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第38講　基因工程及生物技術的安全性與倫理問題
[課程導學]
內容要求 5.1.基因工程是一種重組DNA技術。5．2.蛋白質工程是基因工程的延伸。6．1.轉基因產品的安全性引發社會的廣泛關注。6．2.中國禁止生殖性克隆人。6．3.世界范圍內應全面禁止生物武器。
與舊教材對比 增：①DNA的粗提取與鑒定；②DNA片段的擴增及電泳鑒定；③基因工程在食品工業方面的應用。刪：①基因文庫的構建；②基因槍法；③基因治療；④基因身份證的討論。改：①PCR技術內容更充實；②DNA重組技術改為重組DNA技術；③關注生物技術的倫理問題改為關注生殖性克隆人。淡化：①從基因文庫中獲取目的基因精減為一句話；②農桿菌轉化法變為資料卡。
考點一　重組DNA技術的基本工具
1．基因工程的概念
2．重組DNA技術的基本工具
(1)限制性內切核酸酶(也稱“限制酶”)
?、傧拗泼傅淖R別序列與被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6個核苷酸組成，少數由4個、8個或其他數量的核苷酸組成；后者是雙鏈序列。
②判斷黏性末端是否由同一種限制酶切割形成的方法是將黏性末端旋轉180°，同一種限制酶切割形成的黏性末端應該是完全相同的結構。
③限制酶作用的化學鍵只能是磷酸二酯鍵，而不能是氫鍵。
④在切割含目的基因的DNA分子時，需用限制酶切割兩次此DNA分子，產生4個末端。只有這樣才能使目的基因的兩端都有可連接的黏性末端或平末端。
(2)DNA連接酶
(3)載體
　與膜載體的區別：基因工程中的載體是DNA分子，能將目的基因導入受體細胞內，并利用它在宿主細胞內對目的基因進行大量復制；膜載體是蛋白質，與細胞膜的通透性有關。
(1)基因工程的原理是基因重組，不過這種變異是定向的。(　　)
(2)DNA重組技術所需要的工具酶有限制酶、DNA連接酶和載體。(　　)
(3)DNA連接酶可以連接目的基因與載體的氫鍵，形成重組DNA。(　　)
(4)E.coli DNA連接酶既能連接黏性末端，又能連接平末端。(　　)
(5)載體的種類有質粒、噬菌體、動植物病毒等，其中動植物病毒必須是DNA病毒。(　　)
(6)載體質粒通常采用抗生素合成基因作為篩選的標記基因。(　　)
答案：(1)√　(2)×　(3)×　(4)×　(5)√　(6)×
1．(選擇性必修3 P71旁欄思考)(1)存在于原核生物中的限制酶的作用是什么___________________________________________________________________
__________________________________________________________________。
(2)限制酶來源于原核生物，為什么不能切割自身的DNA分子？_____________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
提示：(1)切割外源DNA以保證自身安全，防止外來病原物的危害　(2)原核生物的DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾
2．(選擇性必修3 P72旁欄思考)DNA連接酶和DNA聚合酶________(填“是”或“不是”)一回事。原因是：①DNA連接酶連接的是________，而DNA聚合酶是把單個的________連接到已有的DNA片段上。②________起作用時需要以一條DNA鏈為模板，而________不需要模板。
提示：不是　兩個DNA片段　脫氧核苷酸　DNA聚合酶　DNA連接酶
1．基因工程的理論基礎
2．限制酶的選擇原則
(1)根據目的基因兩端的限制酶切割位點確定限制酶的種類
①應選擇切割位點位于目的基因兩端的限制酶，以便將目的基因“切出”，如圖可選擇Pst Ⅰ。
②不能選擇切割位點位于目的基因內部的限制酶，防止破壞目的基因，如圖不能選擇Sma Ⅰ。
③為避免目的基因和質粒的自身環化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖也可選擇用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ兩種限制酶(但要確保質粒上也有這兩種限制酶的切割位點，而且這兩種限制酶切割后不會完全破壞標記基因)。
(2)根據質粒的特點確定限制酶的種類
(3)根據Ti質粒的T DNA片段選擇限制酶，圖中甲、乙、丁Ti質粒均不宜選取，而丙Ti質粒宜選取(設切割目的基因的限制酶為Xba Ⅰ和Sac Ⅰ)。
3．標記基因的作用：可用于檢測目的基因是否導入受體細胞。
4．與DNA有關的幾種酶的比較
突破1 基因工程工具酶的應用
核心素養 生命觀念
1．用限制酶EcoR V單獨切割某普通質粒，可產生14 kb(1 kb即1 000個堿基對)的長鏈，而同時用限制酶EcoR V和Mbo Ⅰ聯合切割該質粒，可得到三種長度的DNA片段，見下圖(其中*表示EcoR V限制酶切割后的一個黏性末端)。
若用Mbo Ⅰ限制酶單獨切割該普通質粒，則產生的DNA片段的長度為(　　)
A．2.5和5.5　　　　　　　 B．2.5和6
C．5.5和8 D．6和8
答案：D
2．圖甲、乙中的箭頭表示三種限制性內切核酸酶的酶切位點，ampr表示氨芐青霉素抗性基因，neor表示新霉素抗性基因。下列敘述正確的是(　　)
A．圖甲中的質粒用BamH Ⅰ切割后，含有4個游離的磷酸基團
B．在構建重組質粒時，可用Pst Ⅰ和BamH Ⅰ切割質粒和外源DNA
C．用Pst Ⅰ和Hind Ⅲ酶切，可以保證目的基因與質粒正確連接
D．導入目的基因的大腸桿菌可在含氨芐青霉素的培養基中生長
解析：選C。圖甲中的質粒只有一個BamH Ⅰ的切割位點，切割后形成一個直鏈DNA，含2個游離的磷酸基團，A錯誤；根據圖乙可知，BamH Ⅰ的切割位點在目的基因上，故不能用該酶切割外源DNA，B錯誤；用PstⅠ和Hind Ⅲ酶切，可以保證目的基因與質粒正確連接，C正確；導入目的基因的大腸桿菌，其重組質粒是用Pst Ⅰ和Hind Ⅲ切割形成的，其中的ampr(氨芐青霉素抗性基因)已被破壞，D錯誤。
突破2 基因工程載體的應用
核心素養 生命觀念
3．某一質粒載體如圖所示，外源DNA插入ampr或tetr中會導致相應的基因失活(ampr表示氨芐青霉素抗性基因，tetr表示四環素抗性基因)。有人將此質粒載體用BamH Ⅰ酶切后，與用BamH Ⅰ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉化大腸桿菌。結果大腸桿菌有的未被轉化，有的被轉化。被轉化的大腸桿菌有三種，分別是含有環狀目的基因、含有質粒載體、含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉栴}：
(1)質粒載體作為基因工程的工具，應具備的基本條件有____________________(答出兩點即可)，而作為基因表達載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動子和終止子等。
(2)如果用含有氨芐青霉素的培養基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉化的和僅含環狀目的基因的細胞是不能區分的，其原因是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________；并且______________和______________的細胞也是不能區分的，其原因是__________________________________________。
(3)基因工程中，某些噬菌體經改造后可以作為載體，其DNA復制所需的原料來自________。
答案：(1)能自我復制、具有標記基因　(2)二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養基上均不生長　含有質粒載體　含有插入了目的基因的重組質粒(或含有重組質粒)　二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養基上均能生長　(3)受體細胞
四類受體細胞的篩選與判定
當用相應的限制酶切割了目的基因與載體后，可將二者混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉化受體細胞，其結果有如下四種：
上述四類受體細胞中通過“標記基因”(制備的培養基)可區分出(1)(2)與(3)(4)，而通過PCR等技術，可進一步區分(3)與(4)。　
考點二　基因工程的基本操作程序
1．目的基因的篩選與獲取
(1)目的基因：主要指編碼蛋白質的基因。
(2)獲取方法——利用PCR獲取和擴增目的基因
①原理：DNA的半保留復制。
②條件
a．場所：在緩沖溶液中進行，其中一般要添加Mg2＋。
b．模板：DNA雙鏈。
c．原料：4種脫氧核苷酸。
d．酶：耐高溫的DNA聚合酶。
e．引物：使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸。
③過程
a．變性：當溫度超過90 ℃時，雙鏈DNA解聚為單鏈。
b．復性：當溫度下降到50 ℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。
c．延伸：當溫度上升到72 ℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。
④結果：每次循環后目的基因的量增加一倍，即成指數形式擴增(約為2n，其中n為擴增循環的次數)。
⑤鑒定：常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產物。
　a．在PCR過程中實際加入的為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。
b．引物既可以是DNA單鏈，也可以為RNA單鏈。細胞內的DNA進行復制時，也需要引物，一般為RNA片段。
c．真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應緩沖溶液中一般要添加Mg2＋。
2．基因表達載體的構建——基因工程的核心
　啟動子≠起始密碼子，終止子≠終止密碼子
①啟動子：一段有特殊序列結構的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶識別、結合的部位。
②終止子：一段有特殊序列結構的DNA片段，位于基因的下游，作用是使轉錄在所需要的地方停止。
③起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，分別控制翻譯過程的啟動和終止。
　若考慮兩兩相連，則DNA連接酶連接DNA片段會出現三種情況：①目的基因與目的基因的連接；②目的基因與質粒的連接；③質粒與質粒的連接，需篩選出重組質粒。
3．將目的基因導入受體細胞
(1)植物細胞
?、俎r桿菌轉化法中的兩次拼接和兩次導入：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的T DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T DNA拼接到受體細胞的染色體DNA上；第一次導入農桿菌，第二次導入(非人工操作)是指含目的基因的T DNA導入受體細胞。
②導入的目的基因，可能存在于細胞質中，也可能整合到染色體DNA上。存在于染色體DNA上的目的基因有可能通過花粉傳播進入雜草或其他作物中，造成“基因污染”。
(2)動物細胞：顯微注射法，將目的基因注入動物的受精卵中。
(3)原核生物：先用Ca2＋處理大腸桿菌細胞，使之處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，然后再將重組的基因表達載體導入其中。
4．目的基因的檢測與鑒定
　分子水平檢測是否插入了目的基因和是否轉錄出了mRNA時，①都遵循堿基互補配對原則；②都使用基因探針，探針是放射性同位素或熒光標記的含目的基因的單鏈DNA片段。
(1)所有的目的基因都可以從基因文庫中獲取。(　　)
(2)用PCR儀對DNA分子擴增過程中常用的一種耐高溫的酶是DNA連接酶。(　　)
(3)基因表達載體中含有啟動子和密碼子。(　　)
(4)Ti質粒上的T DNA可與植物受體細胞的染色體DNA整合在一起。(　　)
(5)目的基因的檢測和鑒定過程中，分子水平的檢測方法都是PCR技術。(　　)
(6)抗蟲基因即使成功地插入植物細胞染色體上也未必能正常表達。(　　)
(7)應用DNA探針技術，可以檢測轉基因抗凍番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表達。(　　)
答案：(1)×　(2)×　(3)×　(4)√　(5)×　(6)√
(7)×
1．(選擇性必修3 P79旁欄思考題)PCR不可以擴增mRNA的原因是_____________________________________________________________________
_________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
提示：PCR是以DNA雙鏈作模板的，不能直接用單鏈RNA做PCR，必須把mRNA逆轉錄成單鏈cDNA之后再做PCR
2．(選擇性必修3 P81內文信息資料卡拓展)為什么不直接把目的基因導入受體細胞，而要用載體？__________________________________________
_________________________________________________________________
________________________________________________________________
提示：游離的DNA片段進入受體細胞，一般會直接被分解，就算可以進行轉錄并翻譯成蛋白質，游離的DNA片段也無法隨著細胞分裂而進行復制，導致子代細胞中不再含有目的基因。若將目的基因插入載體，由于載體可以在細胞內復制，隨著細胞分裂，載體會帶著目的基因存在于每個子代細胞中。這樣，基因工程才有意義
3．(選擇性必修3 P83到社會中去)轉基因抗蟲棉培育過程中，檢測目的基因是否成功表達的常見方法有哪兩種？______________________________________
__________________________________。
提示：抗原—抗體雜交法、用棉葉飼喂棉鈴蟲
1．目的基因的篩選與獲取(拓展)
(1)目的基因的篩選：從相關的已知結構和功能清晰的基因中篩選。
(2)目的基因的獲取方法
①利用PCR獲取和擴增目的基因。
②人工合成目的基因
a．逆轉錄法：主要用于相對分子質量較大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA為模板，借助逆轉錄酶合成雙鏈DNA，其過程如下：
b．化學合成法：依據某一蛋白質的氨基酸序列，推測出其基因序列，然后直接合成目的基因，其過程如下：
③從基因文庫中獲取目的基因
根據目的基因的有關信息，例如，根據基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉錄產物——mRNA，以及基因的表達產物——蛋白質等特性來獲取目的基因。
2．PCR技術的過程
(1)
(2)循環圖示與規律
循環次數 1 2 3 n
DNA分子數 2 4 8 2n
含引物A(或B)的DNA分子數 1 3 7 2n－1
同時含引物A、B的DNA分子數 0 2 6 2n－2
共消耗的引物數量 2 6 14 2n＋1－2
注：第三輪循環后，開始出現雙鏈等長的目的基因片段。
突破1 PCR技術
核心素養 科學思維
1．(2022·天津高三模擬)PCR技術是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，使目的DNA得以迅速擴增。其簡要過程如下圖所示。下列關于PCR技術敘述錯誤的是(　　)
A．PCR反應中新合成的DNA又可以作為下一輪反應的模板
B．PCR技術制備大量DNA時引物要被不斷消耗
C．DNA的合成方向總是從子鏈的3′端向5′端延伸
D．應用PCR技術與探針雜交技術可以檢測特定的基因
解析：選C。DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸，C錯誤。
2．(2020·高考江蘇卷改編)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側的序列，具體流程如下圖(以EcoR Ⅰ酶切為例)：
請據圖回答問題：
(1)步驟Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一種________________酶，它通過識別特定的________________切割特定位點。
(2)步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′ 羥基與5′ 磷酸間形成________________；PCR循環中，升溫到超過90 ℃是為了獲得________；耐高溫的DNA聚合酶的作用是催化________________________________________________________________________。
(3)若下表所列為已知的DNA序列和設計的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是________(從引物①②③④中選擇，填編號)。
DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物 ①5′—AACTATGCGCTCATGA—3′②5′—GCAATGCGTAGCCTCT—3′③5′—AGAGGCTACGCATTGC—3′④5′—TCATGAGCGCATAGTT—3′
(4)對PCR產物測序，經分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列)，結果正確的是________。
A．5′—AACTATGCG…………AGCCCTT—3′
B．5′—AATTCCATG…………CTGAATT—3′
C．5′—GCAATGCGT…………TCGGGAA—3′
D．5′—TTGATACGC…………CGAGTAC—3′
解析：(1)EcoR Ⅰ是一種限制性內切核酸酶，它通過識別特定的核苷酸序列切割特定位點，使切割后的DNA片段具有相同的黏性末端。(2)DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′ 羥基與5′ 磷酸間形成磷酸二酯鍵。在PCR循環中，升溫到超過90 ℃是為了使DNA變性，DNA雙鏈解聚為DNA單鏈，以作為DNA擴增的模板鏈。耐高溫的DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，以結合在特定DNA模板上的引物為出發點，將4種游離的脫氧核苷酸按5′→3′方向沿模板鏈順序合成新的DNA子鏈，故其作用是催化以DNA為模板的DNA鏈的延伸。(3)片段F中，已知的DNA序列如下所示：
，
要通過設計引物進行反向PCR，從而得到已知序列在兩端、未知序列在中間段的PCR產物(過程如反向PCR的原理示意圖)，則需要反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段，因此要選擇5′—GCAATGCGTAGCCTCT—3′和5′—TCATGAGCGCATAGTT—3′這對引物。(4)分析題意可知，片段下的兩端為限制酶EcoRⅠ切割后產生的黏性末端，因此其5′端序列應為AATT—，3′端序列為—TTAA，B正確。
答案：(1)限制性內切核酸(或限制)　核苷酸序列　(2)磷酸二酯鍵　DNA單鏈　以DNA為模板的DNA鏈的延伸　(3)②④　(4)B
突破2 基因工程的操作程序
核心素養 科學思維
3．(不定項)(2021·遼寧省適應性考試?？?菊花是一種雙子葉植物，易感桃蚜。桃蚜不但直接影響植物生長，還是多種植物病毒的傳播媒介。雪花蓮凝集素基因GNA的表達產物能有效抑制桃蚜生長。某科研團隊運用農桿菌轉化法獲得了轉GNA基因菊花。下列有關敘述正確的是(　　)
A．受體細胞可以選擇菊花葉片細胞或桃蚜細胞
B．將目的基因GNA插入Ti質粒的T DNA上構建表達載體
C．菊花外植體產生的酚類化合物能吸引農桿菌移向受體細胞
D．應用抗蟲接種實驗，檢測轉基因菊花對桃蚜的抗性及抗性的程度
解析：選BCD?？茖W家將目的基因導入了菊花細胞，故受體細胞可以選擇菊花葉片細胞，但不能選擇桃蚜細胞，A錯誤；基因工程中構建表達載體時，由于T DNA可以轉移到受體細胞內， 故可以將目的基因GNA插入Ti質粒的T DNA上，B正確；菊花外植體產生的酚類化合物能吸引農桿菌移向受體細胞，有利于目的基因的導入，C正確；已知雪花蓮凝集素基因GNA的表達產物能有效抑制桃蚜生長，故應用抗蟲接種實驗，檢測轉基因菊花對桃蚜的抗性及抗性的程度，D正確。
4．人參是一種名貴中藥材，具有良好的滋補作用。干擾素可用于治療慢性乙肝、丙肝及部分腫瘤。下圖為三種限制酶識別序列與酶切位點及制備能合成干擾素的人參愈傷組織細胞的示意圖。請回答下列問題：
(1)圖中①的DNA用Hind Ⅲ、BamH Ⅰ完全酶切后，反應管中有________種DNA片段。以一個DNA為模板，利用PCR技術擴增干擾素基因時，擴增第n次時，需要________個引物，設計引物序列的主要依據是____________。
(2)假設圖中質粒上BamH Ⅰ識別位點的堿基序列變為了另一種限制酶BclⅠ識別位點的堿基序列，現用Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ切割質粒，那么該圖中①的DNA右側選擇________進行切割，理由是________________________。
(3)在構建重組質粒的過程中，用Hind Ⅲ、BamH Ⅰ切割質粒和目的基因比只用BamHⅠ好，這樣可以防止________和__________。②過程需要用到的酶是__________。
(4)④過程檢測人參愈傷組織細胞是否產生干擾素，所用的方法是______________________。
答案：(1)4　2n　干擾素基因兩端的部分核苷酸序列　(2)BamH Ⅰ　BamHⅠ、Bcl Ⅰ切割后產生的黏性末端相同　(3)目的基因的自身環化　目的基因反向接入質?！NA連接酶　(4)抗原—抗體雜交
[事實概述類]
1．在培育有些轉基因植物時，常用農桿菌轉化法，農桿菌的作用是_____________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案：侵染植物，將目的基因轉移到受體細胞中
2．[2017·全國Ⅱ，T38(2)改編]以mRNA為材料可以獲得DNA，其原理是____________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案：在逆轉錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補配對的原則可以合成DNA
3．[2017·江蘇，T33(4)改編]PCR擴增時，復性溫度的設定是成敗的關鍵。復性溫度過高會破壞__________的堿基配對。復性溫度的設定與引物長度、堿基組成有關，長度相同但________的引物需要設定更高的復性溫度。
答案：引物與模板　G、C含量高
4．[2015·全國Ⅰ，T40(2)]從受體細胞中分離純化出目的蛋白，該蛋白作為抗原注入機體后，刺激機體產生的可與此蛋白結合的相應分泌蛋白是________，該分泌蛋白可用于檢測受試者血清中的HIV，檢測的原理是_____________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案：抗體　抗原、抗體特異性結合
5．質粒運載體用EcoR Ⅰ切割后產生的片段如下：
為使運載體與目的基因相連，含有目的基因的DNA除可用EcoR Ⅰ切割外，還可用另一種限制性內切核酸酶切割，該酶必須具有的特點是_____________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案：切割產生的DNA片段末端與EcoR Ⅰ切割產生的末端相同
6．為確定轉基因抗鹽煙草是否培育成功，既要用________進行檢測目的基因是否已插入，又要在個體水平上鑒定，后者的具體過程是____________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案：PCR技術　將培育的煙草幼苗栽培于含有一定鹽的土壤中，觀察該煙草植株的生長狀態
[原因分析類]
7．若用重組質粒轉化大腸桿菌，一般情況下，不能直接用未處理的大腸桿菌作為受體細胞，原因是_____________________________________________
____________________________。
答案：未處理的大腸桿菌吸收質粒(外源DNA)的能力極弱
8．[2017·全國Ⅰ，T38(2)]若用家蠶作為表達基因A的受體，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，不選用__________作為載體，其原因是________________________________________________________________________。
答案：噬菌體　噬菌體的宿主是細菌，而不是家蠶
9．[2017·全國Ⅱ，T38(3)]若要使目的基因在受體細胞中表達，需要通過質粒載體而不能直接將目的基因導入受體細胞，原因是________________________
________________________________________________________________________(答出兩點即可)。
答案：目的基因無復制原點；目的基因無表達所需的啟動子
10．[2019·全國Ⅰ，T38(3)改編]目前在PCR反應中使用耐高溫的DNA聚合酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是________________________
________________________________________________________________________。
答案：耐高溫的DNA聚合酶熱穩定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活
考點三　基因工程的應用與蛋白質工程
1．基因工程的應用
(1)基因工程在農牧業方面的應用
(2)基因工程在醫藥衛生領域的應用
　乳腺生物反應器與膀胱生物反應器
a．乳腺生物反應器是利用轉基因動物的乳汁生產藥用蛋白，而膀胱生物反應器是利用轉基因動物的尿液生產藥用蛋白，二者的優點是產量高、質量好、成本低、易提取，且不必對動物造成傷害。
b．乳腺生物反應器需是處于生殖期的雌性動物才可生產藥用蛋白，而膀胱生物反應器則是任何生長時期的雌、雄動物均可生產。
②器官移植：在器官供體的基因組中導入某種調節因子，以抑制抗原決定基因的表達，或設法除去抗原決定基因，然后再結合克隆技術，培育出不會引起免疫排斥反應的轉基因克隆器官。
(3)基因工程在食品工業方面的應用
2．蛋白質工程
　基因工程不會導致受體細胞或生物產生“新基因”或“新蛋白質”。
(1)Bt基因來源于蘇云金桿菌，對哺乳動物有毒害作用。(　　)
(2)乳腺生物反應器是將藥用蛋白基因導入動物的乳腺細胞中。(　　)
(3)用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達的菌類一般稱為基因工程菌。(　　)
(4)為延長干擾素保存時間，需要替換氨基酸；為提高玉米中賴氨酸含量，需要在蛋白質中加入賴氨酸。(　　)
(5)由大腸桿菌工程菌獲得的人干擾素可直接應用。(　　)
(6)蛋白質工程是在分子水平上對蛋白質分子直接進行操作，定向改造分子的結構。(　　)
答案：(1)×　(2)×　(3)√　(4)×　(5)×　(6)×
1．(選擇性必修3 P90文字改編)利用轉基因技術獲得的已整合藥用蛋白基因的轉基因小鼠分泌的乳汁中檢測不到藥用蛋白，根據中心法則分析，其可能的原因是
________________________________________________________________________。
提示：藥用蛋白基因沒有轉錄或翻譯
2．(選擇性必修3 P94圖3－17)對天然蛋白質進行改造，你認為應該直接對蛋白質分子進行操作，還是通過對基因的操作來實現？原因是什么？________________________________________________________________________。
提示：通過對基因的操作來實現對天然蛋白質的改造。原因是任何蛋白質都是由基因編碼的，改造了基因即對蛋白質進行了改造，而且改造過的基因可以遺傳下去。如果對蛋白質直接進行改造，即使改造成功了，被改造過的蛋白質分子還是無法遺傳
突破1 基因工程的應用
核心素養 社會責任
1．(不定項)利用基因工程技術生產羧酸酯酶(CarE)制劑的流程如下圖所示，下列敘述正確的是(　　)
A．過程①需使用逆轉錄酶
B．過程②需使用解旋酶和PCR獲取目的基因
C．過程③使用的大腸桿菌細胞可用Na＋處理
D．過程④可利用RCR技術檢測目的基因是否已導入受體細胞
解析：選AD。過程①表示利用mRNA通過逆轉錄法合成目的基因，逆轉錄過程中需要逆轉錄酶的催化，A正確；過程②表示利用PCR技術對目的基因進行擴增，該過程中不需要利用解旋酶，解旋是通過高溫實現的，B錯誤；大腸桿菌細胞應利用Ca2＋處理，使其處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，C錯誤；過程④可利用RCR技術檢測目的基因是否已導入受體細胞，D正確。
2．(2020·高考全國卷Ⅲ)W是一種具有特定功能的人體蛋白質。某研究小組擬仿照制備乳腺生物反應器的研究思路，制備一種膀胱生物反應器來獲得W，基本過程如圖所示。
回答下列問題：
(1)步驟①中需要使用的工具酶有______________________________________。步驟②和③所代表的操作分別是________和________。步驟④稱為________。
(2)與乳腺生物反應器相比，用膀胱生物反應器生產W的優勢在于不受轉基因動物的________________(答出2點即可)的限制。
(3)一般來說，在同一動物個體中，乳腺上皮細胞與膀胱上皮細胞的細胞核中染色體DNA所含的遺傳信息________(填“相同”或“不同”)，原因是_____________________________________________________________________
__________________________________。
(4)從上述流程可知，制備生物反應器涉及胚胎工程，胚胎工程中所用到的主要技術有______________________(答出2點即可)。
答案：(1)限制性內切核酸酶、DNA連接酶　顯微注射　體外培養　胚胎移植　(2)性別、年齡　(3)相同　兩種上皮細胞都是體細胞且來源于同一個受精卵　(4)體外受精、胚胎移植
突破2 蛋白質工程及其應用
核心素養 生命觀念、社會責任
3．新冠病毒的表面刺突蛋白(S蛋白)的受體結合域(RBD)與人體細胞表面的ACE2受體相互作用感染細胞。科學家設計了一種自然界中不存在的蛋白質LCB1，可與S蛋白的RBD緊密結合，以干擾新冠病毒的感染。下列說法不合理的是(　　)
A．LCB1的作用機理與S蛋白的抗體類似
B．LCB1可依據S蛋白的RBD結構進行設計
C．LCB1是通過細胞中原有基因表達產生的
D．可用蛋白質工程進行LCB1的設計
解析：選C。LCB1是自然界中不存在的蛋白質，故無法通過細胞中原有基因表達產生，C不合理。
4．已知生物體內有一種蛋白質(P)，該蛋白質是一種轉運蛋白，由305個氨基酸組成。如果將P分子中158位的絲氨酸變成亮氨酸，240位的谷氨酰胺變成苯丙氨酸，改變后的蛋白質(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性?；卮鹣铝袉栴}：
(1)從上述資料可知，若要改變蛋白質的功能，可以考慮對蛋白質的________________進行改造。
(2)以P基因序列為基礎，獲得P1基因的途徑有改造________基因或合成________基因。所獲得的基因表達時是遵循中心法則的，中心法則的全部內容包括________________的復制，以及遺傳信息在不同分子之間的流動，即___________________________________________________________________
__________________________。
(3)蛋白質工程也被稱為第二代基因工程，其基本途徑是從預期的蛋白質功能出發，通過____________________和______________________，進而確定相對應的脫氧核苷酸序列，據此獲得基因，再經表達、純化獲得蛋白質，之后還需要對蛋白質的生物________進行鑒定。
答案：(1)氨基酸序列(或結構)
(2)P　P1　DNA和RNA(或遺傳物質)　DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白質(或轉錄、逆轉錄、翻譯)
(3)設計預期的蛋白質結構　推測應有的氨基酸序列　功能
基因工程與蛋白質工程的比較
(1)區別
項目 基因工程 蛋白質工程
過程 篩選和獲取目的基因→基因表達載體的構建→將目的基因導入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定 預期蛋白質功能→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到并改變相對應的脫氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→獲得所需要的蛋白質
實質 定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的生物類型和生物產品 定向改造或生產人類所需的蛋白質
結果 只能生產自然界已存在的蛋白質 可生產自然界沒有的蛋白質
(2)聯系
①蛋白質工程是在基因工程的基礎上延伸出來的第二代基因工程。
②基因工程中所利用的某些酶需要通過蛋白質工程進行改造?！?br/>考點四　DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴增及電泳鑒定
1．DNA的粗提取與鑒定
(1)實驗原理
(2)方法步驟(以洋蔥為例)
?、偌尤刖凭陀貌ＡО魯嚢钑r，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。
②本實驗不能用哺乳動物成熟的紅細胞作為實驗材料，原因是哺乳動物成熟的紅細胞無細胞核(無DNA)，可選用雞血細胞作為材料。
③鑒定DNA時，一支試管為對照組，另一支試管為實驗組。兩支試管中都先加物質的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液；在實驗組試管中加DNA絲狀物，對照組不加；加入二苯胺試劑后沸水浴加熱。待試管冷卻后，結果可以看到加DNA絲狀物的試管呈現藍色，對照組無色。如果實驗組藍色較淺，說明提取出的DNA量太少。
2．DNA片段的擴增及電泳鑒定
(1)原理
①PCR原理：DNA的熱變性原理，即通過調節溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合。
②電泳
(2)方法步驟
①PCR擴增
②鑒定PCR產物→瓊脂糖凝膠電泳法→配制瓊脂糖溶液→制備瓊脂糖凝膠→將電泳緩沖液加入電泳槽中→加樣→電泳→取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。
　a．為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。
b．在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換，避免試劑的污染。
c．在進行操作時，一定要戴好一次性手套。
d．觀察DNA帶的分布及粗細程度來評價擴增的效果。
(1)在溶有DNA的NaCl溶液中，加入二苯胺試劑即呈藍色。(　　)
(2)DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精。(　　)
(3)進行DNA片段的擴增及電泳鑒定實驗所需的緩沖液和酶應分裝成小份，并在20 ℃條件下儲存。(　　)
(4)在凝膠中DNA分子的遷移速率只與DNA分子的大小相關。(　　)
(5)為了節約資源，移液器上的槍頭在實驗過程中不必更換。(　　)
答案：(1)×　(2)√　(3)×　(4)×　(5)×
1．(2022·北京高三模擬)下圖是快速RT PCR過程示意圖，①和②為逆轉錄酶催化的逆轉錄過程，③是PCR過程。據圖分析下列敘述錯誤的是(　　)
A．逆轉錄酶具有DNA聚合酶能力
B．③PCR過程只需要引物b
C．RT PCR可檢測基因表達水平
D．RT PCR可檢測新冠病毒等RNA病毒
解析：選B。③PCR過程需要引物a、b，因為后續的模板鏈序列既有與靶RNA一致的，也有與cDNA一致的，B錯誤。
2．用Xho Ⅰ和Sal Ⅰ兩種限制性內切核酸酶分別處理同一DNA片段，酶切位點及酶切產物分離結果如下圖所示。以下敘述不正確的是(　　)
A．圖1中兩種酶識別的核苷酸序列不同
B．圖2中酶切產物可用于構建重組DNA
C．泳道①中是用Sal Ⅰ處理得到的酶切產物
D．圖中被酶切的DNA片段是單鏈DNA
解析：選D。能被限制性內切核酸酶酶切的DNA片段仍為雙鏈DNA，D錯誤。
3．(不定項)(2022·黃山模擬)下圖是“DNA的粗提取與鑒定”實驗中幾個重要操作的示意圖，下列敘述正確的是(　　)
A．通過①操作使NaCl溶液濃度降至0.014 mol/L，析出DNA
B．經①②操作，DNA留在紗布上；經③②操作，則DNA留在濾液中
C．圖④是用預冷的體積分數為95%的酒精來進一步純化粗提取的DNA
D．圖①③④都需要玻璃棒沿一個方向輕緩攪拌，以防止破壞DNA
答案：BC
考點五　生物技術的安全性與倫理問題
1．轉基因成果
2．關注生殖性克隆人
3．禁止生物武器
(1)對微生物的基因改造是基因工程中研究最早、最廣泛和取得實際應用成果最多的領域。(　　)
(2)轉基因技術已被用來減少啤酒酵母雙乙酰的生成，縮短啤酒的發酵周期。(　　)
(3)高產青霉素菌株屬于轉基因成果。(　　)
(4)中國政府主張對治療性克隆和生殖性克隆的有效監控并進行嚴格審查。(　　)
(5)設計試管嬰兒與試管嬰兒技術沒有區別。(　　)
(6)生物武器可通過吸入、誤食、接觸帶菌物品，被帶菌昆蟲叮咬等侵入人體。(　　)
答案：(1)√　(2)√　(3)×　(4)×　(5)×　(6)√
突破1 轉基因成果
核心素養 社會責任
1．(2022·山東臨沂高三期末)現在轉基因技術已經相當成熟，前不久美國批準轉基因三文魚進入市場，旨在利用生物技術提升水產產業，不過這種轉基因三文魚目前只能在加拿大和巴拿馬飼養。下列關于轉基因技術的敘述，正確的是(　　)
A．轉基因技術的原理是DNA分子雜交
B．轉基因技術的應用解決了人類史上的很多難題，是有利無害的
C．現在很多轉基因食品包裝都有警示標志
D．轉基因食品比傳統食品的營養更豐富，因此在不久之后轉基因食品會替代傳統食品
答案：C
2．(2022·安徽蚌埠一模)轉基因食品存在“是否安全”的爭議，有人認為轉基因食品是有害的。比如抗“草甘膦(除草劑)”轉基因農作物的種植，使噴灑除草劑的人患癌癥。請用已學知識判斷，以下說法正確的是(　　)
A．自古就有“吃啥補啥”的說法，所以吃了轉基因食品，則其中的基因會整合到人的基因組中
B．嚴格管理好目的基因和控制好目的基因的表達部位，則轉基因食品的安全性可以得到保障
C．若食用轉基因大米，就一定會對人的健康造成危害
D．抗除草劑植物生產的食品會導致人患癌癥
答案：B
突破2 關注生殖性克隆人、禁止生物武器
核心素養 社會責任
3．(2022·山東百師聯盟聯考)2018年11月，世界首例免疫艾滋病的基因編輯嬰兒誕生。這項研究用到了能夠精確定位并修飾基因的基因編輯技術，即基因編輯時用約為頭發二十分之一細的針把Cas9蛋白和特定的RNA引導序列注入受精卵中，對CCR 5基因進行修改，預期嬰兒出生后能天然抵抗人類免疫缺陷病毒，關于該技術的安全性問題，下列說法錯誤的是(　　)
A．基因編輯時，引導序列可能發生變異，導致剪切錯誤，造成不可預知的后果
B．經過基因編輯的個體，有可能影響基因選擇性表達，而導致其他疾病的產生
C．將基因編輯技術應用于治療性克隆，符合人類倫理道德
D．只要加強監管、完善法律法規、完善技術手段，不需擔心基因編輯技術的安全性
解析：選D?？梢约訌姳O管、完善法律法規、完善技術手段，但基因編輯技術仍存在一定的安全性問題，D錯誤。
4.(2022·泰州高三模擬)“試管嬰兒”技術是通過將不孕夫婦的精子和卵細胞取出，在試管中完成受精，并在試管中培養使其發育到如右圖所示的時期，再將胚胎植入女性子宮內發育成胎兒，它使一部分不能生育的夫婦重新獲得了生育的機會。下列敘述正確的是(　　)
A．“試管嬰兒”技術在生物學上所依據的原理是無性生殖
B．如圖所示時期是胚胎發育的囊胚期，1代表內細胞團，2代表囊胚腔，3代表滋養層
C．“試管嬰兒”的形成用到的技術有人工授精、體內培養、核移植
D．“試管嬰兒”技術誕生后，繼而出現了“設計試管嬰兒技術”，二者對人類的作用是相同的
解析：選B?！霸嚬軏雰骸奔夹g中存在體外受精，因此屬于有性生殖，A錯誤；圖示時期是胚胎發育的囊胚期，1代表內細胞團，2代表囊胚腔，3代表滋養層，B正確；“試管嬰兒”的形成用到的技術有人工授精、早期胚胎培養、胚胎移植，C錯誤；“設計試管嬰兒”技術可用于治療需要骨髓移植或造血干細胞移植的疾病，“試管嬰兒”技術用于解決不孕不育問題，D錯誤。
“試管嬰兒”和“設計試管嬰兒”的比較
(1)圖示過程中①②③是“試管嬰兒”的培育過程，①②④⑤是“設計試管嬰兒”的培育過程。
(2)后者比前者多了胚胎移植前的“遺傳學診斷”或“基因診斷”。
(3)前者主要是解決不孕夫婦的生育問題，后者主要用于白血病、貧血癥等的治療。
(4)兩者都是體外受精，并進行體外早期胚胎培養，都要經過胚胎移植，都是有性生殖。　
[體驗等級考]
1．(2021·高考河北卷改編)采礦污染和不當使用化肥導致重金屬鎘(Cd)在土壤中過量積累。利用植物修復技術將土壤中的Cd富集到植物體內，進行后續處理(例如，收集植物組織器官異地妥善儲存)，可降低土壤中Cd的含量。為提高植物對Cd污染土壤的修復能力，研究者將酵母液泡Cd轉運蛋白(YCF1)基因導入受試植物，并檢測了相關指標。
回答下列問題：
(1)將DNA序列插入Ti質粒構建重組載體時，所需要的兩種酶是______________。構建的重組基因表達載體中必須含有標記基因，其作用是_____________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)進行前期研究時，將含有YCF1基因的重組載體導入受試雙子葉植物印度芥菜，采用最多的方法是______________________。研究者進一步獲得了轉YCF1基因的不育楊樹株系，采用不育株系作為實驗材料的目的是________________________________________。
(3)將長勢一致的野生型和轉基因楊樹苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后測定植株干重(圖1)及不同器官中Cd含量(圖2)。據圖1可知，與野生型比，轉基因植株對Cd具有更強的________(填“耐性”或“富集能力”)；據圖2可知，對轉基因植株的________進行后續處理對于緩解土壤Cd污染最為方便有效。
(4)已知YCF1特異定位于轉基因植物細胞的液泡膜上。據此分析，轉基因楊樹比野生型能更好地適應高Cd環境的原因是____________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
相較于草本植物，采用楊樹這種喬木作為Cd污染土壤修復植物的優勢在于_____________________________________________________________________
________________________________________________________________________(寫出兩點即可)。
答案：(1)限制酶和DNA連接酶　鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來
(2)農桿菌轉化法　防止YCF1基因通過花粉傳播，造成基因污染
(3)富集能力　葉
(4)轉基因楊樹可利用Cd轉運蛋白將Cd搬運至液泡內，導致細胞液濃度增大　楊樹是多年生植物，更有利于持續儲存Cd，且楊樹的根系更發達
2．(2021·高考遼寧卷改編)PHB2蛋白具有抑制細胞增殖的作用。為初步探究某動物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細胞增殖的原因，研究者從基因數據庫中獲取了該蛋白的基因編碼序列(簡稱phb2基因)，大小為0.9 kb(1 kb＝1 000堿基對)，利用大腸桿菌表達該蛋白。回答下列問題：
(1)為獲取phb2基因，提取該動物肝臟組織的總RNA，再經________過程得到cDNA，將其作為PCR反應的模板，并設計一對特異性引物來擴增目的基因。
(2)圖1為所用載體圖譜示意圖，圖中限制酶的識別序列及切割位點見下表。為使phb2基因(該基因序列不含圖1中限制酶的識別序列)與載體正確連接，在擴增的phb2基因兩端分別引入____________和____________兩種不同限制酶的識別序列。經過這兩種酶酶切的phb2基因和載體進行連接時，可選用________(填“E.coli DNA連接酶”或“T4DNA連接酶”)。
相關限制酶的識別序列及切割位點
名稱 識別序列及切割位點 名稱 識別序列及切割位點
HindⅢ A↓AGCTTTTCGA↑A EcoRⅠ G↓AATTCCTTAA↑G
PvitⅡ CAG↓CTGGTC↑GAC PstⅠ CTGC↓AGGA↑CGTC
KpnⅠ G↓GTACCCCATG↑G BamHⅠ G↓GATCCCCTAG↑G
注：箭頭表示切割位點
(3)轉化前需用CaCl2處理大腸桿菌細胞，使其處于________的生理狀態，以提高轉化效率。
(4)將轉化后的大腸桿菌接種在含氨芐青霉素的培養基上進行培養，隨機挑取菌落(分別編號為1、2、3、4)培養并提取質粒，用(2)中選用的兩種限制酶進行酶切，酶切產物經電分離，結果如圖2，________號菌落的質粒很可能是含目的基因的重組質粒。
注：M為指示分子大小的標準參照物；小于0.2 kb的DNA分子條帶未出現在圖中
(5)將純化得到的PHB2蛋白以一定濃度添加到人宮頸癌細胞培養液中，培養24小時后，檢測處于細胞周期(示意圖見圖3)不同時期的細胞數量，統計結果如圖4。分析該蛋白抑制人宮頸癌細胞增殖可能的原因是將細胞阻滯在細胞周期的__________(填“G1”“S”或“G2/M”)期。
解析：(2)根據啟動子和終止子的生理作用可知，目的基因應導入啟動子和終止子之間。由圖中看出，兩者之間存在三種限制酶切點，但是由于KpnⅠ在質粒上不止一個酶切位點，所以應該選擇EcoRⅠ和PvitⅡ兩種不同限制酶的識別序列；根據PvitⅡ的酶切序列，切出了平末端，所以構建基因表達載體時，應該用T4DNA連接酶連接質粒和目的基因。(3)轉化時用CaCl2處理大腸桿菌細胞，使其處于感受態，以提高轉化效率。(4)由于這些菌落都可以生長在含有氨芐青霉素的培養基中，因此都含有質粒，重組質粒包含了目的基因和質粒，如果用EcoRⅠ和PvitⅡ兩種酶切割重組質粒電泳后將獲得含有質粒和目的基因的兩條條帶，由于phb2基因大小為0.9 kb，所以對應電泳圖是菌落3。(5)圖4中G1期和S期細胞減少，而G2期細胞數目明顯增多，說明了G1期和S期細胞可以進入G2期，而G2期的細胞未能完成分裂進入G1期，因此PHB2蛋白應該作用于G2/M期。
答案：(1)逆轉錄　(2)EcoRⅠ　PvitⅡ　T4DNA連接酶　(3)感受態　(4)3　(5)G2/M
3．(2021·高考海南卷)CRISPR/Cas9是一種高效的基因編輯技術，Cas9基因表達的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在單鏈向導RNA(sgRNA)引導下，切割DNA雙鏈以敲除目標基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因編輯技術的工作原理如圖所示。
回答下列問題。
(1)過程①中，為構建CRISPR/Cas9重組質粒，需對含有特定sgRNA編碼序列的DNA進行酶切處理，然后將其插入經相同酶切處理過的質粒上，插入時所需要的酶是___________________________________________________。
(2)過程②中，將重組質粒導入大腸桿菌細胞的方法是________________。
(3)過程③～⑤中，sgRNA與Cas9蛋白形成復合體，該復合體中的sgRNA可識別并與目標DNA序列特異性結合，二者結合所遵循的原則是________________。隨后，Cas9蛋白可切割________________序列。
(4)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除一個長度為1 200 bp的基因，在DNA水平上判斷基因敲除是否成功所采用的方法是________________，基因敲除成功的判斷依據是____________。
(5)某種蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白?？蒲腥藛T將該蛋白酶基因插入CRISPR/Cas9質粒中獲得重組質粒，隨后將其導入大腸桿菌細胞，通過基因編輯把該蛋白酶基因插入基因組DNA中，構建得到能大量分泌該蛋白酶的工程菌。據圖簡述CRISPR/Cas9重組質粒在受體細胞內，將該蛋白酶基因插入基因組DNA的編輯過程：____________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案：(1)DNA連接酶　(2)感受態細胞法　(3)堿基互補配對原則　目標DNA特定的核苷酸　(4)DNA分子雜交技術　出現雜交帶　(5)CRISPR/Cas9重組質粒在受體細胞內進行轉錄和表達，轉錄的產物是sgRNA，表達的產物是Cas9蛋白，二者形成復合體，該復合體中的sgRNA可識別并與目標DNA序列特異性結合，從而插入基因組DNA中
21世紀教育網 www.21cnjy.com 精品試卷·第 2 頁 （共 2 頁）
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