種抗生素的培養基中培養導入了重組質粒的大腸桿菌
C.利用相應的DNA探針與受體細胞DNA分子進行雜交
D.提取受體細胞的蛋白質,利用抗原—抗體特異性反應進行檢測
A
解析:在顯微鏡下無法觀察到基因,因此該方法不能用于檢測目的基因是否成功導入或表達。
學以致用
將蘇云金桿菌的Bt基因導入棉花植株后,從個體生物學水平進行鑒定時應鑒定其(　　)
A.是否有抗藥性　
B.是否有相應的抗蟲性狀
C.是否能檢測到標記基因　
D.是否能分離到目的基因
答案:B
1.下面是基因工程的基本操作程序,正確的排序是(　　)
①使目的基因與載體相結合　
②將目的基因導入受體細胞　
③檢測目的基因的表達是否符合特定性狀要求　
④提取目的基因
A.③②④①　　　　B.②④①③
C.④①②③　　　 D.③④①②
答案:C
2.PCR是一種DNA擴增技術,其基本原理和過程與細胞內DNA的復制類似。下列關于兩者共同點的敘述,正確的是
(　　)
①邊解旋邊復制 ②遵循堿基互補配對原則　
③需要引物　 ④過程可分為變性、復性、延伸等步驟
A.①②　 B.②③
C.③④　 D.①④
答案:B
3.基因工程的核心是(　　)
A.目的基因的獲取　
B.基因表達載體的構建
C.將目的基因導入受體細胞
D.目的基因的檢測與鑒定
答案:B
4.下列基因工程的操作步驟中,未發生堿基互補配對的是
(　　)
A.人工條件下以mRNA為模板逆轉錄合成目的基因
B.目的基因與質粒結合
C.重組質粒導入受體細胞
D.目的基因的表達
答案:C
5.農桿菌是一種在土壤中生活的微生物,能在自然條件下感染植物,因而在植物基因工程中得到了廣泛的運用。下圖為農桿菌轉化法的示意圖,回答下列問題。
(1)一般情況下,農桿菌不能侵染的植物是　　　　　。利用農桿菌自然條件下侵染植物的特點,能實現　　　　　的目的。具體原理是在農桿菌的Ti質粒上存在T-DNA片段,它具有可轉移至受體細胞并整合到受體細胞　　　　　上的特點,因此只要將攜帶外源基因的DNA片段插入　　　　　(部位)即可。
(2)根據T-DNA這一轉移特點,推測該DNA片段上可能含有控制　　　　　　酶合成的基因。
(3)植物基因工程中,除了農桿菌轉化法外,還可采取
　　　　　　　　　　　　將目的基因導入受體細胞。
答案:(1)單子葉植物　將目的基因導入植物細胞　染色體DNA　T-DNA片段(內部)
(2)DNA連接酶、限制
(3)花粉管通道法
解析:(1)一般情況下,農桿菌不能侵染單子葉植物,可侵染雙子葉植物和裸子植物。利用這一特性,可實現將目的基因導入植物細胞的目的。真正可轉移至受體細胞并整合到受體細胞染色體DNA上的是農桿菌的T-DNA片段,因此目的基因必須插入該部位才能成功。(2)根據T-DNA這一轉移特點,可以推測該DNA片段能控制合成DNA連接酶、限制酶,以實現與雙子葉植物細胞染色體DNA的整合。(3)植物基因工程中,除了農桿菌轉化法外,還可用花粉管通道法等將目的基因導入受體細胞。

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