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【備考2023】高中生物新教材一輪復習學案
第37講　基因工程
[素養(yǎng)目標]
1．運用結(jié)構(gòu)與功能觀，理解基因工程原理、技術(shù)和應用。(生命觀念)
2．從基因工程誕生的歷程中，體會科學發(fā)展的曲折性和必然性。(科學思維)
3．理清DNA的粗提取與鑒定的原理及操作流程。(科學探究)
　重組DNA技術(shù)的基本工具
1．基因工程的概念
(1)手段：按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性。
(2)目的：創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。
(3)水平：分子水平。
(4)基礎(chǔ)：生物化學、分子生物學和微生物學等學科。
2．基因工程的基本工具
(1)限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”
(2)DNA連接酶——“分子縫合針”
(3)基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”
①作用：將外源基因送入受體細胞中。
②種類：質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒等。
③條件：
a．具有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA片段插入其中。
b．能在受體細胞中進行自我復制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復制。
c．具有標記基因，便于重組DNA分子的篩選。
1．(選擇性必修3 P70圖3 1)重組DNA技術(shù)所需要的工具酶有限制酶、DNA連接酶和載體。(×)
2．(選擇性必修3 P71正文)切割質(zhì)粒的限制性內(nèi)切核酸酶均能特異性地識別6個核苷酸序列。(×)
3．(選擇性必修3 P72“旁欄思考”)DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事。(×)
4．(選擇性必修3 P72正文)DNA連接酶可以連接目的基因與載體的氫鍵，形成重組DNA。(×)
5．(選擇性必修3 P72正文)載體質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選的標記基因。(×)
1．選擇性必修3 P71“旁欄思考”：根據(jù)所掌握的知識，推測限制酶存在于原核生物中的主要作用是____________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制。限制酶就是它的一種防御性工具。當外源DNA入侵時，它會利用限制酶來切割外源DNA，使之失效，以保證自身的安全
2．選擇性必修3 P74“拓展應用1”：限制酶不切割細菌本身的DNA分子是因為________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
提示：含有某種限制酶的細胞的DNA分子或者不具備這種限制酶的識別序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到了限制酶所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開
3．選擇性必修3 P72正文拓展：天然的DNA分子是否可以直接用作基因工程載體？為什么？
提示：不可以。具有能自我復制、有一個或多個限制酶切割位點、有標記基因及對受體細胞無害等特點的DNA分子才可以直接用作基因工程的載體。實際上天然的DNA分子一般不完全具備上述條件，往往需要進行人工改造后才能用于基因工程操作。
1．基因工程的理論基礎(chǔ)[科學思維]
2．與DNA有關(guān)的幾種酶的比較[生命觀念]
3．標記基因的作用[科學思維]
標記基因可用于檢測目的基因是否導入受體細胞：
[探究意圖：以限制酶的功能為情境信息考查理解能力]
如圖表示兩種限制酶識別DNA分子的特定序列，并在特定位點對DNA分子進行切割的示意圖，請回答以下問題：
(1)EcoRⅠ和HpaⅠ的識別序列和識別位點分別是什么？產(chǎn)生的末端分別是哪種類型？
提示：EcoRⅠ限制酶的識別序列是-GAATTC-，切割位點在G、A之間，切斷磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的是黏性末端，HpaⅠ限制酶的識別序列是-GTTAAC-，切割位點在T、A之間，切斷磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的是平末端。
(2)DNA連接酶有哪兩種？來源有什么不同？作用有什么不同？
提示：DNA連接酶有兩種，即E.coli DNA連接酶和T4 DNA連接酶。前者來源于大腸桿菌，后者是從T4噬菌體中分離出來的。E.coli DNA連接酶只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間連接起來，不能將雙鏈DNA片段平末端之間進行連接。而T4 DNA連接酶既能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間連接起來，又能將雙鏈DNA片段平末端之間進行連接，但連接平末端之間的效率比較低。
突破點1　
1．如圖是3種限制性內(nèi)切核酸酶對DNA分子的識別序列和剪切位點圖(箭頭表示切點，切出的斷面為黏性末端)。下列敘述錯誤的是(　　)
A．不同的限制酶有不同的識別序列和切割位點，體現(xiàn)了酶的專一性
B．限制酶2和3識別的序列都包含6個核苷酸
C．限制酶1和3剪出的黏性末端相同
D．能夠識別和切割RNA分子內(nèi)一小段核苷酸序列的酶只有限制酶2
解析：不同的限制酶有不同的識別序列和切割位點體現(xiàn)了酶具有專一性，A正確；據(jù)圖可知，限制酶2和3識別的序列分別是CCGCGG和GGATCC，均為6個核苷酸，B正確；限制酶1和3剪出的黏性末端相同，均為—GATC，C正確；限制酶只能識別特定的DNA序列，因此三種限制酶均不能識別和切割RNA中核糖核苷酸序列，D錯誤。
答案：D
2．下列是基因工程的有關(guān)問題，請回答：
(1)限制性內(nèi)切核酸酶可以識別雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列，并可以使每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的____________(填化學鍵名稱)斷裂，形成的末端總體可分為兩種類型，分別是________________________。
(2)目的基因和載體重組時需要的工具酶是________，和限制性內(nèi)切核酸酶相比，它對所重組的DNA兩端堿基序列____________(填“有”或“無”)專一性要求。
(3)如圖表示構(gòu)建表達載體時的某種質(zhì)粒與目的基因。已知限制酶Ⅰ的識別序列和切割位點是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的識別序列和切割位點是—↓GATC—。分析可知，最好選擇限制酶________切割質(zhì)粒，限制酶________切割目的基因所在的DNA，這樣做的好處分別是________________________________________________________________________、
________________________________________________________________________。
解析：(1)限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式，分別為黏性末端和平末端。
(2)目的基因和載體重組時需要DNA連接酶恢復所連接的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。多種限制酶切割，形成不同的切割位點，所用的DNA連接酶對所連接的DNA兩端堿基序列沒有專一性要求。
(3)由題干及圖示可知，限制酶Ⅰ的識別序列和切割位點是—G↓GATCC—，限制酶Ⅰ切割質(zhì)粒不會把兩個標記基因都破壞，最好選擇限制酶Ⅰ切割質(zhì)粒。限制酶Ⅱ的識別序列和切點是—↓GATC—，目的基因兩端均有限制酶Ⅱ的識別序列，因此用限制酶Ⅱ切割目的基因所在的DNA。
答案：(1)磷酸二酯鍵　黏性末端和平末端　(2)DNA連接酶　無　(3)Ⅰ　Ⅱ　限制酶Ⅰ切割質(zhì)粒不會把兩個標記基因都破壞　目的基因兩端均有限制酶Ⅱ的識別序列
突破點2　
3．(多選)某研究所的研究人員擬將生長激素基因通過質(zhì)粒介導進入大腸桿菌細胞內(nèi)，已知質(zhì)粒中存在兩個抗性基因：A是抗鏈霉素基因，B是抗氨芐青霉素基因，目的基因要插入到基因B中，且大腸桿菌本身不帶有任何抗性基因。下列敘述正確的是(　　)
A．導入大腸桿菌的質(zhì)粒不一定為重組質(zhì)粒
B．抗生素抗性基因是目的基因表達的必要條件
C．成功導入重組質(zhì)粒的大腸桿菌可以在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長
D．能在含鏈霉素的培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌不一定符合生產(chǎn)要求
解析：導入大腸桿菌的質(zhì)粒可能為重組質(zhì)粒，也可能為普通質(zhì)粒，A正確；抗生素抗性基因是標記基因，是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來，與目的基因表達無關(guān)，B錯誤；由于目的基因要插入到基因B中，即抗氨芐青霉素基因被破壞，即工程菌不能抗氨芐青霉素，因此成功導入重組質(zhì)粒的大腸桿菌不能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長，C錯誤；能在含鏈霉素的培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌可能含有重組質(zhì)粒或普通質(zhì)粒，因此不一定符合生產(chǎn)要求，D正確。
答案：AD
4．某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入Ampr或Tetr中會導致相應的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因)。有人將此質(zhì)粒載體用BamH Ⅰ酶切后，與用BamH Ⅰ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。回答下列問題：
(1)質(zhì)粒載體作為基因工程的工具，應具備的基本條件有____________________________________(答出兩點即可)，而作為基因表達載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動子和終止子。
(2)如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細胞是不能區(qū)分的，其原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________；
并且________________和__________________________的細胞也是不能區(qū)分的，其原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有________的固體培養(yǎng)基。
(3)基因工程中，某些噬菌體經(jīng)改造后可以作為載體，其DNA復制所需的原料來自________。
解析：(1)質(zhì)粒作為載體，應具備的基本條件有：有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA片段(基因)插入其中；在受體細胞中能自我復制，或能整合到染色體DNA上，隨染色體DNA進行同步復制；有特殊的標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇；等等。(2)在培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素進行篩選，其中未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌和僅含環(huán)狀目的基因的大腸桿菌，因不含氨芐青霉素抗性基因而都不能在此培養(yǎng)基上存活，二者不能區(qū)分。含有質(zhì)粒載體的大腸桿菌和含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌中都含有氨芐青霉素抗性基因，都能在此培養(yǎng)基上存活，二者也不能區(qū)分。若要將含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌進一步篩選出來，還需要使用含有四環(huán)素的固體培養(yǎng)基。(3)某些噬菌體經(jīng)改造后作為載體，導入受體細胞后，其DNA復制所需的原料來自受體細胞。
答案：(1)能自我復制、具有標記基因、有一個至多個限制酶切割位點(答出兩點即可)
(2)二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不生長　含有質(zhì)粒載體　含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒(或答含有重組質(zhì)粒)　二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長　四環(huán)素　(3)受體細胞
　基因工程的基本操作程序
1．目的基因的篩選與獲取
(1)篩選合適的目的基因
①目的基因：在基因工程的設(shè)計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產(chǎn)物等的基因。主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。
②篩選目的基因的方法：從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。
(2)利用PCR獲取和擴增目的基因
①原理：DNA半保留復制。
②條件：DNA模板、2種引物、耐高溫的DNA聚合酶和4種脫氧核苷酸。
③擴增過程
過程 說明 圖解
變性 溫度上升到90 ℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈
復性 溫度下降到50 ℃左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合
延伸 溫度上升到72 ℃左右，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈
2.基因表達載體的構(gòu)建
(1)構(gòu)建基因表達載體的目的
①使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。
②使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。
(2)基因表達載體的組成
(3)基因表達載體的構(gòu)建過程
3．將目的基因?qū)胧荏w細胞
類型 方法 說明 特點
植物 細胞農(nóng)桿 菌轉(zhuǎn)化法 將目的基因插入到農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T DNA上→轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌→用農(nóng)桿菌侵染植物細胞→將目的基因整合到植物細胞的染色體DNA上→目的基因表達 經(jīng)濟、有效，適用于雙子葉植物和裸子植物，尤其適用于雙子葉植物，但單子葉植物也獲得了成功
花粉管通道法 用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；在植物受粉后的一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊 簡便、經(jīng)濟，我國科學家獨創(chuàng)的一種方法
動物細胞 顯微注射技術(shù) 將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→注射了目的基因的受精卵，經(jīng)胚胎早期培養(yǎng)后，移植到雌性動物的輸卵管或子宮內(nèi)→獲得具有新性狀的動物 將目的基因?qū)雱游锛毎顬橛行У姆椒?br/>微生物細胞 Ca2＋處理法 Ca2＋處理細胞→細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)→基因表達載體導入 簡便、經(jīng)濟、有效
4.目的基因的檢測與鑒定
檢測水平 檢測目的 檢測方法
分子水平 目的基因是否插入到轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上 RCR
目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA
目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì) 抗原—抗體雜交
個體水平 轉(zhuǎn)基因生物是否表現(xiàn)出相應的特性 如抗蟲、抗病的接種實驗
1．(選擇性必修3 P76正文)目的基因就是指編碼蛋白質(zhì)的基因。(×)
2．(選擇性必修3 P77“相關(guān)信息”)用PCR方法擴增目的基因時不必知道基因的全部序列。(√)
3．(選擇性必修3 P80正文)基因工程操作的核心步驟是目的基因的獲取。(×)
4．(選擇性必修3 P80正文和圖3 6)基因表達載體中含有啟動子和密碼子。(×)
5．(選擇性必修3 P82正文)抗蟲基因即使成功地插入植物細胞染色體DNA上也未必能正常表達。(√)
6．(選擇性必修3 P82正文)從大腸桿菌細胞中獲得人胰島素基因的mRNA，說明目的基因完成了表達。(×)
1．選擇性必修3 P77“相關(guān)信息”改編：Bt抗蟲蛋白造成害蟲死亡的原因是
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
提示：當Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細胞的特異性受體結(jié)合，導致細胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡
2．選擇性必修3 P77“相關(guān)信息”改編：PCR的引物是________________________
________________________________________________________________________。
用于PCR的引物長度通常為________個核苷酸。
提示：一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸　20～30
3．選擇性必修3 P79“旁欄思考”：PCR可以擴增mRNA嗎？
提示：不可以，因為PCR是用DNA雙鏈做模板的，不能直接用單鏈RNA做PCR，必須把mRNA逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA之后再做PCR。
1．圖解PCR的擴增過程[科學探究]
(1)在PCR過程中實際加入的為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。
(2)引物既可以是DNA單鏈，也可以為RNA單鏈。細胞內(nèi)的DNA進行復制時，也需要引物，一般為RNA片段。
(3)真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應緩沖溶液中一般要添加Mg2＋。
(4)PCR的擴增結(jié)果：DNA分子以指數(shù)形式擴增(約為2n，其中n為擴增循環(huán)次數(shù))
2．基因表達載體的構(gòu)建[生命觀念]
(1)圖解限制酶的選擇原則
①不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。
②保留標記基因原則：質(zhì)粒作為載體必須具備標記基因，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。
③確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶，如圖甲中PstⅠ；為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。
(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點確定限制酶的種類
(3)根據(jù)Ti質(zhì)粒的T DNA片段選擇限制酶，圖中甲、乙、丁Ti質(zhì)粒均不宜選取，而丙Ti質(zhì)粒宜選取(設(shè)切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ)。
3．篩選出含有目的基因的受體細胞[科學思維]
(1)原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，如果插入某種抗生素抗性基因內(nèi)部，則會導致該抗生素抗性基因失活。如圖，目的基因插入了四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)素抗性基因失活。
(2)被轉(zhuǎn)化的細菌有三種：含環(huán)狀目的基因的細菌、含重組質(zhì)粒的細菌、含質(zhì)粒的細菌。
(3)篩選方法：將細菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長的是含重組質(zhì)粒的細菌和含質(zhì)粒的細菌，如圖1、2、3、4、5菌落，再利用滅菌的絨布影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長的即為含有目的基因的菌落，如圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進行培養(yǎng)。
[探究意圖：以基因表達載體圖示為情境信息考查理解能力]
分析基因表達載體模式圖，回答下面問題。
(1)標記基因的作用是什么？常用什么基因來作標記基因？
提示：標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。
常見的標記基因為抗生素抗性基因，如氨芐青霉素抗性基因；四環(huán)素抗性基因。
(2)構(gòu)建基因表達載體時，目的基因應在哪個位置？為什么？
提示：由圖知，目的基因要插入啟動子和終止子之間，這是因為啟動子使轉(zhuǎn)錄開始，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位；終止子位于基因的尾端，使轉(zhuǎn)錄終止；只有順序正確目的基因才能正常轉(zhuǎn)錄。
(3)為什么不能將目的基因插入載體的標記基因中？
提示：標記基因用于鑒定受體細胞是否成功導入目的基因，以便將含目的基因的細胞篩選出來，若有目的基因插入，則標記基因被破壞，無法進一步篩選。
突破點1　
1．農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T DNA可以轉(zhuǎn)移并隨機插入被侵染植物的染色體DNA中。研究者將圖中被侵染植物的DNA片段連接成環(huán)，并以此環(huán)為模板進行PCR，擴增出T DNA插入位置兩側(cè)的未知序列，以此可確定T DNA插入的具體位置。下列說法不正確的是(　　)
注：子鏈從引物的3′端開始延伸
A．PCR擴增依據(jù)的是DNA分子雙鏈復制的原理
B．進行PCR擴增需要耐高溫的DNA聚合酶
C．利用圖中的引物②③組合可擴增出兩側(cè)的未知序列
D．通過與受體細胞的基因組序列比對，可確定T DNA的插入位置
解析：PCR擴增依據(jù)的是DNA分子雙鏈復制的原理，是體外擴增DNA的一種方式，A正確；PCR技術(shù)需要在高溫條件下進行變性，故進行PCR擴增需要耐高溫的DNA聚合酶，B正確；由于DNA的兩條鏈反向平行，且子鏈從引物的3′端開始延伸，故利用圖中的引物①④組合可擴增出兩側(cè)的未知序列，C錯誤；通過與受體細胞的基因組序列比對，可確定T DNA的插入位置，D正確。
答案：C
2．(2020·江蘇卷)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如下圖(以EcoRⅠ酶切為例)：
請據(jù)圖回答問題：
(1)步驟Ⅰ用的EcoRⅠ是一種________酶，它通過識別特定的________切割特定位點。
(2)步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′ 羥基與5′ 磷酸間形成________________；PCR循環(huán)中，升溫到95 ℃是為了獲得________；Taq DNA聚合酶的作用是催化___________________________________________________________。
(3)若下表所列為已知的DNA序列和設(shè)計的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是________(從引物①②③④中選擇，填編號)。
DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物 ①5′ AACTATGCGCTCATGA 3′ ②5′ GCAATGCGTAGCCTCT 3′ ③5′ AGAGGCTACGCATTGC 3′ ④5′ TCATGAGCGCATAGTT 3′
(4)對PCR產(chǎn)物測序，經(jīng)分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列)，結(jié)果正確的是________。
A．5 ′AACTATGCG－－－－－AGCCCTT 3′
B．5 ′AATTCCATG－－－－－CTGAATT 3′
C．5 ′GCAATGCGT－－－－－TCGGGAA 3′
D．5 ′TTGATACGC－－－－－CGAGTAC 3′
解析：(1)步驟Ⅰ用的EcoRⅠ是一種限制性內(nèi)切核酸酶，它通過識別特定的核苷酸序列來進行切割。(2)步驟Ⅱ中用DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′ 羥基與5′ 磷酸間形成磷酸二酯鍵。PCR循環(huán)中，升溫到95 ℃是為了解開DNA雙鏈獲得DNA單鏈，Taq DNA聚合酶的作用是催化以DNA為模板延伸形成子鏈的過程。(3)PCR過程中，根據(jù)已知的DNA序列合成兩個引物，要注意模板鏈和引物的方向是相反的，引物的核苷酸序列要能夠和相應模板的核苷酸序列發(fā)生堿基互補配對，環(huán)狀DNA圖中顯示PCR過程是從已知DNA序列的兩端分別向相反方向形成子鏈，一個引物是與已知DNA序列的第一條鏈的左端互補結(jié)合，向左側(cè)方向延伸形成子鏈，該引物是④，另一個引物是與已知DNA序列的第二條鏈的右端互補結(jié)合，向右側(cè)方向延伸形成子鏈，該引物是②。(4)圖中由片段F形成的環(huán)狀DNA的未知序列中有一個EcoRⅠ限制酶的切割位點，而EcoRⅠ識別的位點是　因此片段F的單鏈中的一端應含有“AATTC－－－－－”序列，另一端應含有“TTAAG－－－－－”序列，只有B項符合題意。
答案：(1)限制性內(nèi)切核酸(或限制)　核苷酸序列　(2)磷酸二酯鍵　DNA單鏈　以DNA為模板的DNA鏈的延伸　(3)②④　(4)B
(1)細胞膜上的載體與基因工程中的載體化學本質(zhì)不同：細胞膜上的載體化學成分是蛋白質(zhì)；基因工程中的載體可能是物質(zhì)，如質(zhì)粒(DNA)，也可能是生物，如噬菌體、動植物病毒等。
(2)PCR中的復性不一定均為引物與DNA模板結(jié)合。復性時，引物與DNA模板的結(jié)合是隨機的，也存在DNA解開的兩條鏈的結(jié)合。
(3)PCR反應的結(jié)果不都是所需的DNA片段。因為第一次循環(huán)得到的DNA片段只有一種引物，比所需的DNA片段要長，從第二次循環(huán)才出現(xiàn)所需的DNA片段，這樣的片段存在兩種引物。
(4)任何一種天然蛋白質(zhì)都是由基因編碼的，利用蛋白質(zhì)工程改造了基因即對蛋白質(zhì)進行了改造，而且改造過的蛋白質(zhì)可以遺傳下去。
突破點2　
3．下列關(guān)于目的基因?qū)胧荏w細胞的敘述，不正確的是(　　)
A．花粉管通道法的操作之一是用微量注射器將含有目的基因的溶液直接注入子房中
B．顯微注射技術(shù)是轉(zhuǎn)基因動物中采用最多的方法
C．大腸桿菌最常用的轉(zhuǎn)化方法是使細胞的生理狀態(tài)發(fā)生改變
D．農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是我國科學家獨創(chuàng)的一種方法
解析：花粉管通道法的操作之一是用微量注射器將含有目的基因的溶液直接注入子房中；目的基因?qū)雱游锛毎Ｓ玫姆椒ㄊ秋@微注射技術(shù)；大腸桿菌細胞最常用的轉(zhuǎn)化方法是用鈣離子處理細胞，使細胞的生理狀態(tài)發(fā)生改變，從而完成轉(zhuǎn)化過程。我國科學家獨創(chuàng)的方法是花粉管通道法。
答案：D
4．(多選)菊花是一種雙子葉植物，易感桃蚜。桃蚜不但直接影響植物生長，還是多種植物病毒的傳播媒介。雪花蓮凝集素基因GNA的表達產(chǎn)物能有效抑制桃蚜生長，某科研團隊運用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得了轉(zhuǎn)GNA基因菊花。下列有關(guān)敘述正確的是(　　)
A．受體細胞可以選擇菊花葉片細胞或桃蚜細胞
B．將目的基因GNA插入Ti質(zhì)粒的T DNA上構(gòu)建表達載體
C．可以將菊花葉片取下與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細胞
D．應用抗蟲接種實驗，檢測轉(zhuǎn)基因菊花對桃蚜的抗性及抗性的程度
解析：要獲得轉(zhuǎn)基因菊花，可以選擇菊花葉片細胞作為受體細胞，但不能選擇桃蚜細胞作為受體細胞，A錯誤；Ti質(zhì)粒的T DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細胞中，并且整合到受體細胞染色體的DNA上，根據(jù)這一特點，構(gòu)建表達載體時，應該將目的基因GNA插入Ti質(zhì)粒的T DNA上，B正確；可以將菊花葉片取下與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細胞，并再生成植株，C正確；已知雪花蓮凝集素基因GNA的表達產(chǎn)物能有效抑制桃蚜生長，故應用抗蟲接種實驗，檢測轉(zhuǎn)基因菊花對桃蚜的抗性及抗性的程度，D正確。
答案：BCD
　基因工程的應用和蛋白質(zhì)工程
1．基因工程的應用
(1)基因工程在農(nóng)牧業(yè)方面的應用
①轉(zhuǎn)基因抗蟲植物；②轉(zhuǎn)基因抗病植物；③轉(zhuǎn)基因抗除草劑植物；④改良植物的品質(zhì)；⑤提高動物的生長速率；
⑥改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)。
(2)基因工程在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的應用
①對微生物或動植物的細胞進行基因改造，使它們生產(chǎn)藥物。
②讓哺乳動物批量生產(chǎn)藥物。
③嘗試將建立移植器官工廠的設(shè)想成為現(xiàn)實。
(3)在食品工業(yè)方面的應用：利用基因工程菌生產(chǎn)食品工業(yè)用酶、氨基酸和維生素等。
2．蛋白質(zhì)工程的原理和應用
(1)蛋白質(zhì)工程的概念
(2)蛋白質(zhì)工程的基本原理
(3)蛋白質(zhì)工程的應用
①醫(yī)藥工業(yè)方面：研發(fā)藥物，如延長干擾素的保存時間；降低小鼠單克隆抗體誘發(fā)免疫反應的強度。
②其他工業(yè)方面：改進酶的性能或開發(fā)新的工業(yè)用酶。
③農(nóng)業(yè)方面：通過改造某些參與調(diào)控光合作用的酶，增加糧食產(chǎn)量；改造微生物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，設(shè)計優(yōu)良微生物農(nóng)藥，防治病蟲害。
1．(選擇性必修3 P88正文)來自蘇云金桿菌的Bt毒蛋白基因只能應用于棉花。(×)
2．(選擇性必修3 P88正文)“轉(zhuǎn)基因抗蟲植物”也可以用于抵抗各種植物疾病。(×)
3．(選擇性必修3 P90“資料卡”)干擾素是我國批準生產(chǎn)的第一個基因工程藥物。(√)
4．(選擇性必修3 P91“相關(guān)信息”)用基因工程的方法，使得外源基因得到高效表達的菌類一般稱為基因工程菌。(√)
5．(選擇性必修3 P93黑體)對蛋白質(zhì)的改造是通過直接改造相應的mRNA來實現(xiàn)的。(×)
1．選擇性必修3 P91“正文”：利用基因工程技術(shù)對豬的器官進行改造，采用的方法是在器官供體的基因組中導入某種調(diào)節(jié)因子，以____________________________________，然后再結(jié)合________技術(shù)，培育出不會引起____________反應的轉(zhuǎn)基因克隆豬器官。
提示：抑制抗原決定基因的表達，或設(shè)法除去抗原決定基因　克隆　免疫排斥
2．選擇性必修3 P94“思考·討論”節(jié)選：確定目的基因的堿基序列后，怎樣才能合成或改造目的基因？
提示：確定目的基因的堿基序列后，可以人工合成目的基因或從基因文庫中獲取目的基因。對基因的改造經(jīng)常會用到基因定點突變技術(shù)來進行堿基的替換、增添等。
1．乳腺生物反應器與工程菌生產(chǎn)藥物的區(qū)別[科學思維]
比較內(nèi)容 乳腺生物反應器 工程菌
含義 指將外源基因在哺乳動物的乳腺中特異表達，利用動物的乳腺組織生產(chǎn)藥物蛋白 指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達的菌類
基因表達 合成的藥物蛋白與天然蛋白質(zhì)相同 細菌合成的藥物蛋白可能沒有活性
受體細胞 動物受精卵 微生物細胞
目的基因?qū)敕绞?顯微注射法 感受態(tài)細胞法
生產(chǎn)條件 不需嚴格滅菌；溫度等外界條件對其影響不大 需嚴格滅菌，嚴格控制工程菌所需的溫度、pH、營養(yǎng)物質(zhì)濃度等外界條件
藥物提取 從動物乳汁中提取 從微生物細胞或其培養(yǎng)液中提取
2.蛋白質(zhì)工程與基因工程的區(qū)別和聯(lián)系[科學思維]
[探究意圖：以培育抗蟲棉為情境信息考查問題解決能力]
如圖為通過基因工程培育抗蟲棉的過程，請回答：
(1)圖示的轉(zhuǎn)化方法是哪一種？其有何特點？
提示：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。將目的基因整合到受體細胞染色體上，可穩(wěn)定遺傳。
(2)抗蟲棉能抗病毒、細菌和真菌嗎？為什么？
提示：不能。抗蟲基因具有專一性。
(3)經(jīng)上述過程培育的抗蟲棉能否取得最后的成功，最簡單的檢測方法是什么？
提示：做抗蟲實驗。
突破點1　
1．下列關(guān)于基因工程技術(shù)應用的敘述，錯誤的是(　　)
A．基因工程技術(shù)可定向改良農(nóng)作物的某些品質(zhì)
B．利用細菌代謝旺盛的特點生產(chǎn)基因工程藥物
C．運用基因工程技術(shù)讓牛合成并分泌人類抗體
D．噬菌體作為載體可以將重組DNA導入動物細胞獲得轉(zhuǎn)基因動物
解析：基因工程技術(shù)可定向改良農(nóng)作物的某些品質(zhì)，A正確；利用細菌代謝旺盛的特點將細菌利用基因工程手段改造成工程菌，生產(chǎn)基因工程藥物，B正確；運用基因工程技術(shù)經(jīng)所需抗體的相關(guān)基因?qū)肱５氖芫阎校_到讓牛合成并分泌人類抗體的目的，C正確；噬菌體是細菌病毒，不能作為載體將重組DNA導入動物細胞，D錯誤。
答案：D
2．科學家培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因奶牛的乳腺細胞能夠合成并分泌人凝血因子，這是動物乳腺生物反應器研究的重大進展。下列敘述正確的是(　　)
A．在該轉(zhuǎn)基因牛中，人凝血因子基因只存在于乳腺細胞，而不存在于其他體細胞中
B．“提高基因表達水平”是指設(shè)法使牛的乳腺細胞中含有更多的人凝血因子基因
C．人凝血因子基因開始轉(zhuǎn)錄后，DNA聚合酶以DNA分子的一條鏈為模板合成mRNA
D．轉(zhuǎn)基因奶牛需要進入泌乳期才能批量生產(chǎn)人凝血因子
解析：根據(jù)題意，在該轉(zhuǎn)基因工程中，人凝血因子基因?qū)氲氖荏w細胞是牛的受精卵，由該受精卵發(fā)育形成的個體的各種體細胞中都存在人凝血因子基因，A錯誤；“提高基因表達水平”是指設(shè)法使牛的乳腺細胞合成更多的人凝血因子，B錯誤；人凝血因子基因開始轉(zhuǎn)錄后，RNA聚合酶以DNA分子的一條鏈為模板合成mRNA，C錯誤；轉(zhuǎn)基因奶牛需要進入泌乳期才能批量生產(chǎn)人凝血因子，D正確。
答案：D
3．(2020·山東卷)水稻胚乳中含直鏈淀粉和支鏈淀粉，直鏈淀粉所占比例越小糯性越強。科研人員將能表達出基因編輯系統(tǒng)的DNA序列轉(zhuǎn)入水稻，實現(xiàn)了對直鏈淀粉合成酶基因(Wx基因)啟動子序列的定點編輯，從而獲得了3個突變品系。
(1)將能表達出基因編輯系統(tǒng)的DNA序列插入Ti質(zhì)粒構(gòu)建重組載體時，所需的酶是______________________，重組載體進入水稻細胞并在細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程稱為________。
(2)根據(jù)啟動子的作用推測，Wx基因啟動子序列的改變影響了____________________，
從而改變了Wx基因的轉(zhuǎn)錄水平。與野生型水稻相比，3個突變品系中Wx基因控制合成的直鏈淀粉合成酶的氨基酸序列__________(填“發(fā)生”或“不發(fā)生”)改變，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)為檢測啟動子變化對Wx基因表達的影響，科研人員需要檢測Wx基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA(Wx mRNA)的量。檢測時分別提取各品系胚乳中的總RNA，經(jīng)________過程獲得總cDNA。通過PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性的擴增出Wx基因的cDNA，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)各品系Wx mRNA量的檢測結(jié)果如圖所示，據(jù)圖推測糯性最強的品系為__________，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)構(gòu)建基因表達載體需要限制性內(nèi)切核酸酶和DNA連接酶，可以對目的基因和載體進行切割和連接，重組載體進入受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程稱為轉(zhuǎn)化。(2)RNA聚合酶與啟動子識別和結(jié)合后啟動轉(zhuǎn)錄，啟動子的序列改變會影響與RNA聚合酶的識別和結(jié)合，從而改變基因的轉(zhuǎn)錄，3個突變品系中改變的是啟動子的序列，影響mRNA的轉(zhuǎn)錄，而編碼直鏈淀粉合成酶的堿基序列中不含有啟動子的序列，所以編碼合成的直鏈淀粉酶的氨基酸序列不發(fā)生改變。(3)通過mRNA獲得cDNA是逆轉(zhuǎn)錄(或反轉(zhuǎn)錄)過程。PCR過程中需要模板、原料、酶、引物等，其中引物是根據(jù)已知基因上的一段序列合成的，這樣要從總cDNA中專一性的擴增出Wx基因的cDNA，關(guān)鍵是要根據(jù)Wx基因的一段已知序列合成出相應的引物。(4)據(jù)題中信息可知，水稻胚乳中直鏈淀粉所占比例越小，糯性越強，題圖中品系3中Wx的mRNA量最少，這樣合成的直鏈淀粉合成酶的量最少，則合成的直鏈淀粉所占比例最小，糯性最強。
答案：(1)限制性內(nèi)切核酸酶和DNA連接酶　轉(zhuǎn)化　(2)RNA聚合酶與啟動子的識別和結(jié)合　不發(fā)生　編碼直鏈淀粉合成酶的堿基序列中不含啟動子　(3)逆轉(zhuǎn)錄(或：反轉(zhuǎn)錄)　引物是根據(jù)Wx基因的一段已知序列設(shè)計合成的(或：引物能與Wx基因的cDNA特異性結(jié)合)　(4)品系3　品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直鏈淀粉合成酶最少，直鏈淀粉合成量最少，糯性最強
突破點2　
4．如圖表示利用蛋白質(zhì)工程生產(chǎn)保存時間更久的干擾素(一種糖蛋白)的核心流程，下列敘述正確的是(　　)
A．該過程得到的干擾素與自然界中的干擾素相同
B．圖中③過程得到的脫氧核苷酸序列往往是唯一的
C．蛋白質(zhì)工程的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系
D．蛋白質(zhì)工程是通過對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行修飾或合成來操作的
解析：圖示是利用蛋白質(zhì)工程生產(chǎn)保存時間更久的干擾素，該過程得到的干擾素是經(jīng)過改造的，與自然界中的干擾素不相同，A錯誤；由于密碼子的簡并性，圖中③過程得到的脫氧核苷酸序列往往不是唯一的，B錯誤；結(jié)構(gòu)決定功能，蛋白質(zhì)工程的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系，C正確；蛋白質(zhì)工程是通過對基因的結(jié)構(gòu)進行修飾或合成來操作的，D錯誤。
答案：C
5．(多選)新冠病毒通過面刺突蛋白(S蛋白)的活性域(RBD)與人體細胞表面的ACE2受體相互作用感染細胞。科學家設(shè)計了一種自然界中不存在的蛋白質(zhì)LCB1，可與S蛋白的RBD緊密結(jié)合，以干擾新冠病毒的感染。下列說法合理的是(　　)
A．LCB1的結(jié)構(gòu)可能與S蛋白的抗體有相似之處
B．S蛋白的RBD結(jié)構(gòu)可以為設(shè)計LCB1提供信息
C．生產(chǎn)LCB1用到了基因工程的操作技術(shù)
D．可直接從細胞中獲取基因用于LCB1的生產(chǎn)
解析：S蛋白的抗體能與S蛋白的RBD特異性結(jié)合，而根據(jù)題干可知，LCB1可與S蛋白的RBD緊密結(jié)合，說明LCB1的結(jié)構(gòu)可能與S蛋白的抗體類似，A正確；由于LCB1可與S蛋白的RBD緊密結(jié)合，故LCB1可依據(jù)S蛋白的RBD結(jié)構(gòu)進行設(shè)計，B正確；生產(chǎn)LCB1用到了蛋白質(zhì)工程，其中一些步驟用到了基因工程的操作技術(shù)，例如人工合成DNA，C正確；由題意可知蛋白質(zhì)LCB1是一種自然界中不存在的蛋白質(zhì)，故不能從細胞中獲取相應的基因，D錯誤。
答案：ABC
　實驗：DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴增及電泳鑒定
1．DNA的粗提取與鑒定
(1)實驗原理
(2)實驗步驟
2．DNA片段的擴增及電泳鑒定
(1)實驗原理
①PCR原理：利用了DNA的熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。
②電泳：DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。
③PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。
(2)實驗步驟
(3)DNA的測定：凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300_nm的紫外燈下被檢測出來。
1．DNA的粗提取與鑒定的注意事項
(1)加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。
(2)本實驗不能用哺乳動物成熟的紅細胞作為實驗材料，原因是哺乳動物成熟的紅細胞無細胞核(無DNA)。可選用雞血細胞作為材料。
(3)鑒定DNA時，一支試管為對照組，另一支試管為實驗組。兩支試管中都先加物質(zhì)的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液；在實驗組試管中加DNA絲狀物，對照組不加；加入二苯胺試劑后沸水浴加熱。結(jié)果可以看到加DNA絲狀物的試管呈現(xiàn)藍色，對照組無色。如果實驗組藍色較淺，說明提取出的DNA量太少。
2．DNA片段的擴增及電泳鑒定
(1)為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。
(2)該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在－20 ℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。
(3)在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換，避免試劑的污染。
(4)在進行操作時，一定要戴好一次性手套。
(5)觀察DNA帶的分布及粗細程度來評價擴增的效果。
1．選擇性必修3 P74~75“探究·實踐”：DNA的粗提取實驗中過濾能否用濾紙代替紗布？
提示：不可以，因為DNA會被吸附到濾紙上而大量損失，影響最終提取的DNA量。
2．選擇性必修3 P84~85 “探究·實踐”：DNA的電泳鑒定實驗中，影響DNA分子遷移速率的因素有哪些？
提示：電泳時，DNA分子的相對分子質(zhì)量越大，受到的阻力越大，遷移速率越慢，DNA分子的相對分子質(zhì)量越小，受到的阻力越小，遷移速率越快。
3．選擇性必修3 P84~85 “探究·實踐”：你進行電泳鑒定的結(jié)果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請分析產(chǎn)生這個結(jié)果的可能原因。
提示：多條條帶。不止一條條帶的原因：操作過程中混入限制酶將DNA片段切割成片段或還有其他DNA片段，以此為模板，進行了擴增。
突破點1　
1．(2019·江蘇卷)下列關(guān)于DNA粗提取與鑒定的敘述，錯誤的是(　　)
A．用同樣方法從等體積兔血和雞血中提取的DNA量相近
B．DNA析出過程中，攪拌操作要輕柔以防DNA斷裂
C．預冷的乙醇可用來進一步純化粗提的DNA
D．用二苯胺試劑鑒定DNA需要進行水浴加熱
解析：哺乳動物(如兔)成熟的紅細胞無細胞核，細胞內(nèi)基本不含DNA，故兔血不宜作為該實驗的實驗材料，A項錯誤。DNA析出過程中，攪拌要輕柔，以防止DNA斷裂，B項正確。DNA不溶于冷乙醇，向DNA提取液中加入適量預冷的乙醇溶液，會使DNA析出，從而進一步提純DNA，C項正確。向溶有DNA的溶液中加入二苯胺試劑，沸水浴加熱數(shù)分鐘，溶液出現(xiàn)藍色，D項正確。
答案：A
2．人體內(nèi)一些正常或異常細胞脫落破碎后，其DNA會以游離的形式存在于血液中，稱為cfDNA。近幾年，結(jié)合PCR及電泳鑒定、DNA測序等技術(shù)，cfDNA在臨床上得到了廣泛應用。下列相關(guān)說法不正確的是(　　)
A．PCR反應中設(shè)置不同的溫度是為了使DNA聚合酶催化不同的反應
B．在瓊脂糖凝膠中，cfDNA的遷移速率與cfDNA分子的大小、構(gòu)象等有關(guān)
C．在進行電泳時，要預留一個加樣孔，加入指示分子大小的標準參照物
D．對cfDNA進行檢測，可以用于腫瘤的早期篩查
解析：PCR反應中溫度的周期性改變是為了解旋變性、復性、延伸，A錯誤；分子的大小、形態(tài)、凝膠的種類、密度，電泳的電壓大小等都會影響分子遷移速率，B正確；在進行電泳時，要預留一個加樣孔，加入指示分子大小的標準參照物，C正確；cfDNA是人體內(nèi)一些正常或異常細胞脫落破碎后形成的游離DNA，所以可通過檢測cfDNA中的相關(guān)基因，判斷其來自正常或異常細胞，并進行癌癥的篩查，D正確。
答案：A
突破點2　
3．在基因工程操作過程中，科研人員利用識別兩種不同序列的限制酶(R1和R2)處理基因載體，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖所示。以下相關(guān)敘述，不正確的是(　　)
A．該載體最可能為環(huán)狀DNA分子
B．兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點
C．限制酶R1與R2的切點最短相距約200 bp
D．限制酶作用位點會導致氫鍵和肽鍵斷裂
解析：當僅用一種限制酶切割載體時，僅產(chǎn)生一種長度的DNA片段，因此該載體最有可能為環(huán)狀DNA分子，A正確；當僅用一種限制酶切割載體時，兩種限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段等長，而兩種限制酶同時切割時則產(chǎn)生兩種長度的DNA片段，所以兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點，B正確；兩種限制酶同時切割時則產(chǎn)生600 bp和200 bp兩種長度的DNA片段，所以兩種限制酶的酶切位點最短相距200 bp，C正確；限制酶切割DNA分子，破壞的是作用位點上兩個脫氧核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵，D錯誤。
答案：D
4．某生物興趣小組開展DNA粗提取的相關(guān)探究活動，具體步驟如下：
材料處理：稱取新鮮的花菜、辣椒和蒜黃各2份，每份10 g，剪碎后分成兩組，一組置于20 ℃條件下、另一組置于－20 ℃條件下，分別保存24 h。
DNA的粗提取：
第一步：將上述材料分別放入研缽中，各加入15 mL研磨液，充分研磨。用兩層紗布過濾，取濾液備用。
第二步：先向6只小燒杯中分別注入10 mL濾液，再加入20 mL體積分數(shù)為95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒緩緩地向一個方向攪拌，使絮狀物纏繞在玻璃棒上。
第三步：取6支試管，分別加入等量的2 mol·L－1的NaCl溶液溶解上述絮狀物。
DNA的鑒定：在上述試管中各加入4 mL二苯胺試劑，混合均勻后，置于沸水中加熱5 min，待試管冷卻后比較溶液的顏色深淺，結(jié)果如下表。
材料保存溫度 花菜 辣椒 蒜黃
20 ℃ ＋＋ ＋ ＋＋＋
－20 ℃ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋
注：“＋”越多表示藍色越深。
分析上述實驗過程，回答下列問題：
(1)該探究性實驗的課題名稱是____________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)第二步中“緩緩地”攪拌，這是為了減少_________________________________
________________。
(3)根據(jù)實驗結(jié)果，得出結(jié)論并分析。
①結(jié)論1：與20 ℃相比，相同實驗材料在－20 ℃條件下保存，DNA的提取量較多。
結(jié)論2：_______________________________________________________________
________________________________________________________________________。
②針對結(jié)論1，請?zhí)岢龊侠淼慕忉專篲_________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)氯仿密度大于水，能使蛋白質(zhì)變性沉淀，與水和DNA均不相溶，且對DNA影響極小。為了進一步提高DNA純度，依據(jù)氯仿的特性，在DNA粗提取第三步的基礎(chǔ)上繼續(xù)操作的步驟是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________，
然后用體積分數(shù)為95%的冷酒精溶液使DNA析出。
解析：(1)從表格可以看出，該實驗有兩個自變量：材料和溫度，所以該探究性實驗的課題名稱為“探究不同材料和不同保存溫度對DNA提取量的影響”。低溫抑制了相關(guān)酶的活性，DNA降解速度慢，提取的DNA量較多。(2)第二步中用玻璃棒攪拌的目的是獲取DNA絮狀物，所以若攪拌速度快，易造成DNA斷裂。(3)本實驗的結(jié)論可從兩個方面來考慮：①相同材料在不同保存溫度下的結(jié)論；②不同材料在相同保存溫度下的結(jié)論。(4)氯仿能使蛋白質(zhì)變性沉淀，而對DNA影響極小，所以可將第三步獲得的溶液與氯仿混合，又因氯仿密度大于水，所以蛋白質(zhì)沉淀位于溶液下部，DNA位于上清液中。
答案：(1)探究不同材料和不同保存溫度對DNA提取量的影響　(2)DNA斷裂　(3)①等質(zhì)量的不同實驗材料，在相同的保存溫度下，從蒜黃中提取的DNA量最多　②低溫抑制了相關(guān)酶的活性，DNA降解速度慢　(4)將第三步獲得的溶液與等量的氯仿充分混合，靜置一段時間，吸取上清液
[構(gòu)建知識網(wǎng)絡(luò)]
[強化生命觀念]
1．限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。
2．載體上有特殊的標記基因，便于重組DNA分子的篩選。
3．PCR反應需要在一定的緩沖液中才能進行，需提供DNA模板，2種引物，4種脫氧核糖核苷酸和耐高溫的DNA聚合酶。
4．基因表達載體是載體的一種，除目的基因、標記基因外，還必須含有啟動子、終止子等。
5．對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行設(shè)計改造，最終還必須通過改造或合成基因來完成。
真題再現(xiàn)　感悟考情
1．(2020·北京卷)為了對重金屬污染的土壤進行生物修復，研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉(zhuǎn)運蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動子連接，導入楊樹基因組中(如圖)。
為檢測獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹苗中是否含有導入的HMA3基因，同時避免內(nèi)源HMA3基因的干擾，在進行PCR擴增時，應選擇的引物組合是(　　)
A．①＋③　　　　　　　　 B．①＋②
C．③＋② D．③＋④
解析：圖示中克隆的重金屬轉(zhuǎn)運蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動子連接，導入楊樹基因組中，若要檢測獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹苗中是否含有導入的HMA3基因和高效啟動子，需要檢測是否含有高效啟動子序列和HMA3基因序列，應選擇的引物組合是①＋②，即B正確，A、C、D錯誤。
答案：B
2．(2018·北京卷)用XhoⅠ和SalⅠ兩種限制性核酸內(nèi)切酶分別處理同一DNA片段，酶切位點及酶切產(chǎn)物分離結(jié)果如圖。以下敘述不正確的是(　　)
A．如圖中兩種酶識別的核苷酸序列不同
B．如圖中酶切產(chǎn)物可用于構(gòu)建重組DNA
C．泳道①中是用SalⅠ處理得到的酶切產(chǎn)物
D．圖中被酶切的DNA片段是單鏈DNA
解析：限制酶識別特定的脫氧核苷酸序列，不同的限制酶能識別不同的核苷酸序列，由電泳圖可知XhoⅠ和SalⅠ兩種酶分別切割時，識別的序列不同，A正確；同種限制酶切割出的DNA片段，具有相同的黏性末端，再用DNA連接酶進行連接，可以構(gòu)成重組DNA，B正確；SalⅠ將DNA片段切成4段，XhoⅠ將DNA片段切成3段，根據(jù)電泳結(jié)果可知泳道①為SalⅠ，泳道②為XhoⅠ，C正確；限制酶切割雙鏈DNA，酶切后的DNA片段仍然是雙鏈DNA，D錯誤。
答案：D
3．(2020·浙江卷)下列關(guān)于基因工程的敘述，正確的是(　　)
A．若受體大腸桿菌含有構(gòu)建重組質(zhì)粒時用到的限制性核酸內(nèi)切酶，則一定有利于該重組質(zhì)粒進入受體并保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定
B．抗除草劑基因轉(zhuǎn)入某抗鹽植物獲得2個穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)基因品系，抗性鑒定為抗除草劑抗鹽和抗除草劑不抗鹽。表明一定是抗鹽性的改變與抗除草劑基因的轉(zhuǎn)入無關(guān)
C．抗除草劑基因轉(zhuǎn)入某植物獲得轉(zhuǎn)基因植株，其DNA檢測均含目的基因，抗性鑒定為抗除草劑和不抗除草劑。表明一定是前者表達了抗性蛋白而后者只表達抗性基因RNA
D．已知不同分子量DNA可分開成不同條帶，相同分子量的為一條帶。用某種限制性核酸內(nèi)切酶完全酶切環(huán)狀質(zhì)粒后，出現(xiàn)3條帶。表明該質(zhì)粒上一定至少有3個被該酶切開的位置
解析：基因工程中，若受體大腸桿菌含有構(gòu)建重組質(zhì)粒時用到的限制性核酸內(nèi)切酶(限制酶)，重組質(zhì)粒進入大腸桿菌體內(nèi)后，該限制酶可以切割重組質(zhì)粒，使重組質(zhì)粒不能保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，A項錯誤；將抗除草劑基因轉(zhuǎn)入某抗鹽植物獲得2個穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)基因品系，抗性鑒定為抗除草劑抗鹽和抗除草劑不抗鹽，可說明抗鹽性的改變與抗除草劑基因的轉(zhuǎn)入有關(guān)，若抗除草劑基因轉(zhuǎn)入到抗鹽基因的編碼區(qū)，破壞了抗鹽基因，則會出現(xiàn)由抗鹽到不抗鹽的改變，B項錯誤；抗除草劑基因轉(zhuǎn)入某植物獲得轉(zhuǎn)基因植株，其DNA檢測均含目的基因，抗性鑒定為抗除草劑和不抗除草劑，則前者應表達了抗性蛋白，而后者可能表達了抗性基因RNA但不能進行翻譯過程，也可能沒有表達出抗性基因RNA，C項錯誤；已知不同分子量DNA可分開成不同條帶，相同分子量的為一條帶，用某種限制性核酸內(nèi)切酶完全酶切環(huán)狀質(zhì)粒后，出現(xiàn)幾條帶則表明該質(zhì)粒上一定至少有幾個被酶切開的位置，注意若完全酶切鏈狀DNA后，出現(xiàn)3條帶，則表明該鏈狀DNA上一定至少有2個被酶切開的位置。
答案：D
4．(2021·全國乙卷)用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點如圖所示。
回答下列問題：
(1)常用的DNA連接酶有E.coli DNA連接酶和T4(T4)DNA連接酶。上圖中________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA連接酶連接。上圖中__________酶切割后的DNA片段可以用T4(T4)DNA連接酶連接。
(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學鍵是__________。
(3)DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征。如質(zhì)粒DNA分子上有復制原點，可以保證質(zhì)粒在受體細胞中能________；質(zhì)粒DNA分子上有____________，便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有標記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細胞，方法是_________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)表達載體含有啟動子，啟動子是指________________________________________
________________。
解析：(1)E.coli DNA連接酶只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端連接起來。T4(T4)DNA連接酶既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端。(2)DNA連接酶是通過催化兩個核苷酸之間形成磷酸二酯鍵，將雙鏈DNA片段“縫合”起來的。(3)作為載體，質(zhì)粒DNA分子上必須有復制原點，才能使質(zhì)粒在受體細胞中能進行自我復制；且質(zhì)粒DNA分子上應具有一個至多個限制酶切割位點，便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有標記基因(如某種抗生素抗性基因)，可以將待篩選的宿主細胞接種到含該抗生素的培養(yǎng)基中，能夠生長的是含有質(zhì)粒載體的宿主細胞。(4)啟動子是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，RNA聚合酶與該區(qū)域結(jié)合可驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。
答案：(1)EcoRⅠ、PstⅠ　EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ　(2)磷酸二酯鍵　(3)自我復制　限制酶切割位點　將待篩選的宿主細胞接種到含該抗生素的培養(yǎng)基中，能夠生長的是含有質(zhì)粒載體的宿主細胞　(4)RNA聚合酶識別、結(jié)合并啟動轉(zhuǎn)錄的DNA片段
5．(2021·山東卷)人類γ基因啟動子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點，該位點結(jié)合BCL11A蛋白后，γ基因的表達被抑制。通過改變該結(jié)合位點的序列，解除對γ基因表達的抑制，可對某種地中海貧血癥進行基因治療。科研人員擴增了γ基因上游不同長度的片段，將這些片段分別插入表達載體中進行轉(zhuǎn)化和熒光檢測，以確定BCL11A蛋白結(jié)合位點的具體位置。相關(guān)信息如圖所示。
(1)為將擴增后的產(chǎn)物定向插入載體指導熒光蛋白基因表達，需在引物末端添加限制酶識別序列。據(jù)圖可知，在F1～F7末端添加的序列所對應的限制酶是________，在R末端添加的序列所對應的限制酶是________。本實驗中，從產(chǎn)物擴增到載體構(gòu)建完成的整個過程共需要________種酶。
(2)將構(gòu)建的載體導入除去BCL11A基因的受體細胞，成功轉(zhuǎn)化后，含F(xiàn)1～F6與R擴增產(chǎn)物的載體表達熒光蛋白，受體細胞有熒光，含F(xiàn)7與R擴增產(chǎn)物的受體細胞無熒光。含F(xiàn)7與R擴增產(chǎn)物的受體細胞無熒光的原因是________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素，含F(xiàn)1～F4與R擴增產(chǎn)物的受體細胞不再有熒光，而含F(xiàn)5～F6與R擴增產(chǎn)物的受體細胞仍有熒光。若γ基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對應的位置不含有BCL11A蛋白的結(jié)合位點序列，據(jù)此結(jié)果可推測，BCL11A蛋白結(jié)合位點位于________________________________________________________________________，
理由是__________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)觀察含載體的部分結(jié)構(gòu)的圖示，熒光蛋白基因的左側(cè)為終止子，為了將擴增后的產(chǎn)物定向插入載體指導熒光蛋白基因表達，擴增后的產(chǎn)物的插入點應在熒光蛋白基因的右側(cè)，而熒光蛋白基因的右側(cè)有三個限制酶切點，分別是MunⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ限制酶的切點，但因為用EcoRⅠ會破壞熒光蛋白基因，所以只能用MunⅠ和XhoⅠ切割，切割后的載體圖示如下：
擴增后的產(chǎn)物的兩端添加限制酶后得到的DNA片段能夠替換上圖載體中位于MunⅠ和XhoⅠ限制酶切割位點之間的片段，并能與左側(cè)的熒光蛋白基因片段及右側(cè)的P片段連接起來。由于F1～F7中有XhoⅠ限制酶切割位點，所以需尋找能代替XhoⅠ限制酶，且切割后的產(chǎn)物能與XhoⅠ限制酶切割后的產(chǎn)物連接的限制酶，而SalⅠ就符合這一要求，所以在F1～F7末端添加的序列所對應的限制酶是SalⅠ；而調(diào)控序列及啟動子中含有MunⅠ的切割位點，所以需尋找能代替MunⅠ的限制酶，且切割后的產(chǎn)物能與MunⅠ限制酶切割后的產(chǎn)物連接，而EcoRⅠ就符合這一要求；所以在R末端添加的序列所對應的限制酶是EcoRⅠ，擴增后的產(chǎn)物的兩端添加的限制酶識別序列如下圖所示：
即用EcoRⅠ和SalⅠ切割調(diào)控序列及啟動子，用MunⅠ和Xho Ⅰ切割載體。本實驗中，從產(chǎn)物擴增到載體構(gòu)建完成的整個過程共需要Taq酶、SalⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ、MunⅠ、DNA連接酶共6種酶。
(2)將構(gòu)建的載體導入除去BCL11A基因的受體細胞，成功轉(zhuǎn)化后，含F(xiàn)1～F6與R擴增產(chǎn)物的載體表達熒光蛋白，受體細胞有熒光，說明F1～F6與R擴增產(chǎn)物含完整的啟動子，熒光蛋白基因表達；含F(xiàn)7與R擴增產(chǎn)物的受體細胞無熒光，說明F7與R擴增產(chǎn)物不含完整的啟動子，熒光蛋白基因不表達。
(3)向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素，雌激素能誘導啟動子發(fā)揮作用。構(gòu)建的載體含有BCL11A基因，導入構(gòu)建載體的受體細胞能合成BCL11A蛋白。含F(xiàn)1～F4與R擴增產(chǎn)物的受體細胞不再有熒光，說明F1～F4與R擴增產(chǎn)物上均有BCL11A蛋白的結(jié)合位點(調(diào)控啟動子，熒光蛋白基因不表達)，因此結(jié)合位點位于F4所對應調(diào)控序列的下游(右側(cè))；而含F(xiàn)5～F6與R擴增產(chǎn)物的受體細胞仍有熒光，說明F5～F6與R擴增產(chǎn)物上均無結(jié)合位點(啟動子完整，熒光蛋白基因能表達)，可知結(jié)合位點位于F5所對應調(diào)控序列的上游(左側(cè))，所以結(jié)合位點位于引物F4與F5在調(diào)控序列上所對應序列之間的區(qū)段上。
答案：(1)SalⅠ　EcoRⅠ　6　(2)F7與R擴增產(chǎn)物不含完整的啟動子，熒光蛋白基因不表達　(3)引物F4與F5在調(diào)控序列上所對應序列之間的區(qū)段上　根據(jù)有無熒光情況判斷，F(xiàn)1～F4與R擴增產(chǎn)物上均有結(jié)合位點，因此結(jié)合位點位于F4所對應調(diào)控序列的下游(右側(cè))；F5～F6與R擴增產(chǎn)物上均無結(jié)合位點，可知結(jié)合位點位于F5所對應調(diào)控序列的上游(左側(cè))，所以結(jié)合位點位于引物F4與F5在調(diào)控序列上所對應序列之間的區(qū)段上

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