資源簡介

2.1基因工程的基本操作程序
學習目標
1、概括基因工程的原理和基本操作程序。
2、闡明PCR的原理，說出PCR反應所需的條件和PCR反應的過程。
3、列舉將目的基因導入植物細胞、動物細胞和微生物細胞的方法。
4、針對人類生產或生活中的某一需求，選取適當的基因工程的技術和方法，嘗試設計獲得某一轉基因產品的方案。
基礎梳理
（一）目的基因的篩選與獲取
1. 概念：用于改變___________________或獲得____________________等的基因。
2. 實例：培養轉基因抗蟲棉用到的目的基因是____________________。
3. 篩選合適的目的基因
（1）較為有效的方法：從相關的__________________和________________的基因中進行篩選。
（2）實例：在培育轉基因抗蟲棉之前，科學家不僅掌握了Bt基因的序列信息，也對Bt基因的表達產物___________________有了較為深入的了解。
（3）認識基因結構和功能的技術方法：____________________技術、遺傳序列數據庫、_______________________工具。
4. 利用PCR獲取和擴增目的基因
（1）PCR的含義：PCR是______________________的縮寫，它是一項根據______________
________的原理，在體外提供________________的各種組分與反應條件，對_____________
_____________________進行大量復制的技術。
（2）條件：DNA模板、分別與兩條模板鏈結合的2種______________、四種_____________
_______、______________________________。
（3）引物是一小段能與________________的一段堿基序列________________的短單鏈核酸。用于PCR的引物長度通常為20~ 30個核苷酸。
（4）PCR反應的過程：
①變性：溫度上升到90 ℃以上，目的基因DNA_______________________________。
②復性：溫度下降到50 ℃左右時，_________________通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。
③溫度上升到72 ℃左右時，溶液中_________________在耐高溫的_____________________
_________________的作用下加到引物的________端合成子鏈。
④重復循環多次。
（二）基因表達載體的構建
1. 基因表達載體是載體的一種，除______________、標記基因外，還必須有啟動子、終止子等。
2. 啟動子是一段有特殊序列結構的_______________，位于基因的上游，緊挨轉錄的起始位點，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終表達出人類需要的蛋白質。
3. 終止子相當于一盞紅色信號燈，使轉錄在所需要的地方停下來，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列結構的_________________。
4. 過程：首先用一定的__________________切割載體，使它出現一個切口，然后用_______________限制酶或_______________________的限制酶切割目的基因的DNA片段，再利用______________________將目的基因片段拼接到載體的切口處。
（三）將目的基因導入受體細胞
1. 轉化：目的基因進入受體細胞內，并在受體細胞內___________和_________________的過程。
2. 目的基因導入受體細胞的方法
（1）將目的基因導入植物細胞的方法有________________、_________________等。
（2）將目的基因導入動物受精卵的常用方法有_____________等。
（3）將目的基因導入大腸桿菌的方法：用__________處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，然后將重組表達載體導入其中。
（四）目的基因的檢測與鑒定
1. 分子水平的檢測
（1）通過_________________等技術檢測受體細胞染色體DNA上是否插入了目的基因或檢測目的基因是否轉錄出mRNA。
（2）從轉基因生物中提取蛋白質用相應的抗體進行__________________雜交，檢測目的基因是否翻譯成了蛋白質。
2. 個體水平的鑒定
隨堂訓練
1.下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是( )
①從基因文庫中獲取目的基因
②利用PCR技術擴增目的基因
③逆轉錄法
④通過DNA合成儀利用化學方法人工合成
A.①②③④ B.①②③ C.①②④ D.②③
2.實驗室常用PCR技術對DNA進行體外擴增，下列相關敘述正確的是( )
A.需要解旋酶和耐高溫的DNA聚合酶 B.反應過程包括變性→復性→延伸
C.95℃時DNA的磷酸二酯鍵斷開 D.引物與模板結合后向5′端方向延伸DNA鏈
3.下列關于基因表達載體的說法不正確的是( )
A.基因表達載體的構建是基因工程的核心步驟
B.基因表達載體包含啟動子、目的基因、終止子、標記基因等
C.終止子位于目的基因的尾端，能夠終止翻譯過程
D.不同的目的基因所需的啟動子不一定相同
4.科研人員通過PCR技術獲得肝細胞特異性啟動子——白蛋白啟動子，將該啟動子與Cre重組酶基因結合構建表達載體，培育出在肝細胞特異性表達Cre重組酶的轉基因小鼠。下列敘述正確的是( )
A.將該表達載體導入肝細胞以獲得轉基因小鼠
B.利用PCR技術獲得白蛋白啟動子需設計特異性的引物
C.構建該表達載體需要限制酶和DNA聚合酶
D.通過核酸分子雜交技術檢測目的基因是否完成表達
5.利用農桿菌轉化法，將含有基因修飾系統的T-DNA插入到水稻細胞M的某條染色體上，在該修飾系統的作用下，一個DNA分子單鏈上的一個C脫去氨基變為U，脫氨基過程在細胞M中只發生一次。將細胞M培育成植株N。下列說法錯誤的是( )
A.N的每一個細胞中都含有T-DNA
B.N自交，子一代中含T-DNA的植株占3/4
C.M經n（n≥1）次有絲分裂后，脫氨基位點為A—U的細胞占1/2n
D.M經3次有絲分裂后，含T-DNA且脫氨基位點為A—T的細胞占1/2
6.土壤農桿菌中含有Ti質粒，在侵染植物細胞的過程中，Ti質粒上的T-DNA片段可整合到植物細胞中的染色體DNA上。若想用基因工程手段獲取抗旱植株，以下分析不合理的是( )
A.若用Ti質粒作為抗旱基因的載體，目的基因的插入位置應該在T-DNA片段內
B.將重組Ti質粒導入土壤農桿菌中時，可以先用鈣離子處理農桿菌
C.用含有重組Ti質粒的土壤農桿菌感染植物細胞后，可通過植物組織培養技術得到具有抗旱基因的植物
D.若能在植物細胞中檢測到抗旱基因，則說明該基因工程項目獲得成功
7.導致新冠肺炎的病原體是“2019—nCoV”病毒，該病毒為RNA病毒，其序列中具有RNA聚合酶基因，無逆轉錄酶基因。快速準確的檢測對疫情防控起著至關重要的作用。病毒的檢測方法有：①用“新冠病毒核酸檢測試劑盒”，檢測病毒的遺傳物質RNA；②特異性抗原蛋白檢測，即檢測病毒表面的一種糖蛋白；③特異性抗體檢測，即檢測感染者體內通過免疫反應所產生的某種抗體。下列有關說法不正確的是( )
A.方法①②③都需要從患者體內采集病毒樣本
B.方法②③都需要用到抗原—抗體雜交的方法
C.某人有可能①②為陽性③為陰性，也可能③為陽性①②為陰性
D.由于RNA相比DNA穩定性差，往往將病毒樣本的RNA反轉錄成cDNA，擴增之后進行分段測序，在該過程中需要用到的酶有逆轉錄酶、DNA聚合酶
答案
1.答案：D
解析：從基因文庫中獲取目的基因不需要模板鏈，①錯誤；利用PCR技術擴增目的基因需要模板鏈，②正確；反轉錄法合成目的基因需要模板鏈，③正確；通過DNA合成儀利用化學方法人工合成目的基因不需要模板鏈，④錯誤。故D正確。
2.答案：B
解析：PCR技術通過高溫解旋，不需要解旋酶，A錯誤；反應過程包括變性→復性→延伸，B正確；95 ℃時DNA雙鏈間的氫鍵斷開，C錯誤；引物與模板結合后向引物的3′端方向延伸DNA鏈，D錯誤。
3.答案：C
解析：基因表達載體的構建是基因工程的核心步驟，A正確；基因表達載體包含啟動子、終止子、目的基因、標記基因等，其中終止子位于目的基因的下游，能夠終止轉錄過程，B正確、C錯誤；不同的目的基因具有不同的核苷酸序列，其啟動子也不盡相同，D正確。
4.答案：B
解析：將表達載體導入肝細胞無法獲得轉基因小鼠個體，應將表達載體導入受精卵，后者可以發育成新的個體，A選項錯誤；根據堿基互補配對原則，需設計特異性引物才能通過PCR獲得白蛋白啟動子，B選項正確；構建該表達載體需要限制酶和DNA鏈接酶，不需要DNA聚合酶，C選項錯誤；通過核酸分子雜交技術只能檢測目的基因是否轉入(運用DNA—DNA分子雜交技術)以及目的基因是否轉錄(運用DNA—RNA 分子雜交技術)，檢測是否表達，是要檢測蛋白質，需要用抗原—抗體雜交技術，D選項錯誤。
5.答案：D
解析：植株N是由細胞M形成的，在形成過程中沒有DNA的丟失，由于T-DNA插入到水稻細胞M的某條染色體上，所以細胞M含有T-DNA，因此植株N的每一個細胞中都含有T-DNA，A項正確。植株N的一條染色體中含有T-DNA，可以記為+，因此植株N的基因型記為+-，若自交，則子代中相關的基因型為++：+-：--=1:2:1，有3/4的植株含T-DNA，B項正確。細胞M中只有1個DNA分子的單鏈上的一個C脫去氨基變為U，所以復制n次后，產生的子細胞有2n個，但脫氨基位點為A—U的細胞的只有1個，所以這種細胞的比例為1/2n，C項正確。細胞M經3次有絲分裂后，形成的子細胞有8個，由于細胞M的DNA分子單鏈上的一個C脫去氨基變為U，所以是G和U配對，復制3次后，有4個細胞脫氨基位點為C—G，3個細胞脫氨基位點為A—T，1個細胞脫氨基位點為U—A，因此含T-DNA且脫氨基位點為A—T的細胞占3/8，D項錯誤。
6.答案：D
解析：土壤農桿菌中含有Ti質粒，在侵染植物細胞的過程中，Ti質粒上的T-DNA片段可整合到植物細胞中的染色體DNA上，所以若用Ti質粒作為抗旱基因的載體，目的基因的插入位置應該在T-DNA片段內，A正確；將重組Ti質粒導入土壤農桿菌時，可先用鈣離子處理農桿菌，使其處于能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，B正確；用含有重組Ti質粒的土壤農桿菌去感染植物細胞，使其具有抗旱基因，然后再通過植物組織培養技術將受體細胞培養成具有抗旱基因的植物，C正確；能夠在植物細胞中檢測到抗旱基因，只能說明目的基因導入成功，不能說明該基因成功表達，即不能說明該基因工程項目獲得成功，D錯誤。
7.答案：A
解析：2019—nCoV病毒為RNA病毒，具有RNA聚合酶基因，無逆轉錄基因，其RNA首先侵入機體，然后經過復制過程并指導相關蛋白質合成，進而完成病毒自身的增殖過程，同時杋體產生相應的抗體，抗體的產生的快慢可能會因人而異，據此推測：RNA檢測和抗原蛋白檢測需要從患者體內采集病毒樣本，而檢測抗體不需要采集病毒樣本，A錯誤；方法②③都是檢測蛋白質，都需要用到抗原一抗體雜交的方法，B正確；某人有可能①②為陽性③為陰性，即感染了新冠病毒但還未產生抗體，也可能③為陽性①②為陰性，即抗體陽性，因感染該病毒但痊愈或注射疫苗產生了抗體，C正確；由于RNA相比DNA穩定性差，往往將病毒樣本的RNA反轉錄成cDNA，該過程中需要用到的酶有逆轉錄酶、DNA聚合酶，D正確。

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