資源簡介

第一節　基因工程及其技術
第1課時　基因工程的基本工具與聚合酶鏈式反應(PCR)技術
課標內容要求 核心素養對接
1.概述基因工程是在遺傳學、微生物學、生物化學和分子生物學等學科基礎上發展而來的。2.闡明DNA重組技術的實現需要利用限制性內切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。 生命觀念：掌握基因工程的基本工具的種類及作用，并能說出它們在基因工程中的應用。科學思維：掌握PCR技術的過程與原理，并能正確比較PCR技術與體內DNA復制的異同。社會責任：通過了解基因工程的發展歷程，認同新技術的發展是一代又一代科學家前赴后繼努力的結果，并會給人類發展帶來巨大的經濟效益和社會效益。
一、基因工程是在多學科基礎上發展而來的
1957年：科恩伯格等首次發現DNA聚合酶。
↓
1967年：羅思和海林斯基等發現運轉工具質粒，同年，科學家發現DNA連接酶。
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1970年：特明和巴爾的摩各自在RNA病毒中發現逆轉錄酶。史密斯等人分離到限制性內切核酸酶。
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1972年科學家伯格領導的研究小組完成了世界上首次DNA分子體外重組。
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1973年科學家科恩領導的研究小組利用大腸桿菌質粒進行了另一個體外重組DNA分子實驗。
↓
接著，科恩和美國博耶證明真核生物的基因可以在原核生物中進行表達。
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1976年，科學家用質粒為載體，將生長激素釋放抑制因子基因轉入大腸桿菌，1977年首次生產出治療肢端肥大癥、巨人癥的生長激素釋放抑制因子。
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1977年桑格測定了一種噬菌體的基因組序列，這是人類首次對完整基因組的核苷酸順序進行測定。
二、基因工程的基本工具
1．基因工程
(1)概念：又稱為DNA重組技術，是指在體外通過人工“剪切”和“拼接”等方法，將外源目的基因與載體DNA進行組合形成重組DNA，然后導入受體細胞，并使其在受體細胞中表達，產生人類需要的基因產物的技術。
(2)原理：基因重組。
(3)操作水平：基因(分子)水平。
2．“分子剪刀”——限制性內切核酸酶(限制酶)
(1)作用：識別DNA分子上特定的脫氧核苷酸序列，并使每條鏈中特定部位的兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。
(2)特點：特異性(專一性)很強。
(3)切割方式
①錯位切：在DNA分子兩條鏈的不同部位進行切割，切割后形成的兩個DNA分子片段的末端均留下一段游離的單鏈，稱為黏性末端。
②平切：在DNA分子兩條鏈上相同的部位進行切割，切割后形成平末端。
3．“分子黏合劑”——DNA連接酶
(1)作用：連接兩個DNA片段之間的磷酸二酯鍵。
(2)類型
①E.coli DNA連接酶：分離自大腸桿菌，可以連接黏性末端的DNA分子。
②T4 DNA連接酶：分離自T4噬菌體，可以連接黏性末端或平末端的DNA分子。
4．“分子搬運工”——載體
(1)作用：將外源基因導入受體細胞，并使其在受體細胞中穩定遺傳和表達。
(2)類型：質粒、λ噬菌體的衍生物、動物病毒等。
(3)組成：復制原點、適合的標記基因、多種限制酶的切割位點。
(4)改造：基因工程上用作載體的質粒一般都是經過人工改造過的。
三、聚合酶鏈式反應(PCR)技術
1．PCR概念：目的DNA片段(目的基因)的體外擴增技術。
2．原理：類似于DNA的復制。
3．條件
①模板DNA：DNA的兩條鏈。
②引物對：使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸。
③原料：4種dNTP。
④熱穩定的DNA聚合酶：Taq酶。
⑤其他：緩沖液、Mg2＋等。
4．過程
(1)變性：在約94_℃高溫下，作為模板的雙鏈DNA解旋(變性)為兩條單鏈DNA。
(2)退火：反應體系的溫度降至約55 ℃，2條引物分別與對應單鏈DNA上的特定部位配對。
(3)延伸：反應體系的溫度回升到約72_℃左右，4種脫氧核苷三磷酸根據堿基互補配對原則，在Taq酶的作用下連接到引物的3′端之后，使引物鏈延伸，并形成互補的DNA雙鏈。
判斷對錯(正確的打“√”，錯誤的打“×”)
1．基因工程的原理是基因重組，不過在這里這種變異是定向的。 (　　)
[答案]　√
2．DNA聚合酶也可以用作DNA重組技術的工具。 (　　)
×　提示：DNA重組技術的工具有限制酶、DNA連接酶和載體，沒有DNA聚合酶。
3．不同DNA分子用同一種限制酶切割形成的黏性末端相同。 (　　)
[答案]　√
4．DNA連接酶既能連接黏性末端，又能連接平末端。 (　　)
×　提示：E.coli DNA連接酶不能連接平末端。
5．載體的種類有質粒、噬菌體、動物病毒等，其中動物病毒必須是DNA病毒。 (　　)
[答案]　√
6．PCR技術需要熱穩定的DNA聚合酶和解旋酶的參與。 (　　)
×　提示：PCR技術中通過加熱使雙鏈DNA解旋，不需要解旋酶參與。
7．擴增目的基因時只需要一種引物。 (　　)
×　提示：需兩種引物分別與兩條母鏈結合。
　基因工程的工具酶
1．限制性內切核酸酶
(1)作用特點：具有專一性，表現在以下兩個方面
①能夠識別雙鏈DNA分子中特定的核苷酸序列。
②能夠切割特定序列中的特定位點。
(2)識別序列的特點：遵循堿基互補配對原則，無論是奇數個堿基還是偶數個堿基，都可以找到一條中心軸線，如圖，中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向對稱重復排列的。如以中心線為軸，兩側堿基互補對稱；以為軸，兩側堿基互補對稱。
(3)作用產物：黏性末端或平末端。
①黏性末端：是限制性內切核酸酶在它識別序列的中心軸線兩側將DNA的兩條鏈分別切開時形成的，如圖所示：
②平末端：是限制性內切核酸酶在它識別序列的中心軸線處切開時形成的，如圖所示：
2．限制性內切核酸酶與DNA連接酶的關系
(1)區別
作用 應用
限制性內切核酸酶 使特定部位的磷酸二酯鍵斷裂 用于提取目的基因和切割載體
DNA連接酶 在DNA片段之間重新形成磷酸二酯鍵 用于目的基因和載體的連接
(2)兩者的關系可表示為
3．DNA連接酶與DNA聚合酶的比較
比較項目 DNA連接酶 DNA聚合酶
相同點 作用實質相同，都是催化磷酸二酯鍵的形成
不同點 是否需要模板 不需要 需要
接DNA鏈 雙鏈 單鏈
作用過程 在兩個DNA片段間形成磷酸二酯鍵 將單個核苷酸加到已存在的DNA單鏈片段上，形成磷酸二酯鍵
作用結果 將已存在的DNA片段連接 合成新的DNA分子
用途 基因工程 DNA復制
合作探究：(1)為什么限制酶主要從原核生物中分離純化而來？推測它在原核生物中的作用是什么？它會不會切割自己的DNA分子？
提示：原核細胞容易受到外源DNA的入侵，原核細胞中的限制酶能夠切割入侵的外源DNA而保護自身。原核細胞中的限制酶不會切割自己的DNA分子，因為酶具有專一性或自己的DNA分子已被修飾而不被識別。
(2)限制性內切核酸酶和DNA連接酶的作用是否都體現了酶的專一性？
提示：限制性內切核酸酶能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開，體現了酶的專一性。E.coli DNA連接酶能將具有互補黏性末端的DNA片段連接起來，對末端的堿基序列沒有要求；T4 DNA連接酶既可以連接雙鏈DNA片段互補的黏性末端，又可以連接雙鏈DNA分子的平末端，都對末端的堿基序列沒有要求，因此DNA連接酶的作用沒有體現酶的專一性。
1.限制酶a和b的識別序列和切割位點如圖所示，下列有關說法正確的是(　　)
A．一個DNA分子中，酶a與酶b的識別序列可能有多個
B．酶a與酶b切出的黏性末端不能相互連接
C．酶a與酶b切斷的化學鍵不完全相同
D．用酶a切割有3個識別位點的質粒，得到4種切割產物
A　[一個DNA分子中，可能存在一個至多個酶a與酶b的識別序列，A正確；由圖可知，酶a與酶b識別的序列雖然不同，但切出的黏性末端相同，相同的黏性末端能相互連接，B錯誤；酶a與酶b切斷的化學鍵均為相鄰脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵，C錯誤；質粒為小型環狀DNA分子，用酶a切割有3個識別位點的質粒，可得到3種切割產物，D錯誤。]
2．下列有關DNA連接酶的敘述，正確的是(　　)
A．T4 DNA連接酶只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間連接起來
B．E.coli DNA連接酶能將雙鏈DNA片段平末端之間進行連接
C．DNA連接酶能恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵
D．DNA連接酶可連接DNA雙鏈的氫鍵，使雙鏈延伸
C　[DNA連接酶能使兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，從而將它們連接起來。E.coli DNA連接酶只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間連接起來，不能將雙鏈DNA片段平末端之間進行連接。T4 DNA連接酶既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端。]
3．下列關于幾種酶作用的敘述，錯誤的是(　　)
A．DNA連接酶能使不同脫氧核苷酸的磷酸與脫氧核糖連接
B．RNA聚合酶能與基因的特定位點結合，催化遺傳信息的轉錄
C．一種限制酶能識別多種核苷酸序列，并切割出多種目的基因
D．DNA聚合酶能把單個脫氧核苷酸分子連接成一條DNA單鏈
C　[限制酶具有專一性，一種限制酶一般只能識別一種核苷酸序列，并在特定位點切割DNA分子。DNA連接酶能使不同DNA片段的脫氧核苷酸的磷酸與脫氧核糖連接，重新形成DNA分子；RNA聚合酶能與基因的特定位點結合，催化遺傳信息的轉錄；DNA聚合酶能以DNA的一條鏈為模板，把單個脫氧核苷酸分子連接成一條DNA單鏈，復制形成新的DNA分子。]
　基因工程中的載體
1．種類
常用載體：質粒、λ噬菌體的衍生物、動物病毒等。質粒是一種裸露的、結構簡單的、獨立于細菌擬核DNA之外的、具有自我復制能力的、很小的雙鏈環狀DNA分子。
2．具備條件
(1)能自我復制：能夠在受體細胞中進行自我復制，或整合到染色體DNA上，隨染色體DNA進行同步復制。
(2)有切割位點：有一個至多個限制酶切割位點，供外源基因插入。
(3)具有標記基因：具有特殊的標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。
(4)無毒害作用：對受體細胞無毒害作用，否則受體細胞將受到損傷甚至死亡。
說明：一般來說，天然載體不能同時滿足所有條件，要對其進行人工改造才可以使用。
3．作用
(1)用它作為運輸工具，將目的基因送入受體細胞中。
(2)利用它在受體細胞內對目的基因進行大量復制。
合作探究：(1)細胞膜上的載體與基因工程中的載體有什么不同？
提示：①化學本質不同：細胞膜上的載體化學成分是蛋白質；基因工程中的載體可能是物質，如質粒(DNA)、λ噬菌體的衍生物，也可能是生物，如動植物病毒等。
②功能不同：細胞膜上的載體功能是協助細胞膜控制物質進出細胞；基因工程中的載體是一種“分子運輸車”，把目的基因導入受體細胞。
(2)標記基因標記的原理是什么？
提示：①前提：載體上的標記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉入的受體細胞沒有抵抗相關抗生素的能力。
②過程：含有某抗生素抗性基因的載體導入受體細胞，抗性基因在受體細胞內表達，受體細胞對該抗生素產生抗性，因此培養受體細胞的培養基中加入該種抗生素即可篩選。
③結果：在培養基上，被抗生素殺死的是沒有抗性的受體細胞，沒被殺死的具有抗性的受體細胞得以篩選。
原理如圖所示：
1．作為基因的運輸工具——載體，必須具備的條件之一及理由是(　　)
A．能夠在宿主細胞中穩定地保存下來并大量復制，以便提供大量的目的基因
B．具有多個限制酶切點，以便于目的基因的表達
C．具有某些標記基因，以使目的基因能夠與其結合
D．對宿主細胞無傷害，以便于重組DNA的鑒定和選擇
A　[作為載體必須能夠在宿主細胞中穩定地保存下來并大量復制，以便提供大量的目的基因，A正確；作為載體必須具有一個或多個限制酶切點，以便于目的基因的插入，而不是表達，B錯誤；作為載體必須具有標記基因，以便于重組DNA的篩選，C錯誤；作為載體必須是安全的，對受體細胞無害，以便宿主細胞能進行正常的生命活動，D錯誤。]
2．限制酶Mun Ⅰ和限制酶EcoR Ⅰ的識別序列及切割位點分別是。下圖表示四種質粒和目的基因，其中，質粒上箭頭所指部位為酶的識別位點，陰影部分表示標記基因。適于作為圖示目的基因載體的質粒是(　　)
A　　　　　B　　　　C　　　　D
A　[用限制酶Mun Ⅰ切割A質粒后，不會破壞標記基因，而且還能產生與目的基因兩側黏性末端相同的末端，適于作為目的基因的載體。B項中質粒沒有標記基因，不適于作為目的基因的載體。C、D質粒含有標記基因，但用限制酶切割后會被破壞，因此不適于作為目的基因的載體。]
3．某一質粒載體如圖所示，外源DNA插入Ampr或Tetr中會導致相應的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環素抗性基因)。有人將此質粒載體用BamH Ⅰ酶切后，與用BamH Ⅰ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉化大腸桿菌，結果大腸桿菌有的未被轉化，有的被轉化。被轉化的大腸桿菌有三種，分別是含有環狀目的基因、含有質粒載體、含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉栴}：
(1)質粒載體作為基因工程的工具，應具備的基本條件有____________________(答出兩點即可)。而作為基因表達載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動子和終止子。
(2)如果用含有氨芐青霉素的培養基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉化的和僅含環狀目的基因的細胞是不能區分的，其原因是________
_______________________________________________________________；
并且________________和________________的細胞也是不能區分的，其原因是______________________。在上述篩選的基礎上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有________的固體培養基。
(3)基因工程中，某些噬菌體經改造后可以作為載體，其DNA復制所需的原料來自________。
[解析]　(1)質粒作為載體，應具備的基本條件有：有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA片段(基因)插入其中；在受體細胞中能自我復制，或能整合到染色體DNA上，隨染色體DNA進行同步復制；有特殊的標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇等。(2)在培養基中加入氨芐青霉素進行篩選，其中未被轉化的大腸桿菌和僅含環狀目的基因的大腸桿菌，因不含氨芐青霉素抗性基因而都不能在此培養基上存活，二者不能區分。含有質粒載體的大腸桿菌和含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌中都含有氨芐青霉素抗性基因，都能在此培養基上存活，二者也不能區分。若要將含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌進一步篩選出來，還需要使用含有四環素的固體培養基。(3)某些噬菌體經改造后作為載體，導入受體細胞后，其DNA復制所需的原料來自受體細胞。
[答案]　(1)能自我復制、具有標記基因　(2)二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養基上均不生長　含有質粒載體　含有插入了目的基因的重組質粒(或含有重組質粒)　二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養基上均能生長　四環素　(3)受體細胞
　聚合酶鏈式反應(PCR)技術
1．PCR反應的過程
2．PCR技術與生物體內DNA復制的比較
比較項目 PCR技術 DNA復制
區別 解旋方式 DNA在高溫作用下變性解旋 解旋酶催化
場所 細胞外(在PCR擴增儀內) 細胞內(主要在細胞核內)
酶 耐高溫的DNA聚合酶(Taq聚合酶) DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等
溫度條件 需控制溫度，在較高溫度下進行 細胞內溫和條件
合成的對象 DNA片段或基因 DNA分子
聯系 ①模板：均需要脫氧核苷酸鏈作為模板進行物質合成②原料：均為四種脫氧核苷酸③酶：均需要DNA聚合酶進行催化④引物：均需要引物，使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸
合作探究：(1)PCR過程中為什么需要引物？
提示：引物是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復制的起始序列，它能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對。存在于自然界中生物的DNA復制和人工合成中的多聚酶鏈式反應(PCR)之所以需要引物，是因為在DNA合成時DNA聚合酶只能從子鏈的3′端催化連接脫氧核苷酸。
(2)PCR擴增目的基因時，復性溫度的設定是成敗的關鍵。復性溫度過高會破壞引物與模板的堿基配對，復性溫度過低又會造成引物不能與DNA模板鏈的特定部位結合。復性溫度的設定與引物長度、堿基組成有關，假設引物的長度相同，在GC含量高時，對復性溫度的設定有什么要求？說明理由。
提示：在引物的GC含量高時，設定的復性溫度要高一些。因為DNA分子中G—C之間有三個氫鍵，A—T之間有兩個氫鍵。
(3)在利用PCR獲取和擴增目的基因時，從第幾輪循環才會產生完整的目的基因？
提示：第3輪
1．下列關于PCR反應體系中所加物質作用的描述，錯誤的是(　　)
A．耐高溫的DNA聚合酶用于催化DNA子鏈的合成
B．引物使Taq酶能從引物的5′端延伸DNA鏈
C．目標DNA母鏈用作合成DNA復制的模板
D．四種dNTP為PCR提供能量和原料
B　[通過PCR技術擴增目的基因時，需要用耐高溫的DNA聚合酶催化單個脫氧核苷酸聚合形成DNA子鏈，A正確；在復制時，引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結合后，DNA聚合酶從引物的3′端開始延伸DNA鏈，因此DNA合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸，B錯誤；PCR技術的原理是DNA雙鏈復制，DNA復制時兩條鏈均作為復制的模板，C正確；DNA合成的原料是四種脫氧核苷酸，同時兩個核苷酸連接時可釋放能量，D正確。]
2．在基因表達載體的構建中，下列說法不正確的是(　　)
①一個基因表達載體的組成只包括目的基因、啟動子、終止子
②有了啟動子才能驅動基因轉錄出mRNA
③終止子的作用是使轉錄在所需要的地方停止
④所有基因表達載體的構建是完全相同的
⑤必須在細胞內進行
A．②③⑤　　B．①④⑤　　C．①②⑤　　D．③④
B　[基因表達載體的構建是基因工程的核心內容，基因表達載體是載體的一種，除了目的基因外，它還有啟動子、終止子和標記基因等，①錯誤；啟動子是RNA聚合酶的結合位點，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，②正確；終止子控制著轉錄的結束，③正確；由于受體細胞有植物、動物以及微生物之分，以及目的基因導入受體細胞的方法不同，因此基因表達載體的構建是不完全相同的，④錯誤；基因表達載體的構建必須在細胞外進行，⑤錯誤。②③正確，①④⑤錯誤。故選B。]
3．基因工程中可以通過PCR技術擴增目的基因?；卮鹣铝袉栴}。
(1)生物體細胞內的DNA復制開始時，解開DNA雙鏈的酶是________。在體外利用PCR技術擴增目的基因時，使反應體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是__________。上述兩個解鏈過程的共同點是破壞了DNA雙鏈分子中的________。
(2)目前在PCR反應中使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是_________________________________________________________________
_____________________________________________________________。
[解析]　(1)生物體細胞內DNA復制開始時是利用解旋酶進行解旋的，而在體外利用PCR技術擴增目的基因時，則是通過加熱至90～95 ℃進行解旋的，二者都破壞了堿基對之間的氫鍵。(2)在PCR過程中，要加熱至90～95 ℃，所以使用熱穩定性高的Taq酶，而不使用在高溫下會失活的大腸桿菌DNA聚合酶。
[答案]　(1)解旋酶　加熱至90～95 ℃　氫鍵
(2)Taq酶熱穩定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活
[課堂小結]
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1.基因工程又稱為DNA重組技術，是指在體外通過人工“剪切”和“拼接”等方法，將外源目的基因與載體DNA進行組合形成重組DNA，然后導入受體細胞，并使其在受體細胞中表達，產生人類需要的基因產物的技術。2.限制酶的特異性(專一性)很強，能識別DNA分子上特定的脫氧核苷酸序列，并使每條鏈中特定部位的兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。3.從大腸桿菌分離得到的E.coli DNA 連接酶，可以用于連接具有黏性末端的DNA分子；從T4噬菌體中分離出來的T4 DNA連接酶，可以用于連接具有黏性末端或平末端的DNA分子。4.質粒載體應該具有的DNA序列包括：復制原點、適合的標記基因、多種限制酶的切割位點。5.聚合酶鏈式反應是目的DNA片段的體外擴增技術。包括變性、退火、延伸三個反應步驟。
1．下列對基因工程的說法，錯誤的是(　　)
A．基因工程是在分子水平上進行設計和施工
B．基因工程產生的變異屬于染色體變異
C．基因工程可以導入不同種生物的基因
D．基因工程可定向改變生物性狀
B　[基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，A正確；基因工程屬于基因重組，B錯誤；基因工程可以導入不同種生物的基因，C正確；基因工程可按照人們的意愿，定向改變生物性狀，D正確。]
2．(2020·上海高二期末)如圖是DNA分子結構的示意圖，其中，基因工程中使用的限制酶的作用位點是 (　　)
A．①　　　　B．②　　　　C．③　　　　D．④
B　[限制酶的作用位點是兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵，即圖中②，B正確。]
3．“分子縫合針”——DNA連接酶“縫合”的部位是(　　)
A．堿基對之間的氫鍵
B．堿基與脫氧核糖
C．雙鏈DNA片段間的磷酸二酯鍵
D．脫氧核糖與脫氧核糖
C　[相鄰的兩個脫氧核苷酸之間由磷酸和脫氧核糖形成的磷酸二酯鍵連接，DNA連接酶連接的是此化學鍵。]
4．質粒是基因工程最常用的載體，下列有關質粒的說法錯誤的是(　　)
A．質粒不僅存在于細菌中，某些病毒也具有
B．質粒作為載體時，應具有標記基因和多個限制酶切點
C．質粒為小型環狀DNA分子，存在于擬核(區)外的細胞質基質中
D．質粒能夠在宿主細胞中穩定保存，并在宿主細胞內復制
A　[質粒為小型環狀DNA分子，不僅存在于細菌中，也存在于某些真核生物中，但病毒中沒有質粒；質粒作為載體時，應具有標記基因和多個限制酶切割位點；質粒為小型環狀DNA分子，存在于細胞核或擬核外的細胞質基質中；質粒能夠在宿主細胞中穩定保存，并在宿主細胞內復制。]
5．PCR利用了DNA熱變性的原理，PCR儀實際上也是一種能自動調控溫度的儀器，對PCR過程中“溫度的控制”的說法錯誤的是(　　)
A．酶促反應需要高的溫度，是為了確保模板是單鏈
B．延伸的溫度必須大于復性溫度，而小于變性溫度
C．DNA聚合酶具有耐高溫的能力
D．DNA解旋酶具有耐高溫的能力
D　[PCR是體外DNA擴增，DNA雙鏈的解開不需要解旋酶，靠高溫使其變性，雙鏈螺旋結構解體，雙鏈分開，在復性后，在耐高溫的DNA聚合酶的作用下根據堿基互補配對原則合成新的DNA，因此延伸的溫度要大于復性溫度而小于變性溫度。]
6．下圖表示形成cDNA并進行PCR擴增的過程。據圖分析，下列敘述正確的是 (　　)
A．①過程所需的原料是核糖核苷酸
B．②過程所需的酶必須耐高溫
C．③過程需要解旋酶破壞氫鍵
D．④過程的引物對之間不能互補配對
D　[①過程為逆轉錄，所需的原料是脫氧核苷酸，A錯誤；②過程由DNA單鏈合成DNA雙鏈過程所需要的DNA聚合酶不需要耐高溫，B錯誤；③過程為變性，溫度上升到90 ℃以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈，不需要DNA解旋酶破壞氫鍵，C錯誤；④過程為復性，溫度降到50 ℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條DNA單鏈結合，但引物對之間不能互補配對，D正確。]
17/17課后素養落實(十二)　基因工程的基本工具與聚合酶鏈式反應(PCR)技術
(建議用時：40分鐘)
題組一　基因工程及其誕生和發展
1．科學家經過多年的努力，創立了一種新興生物技術——基因工程。實施該工程的最終目的是(　　)
A．定向提取生物體的DNA分子
B．定向地對DNA分子進行人工“剪切”
C．在生物體外對DNA分子進行改造
D．定向地改造生物的遺傳性狀
D　[該題的關鍵詞是“最終目的”，A、B、C三項都是基因工程的技術手段，這些手段的目的是定向改造生物的遺傳性狀，故選D項。]
2．下列關于基因工程的發展歷程的說法錯誤的是(　　)
A．質粒是一種具有自我復制能力的環狀DNA分子
B．美國科學家伯格領導的研究小組完成世界上首次DNA分子體外重組
C．科恩和博耶證明真核生物的基因可以在原核生物中表達
D．基因工程的建立和發展是生物學進步的結果，與其他學科無關
D　[基因工程是在遺傳學、微生物學、生物化學和分子生物學等眾多學科長足進步的基礎上發展而來的。]
題組二　基因工程的基本工具
3．下列有關限制性內切核酸酶的敘述，正確的是(　　)
A．用限制性內切核酸酶切割一個DNA分子中部，獲得一個目的基因時，被水解的磷酸二酯鍵有2個
B．限制性內切核酸酶識別序列越短，則該序列在DNA中出現的概率就越大
C．—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端可用DNA連接酶連接
D．只有用相同的限制性內切核酸酶處理含目的基因的片段和質粒，才能形成重組質粒
B　[用限制性內切核酸酶切割一個DNA分子中部，獲得一個目的基因時，需要切割目的基因的兩側，因此要斷裂4個磷酸二酯鍵，即被水解的磷酸二酯鍵有4個，A錯誤；限制性內切核酸酶識別序列越短，則該序列在DNA中出現的概率就越大，B正確；—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端不同，分別為CATG和GATC，不能用DNA連接酶連接，C錯誤；用不同的限制性內切核酸酶處理含目的基因的DNA片段和質粒，若產生的黏性末端相同，也能形成重組質粒，D錯誤。]
4．下列關于DNA連接酶作用的敘述，正確的是 (　　)
A．將單個核苷酸加到某個DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵
B．將斷開的2個DNA片段的骨架連接起來，重新形成磷酸二酯鍵
C．連接2條DNA鏈上堿基之間的氫鍵
D．只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端連接起來，而不能將兩者之間的平末端進行連接
B　[DNA連接酶和DNA聚合酶都是催化2個脫氧核苷酸分子之間形成磷酸二酯鍵。但DNA連接酶是在2個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，將2個DNA片段連接成重組DNA分子；DNA聚合酶是將單個的核苷酸分子加到已存在的核酸片段上形成磷酸二酯鍵，合成新的DNA分子。]
5．下列關于載體的敘述中，錯誤的是(　　)
A．載體與目的基因結合后，實質上就是一個重組DNA分子
B．在進行基因工程操作中，真正被用作載體的質粒，都是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的
C．目前常用的載體有質粒、噬菌體和動植物病毒等
D．載體具有某些標記基因，便于對其進行切割
D　[用DNA連接酶將目的基因和載體DNA連接在一起，形成的DNA分子為重組DNA分子，A正確；常用的載體有質粒、λ噬菌體的衍生物、動植物病毒等，其中在進行基因工程操作中，真正被用作載體的質粒，都是在天然質粒的基礎上進行人工改造的，B、C正確；標記基因的作用是鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來，D錯誤。]
6．下面是四種不同質粒的示意圖，其中ori為復制必需的序列，ampr為氨芐青霉素抗性基因，tetr為四環素抗性基因，箭頭表示一種限制性內切核酸酶的酶切位點。若要得到一個能在四環素培養基上生長而不能在氨芐青霉素培養基上生長的含重組DNA的細胞，應選用的質粒是(　　)
C　[A項破壞了復制必需的序列。B項氨芐青霉素抗性基因和四環素抗性基因都完好，在四環素培養基上和氨芐青霉素培養基上都能生長。C項氨芐青霉素抗性基因被破壞，四環素抗性基因完好，能在四環素培養基上生長而不能在氨芐青霉素培養基上生長。D項氨芐青霉素抗性基因完好，四環素抗性基因被破壞。]
7．根據圖表的內容回答問題：
幾種限制酶識別序列切割位點
(1)假設所用的限制酶均能將所識別的位點完全切開，采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切含有目的基因的DNA，能得到________種DNA片段。如果將質粒載體和含目的基因的DNA片段只用EcoRⅠ酶切，酶切產物再加入DNA連接酶，其中由兩個DNA片段之間連接形成的產物有________________、________________、________________。
(2)為了防止目的基因和質粒表達載體酶切后的末端任意連接，酶切時應該選用的酶是________、________。
[解析]　(1)含目的基因的DNA分子上含有2個EcoR Ⅰ和1個Pst Ⅰ的酶切位點，3個切點全部切開，則形成4種DNA片段。質粒與含目的基因的DNA片段都用EcoRⅠ酶切，目的基因兩端和質粒切口處的黏性末端相同，只考慮兩個DNA片段相連，則會形成3種連接產物，即質粒與質粒相連、質粒與目的基因相連、目的基因與目的基因相連。(2)為了防止任意連接，可選用EcoRⅠ和SmaⅠ兩種酶同時切割。
[答案]　(1)4　質粒載體與質粒載體連接物　目的基因與目的基因連接物　質粒載體與目的基因連接物　(2)EcoRⅠ　SmaⅠ
題組三　PCR技術
8．DNA的復制需要引物，主要原因是(　　)
A．可加快DNA的復制速度
B．引物可與DNA母鏈通過堿基互補配對結合
C．引物的5′端有助于DNA聚合酶的延伸DNA鏈
D．DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈
D　[DNA聚合酶不能從5′端開始合成DNA，而只能從3′端延伸DNA鏈，因此，DNA復制需要引物。當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。]
9．利用PCR技術從某種生物的基因組DNA中獲取目的基因的前提是(　　)
A．有目的基因的DNA片段，作為模板進行復制
B．有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據這一序列合成引物
C．有足夠的脫氧核苷酸作為原料
D．加入足夠數量的DNA連接酶進行指數式擴增
B　[利用PCR技術從某種生物的基因組DNA中獲取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成引物。]
10．金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在的金屬結合蛋白，某研究小組計劃通過多聚酶鏈式反應(PCR)擴增獲得目的基因，構建轉基因工程菌，用于重金屬廢水的凈化處理。PCR擴增過程示意圖如下，請回答下列問題：
(1)從高表達MT蛋白的生物組織中提取mRNA，通過________獲得________用于PCR擴增。
(2)設計一對與MT基因兩端序列互補配對的引物(引物1和引物2)，為方便構建重組質粒，在引物中需要增加適當的________________位點。設計引物時需要避免引物之間形成________________，而造成引物自連。
(3)圖中步驟1代表________，步驟2代表退火，步驟3代表延伸，這三個步驟組成一輪循環。
(4)如果PCR反應得不到任何擴增產物，則可以采取的改進措施有________(填序號：①升高退火溫度?、诮档屯嘶饻囟取、壑匦略O計引物)。
[解析]　(1)目的基因的獲?。簭母弑磉_MT蛋白的生物組織中提取mRNA，通過逆轉錄獲得cDNA用于PCR擴增。
(2)設計一對與MT基因兩端序列互補配對的引物(引物1和引物2)，為方便基因與載體相連構建重組質粒，在引物中需要增加適當的限制性內切核酸酶的切割位點。為了避免引物自連，設計引物時需要避免引物之間形成堿基互補配對。
(3)根據PCR的過程可知，圖中步驟1為變性，步驟2為退火，步驟3為延伸，這三個步驟組成一輪循環。
(4)如果PCR反應得不到任何擴增產物，可能的原因是退火溫度過高，或者設計的引物不合適，不能與模板堿基配對。因此可采取的改進措施有降低退火溫度、重新設計引物等。
[答案]　(1)逆轉錄　cDNA　(2)限制性內切核酸酶　堿基互補配對　(3)變性　(4)②③
11．對下圖所示黏性末端的相關說法錯誤的是(　　)
A．甲、乙、丙黏性末端是由各自不同的限制性內切核酸酶催化產生的
B．甲、乙具相同的黏性末端，可形成重組DNA分子，但甲、丙之間不能
C．DNA連接酶作用位點在b處，催化磷酸基團和脫氧核糖之間形成化學鍵
D．切割甲的限制性內切核酸酶不能識別由甲、乙片段形成的重組DNA分子
C　[甲圖表示在G和A之間進行剪切，乙圖表示在C和A之間進行剪切，丙圖表示在C和T之間進行剪切，因此三者需要不同的限制性內切核酸酶進行剪切；甲和乙的黏性末端相同，能夠通過堿基互補配對形成重組DNA分子，但甲和丙不行；DNA連接酶作用的位點是磷酸二酯鍵，乙圖中的a和b分別表示磷酸二酯鍵和氫鍵；甲和乙形成的重組DNA分子相應位置的DNA堿基序列為，而甲圖表示在G和A之間切割，所以該重組序列不能被切割甲的限制性內切核酸酶識別。]
12．下圖所示為限制酶BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ的識別序列及切割位點，實驗中用BamH Ⅰ切割DNA獲得目的基因，用Bgl Ⅱ切割質粒，并將它們拼接得到重組質粒。下列相關敘述正確的是(　　)
A．在酶切過程中，只需要控制好酶的濃度，不需要控制溫度等因素
B．經兩種酶處理得到的重組質粒不能再被這兩種酶所識別
C．質粒經Bgl Ⅱ切割后形成的黏性末端是
D．分別用圖中兩種限制酶切割，可保證目的基因定向地插入質粒
B　[影響酶促反應的因素有溫度、pH、酶濃度、底物濃度、反應時間等，因此酶切過程中，需控制好酶濃度、溫度和反應時間等因素，A錯誤；經兩種酶處理得到的重組質粒不能再被這兩種酶識別，B正確；質粒經Bgl Ⅱ切割后形成的黏性末端是，C錯誤；分別用題圖中兩種限制酶切割目的基因和質粒，由于形成的黏性末端相同，因此并不能保證目的基因定向地插入質粒，D錯誤。]
13．RT PCR是將RNA逆轉錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈式擴增反應相結合的技術，可利用此技術獲取目的基因，具體過程如圖所示，以下說法錯誤的是(　　)
A．設計擴增目的基因的引物時需考慮表達載體的序列
B．GC含量高的引物在與模板鏈結合時，需要更高的溫度
C．過程Ⅰ需要加入緩沖液、原料、耐高溫的DNA聚合酶和引物A等
D．過程Ⅱ擬對單鏈cDNA進行n次循環的擴增，理論上需要2n－1個引物B
C　[設計擴增目的基因的引物時，引物應當可以與表達載體兩端的序列進行互補配對。所以設計引物時需考慮表達載體的序列，A正確；GC對之間有三個氫鍵，GC含量高時穩定性高，所以需要更高的溫度，B正確；過程Ⅰ是逆轉錄過程，所以需要加入緩沖液、原料、逆轉錄酶和引物A等，C錯誤；過程Ⅱ擬對單鏈cDNA進行n次循環的擴增，根據DNA的半保留復制可知理論上需要2n－1個引物B，D正確。]
14．目前基因工程所用的質粒載體主要是以天然細菌質粒的各種元件為基礎重新組建的人工質粒，pBR322質粒是較早構建的質粒載體，其主要結構如圖一所示。
(1)構建人工質粒時要有抗性基因，以便于____________________________。
(2)pBR322分子中有單個EcoRⅠ限制酶作用位點，EcoR Ⅰ只能識別序列—GAATTC—，并只能在G與A之間切割。若在某目的基因的兩側各有1個EcoR Ⅰ的切點，請畫出目的基因兩側被限制酶EcoR Ⅰ切割后所形成的黏性末端。_____________________________________________________。
(3)pBR322分子中另有單個的BamH Ⅰ限制酶作用位點，現將經BamH Ⅰ處理后的質粒與用另一種限制酶Bgl Ⅱ處理得到的目的基因，通過DNA連接酶的作用恢復____________鍵，成功地獲得了重組質粒，這說明_________________
____________________________________________________________。
(4)為了檢測上述重組質粒是否導入原本無Ampr和Tetr的大腸桿菌，將大腸桿菌在含氨芐青霉素的培養基上培養，得到如圖二的菌落。再將滅菌絨布按到培養基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到含四環素的培養基上培養，得到如圖三的結果(空圈表示與圖二對照無菌落的位置)。與圖三空圈相對應的圖二中的菌落表型是____________________，圖三結果顯示，多數大腸桿菌導入的是________。
[解析]　(1)構建人工質粒時要有抗性基因作為標記基因，用于重組DNA的鑒定和篩選或便于鑒別目的基因是否導入受體細胞。(2)EcoR Ⅰ只能識別核酸序列—GAATTC—，并只能在G與A之間切割。根據限制酶的識別序列和切割位點進行解答。(3)DNA連接酶的作用是恢復磷酸二酯鍵；由題干可知，兩種限制酶(BamH Ⅰ和BglⅡ)切割得到的黏性末端相同，這樣才能進行相應的堿基互補配對。(4)與圖三空圈相對應的圖二中的菌落表型是能抗氨芐青霉素，但不能抗四環素；圖三結果顯示，多數大腸桿菌導入的是能抗氨芐青霉素和四環素的人工質粒即pBR322質粒。
[答案]　(1)重組DNA的鑒定和篩選(鑒別目的基因是否導入受體細胞)
(2)
(3)磷酸二酯　兩種限制酶(BamH Ⅰ和BglⅡ)切割得到的黏性末端相同
(4)能抗氨芐青霉素，但不能抗四環素　pBR322質粒
對限制酶的作用結果分辨不清
15．表1列舉了幾種限制酶識別序列及其切割位點(箭頭表示相關酶的切割位點)。圖2是酶切后產生的幾種末端。下列說法正確的是(　　)
表1
圖2
A．BamH Ⅰ切割的是磷酸二酯鍵，Alu Ⅰ切割的是氫鍵
B．能被Sau3A Ⅰ識別的序列，一定也能被BamH Ⅰ識別
C．DNA連接酶能連接②⑤，也能連接②④
D．E.coli DNA連接酶和T4 DNA連接酶都能連接①③
C　[BamH Ⅰ與Alu Ⅰ切割的均是磷酸二酯鍵，A錯誤；BamH Ⅰ識別并切割，Sau3A Ⅰ識別并切割，故BamH Ⅰ能識別的堿基序列，Sau3A Ⅰ一定能識別，但是Sau3A Ⅰ能識別的序列，BamH Ⅰ不一定能識別，B錯誤；②⑤的黏性末端相同，②④的黏性末端也相同，因此DNA連接酶能連接②⑤，也能連接②④，C正確；E.coli DNA連接酶是從大腸桿菌中獲得的，只能連接黏性末端，T4 DNA連接酶既可以連接黏性末端也可以連接平末端，而圖中①③均屬于平末端，只能用T4 DNA連接酶連接，D錯誤。]
8/9課后素養落實(十三)　基因工程的基本操作程序
(建議用時：40分鐘)
題組一　目的基因的獲取與基因表達載體的構建
1．下列不屬于獲取目的基因的方法是(　　)
A．從基因文庫中提取
B．利用PCR技術合成
C．利用DNA轉錄合成
D．利用化學方法人工合成
C　[可以從基因組文庫中獲取目的基因，A正確；可以利用PCR技術擴增目的基因，B正確；利用DNA轉錄合成的是RNA，不是基因，C錯誤；可以利用化學方法人工合成目的基因，D正確。]
2．在基因表達載體的構建中，下列說法不正確的是(　　)
A．基因表達載體的構建方法不完全相同
B．有了啟動子才能驅動基因轉錄出mRNA
C．終止子的作用是終止翻譯過程
D．基因表達載體的結構包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等
C　[因為受體細胞有植物、動物、微生物之分，且目的基因導入受體細胞的方法不同，因此，基因表達載體的構建方法是不完全相同的，A正確；啟動子是一段有特殊結構的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結合的部位，能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得所需要的蛋白質，B正確；終止子的作用是使轉錄在所需要的地方停止，終止密碼子的作用是使翻譯在所需要的地方停止，C錯誤；基因表達載體包括啟動子、終止子、目的基因、標記基因等，D正確。]
3.CTB是霍亂弧菌產生的腸毒素(蛋白質)結構的一部分，可用作針對霍亂弧菌的疫苗。研究人員提取了控制CTB合成的基因(ctb)，構建基因表達載體(如圖所示)，將其導入番茄，然后用轉基因番茄飼喂試驗小鼠，檢測疫苗的有效性。請回答相關問題：
(1)為了在短時間內獲得大量基因，可以采用________技術。與細胞內DNA復制時的解旋過程相比，該技術的DNA解鏈過程有何不同？_____________(寫出一點即可。)
(2)使用兩種限制酶切割載體可防止切開的載體的兩個末端重新連接起來，原因是_____________________________________________________。
(3)可采用________法將基因表達載體導入番茄細胞，然后在加入了________的培養基中進行初步篩選，之后還需用________技術檢測ctb基因是否整合到番茄染色體的DNA上。
(4)提取轉基因番茄不同部位的蛋白質進行檢測，發現只有果實中含有CTB。ctb基因只能在果實細胞中表達，這與基因表達載體中的________有關。
(5)用轉基因番茄果實飼喂試驗小鼠，若能在小鼠的血清中檢測到________，則說明該轉基因疫苗是有效的。
[答案]　(1)PCR　不需要解旋酶　(2)兩種限制酶切割載體可以產生不同的末端　(3)農桿菌轉化　卡那霉素　DNA分子雜交　(4)E8啟動子　(5)CTB抗體
題組二　將目的基因導入受體細胞及相關檢測與鑒定
4．(多選)采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導入目的基因的做法正確的是(　　)
A．將毒素蛋白注射到棉受精卵中
B．將編碼毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中
C．將編碼毒素蛋白的DNA序列，與質粒重組，導入細菌，用該細菌感染棉的體細胞，再進行組織培養
D．將編碼毒素蛋白的DNA序列，與細菌質粒重組，注射到棉的子房并進入受精卵
CD　[將毒素蛋白直接注射到棉受精卵中，棉受精卵沒有獲得目的基因，發育成的植株不會有抗蟲性狀，A錯誤；將編碼毒素蛋白的DNA序列，直接注射到棉受精卵中，而沒有將目的基因與運載體結合，目的基因將不能穩定存在，很容易被水解，不能培養出抗蟲棉，B錯誤；C項所述為用農桿菌轉化法將目的基因導入受體細胞，C正確；當受體細胞是植物細胞時，還可以利用花粉管通道法將目的基因導入受精卵中，然后發育為轉基因植株，D項所描述的類似于花粉管通道法，D正確。所以選CD。]
5．下列關于目的基因導入微生物細胞的敘述中，不正確的是(　　)
A．常用原核生物作為受體細胞，是因為原核生物繁殖快，且多為單細胞、遺傳物質相對較少
B．受體細胞所處的一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態稱為感受態
C．感受態細胞吸收DNA分子需要適宜的溫度和酸堿度
D．感受態細胞吸收重組表達載體DNA分子的液體只要調節為適宜的pH即可，沒必要用緩沖液
D　[由于原核生物具有繁殖快，且多為單細胞、遺傳物質相對較少等特點，所以早期的基因工程通常都用原核生物作為受體細胞；受體細胞經Ca2＋處理后，處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，稱為感受態；感受態細胞吸收DNA分子需要在適宜的溫度和酸堿度的緩沖液中完成。]
6．目的基因導入受體細胞后，是否可以穩定維持和表達其遺傳特性，只有通過鑒定與檢測才能知道。下列屬于目的基因檢測和鑒定的是(　　)
①檢測受體細胞中是否有目的基因
②檢測受體細胞中是否有致病基因
③檢測目的基因是否轉錄出了mRNA
④檢測目的基因是否翻譯成蛋白質
A．①②③ 　　　　 B．②③④
C．①③④ D．①②④
C　[目的基因的分子檢測包括三個方面：①檢測轉基因生物的DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了相應的mRNA，方法是使用基因探針與之雜交；③檢測目的基因是否翻譯成了相應的蛋白質，常用的方法是抗原—抗體雜交。]
7．基因工程中，受體細胞的不同，導入目的基因的方法也不同。請回答下列問題：
(1)農桿菌轉化法常用來將外源基因轉入________細胞，具體操作時，先要將目的基因插入農桿菌________質粒的T DNA中，然后用該農桿菌感染植物細胞。農桿菌在自然條件下，不容易感染____________植物。農桿菌侵染植物，能夠將目的基因插入植物細胞的________________上。
(2)將重組質粒導入動物細胞，常采用________的方法。若用重組質粒轉化大腸桿菌，一般情況下，不能直接用未處理的大腸桿菌作為受體細胞，原因是未處理的大腸桿菌吸收質粒(外源DNA)的能力極弱。所以，用表達載體轉化大腸桿菌時，常先用________處理大腸桿菌，使較多的細胞成為________細胞以利于表達載體的進入。
(3)目的基因導入受體細胞引起生物性狀的改變，屬于可遺傳變異中的________(變異類型)。
[解析]　(1)農桿菌轉化法常用來將外源基因轉入植物細胞，具體操作時，先要將目的基因插入農桿菌Ti質粒的T DNA中，然后用該農桿菌感染植物細胞。農桿菌在自然條件下，不容易感染單子葉植物。農桿菌侵染植物后，能夠將Ti質粒上的T DNA攜帶的目的基因插入植物細胞的染色體DNA上。
(2)將目的基因導入動物細胞最常用的方法是顯微注射法。若用重組質粒轉化大腸桿菌，一般情況下，不能直接用未處理的大腸桿菌作為受體細胞，原因是未處理的大腸桿菌吸收質粒(外源DNA)的能力極弱。所以，用表達載體轉化大腸桿菌時，常先用Ca2＋處理大腸桿菌，使較多的細胞成為感受態細胞以利于表達載體的進入。
(3)基因工程的原理為基因重組。
[答案]　(1)植物　Ti　單子葉　染色體DNA
(2)顯微注射　Ca2＋　感受態
(3)基因重組
題組三　DNA的粗提取與鑒定
8．下列關于DNA的粗提取與鑒定的敘述，錯誤的是(　　)
A．用同樣方法從等體積兔血和雞血中提取的DNA量相近
B．DNA析出過程中，攪拌操作要輕柔以防DNA斷裂
C．2 mol·L－1的NaCl溶液可用來粗提取DNA
D．用二苯胺試劑鑒定DNA需要進行沸水浴加熱
A　[兔屬于哺乳動物，其紅細胞沒有細胞核及各種細胞器，提取不到DNA，而雞屬于鳥類，其紅細胞內含有細胞核與各種細胞器，DNA含量較多，A錯誤；DNA分子從細胞中被釋放出來且除去蛋白后是非常容易斷裂的，如果太過劇烈的攪拌，DNA鏈可能會被破壞，因此輕柔攪拌的目的是為了獲得較完整的DNA分子，B正確；DNA在2 mol·L－1的NaCl溶液中溶解度較高，可用來溶解DNA，C正確；將析出的DNA溶解在2 mol·L－1的NaCl溶液中，加入二苯胺試劑后需要沸水浴加熱才會呈現藍色，D正確。]
9．下列有關“DNA的粗提取與鑒定”實驗的敘述，正確的是(　　)
A．新鮮豬血、菜花等動植物材料均可用于 DNA 的粗提取
B．植物材料的細胞壁不影響DNA的粗提取
C．DNA易溶于 2 mol·L－1 的 NaCl 溶液中
D．溶有 DNA 的 NaCl 溶液中加入二苯胺試劑后，顏色呈紫色
C　[豬是哺乳動物，其紅細胞沒有細胞核，所以豬血不能用于DNA的粗提取，A錯誤；細胞壁會對DNA的粗提取造成一定的阻礙，B錯誤；DNA可溶于2 mol·L－1的NaCl溶液，C正確；溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺試劑，需沸水浴加熱后冷卻，再觀察顏色(呈藍色)，D錯誤。]
10．如圖為“DNA的粗提取與鑒定”實驗的相關操作。已知DNA在0.14 mol·L－1的氯化鈉中溶解度最低；DNA不溶于酒精溶液，但細胞中的某些蛋白質溶于酒精?；卮鹣铝袉栴}：
(1)通過上述步驟得到濾液C后，向濾液中加入2 mol·L－1的NaCl溶液的目的是________________，再過濾得到濾液D，向濾液D中加入蒸餾水的目的是__________________。
(2)在“DNA的粗提取與鑒定”實驗中，將含有一定量雜質的DNA絲狀物分別放入體積為2 mL的4種溶液中，經攪拌后過濾，獲得下表所示的4種濾液，則含DNA最少的是濾液________，原因是_________________________________
______________________________________________________________。
序號 溶液 操作 濾液
1 圖中B的溶液 研磨攪拌后過濾 E
2 2 mol·L－1 NaCl溶液 攪拌后過濾 F
3 0.14 mol·L－1 NaCl溶液 攪拌后過濾 G
4 冷卻的95%的酒精溶液 攪拌后過濾 H
(3)DNA鑒定的原理是___________________________________________。
[解析]　(1)通過上述所示步驟得到濾液C后，再向濾液中加入2 mol·L－1的NaCl溶液，溶解DNA，過濾除去不溶于NaCl的雜質；向濾液D中加入蒸餾水的目的是降低DNA的溶解度，有利于DNA析出。
(2)由于DNA可以溶于氯化鈉溶液中，在2 mol·L－1的氯化鈉溶液中DNA的溶解度較高，攪拌過濾后，DNA存在于得到的濾液中；DNA在0.14 mol·L－1的氯化鈉溶液中溶解度最低，此時DNA會從溶液中析出，攪拌過濾后，得到的黏稠物主要就是DNA，濾液只含有少量DNA；由于DNA不溶于酒精，而其他雜質可以溶于酒精，因此放入冷卻的95%的酒精溶液中，DNA不溶于酒精，攪拌過濾后，DNA存在于黏稠物中，濾液中幾乎不含DNA，因此含DNA最少的是濾液H。
(3)DNA鑒定的原理：在沸水浴的條件下，DNA與二苯胺反應呈現藍色。
[答案]　(1)使DNA溶解　使DNA(溶解度下降而沉淀)析出　(2)H　DNA不溶于酒精　(3)在沸水浴條件下，DNA與二苯胺試劑反應呈現藍色
11．抗菌肽對治療癌癥有一定的作用，下圖表示抗菌肽合成過程。相關說法正確的是(　　)
A．用PCR克隆目的基因不需要DNA解旋酶
B．基因表達載體包含起始密碼和終止密碼
C．用顯微注射法導入基因表達載體
D．篩選菌種時用基因探針檢測相關蛋白質
A　[PCR技術中采用高溫變性，因此用PCR克隆目的基因不需要DNA解旋酶；基因表達載體包括啟動子和終止子，起始密碼和終止密碼在mRNA上；將基因表達載體導入酵母菌細胞時應用感受態細胞法；篩選菌種時用基因探針檢測相關基因或mRNA，不能用基因探針檢測蛋白質。]
12．番茄葉片受害蟲的損傷后，葉肉細胞迅速合成蛋白酶抑制劑，抑制害蟲的消化作用。人們嘗試將番茄的蛋白酶抑制劑基因導入玉米，以對付猖獗的玉米螟。下圖為培育轉基因抗蟲玉米的流程圖，下列描述正確的是(　　)
A．用限制性內切核酸酶切割番茄的DNA得到的產物就是蛋白酶抑制劑基因
B．用Ca2＋處理玉米受體細胞，有利于含目的基因的重組質粒導入
C．重組Ti質粒應有RNA聚合酶識別和結合的部位，以啟動蛋白酶抑制劑基因的轉錄
D．若將目的基因導入玉米花粉細胞，通過花藥離體培養可獲得穩定遺傳的轉基因玉米
C　[目的基因是用限制性內切核酸酶將DNA酶切后得到的，需篩選；Ca2＋用于處理細菌細胞；基因成功表達的前提是能轉錄和翻譯，轉錄時需RNA聚合酶識別轉錄的起點才能啟動；花藥離體培養得到的是玉米的單倍體，需再用秋水仙素處理單倍體，使染色體加倍才能得到穩定遺傳的轉基因玉米。]
13．大腸桿菌pUC18質粒是基因工程中常用的載體。某限制酶在此質粒上的唯一酶切位點位于LacZ基因中，如果沒有插入外源基因，LacZ基因便可表達出β 半乳糖苷酶。當培養基中含有IPTG和X gal時，X gal便會被β 半乳糖苷酶水解成藍色，大腸桿菌將形成藍色菌落。反之，則形成白色菌落。下圖表示利用此質粒實施基因工程的主要流程。請分析并回答下列問題：
(1)對已獲得的目的基因可利用________技術進行擴增。
(2)目的基因插入質粒構建重組質粒的過程中，需要DNA連接酶恢復________鍵。
(3)將試管Ⅰ中的物質和大腸桿菌共同置于試管Ⅱ的目的是________；大腸桿菌需事先用Ca2＋進行處理，目的是____________________________________
______________________________________________________________。
(4)將試管Ⅱ中的菌液接種于選擇培養基上培養，培養基中應含有大腸桿菌必需的營養物質____________________________和生長因子，還應加入IPTG、X gal以及氨芐青霉素，其中加入氨芐青霉素的作用是篩選出________________________________。
(5)若觀察到培養基上出現________色菌落，則說明大腸桿菌中已成功導入了重組質粒。如果作為受體細胞的大腸桿菌也含有LacZ基因，則不利于重組質粒的篩選，原因是___________________________________________________
_____________________________________________________________。
[答案]　(1)PCR　(2)磷酸二酯　(3)進行轉化　使大腸桿菌細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態　(4)碳源、氮源、無機鹽、水　導入pUC18質粒和重組質粒的大腸桿菌　(5)白　無論大腸桿菌中是否導入重組質粒，均會呈現藍色菌落，無法判斷導入的是原pUC18質粒還是重組質粒
混淆啟動子與起始密碼子，終止子與終止密碼子
14．下列有關人胰島素基因表達載體的敘述，正確的是(　　)
A．表達載體中的胰島素基因可通過人肝細胞mRNA逆轉錄獲得
B．表達載體的復制和胰島素基因的表達均啟動于復制原(起)點
C．借助抗生素抗性基因可將含胰島素基因的受體細胞篩選出來
D．啟動子和終止密碼子均在胰島素基因的轉錄中起作用
C　[由于基因的選擇性表達，在人的肝細胞中沒有胰島素基因轉錄的mRNA，所以表達載體中的胰島素基因不能通過人肝細胞mRNA逆轉錄獲得，A錯誤；表達載體的復制啟動于復制原(起)點，胰島素基因的表達啟動于啟動子，B錯誤；標記基因的作用是鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來，C正確；啟動子在胰島素基因的轉錄過程中起作用，終止密碼子在胰島素基因的翻譯過程中起作用，D錯誤。]
8/8第2課時　基因工程的基本操作程序
課標內容要求 核心素養對接
闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的獲取、基因表達載體的構建、目的基因導入受體細胞和目的基因及其表達產物的檢測鑒定等步驟。 科學思維：結合生產實例，說出基因工程的基本操作程序?？茖W探究：針對人類生產和生活的某一需求，小組合作探究，嘗試提出初步的基因工程構想，完成框架設計。
一、基因工程的基本操作程序
1．目的基因的獲取
(1)通過化學合成法直接人工合成目的基因
①對于比較小的目的基因，在明確脫氧核苷酸序列后，可以通過DNA合成儀直接人工合成。
②全基因或較大基因，使用半合成的方法可以降低成本。
(2)通過基因文庫獲取目的基因
①基因組文庫：是指含有某種生物體全部基因片段的重組DNA的克隆群體。
特點：受體菌群中的不同個體含有該種生物的不同基因拷貝，整個菌群所含有的基因拷貝便可能涵蓋了該生物的所有基因。
篩選方法：一般采用核酸探針雜交的方法。
②cDNA文庫：從組織細胞中提取mRNA，逆轉錄成cDNA，與適當載體連接后轉化宿主，這種包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細胞的cDNA文庫。
特點：含有某種生物的部分基因。
2．基因表達載體的構建
(1)目的：使目的基因進入受體細胞并有效表達，還要能穩定存在且遺傳給后代。
(2)基因表達載體的構成：目的基因、復制原點、啟動子、終止子和標記基因等。
3．將目的基因導入受體細胞
(1)將目的基因導入植物細胞
①方法：主要是農桿菌轉化法。
②原理：雙子葉植物或裸子植物受到損傷時，傷口處的細胞會分泌大量的酚類化合物，吸引農桿菌向傷口處移動。農桿菌含有Ti質粒，上面有一段轉移DNA(T DNA)，能進入受體細胞，并整合到受體細胞染色體DNA上。
③過程
將目的基因插到農桿菌Ti質粒的T DNA特定區段上→轉入農桿菌→侵染植物細胞→整合到受體細胞染色體的DNA上→目的基因穩定的遺傳和表達
(2)將目的基因導入動物細胞
①主要方法：顯微注射法。
②操作對象：受精卵。
③其他方法：也可用病毒DNA與目的基因一起構建的載體，去感染受體動物細胞。
(3)將目的基因導入微生物細胞
①方法：感受態細胞法。
②原理：經過適當處理(Ca2＋處理)后，細胞質膜對DNA的通透性會發生改變，細胞變得容易接受外來的DNA。
③過程
CaCl2溶液處理大腸桿菌→感受態細胞→重組的基因表達載體與感受態細胞混合→轉化→培養→篩選含目的基因的微生物
4．目的基因及其表達產物的檢測鑒定
(1)從DNA方面進行檢測
①方法：DNA分子雜交法。
②基因探針：用放射性同位素或熒光標記的已知DNA片段。
③原理：具有一定同源性的兩條DNA單鏈，在一定條件下可以按照堿基互補配對原則形成雙鏈。
(2)從RNA方面檢測受體細胞
①方法：分子雜交技術。
②操作：從待測轉基因生物細胞中提取mRNA分子，用已標記的目的基因片段作為探針與mRNA雜交，觀察是否出現雜交帶。
(3)從蛋白質方面進行檢測
①方法：抗原—抗體雜交。
②操作：從待測轉基因生物中提取蛋白質，再用相應的抗體進行抗原—抗體雜交，觀察是否出現雜交帶。
(4)從個體水平進行鑒定：檢測轉基因生物是否表現出目的基因控制的性狀。
二、DNA的粗提取和鑒定
1．DNA的粗提取
2．DNA的鑒定
判斷對錯(正確的打“√”，錯誤的打“×”)
1．基因組文庫含有某種生物體全部基因片段，cDNA文庫只包含某種生物體一部分的基因片段。 (　　)
[答案]　√
2．一般可采用豬血進行DNA的粗提取。 (　　)
×　提示：哺乳動物血液中DNA含量較低，不適宜作為DNA粗提取的材料。
3．基因表達載體中啟動子是DNA聚合酶識別和結合的部位。
(　　)
×　提示：啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位。
4．將重組表達載體導入動物受精卵常用顯微注射法。 (　　)
[答案]　√
5．轉基因抗蟲棉植株抗蟲效果的鑒定必須通過分子檢測才能達到目的。 (　　)
×　提示：抗蟲效果的鑒定要在個體生物學水平上做抗蟲接種實驗來鑒定。
6．可通過DNA分子雜交技術檢測棉花的染色體上是否插入了Bt基因。 (　　)
[答案]　√
　基因表達載體的構建
1．基因表達載體的構建過程
(1)用同一種限制酶或產生相同末端的限制酶切割含目的基因DNA和質粒，使其產生相同末端。
(2)將切下的目的基因片段與切開的質?；旌?，再加入適量DNA連接酶，使目的基因插入質粒的切口處，形成一個重組DNA分子(重組質粒)。構建過程如下圖所示：
2．限制酶的選擇策略
甲　　　　　　　　　乙
(1)根據目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類。
①應選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇Pst Ⅰ。
②不能選擇切點位于目的基因內部的限制酶，如圖甲不能選擇Sma Ⅰ。
③為避免目的基因和質粒的自身環化和反向連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ兩種限制酶(但要確保質粒上也有這兩種酶的切點)切割。
(2)根據質粒的特點確定限制酶的種類。
①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶相一致，以確保具有相同的黏性末端。
②質粒作為載體必須具有標記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構。
(3)在基因表達載體中，啟動子應位于目的基因的首端，終止子應位于目的基因的尾端，這樣目的基因才能表達，即酶切位點應位于啟動子與終止子之間。
合作探究：(1)如何區分啟動子、終止子、起始密碼子和終止密碼子？
提示：啟動子和終止子位于DNA上，是基因表達載體必需的部分，而起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，決定翻譯的開始和結束。
(2)下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖1、圖2中箭頭表示相關限制酶的酶切位點。請據圖回答下列問題：
限制酶 BamHⅠ HindⅢ EcoRⅠ Sma Ⅰ
識別序列及切割位點
圖1
圖2
①構建基因表達載體時，能否用Sma Ⅰ酶切割質粒？為什么？
提示：不能；因為Sma Ⅰ會破壞質粒的抗性基因。質粒上的抗性基因是標記基因，便于重組DNA分子的篩選，若被破壞，無法進一步篩選。
②與只使用EcoRⅠ相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理質粒、外源DNA的優點是什么？
提示：可以防止質粒和目的基因的自身環化以及目的基因與載體的反向連接。
1．在基因工程的操作過程中，獲得重組質粒不需要 (　　)
①DNA連接酶?、谙拗菩詢惹泻怂崦浮、跼NA聚合酶
④具有標記基因的質粒?、菽康幕颉、匏姆N脫氧核苷酸
A．③⑥ B．②④　　　
C．①⑤　　　 D．①②④
A　[構建重組質粒時，首先要用限制性內切核酸酶切割含有目的基因的DNA片段和質粒，其次需要用DNA連接酶將目的基因與質粒連接；RNA聚合酶催化轉錄過程，獲得重組質粒時不需要RNA聚合酶；獲得重組質粒時，需要具有標記基因的質粒作為載體；重組質粒是由目的基因與質粒形成的；四種脫氧核苷酸是合成DNA的原料，獲得重組質粒不需要四種脫氧核苷酸。]
2．下列有關抗蟲基因表達載體的敘述，正確的是(　　)
A．切割含抗蟲基因的DNA片段和載體必須用同一種限制酶
B．抗蟲基因表達載體中要有起始密碼子
C．抗蟲基因表達載體必須具備標記基因，其作用是篩選含有目的基因的受體細胞
D．抗蟲基因的表達開始于復制原點
C　[切割含抗蟲基因的DNA片段和載體可以用不同的限制酶，只要切割出的末端相同即可，A項錯誤；抗蟲基因表達載體的構建必須具備啟動子和終止子，起始密碼子位于mRNA上，B項錯誤；基因表達載體必須具備標記基因，其作用是檢測目的基因是否導入到受體細胞中，從而將含有目的基因的受體細胞篩選出來，C項正確；抗蟲基因的表達開始于啟動子，D項錯誤。]
3．圖甲、圖乙分別表示質粒和外源DNA，其中箭頭表示相關限制酶的酶切位點，下列敘述正確的是(　　)
圖甲
圖乙
A．用質粒和外源DNA構建重組質粒過程中，不能使用Sma Ⅰ切割
B．圖甲所示的質粒分子在經Sma Ⅰ酶切割后含有4個游離的磷酸基團
C．為獲取重組質粒，將切割后的質粒與目的基因片段混合，并加入DNA聚合酶
D．用EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ和BamHⅠ中的任意一種酶切割質粒和外源基因都可以
A　[據圖分析，質粒中，Sma Ⅰ的切割位點位于標記基因(抗生素抗性基因)上，在外源DNA分子中，Sma Ⅰ的切割位點位于目的基因上，因此用質粒和外源DNA構建重組質粒過程中，不能使用Sma Ⅰ切割，A正確；圖甲所示的質粒分子只有一個Sma Ⅰ切割位點，所以在經Sma Ⅰ酶切割后含有2個游離的磷酸基團，B錯誤；為獲取重組質粒，將切割后的質粒與目的基因片段混合，并加入DNA連接酶，C錯誤；只使用EcoR Ⅰ，則質粒和目的基因兩端的黏性末端相同，用DNA連接酶連接時，會產生質粒和目的基因自身連接物，而利用BamH Ⅰ或HindⅢ剪切時，在目的基因上只有一個酶切位點，因此不能切割目的基因，D錯誤。]
　將目的基因導入受體細胞
1．目的基因導入受體細胞的方法
受體細胞類型 方法 說明 特點
植物細胞 農桿菌轉化法 將目的基因插入農桿菌Ti質粒的T DNA上→轉入農桿菌→用農桿菌侵染植物細胞→將目的基因整合到植物細胞染色體的DNA上→目的基因表達 經濟、有效，適用于雙子葉植物和裸子植物，尤其適用于雙子葉植物
花粉管通道法 在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭→滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞→目的基因表達 簡便、經濟，我國科學家獨創的一種方法
動物細胞 顯微注射技術　　 將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→注射了目的基因的受精卵，經胚胎早期培養后，移植到雌性動物的輸卵管或子宮內→獲得具有新性狀的動物 將目的基因導入動物細胞最為有效的方法
微生物細胞 Ca2＋處理法(感受態細胞法) 用Ca2＋處理微生物細胞→感受態細胞→將基因表達載體與感受態細胞混合→在一定溫度下促進感受態細胞吸收DNA分子 簡便、經濟、有效
2．農桿菌轉化法分析
(1)構建攜帶目的基因的表達載體，需要兩種工具酶：限制酶和DNA連接酶。
(2)基因表達載體(重組質粒)導入農桿菌細胞時，要用Ca2＋處理農桿菌細胞，使其處于感受態，利于重組質粒的導入。
(3)由導入目的基因的受體細胞培育到完整的植株要用到植物組織培養技術。
合作探究：(1)農桿菌轉化法是將目的基因導入雙子葉植物和裸子植物的一種方法，原因是雙子葉植物和裸子植物能夠產生一種吸引農桿菌的化學物質，而單子葉植物不能產生這種物質，能不能利用農桿菌轉化法將目的基因導入單子葉植物？說明原因。
提示：能，可從雙子葉植物中提取該化合物，再用該化合物處理單子葉植物細胞，然后就可用農桿菌轉化法將目的基因導入單子葉植物細胞。
(2)將目的基因導入動物細胞的受體細胞除了受精卵外，還可以選擇什么細胞？
提示：還可以將目的基因導入胚胎干細胞，因為胚胎干細胞也能發育成動物體。
1．下列關于目的基因導入受體細胞的描述，不正確的是(　　)
A．培育“黃金大米”可用花粉管通道法導入目的基因
B．顯微注射技術是轉基因動物中采用最多的方法
C．目的基因導入大腸桿菌最常用的方法是Ca2＋處理法
D．農桿菌轉化法是將目的基因導入植物細胞最常用的方法
A　[水稻的花很小，不適合用花粉管通道法導入目的基因，A錯誤；將目的基因導入動物細胞常用顯微注射法，B正確；將目的基因導入微生物細胞最常用的方法是用Ca2＋處理大腸桿菌，使其處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的狀態，C正確；將目的基因導入植物細胞最常用的方法是農桿菌轉化法，此外還有基因槍法和花粉管通道法，D正確。]
2．農桿菌侵染植物細胞后，能將Ti質粒上的T DNA插入植物基因組中。圖示為利用農桿菌培育轉基因植物的基本流程，請據圖回答：
(1)剪除Ti質粒的某些片段、替換復制原點O與添加抗生素的抗性基因T的過程①中，需用多種限制酶處理，原因是______________________________，需用________“縫合”雙鏈DNA片段的平末端。
(2)目的基因是指________________。由過程②形成的基因表達載體中，目的基因的上游具有________，它是________識別和結合的部位。
(3)過程③常用________處理使農桿菌成為感受態細胞?？股乜剐曰騎的作用是________________________________。
(4)可通過________技術檢測試管苗的染色體DNA上是否插入了目的基因。
[解析]　(1)Ti質粒有多種限制酶切割位點，不同的限制酶識別并切割不同的堿基序列。連接平末端應選用T4 DNA連接酶。
(2)目的基因主要是指編碼蛋白質的基因。目的基因的首端具有啟動子，以便于RNA聚合酶識別和結合。
(3)過程③常采用Ca2＋(CaCl2溶液)處理農桿菌，以增大農桿菌細胞壁的通透性?？股乜剐曰騎用于檢測受體細胞中是否含有基因表達載體。
(4)檢測農桿菌和愈傷組織細胞中是否有目的基因常采用DNA分子雜交技術。
[答案]　(1)不同的限制酶識別并切割不同的堿基序列T4 DNA連接酶
(2)編碼蛋白質的基因　啟動子　RNA聚合酶
(3)Ca2＋(CaCl2溶液)　鑒定和篩選導入了基因表達載體的農桿菌
(4)DNA分子雜交
[課堂小結]
知 識 網 絡 構 建 核 心 語 句 背 誦
1.基因工程的基本操作程序包括目的基因的獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞，以及目的基因及其表達產物的檢測鑒定等步驟。2.基因組文庫是指含有某種生物體全部基因片段的重組DNA的克隆群體。從組織細胞中提取mRNA，逆轉錄成cDNA，與適當載體連接后，轉化宿主，這種包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細胞的cDNA文庫。3.構建基因表達載體不僅要使目的基因進入受體細胞并有效表達，還要能穩定存在且遺傳給后代?；虮磉_載體除了目的基因外，還應該包括復制原點、啟動子、終止子和標記基因等。4.農桿菌Ti質粒上的可轉移DNA(T DNA)能進入受體細胞并整合到受體細胞染色體DNA上。5.基因導入受體后，能否有效表達需從DNA方面、RNA方面、蛋白質方面、個體水平對生物的特定性狀進行篩選和鑒定。6.在酸性條件下，DNA與二苯胺發生反應，溶液呈藍色。
1．基因工程主要操作步驟的順序是(　　)
①基因表達載體的構建　②將目的基因導入受體細胞?、勰康幕蚣捌浔磉_產物的檢測與鑒定?、苣康幕虻墨@取
A．③②④①　B．②④①③　C．④①②③　D．③④①②
C　[基因工程的主要操作步驟順序是：目的基因的獲取→基因表達載體的構建→將目的基因導入受體細胞→目的基因及其表達產物的檢測和鑒定。]
2．右圖為基因表達載體的模式圖，下列有關基因工程中載體的說法錯誤的是(　　)
A．基因表達載體的構建是在生物體外完成的
B．任何基因表達載體的構建都是一樣的，沒有差別
C．圖中啟動子位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結合的部位
D．抗生素抗性基因的作用是作為標記基因，用于鑒別受體細胞中是否導入了目的基因
B　[由于受體細胞有植物、動物和微生物之分，以及目的基因導入受體細胞的方式不同，所以基因表達載體的構建也會有所差別，不可能千篇一律。]
3．下圖是利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖。下列相關敘述正確的是(　　)
A．②的構建需要限制性內切核酸酶和DNA聚合酶參與
B．③侵染植物細胞后，重組Ti質粒整合到④的染色體上
C．④的染色體上若含抗蟲基因，則⑤就表現出抗蟲性狀
D．⑤只要表現出抗蟲性狀就表明植株發生了可遺傳變異
D　[重組質粒的構建需要限制性內切核酸酶和DNA連接酶參與，DNA聚合酶一般用于DNA復制過程，A錯誤；③侵染植物細胞后，重組Ti質粒上的T DNA整合到植物細胞的染色體上，B錯誤；如果受體細胞的染色體上含抗蟲基因，只能說明抗蟲基因成功整合到受體細胞的染色體上，不代表該基因就一定能表達成功，因此不能確定⑤是否表現出抗蟲性狀，C錯誤；⑤只要表現出抗蟲性狀就表明植株發生了可遺傳變異，D正確。]
4．利用外源基因在受體細胞中表達可生產人類所需的產品。下列選項中能說明目的基因完成表達的是(　　)
A．棉花細胞中檢測到載體上的標記基因
B．山羊乳腺細胞中檢測到人的生長激素基因
C．大腸桿菌中檢測到人的胰島素基因轉錄出的mRNA
D．酵母菌細胞中提取到人的干擾素
D　[目的基因完成表達是指目的基因在細胞中合成相應的蛋白質，在酵母菌細胞中提取到人的干擾素，說明導入酵母菌中的人的干擾素基因完成了表達。]
5．下列關于DNA粗提取與鑒定說法錯誤的是(　　)
A．檸檬酸鈉溶液可防止血液凝固
B．加蒸餾水是為了讓雞血細胞破裂
C．在2 mol·L－1 NaCl溶液中DNA會析出
D．酸性條件下二苯胺與DNA反應呈藍色
C　[在2 mol·L－1 NaCl溶液中，DNA溶解度較高，不會析出，C錯誤。]
6．下圖是將某細菌的基因A導入大腸桿菌內制備“工程菌”的示意圖。
據圖回答：
(1)獲得A有兩條途徑：一是以A的mRNA為模板，在________酶的催化下，合成互補的單鏈DNA，然后在________的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需基因；二是根據目標蛋白質的________序列，推測出相應的mRNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測其DNA的________序列，再通過化學方法合成所需基因。
(2)利用PCR技術擴增DNA時，需要在反應體系中添加的有機物質有________、________、4種脫氧核糖核苷三磷酸和耐高溫的DNA聚合酶，擴增過程可以在PCR擴增儀中完成。
(3)由A和載體B拼接形成的C通常稱為________。
(4)在基因工程中，常用Ca2＋處理D，其目的是________________________
______________________________________________________________。
[解析]　(1)利用逆轉錄法合成目的基因的過程是：以mRNA為模板，在逆轉錄酶的催化作用下合成單鏈DNA，然后在DNA聚合酶作用下，合成雙鏈DNA分子；根據蛋白質工程合成目的基因的過程是：根據目標蛋白質的氨基酸序列，推測出相應的mRNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測DNA中脫氧核苷酸的排列順序，通過化學方法合成。(2)PCR過程中需要酶、底物、模板、引物和能量等條件。(3)目的基因和載體結合，形成基因表達載體。(4)在利用大腸桿菌作受體細胞時，需要先用Ca2＋處理，使其處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的狀態。
[答案]　(1)逆轉錄　DNA聚合酶　氨基酸　脫氧核苷酸　(2)引物　模板(A基因)　(3)基因表達載體　(4)使其處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的狀態
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