資源簡介

主題：基因工程的應用——利用CRISPR/Cas9技術培育高抗性淀粉水稻
一、教學目標 1、閱讀資料理解CRISPR/Cas9的原理，并嘗試應用CRISPR/Cas9解決實際問題。 2、通過應用基因工程的知識，培養學生實驗設計、結果分析，演繹推理和創造性思維等科學思維能力。 3、激發對前沿科學發展的興趣，通過課下作業培養學生發散性思維。 二、教學重難點 重點： 1、了解CRISPR/Cas9的過程 2、應用基因工程的操作解決實際問題 難點： 1、設計靶向SBEⅠg RNA的方案 2、設計檢測導入水稻細胞的CRISPR/Cas9系統誘發SBE基因突變的方法
三、教學過程
教學階 段 教師活動 學生活動 設計意圖
引入 通過一種適合糖尿病人食用的“米抗兒”低GI值大米引入抗性淀粉的概念。并通過淀粉代謝過程，讓學生分析如何通過控制酶的活性提高水稻中抗性淀粉的含量。 讓學生閱讀資料理解CRISPR/Cas9，講解CRISPR/Cas9的原理，并說明可運用CRISPR/Cas9引起SBE基因的突變，從而改變SBE酶的功能。 感悟培育高抗性淀粉水稻的意義，并分析如何提高水稻的抗性淀粉含量。 通過閱讀了解CRISPR/Cas9的原理，理解CRISPR/Cas9如何誘導特定基因產生突變。 創設真實情境， 啟發學生的學習興趣。引導學生理解CRISPR/Cas9的原理。
將CRISPR/Cas9系統導入水稻細胞 3.提出問題。 自然界中的水稻存在CRISPR/Cas9系統嗎？ 基因工程的四步程序分別是什么？ 為了導入CRISPR/Cas9系統需要獲取哪些基因？ 如何從SBEＩ和SBEＩＩ基因的編碼區序列中篩選靶點序列呢？ 回顧基因工程所學知識，運用剛剛學習的資料中的信息解決問題。 引導學生將CRISPR/Cas9與基因工程相結合運用，并學會從資料中獲取信息。
目的基因的獲取——設計SBEⅠgRNA 4、引導學生結合資料第三段，設計一個可以編碼SBEⅠgRNA的DNA片段 提出要求（①可以重組到載體上②編碼SBEⅠgRNA的基因能夠正常表達）并介紹所給質粒。 分析、討論并分享。完成對可編碼SBEⅠgRNA的DNA片段的設計。 引導學生運用資料、并通過討論設計DNA片段，從而進一步理解gRNA的結構以及復習運用學過的基因工程相關知識。
基因表達載體的構建及導入受體細胞 5、通過問題引導學生回憶基因表達載體的構建的過程。 基因表達載體的構建需要應用哪兩種工具酶？ 如何從導入DNA混合物的受體菌中篩選出導入重組質粒的受體菌？ 展示：PCR電泳圖像，讓學生分析結果。 6、通過問題引導學生思考將目的基因導入受體細胞的方法。 依據使用的載體用什么方法將目的基因導入受體細胞中？ 導入的受體細胞是誰的細胞？可以使用什么細胞？ 回憶所學的基因工程基本操作的知識，運用知識解決真實情景中的問題。 引導學生分析、思考運用學過的知識解決實際問題，加深對基因工程基本操作的知識理解。
檢測導入水稻細胞中的CRISPR/Cas9系統的效果 7、引導學生分析思考檢測導入水稻細胞中的CRISPR/Cas9系統效果的方法。 什么體現了CRISPR/Cas9系統的效果？ 可以從什么層面進行效果檢測？ Cas9會切割雙鏈DNA的特定部位和DNA產生突變的部位有什么關系？ 如何從分子層面檢驗SBE基因有無發生突變？ 展示：真實研究中的檢測數據，并讓學生分析并得出結論。 思考、討論設計檢測導入水稻細胞的CRISPR/Cas9系統誘發SBE基因突變的方法。分析數據得出結論。 引導學生分析、思考、設計檢驗CRISPR/Cas9系統效果的方法。鍛煉學生分析數據得出結論的能力。
對CRISPR/Cas技術的展望 8、介紹CRISPR/Cas9其他方面的應用 最后介紹如果改變Cas9酶的切割作用，CRISPR/Cas系統還可以發展出其他方面的應用如單堿基編輯技術、活體成像技術，介紹原理。 布置課后作業：讓學生去查找CRISPR/Cas系統的其他應用。 思考、理解 引導學生關注CRISPR/Cas技術的應用，鍛煉學生查找資料和發散思維的能力。
四、板書設計
培育培育高抗性淀粉水稻 ——利用CRISPR/Cas9 gRNA+含有Cas9基因的Ti質粒 構建基因表達載體 農桿菌 導入受體細胞 檢測CRISPR/Cas9的效果：酶切、測序 檢測淀粉含量
五、學習資料
資料：
1987年，科學家發現大腸桿菌基因組DNA中有一些重復結構：一段29個堿基的序列反復出現了多次，兩兩之間都被32個堿基形成的看似無規律的間隔序列隔開，這種重復結構被命名為CRISPR（圖1）。進一步研究發現，多種細菌均有CRISPR結構，且很多間隔序列與入侵細菌的一些噬菌體基因組序列一致。法國科學家在2007年證明了CRISPR-Cas9是一種細菌獲得性免疫系統，細菌通過對入侵的外源 DNA 進行特異性識別，利用Cas9對外源DNA進行剪切，從而達到對自身的免疫作用。Cas9對DNA的特異性識別需要依賴一種特殊的RNA——guide RNA(gRNA)（圖2）。
如圖3所示，在細菌中gRNA由兩部分組成，一部分是CRISPR序列中的一段間隔序列與部分重復序列轉錄形成的crRNA，它可以與外源DNA上的靶序列互補配對，還可以和gRNA的另一部分具有支架功能的trans activating crRNA （tracrRNA)部分堿基互補配對從而形成具有部分雙鏈結構的gRNA，在細胞內gRNA與Cas9蛋白結合形成Cas9復合體。
根據細菌中gRNA的生成過程，科學家成功優化設計出可以在其他生物中定向切割某一目標基因的人工構建編碼gRNA基因的方法，由人工設計的Cas9結合所必需的支架序列(gRNA scaffold)以及約20個核苷酸的靶點序列（Target）組成，轉錄后的gRNA既可以與Cas9蛋白結合又可以識別靶點序列，從而對某個特定基因進行切割。
科學家基于此，構建了對DNA序列進行定點切割的CRISPR/Cas9基因編輯技術，并將其廣泛應用于各種生物中。將編碼Cas9蛋白和gRNA的基因作為目的基因，構建基因表達載體后導入受體細胞，可對細胞內某個基因定點切割，形成DNA的雙鏈斷裂，通常情況下，會觸發細胞高效的非同源末端連接方式，從而導致堿基插入或缺失，引發被切割部位的.

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