資源簡介

中小學教育資源及組卷應用平臺
新高考生物一輪考點梳理&分層訓練
第31講　微生物的培養技術及應用
內容比較——知考向 核心素養——提考能
內容要求 1.闡明無菌技術在微生物培養中的應用 2.概述微生物分離和純化的常用方法 3.概述測定微生物數量的常用方法 4.活動：通過配制培養基、滅菌、接種和培養等實驗操作獲得純化的酵母菌菌落 5.活動：分離土壤中分解尿素的細菌，并進行計數 科學思維 分析培養基的成分及其作用，比較平板劃線法和稀釋涂布平板法的異同；掌握無菌技術及微生物的純培養
科學探究 設計實驗探究微生物培養的條件，利用選擇培養基分離細菌，運用相關技術解決生產生活中微生物的計數問題
社會責任 關注有害微生物的控制及宣傳健康生活等
與舊教 材對比 改：①大腸桿菌純化培養改為酵母菌的純培養；②分解纖維素微生物的分離改為課后習題呈現。 刪：①菌種的保藏；②制備牛肉膏蛋白胨固體培養基的步驟。
考點一　微生物的培養技術及應用
1.培養基的配制
(1)概念：人們按照微生物對營養物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養基質。
(2)培養基的種類、特點及用途分析
(3)培養基營養成分的含義、作用、主要來源分析
提醒　(1)是否含有凝固劑(如瓊脂)是區分半固體培養基和液體培養基的唯一標準，含凝固劑的為半固體培養基。
(2)常見選擇培養基舉例
①缺少氮源的培養基可以篩選能利用大氣中N2的微生物。
②含青霉素的培養基可淘汰細菌，篩選出真菌。
③無有機碳源的培養基可篩選出自養微生物。
(3)自養型微生物與異養型微生物的區別
①劃分自養型微生物與異養型微生物的主要依據是能否以CO2作為碳源。需根據微生物的代謝特點去選擇相應的培養基。如自養型微生物可以利用空氣中的CO2，缺碳培養基可以培養自養型微生物。
②自養型微生物所需的碳源、氮源來自含碳、含氮的無機物，而異養型微生物需要的碳源、氮源來自含碳、含氮的有機物，因此可根據培養基中的營養物質判斷微生物的代謝類型。含氮無機物不但能給自養型微生物提供氮源，也能作為能源物質提供能量，如NH3既為硝化細菌提供氮源，也作為能源物質。
2.無菌技術
(1)含義：在培養微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。
(2)常用方法
3.微生物的純培養
(1)微生物純培養的操作步驟
培養物、純培養物、純培養
　(2)倒平板的操作步驟
倒平板操作的注意事項
①培養基要冷卻到50__℃左右時開始倒平板。溫度過高會燙手，過低培養基又會凝固。
②要使錐形瓶的瓶口通過酒精燈火焰。通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養基。
③倒平板時，要用左手的拇指和食指將培養皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，不要完全打開，以免雜菌污染培養基。
④平板冷凝后，要將平板倒置。因為平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，平板倒置后，既可避免培養基表面的水分過快地揮發，又可防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染。
⑤在倒平板的過程中，如果不小心將培養基濺在皿蓋與皿底之間的部位，那么這個平板不能用來培養微生物。因為空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養基上滋生。
⑥整個操作過程要在酒精燈火焰旁進行，避免雜菌污染。
(3)平板劃線法操作步驟
平板劃線操作的注意事項
①第一次劃線及每次劃線之前都需灼燒接種環滅菌，劃線操作結束仍需灼燒接種環。
②灼燒接種環之后，要等其冷卻后才能伸入菌液，以免溫度太高殺死菌種。
③在做第二次以及其后的劃線操作時，總是從上一次劃線的末端開始劃線，這樣才能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐步減少，最終得到由單個細菌繁殖而來的菌落。
④劃線時最后一區域不要與第一區域相連。
⑤劃線用力大小要適當，防止用力過大將培養基劃破。
(1)培養基一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽，有時還需要加入一些特殊的物質(√)
(2)倒平板時，應將打開的皿蓋放到一邊，以免培養基濺到皿蓋上(×)
(3)消毒的原則是既殺死材料表面的微生物，又減少消毒劑對細胞的傷害(√)
(4)為了防止污染，接種環經火焰滅菌后應趁熱快速挑取菌落(×)
(5)用稀釋涂布平板法純化大腸桿菌時，只要稀釋度足夠高，就能在培養基表面形成單個菌落(√)
(6)無菌操作的對象只要是沒有生物活性的材料(如培養基、接種環等)都可采用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌(×)
(7)平板劃線法中每一次劃線后要將接種環灼燒(√)
1.為什么培養基需要氮源？
選擇性必修3 P10“旁欄思考題”
提示　微生物細胞內有蛋白質、核酸、脂肪等多種含氮的營養物質或代謝產物，培養基中的氮源可以作為合成這些營養物質及代謝產物的原料。
2.無菌技術除用來防止實驗室的培養物被其他外來微生物污染外，還有什么作用？
選擇性必修3 P10“旁欄思考題”
提示　無菌技術還能有效避免操作者自身被微生物感染。
3.平板劃線時最后一次劃線為何不能與第一次劃線相連？
提示　最后一次劃線已經將細菌稀釋成單個的細胞，如果與第一次劃線相連，則增加了細菌的數目，得不到純化的效果。
1.常見物品的消毒或滅菌方法
(1)消毒方法及適用對象
(2)滅菌方法及適用對象
2.幾種微生物的營養和能量來源
微生物 碳源 氮源 能源
藍細菌 CO2 NH、NO等 光能
硝化細菌 CO2 NH3 NH3的氧化
根瘤菌 糖類等有機物 N2 有機物
酵母菌 糖類、蛋白質等有機物 蛋白質等 有機物
3.平板劃線操作中幾次灼燒接種環的目的
項目 第一次劃線前灼燒 每次劃線前灼燒 最后一次劃線結束灼燒
目的 避免接種環上可能存在的微生物污染培養物 殺死上次劃線結束后接種環上殘留的菌種，使下次劃線的菌種均來自上次劃線的末端 殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者
考向1　結合無菌技術，考查實驗設計及方案實施能力
1.(2020·江蘇卷，19)為純化菌種，在鑒別培養基上劃線接種纖維素降解細菌，培養結果如圖所示。下列敘述正確的是(　　)
A.倒平板后需間歇晃動，以保證表面平整
B.圖中Ⅰ、Ⅱ區的細菌數量均太多，應從Ⅲ區挑取單菌落
C.該實驗結果因單菌落太多，不能達到菌種純化的目的
D.菌落周圍的纖維素被降解后，可被剛果紅染成紅色
答案　B
解析　倒平板后無需間歇晃動，A錯誤；圖中Ⅰ區、Ⅱ區的細菌數量太多，Ⅲ區的細菌數量較少，可從Ⅲ區挑取單菌落，B正確；Ⅲ區中存在單菌落，該實驗結果能達到菌種純化的目的，C錯誤；剛果紅能與纖維素形成紅色復合物，但不能和纖維素水解后的纖維二糖和葡萄糖形成紅色復合物，因此菌落周圍的纖維素被降解后，不能被剛果紅染成紅色，D錯誤。
2.(2021·山西高三適應考試)自然界里有多種微生物，將其進行合理的篩選、培養和應用，能給醫藥和化工等生產領域帶來巨大經濟效益?；卮鹣铝袉栴}：
(1)對培養基進行滅菌時，多采取________法，而對接種環或涂布器滅菌時則用________法，若要將微生物采用平板劃線法進行分離操作，在固體培養基表面連續進行了5次劃線，則需要對接種環灼燒________次。平板劃線在做第二次及其后的劃線操作時，要從上次劃線的________開始劃線，最后一次劃的線不能與第一次劃的線________。
(2)將接種后的固體培養基和一個未接種的固體培養基放入恒溫箱中________培養，以減少培養基中水分的揮發。其中，培養未接種的固體培養基是為了_____________________。
(3)甲、乙兩組同學用稀釋涂布平板法測定某種微生物的數量，在同一稀釋倍數下每隔一段時間記錄數據(統計時間內微生物總數小于環境容納量)，得到如表結果：
培養時間/小時 24 48 72 96
甲組菌落均值/個 18 25 36 32
乙組菌落均值/個 20 28 38 32
據表可知，計數時最好取培養________小時記錄的菌落數作為實驗結果，一方面是由于培養時間較短，會遺漏菌落數目，另一方面是由于____________________________________。
答案　(1)高壓蒸汽滅菌　灼燒滅菌　6　末端　相連　(2)倒置　作為對照組，排除培養基被雜菌污染的可能　(3)72　培養時間過長，兩個或多個菌落連成一個菌落
解析　(1)對培養基進行滅菌時，多采取高壓蒸汽滅菌法，而對接種環或涂布器滅菌時則用灼燒滅菌法。接種環在每次接種前都要灼燒滅菌，最后一次接種完也要滅菌，所以在固體培養基表面連續進行了5次劃線，需要對接種環灼燒6次。平板劃線在做第二次及其后的劃線操作時，要從上次劃線的末端開始劃線，使菌體的數目隨著劃線次數的增加而逐漸減少，最終獲得由單個菌體形成的單個菌落。最后一次劃的線不能與第一次劃的線相連。(2)將接種后的固體培養基和一個未接種的固體培養基放入恒溫培養箱中倒置培養，以減少培養基中水分的揮發。培養未接種的固體培養基是為了作為對照組，排除培養基被雜菌污染的可能。(3)根據表中數據可知，甲組和乙組中的菌落數都在72小時達到最大，由此推知最好取72小時記錄的菌落數作為實驗結果，原因：①培養時間不足會遺落菌落數目；②培養時間過長會導致兩個或多個菌落連成一個菌落，使計數不準確。
考向2　結合微生物的純培養，考查科學思維能力
3.(2019·全國卷Ⅲ，37)回答下列與細菌培養相關的問題。
(1)在細菌培養時，培養基中能同時提供碳源、氮源的成分是________(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常，制備培養基時要根據所培養細菌的不同來調節培養基的pH，其原因是________________________________________________________________________。
硝化細菌在沒有碳源的培養基上________(填“能夠”或“不能”)生長，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)用平板培養細菌時一般需要將平板________(填“倒置”或“正置”)。
(3)單個細菌在平板上會形成菌落，研究人員通常可根據菌落的形狀、大小、顏色等特征來初步區分不同種的微生物，原因是____________________________________________。
(4)有些使用后的培養基在丟棄前需要經過________處理，這種處理可以殺死丟棄物中所有的微生物。
答案　(1)蛋白胨　不同細菌生長繁殖所需的最適pH不同　能夠　硝化細菌可以利用空氣中的CO2作為碳源
(2)倒置
(3)在一定的培養條件下，不同種微生物表現出各自穩定的菌落特征
(4)滅菌
解析　(1)細菌培養時常用牛肉膏蛋白胨培養基，牛肉膏能提供碳源、氮源、磷酸鹽、維生素，蛋白胨能提供碳源、氮源、維生素，而葡萄糖不能提供氮源，NaNO3不能為微生物提供碳源。不同細菌生長繁殖所需要的最適pH是不同的，應該根據培養細菌的不同來調節培養基的pH。硝化細菌是化能自養型細菌，可以利用空氣中的CO2為碳源，因此在沒有碳源的培養基上能夠生長。(2)在平板培養基上培養細菌時，一般需將平板倒置，這樣可以防止皿蓋上的水珠落入培養基造成污染。(3)不同種類的細菌所形成的菌落，在大小、形狀、光澤度、顏色、硬度、透明度等方面具有一定的特征，不同種細菌在一定培養條件下表現出各自穩定的菌落特征，可以作為菌種鑒定的重要依據。(4)使用后的培養基在丟棄前需進行滅菌處理，以免污染環境。
考點二　微生物的選擇培養和計數
1.微生物篩選的原理
(1)原理：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物的生長。即根據不同微生物的特殊營養要求或其對某化學、物理因素的抗性不同而制備培養基。
(2)篩選方法
方法 特點 舉例
利用營養缺陷型選擇培養基進行的選擇培養 通過控制培養基的營養成分，使營養缺陷型微生物不能正常生長 缺乏氮源的培養基可篩選自生固氮微生物
利用某種化學物質進行的選擇培養 在培養基中加入某種化學物質，抑制某些微生物，同時選擇所需的微生物 加入青霉素的培養基可抑制細菌，分離出真菌
利用培養條件進行的選擇培養 改變微生物的培養條件 將培養基放在高溫環境中培養，可分離出耐高溫的微生物
2.稀釋涂布平板法
將菌液進行一系列的梯度稀釋后，將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養基表面，進行培養
(1)系列稀釋操作
取1 mL上清液加入盛有9 mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。
(2)涂布平板操作
(3)稀釋涂布平板法計數的幾個注意事項
①為了保證結果準確，一般選擇菌落數在30～300的平板進行計數。
②要設置對照實驗，且一定要涂布至少3個平板作為重復組，才能增強實驗的說服力與準確性。
③計數時機：每隔24 h統計一次菌落數目，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果，這樣可以防止因培養時間不足而導致遺漏菌落的數目。
④用此種方法統計的菌落數目往往比活菌的實際數目低。 這是因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。因此，統計結果一般用菌落數而不是用活菌數來表示。
3.土壤中分解尿素的細菌的分離與計數的實驗操作
(1)實驗原理
(2)實驗流程
(3)統計細菌數目的方法
①顯微鏡直接計數法
即稀釋涂布平板法
②間接計數法——活菌計數法
原理：當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。
(4)實驗結果分析與評價
4.分解纖維素的微生物的分離
(1)分離方法與原理
(2)纖維素分解菌的培養基成分及鑒定原理
(1)選擇培養基可以鑒定某種微生物的種類(×)
(2)對細菌進行計數只能采用稀釋涂布平板法，而不能用平板劃線法(×)
(3)篩選能分解尿素的細菌所利用的培養基中，尿素是唯一的氮源(√)
(4)分解尿素的細菌在分解尿素時，可以將尿素轉化為氨，使得培養基的酸堿度降低(×)
(5)剛果紅可以與纖維素形成透明復合物，所以可以通過是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌(×)
1.平板劃線法和稀釋涂布平板法的比較
2.選擇培養基四種常見制備方法或實例
(1)加入某些特定的物質(前提是培養基具備全部營養成分)
(2)改變培養基的營養成分
(3)利用培養基“特定化學成分”分離
(4)通過某些“特殊環境”分離
考向1　結合選擇培養基成分及配制方法，考查科學探究能力
1.(2020·浙江7月選考，19)下列關于微生物培養及利用的敘述，錯誤的是(　　)
A.利用尿素固體培養基可迅速殺死其他微生物，而保留利用尿素的微生物
B.配制培養基時應根據微生物的種類調整培養基的pH
C.酵母菌不能直接利用糯米淀粉發酵得到糯米酒
D.適宜濃度的酒精可使醋化醋桿菌活化
答案　A
解析　利用尿素固體培養基篩選尿素分解菌時，尿素固體培養基并不直接殺死其他微生物，而是其他微生物不能以尿素為氮源，無法在尿素固體培養基中存活，A錯誤；不同的微生物生長所需的最適pH不同，如細菌適宜生活在中性偏堿環境，霉菌適宜生活在中性偏酸環境，因此配制培養基時應根據微生物的種類調整培養基的pH，B正確；利用糯米釀酒需要先進行糖化，酵母菌不能直接利用淀粉進行發酵，C正確；醋化醋桿菌的發酵底物可為一定濃度的酒—水混合物，適宜濃度的酒精可使醋化醋桿菌活化，D正確。
2.(2020·全國卷Ⅰ，37)[生物——選修1：生物技術實踐]
某種物質S(一種含有C、H、N的有機物)難以降解，會對環境造成污染，只有某些細菌能降解S。研究人員按照下圖所示流程從淤泥中分離得到能高效降解S的細菌菌株。實驗過程中需要甲、乙兩種培養基，甲的組分為無機鹽、水和S，乙的組分為無機鹽、水、S和Y。
回答下列問題：
(1)實驗時，盛有水或培養基的搖瓶通常采用________的方法進行滅菌。乙培養基中的Y物質是________。甲、乙培養基均屬于________培養基。
(2)實驗中初步估測搖瓶M中細菌細胞數為2×107 個/mL，若要在每個平板上涂布100 μL稀釋后的菌液，且保證每個平板上長出的菌落數不超過200個，則至少應將搖瓶M中的菌液稀釋________倍。
(3)在步驟⑤的篩選過程中，發現當培養基中的S超過某一濃度時，某菌株對S的降解量反而下降，其原因可能是________________________________(答出1點即可)。
(4)若要測定淤泥中能降解S的細菌細胞數，請寫出主要實驗步驟：________________________________________________________________________。
(5)上述實驗中，甲、乙兩種培養基所含有的組分雖然不同，但都能為細菌的生長提供4類營養物質，即___________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案　(1)高壓蒸汽滅菌　瓊脂　選擇　(2)104　(3)S的濃度超過某一值時會抑制菌株的生長　(4)取淤泥加入無菌水中，涂布(或稀釋涂布)到乙培養基上，培養后計數　(5)水、碳源、氮源和無機鹽
解析　(1)實驗過程中，對盛有水或培養基的搖瓶進行滅菌時，常采用高壓蒸汽滅菌法。據題圖分析可知，乙培養基為固體培養基，與甲培養基相比，其特有的組分Y物質應是凝固劑瓊脂。甲、乙培養基均只允許能利用物質S作為氮源和碳源的微生物生長，因此均為選擇培養基。(2)據題意，假設至少將搖瓶M中的菌液稀釋X倍，才能保證稀釋后的100 μL菌液中細菌細胞數不超過200個，初步估測搖瓶M中細菌細胞數為2×107個/mL，則稀釋之前100 μL菌液中有2×106個細菌，可得2×106×(1/X)＝200，則X＝104，因此至少應將搖瓶M中的菌液稀釋104倍。(3)在篩選過程中，若培養基中S濃度過高，可能會導致細胞失水，進而抑制菌株的生長。(4)將含有能降解S的細菌的淤泥加入無菌水中，進行適當稀釋后，利用稀釋涂布平板法，取適量的菌液涂布到乙培養基上，在適宜條件下進行培養，一段時間后，統計菌落數，即可估算出淤泥中能降解S的細菌細胞數。(5)本實驗中，甲、乙兩種培養基所含有的組分雖然不同，但都能為細菌的生長提供的營養物質是水、碳源、氮源和無機鹽。
考向2　圍繞土壤中分解尿素細菌的分離，考查科學探究能力
3.(2020·山東聊城期初)某些土壤細菌可將尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。下列關于土壤中分解尿素細菌的分離和計數的敘述，正確的是(　　)
A.分解尿素的細菌是以尿素的分解產物CO2作為碳源的
B.倒平板時應將打開的培養皿蓋放到一邊，以免培養基濺到皿蓋上
C.培養基中KH2PO4等的作用之一是作為緩沖劑保持pH穩定
D.若實驗組菌落平均數為37個/平板，空白對照平板上有3個菌落，則本組菌落數的平均值為34個/平板
答案　C
解析　分解尿素的細菌是異養型，不能以CO2作為碳源，A錯誤；倒平板時，不能將打開的培養皿蓋放到一邊，以免被雜菌污染，B錯誤；無機鹽可以作為緩沖劑保持細胞生長過程中pH的穩定，所以培養基中KH2PO4等的作用之一是作為緩沖劑保持pH穩定，C正確；在完全正確的操作情況下，空白對照組中不應出現菌落，若空白對照組出現菌落，說明操作過程中存在雜菌污染，屬于實驗失誤，所有實驗數據均不應采用，D錯誤。
4.(2017·全國卷Ⅰ，37)某些土壤細菌可將尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用?；卮鹣铝袉栴}：
(1)有些細菌能分解尿素，有些細菌則不能，原因是前者能產生________________。能分解尿素的細菌不能以尿素的分解產物CO2作為碳源，原因是____________________________
________________________________________________________________________，
但可用葡萄糖作為碳源，進入細菌體內的葡萄糖的主要作用是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________(答出兩點即可)。
(2)為了篩選可分解尿素的細菌，在配制培養基時，應選擇________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作為氮源，不選擇其他兩組的原因是___________________________
________________________________________________________________________。
(3)用來篩選分解尿素細菌的培養基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________________________________________________________________
________________________________________________________________________(答出兩點即可)。
答案　(1)脲酶　分解尿素的細菌是異養生物，不能利用CO2來合成有機物　為細胞生命活動提供能量，為其他有機物的合成提供原料　(2)尿素　其他兩組都含有NH4NO3，能分解尿素的細菌和不能分解尿素的細菌都能利用NH4NO3，不能起到篩選作用　(3)為細菌生長提供無機鹽離子，作為緩沖劑保持細菌生長過程中pH的穩定
解析　(1)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。能分解尿素的細菌是一種分解者，屬于異養型生物，不能以尿素的分解產物CO2作為碳源。能分解尿素的細菌可以以葡萄糖作為碳源，進入細菌體內的葡萄糖的主要作用是一方面可氧化分解為細胞生命活動提供能量，另一方面其代謝中間產物可為多種有機物的合成提供原料。
(2)為了篩選可分解尿素的細菌，在配制培養基時，應選擇以尿素作為唯一氮源的選擇培養基，而其他兩組都含有含氮物質NH4NO3，能分解尿素的細菌和不能分解尿素的細菌都能利用NH4NO3，不能起到篩選作用。
(3)用來篩選分解尿素細菌的培養基含有KH2PO4和Na2HPO4，既可維持培養基pH的相對穩定，又能為微生物生長提供無機鹽離子。
重溫真題　經典再現
1.(2019·北京卷，3)篩選淀粉分解菌需使用以淀粉為唯一碳源的培養基。接種培養后，若細菌能分解淀粉，培養平板經稀碘液處理，會出現以菌落為中心的透明圈(如圖)，實驗結果見下表。
菌種 菌落直徑：C/mm 透明圈直徑：H/mm H/C
細菌Ⅰ 5.1 11.2 2.2
細菌Ⅱ 8.1 13.0 1.6
有關本實驗的敘述，錯誤的是(　　)
A.培養基除淀粉外還含有氮源等其他營養物質
B.篩選分解淀粉的細菌時，菌液應稀釋后涂布
C.以上兩種細菌均不能將淀粉酶分泌至細胞外
D.H/C值反映了兩種細菌分解淀粉能力的差異
答案　C
解析　微生物培養基含有四類營養物質：水、無機鹽、碳源、氮源，A正確；常用稀釋涂布平板法篩選淀粉分解菌，涂布前需將菌液稀釋，B正確；淀粉分解菌可分解淀粉，導致菌落周圍的淀粉被分解，不能與碘液反應生成藍色，故而出現透明圈，透明圈直徑與菌落直徑的比值越大，說明細菌分解淀粉能力越強，D正確；由題圖可知，細菌Ⅰ和Ⅱ形成的菌落周圍都出現了透明圈，說明兩種細菌都能將淀粉酶分泌至細胞外，C錯誤。
2.(2020·山東卷，20)野生型大腸桿菌可以在基本培養基上生長，發生基因突變產生的氨基酸依賴型菌株需要在基本培養基上補充相應氨基酸才能生長。將甲硫氨酸依賴型菌株M和蘇氨酸依賴型菌株N單獨接種在基本培養基上時，均不會產生菌落。某同學實驗過程中發現，將M、N菌株混合培養一段時間，充分稀釋后再涂布到基本培養基上，培養后出現許多由單個細菌形成的菌落，將這些菌落分別接種到基本培養基上，培養后均有菌落出現。該同學對這些菌落出現原因的分析，不合理的是(　　)
A.操作過程中出現雜菌污染
B.M、N菌株互為對方提供所缺失的氨基酸
C.混合培養過程中，菌株獲得了對方的遺傳物質
D.混合培養過程中，菌株中已突變的基因再次發生突變
答案　B
解析　若操作過程中出現雜菌污染，則基本培養基上會有雜菌生長，從而出現菌落，A正確；若M、N菌株互為對方提供所缺失的氨基酸，則M、N菌株混合培養一段時間，充分稀釋后再涂布到基本培養基上，培養后會出現許多由單個細菌形成的菌落，但由于M、N菌株的遺傳物質沒有改變，將這些菌落分別接種到基本培養基上時，培養后不會再有菌落出現，B錯誤；若混合培養過程中，菌株獲得了對方的遺傳物質或菌株中已突變的基因再次發生突變，都會造成遺傳物質改變，則混合培養一段時間，充分稀釋涂布到基本培養基上培養后會有菌落出現，將這些菌落再分別接種到基本培養基上培養后，也會有菌落出現，C、D正確。
3.(2019·江蘇卷，12)下列關于微生物實驗操作的敘述，錯誤的是(　　)
A.培養微生物的試劑和器具都要進行高壓蒸汽滅菌
B.接種前后，接種環都要在酒精燈火焰上進行灼燒
C.接種后的培養皿要倒置，以防培養污染
D.菌種分離和菌落計數都可以使用固體培養基
答案　A
解析　培養微生物的培養基一般用高壓蒸汽滅菌法滅菌，微生物的接種工具，如接種針、接種環或其他金屬用具一般通過酒精燈火焰灼燒來滅菌，A錯誤；接種前，接種環要在酒精燈火焰上進行灼燒，防止接種環上附著的微生物對實驗結果造成干擾，接種后灼燒可以防止微生物擴散，對人造成危害，B正確；接種后的培養皿要倒置，防止冷凝水落入培養基造成污染，C正確；在固體培養基表面可形成單菌落，故菌種的分離和菌落的計數可以使用固體培養基，D正確。
4.(2019·全國卷Ⅰ，37)已知一種有機物X(僅含有C、H兩種元素)不易降解，會造成環境污染。某小組用三種培養基篩選土壤中能高效降解X的細菌(目標菌)。
Ⅰ號培養基：在牛肉膏蛋白胨培養基中加入X(5 g/L)。
Ⅱ號培養基：氯化鈉(5 g/L)，硝酸銨(3 g/L)，其他無機鹽(適量)，X(15 g/L)。
Ⅲ號培養基：氯化鈉(5 g/L)，硝酸銨(3 g/L)，其他無機鹽(適量)，X(45 g/L)。
回答下列問題。
(1)在Ⅰ號培養基中，為微生物提供氮源的是________________。Ⅱ、Ⅲ號培養基中為微生物提供碳源的有機物是________________________。
(2)若將土壤懸液接種在Ⅱ號液體培養基中，培養一段時間后，不能降解X的細菌比例會____________，其原因是_____________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)Ⅱ號培養基加入瓊脂后可以制成固體培養基，若要以該固體培養基培養目標菌并對菌落進行計數，接種時，應采用的方法是________________。
(4)假設從Ⅲ號培養基中得到了能高效降解X的細菌，且該菌能將X代謝為丙酮酸，則在有氧條件下，丙酮酸可為該菌的生長提供________________和___________________________。
答案　(1)牛肉膏、蛋白胨　X
(2)下降　不能降解X的細菌因缺乏碳源而不能增殖，能降解X的細菌能夠增殖
(3)稀釋涂布平板法
(4)能量　合成其他物質的原料
解析　(1)牛肉膏蛋白胨培養基中，牛肉膏、蛋白胨為微生物提供了氮源，而Ⅱ號、Ⅲ號培養基中除X外的其他物質均不含碳，所以能為微生物提供碳源的有機物是X。(2)因為Ⅱ號培養基中碳源只有X，相當于是選擇培養基，只有能降解X的細菌才能增殖，不能降解X的細菌因缺乏碳源而不能增殖。(3)要對菌落進行計數，應采用稀釋涂布平板法進行接種。(4)在有氧條件下，丙酮酸參與細菌的有氧呼吸，可以為該菌的生長提供能量和合成其他物質的原料。
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1.(2021·重慶質量抽測調研)不同的微生物對營養物質的需求各不相同。下列有關一種以CO2為唯一碳源的自養微生物營養物質的描述，不正確的是(　　)
A.氮源物質為該微生物提供必要的氮素
B.碳源物質也為該微生物提供能量
C.無機鹽是該微生物不可缺少的營養物質
D.水是該微生物的營養要素之一
答案　B
解析　培養基中的氮源物質可以為該微生物提供必要的氮素，A正確；以CO2為唯一碳源的自養微生物，CO2不能為其提供能量，B錯誤；無機鹽可以為微生物提供碳、氮以外的重要元素，是該微生物不可缺少的營養物質，C正確：水是生物體新陳代謝不可缺少的物質，是該微生物的營養要素之一，D正確。
2.(2021·太原實驗中學調研)微生物的實驗室培養要進行嚴格滅菌和消毒。下列關于滅菌和消毒的敘述，正確的是(　　)
A.滅菌和消毒均可以殺死環境中的一切微生物，包括芽孢和孢子
B.無菌操作時，對實驗操作的空間、操作者的衣物和手進行滅菌
C.灼燒法滅菌的對象是金屬器具，不可以是玻璃器具
D.消毒和滅菌的原理是相同的
答案　D
解析　滅菌是指使用強烈的理化方法殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子，消毒只能殺死物體表面或內部的部分微生物，不能殺死芽孢和孢子，A錯誤；無菌操作時，對實驗操作的空間、操作者的衣物和手進行消毒，B錯誤；灼燒法滅菌的對象可以是金屬器具和玻璃器具，C錯誤；消毒和滅菌的原理相同，都是使微生物的核酸或蛋白質變性，D正確。
3.(2020·上海魯迅中學聯考)下圖表示小方同學在實驗室培養大腸桿菌過程中的部分操作，下列說法錯誤的是(　　)
A.①②③步驟需要在酒精燈火焰旁操作
B.培養基中必須含碳源、氮源、無機鹽和水
C.③步驟接種環多方向劃線是為了便于細菌計數
D.接種結束后，將④倒置放入培養箱中培養
答案　C
解析　①②③步驟依次表示倒平板、用接種環蘸取菌液、進行平板劃線，為了防止被雜菌污染，操作時都需要在酒精燈火焰旁進行，A正確；不同的微生物對營養物質的需求存在差異，但水、碳源、氮源和無機鹽是各種異養型微生物所需的基本營養物質，大腸桿菌是異養型微生物，所以其培養基中必須含碳源、氮源、無機鹽和水，B正確；③步驟為平板劃線法接種大腸桿菌，不能用于計數，C錯誤；劃線接種結束后，將④平板倒置后放入培養箱培養，防止冷凝水污染培養基，同時避免培養基中水分過快地揮發，D正確。
4.(2021·山東濟寧檢測)下列有關微生物培養的敘述，正確的是(　　)
A.配制固體培養基時，所加的瓊脂是從紅藻中提取的脂類
B.劃線操作時，不能將最后一次的劃線與第一次的劃線相連
C.分離計數時，可用平板劃線法對需計數的微生物進行分離
D.純化培養時，培養皿應倒置放在恒溫培養箱內的搖床上培養
答案　B
解析　配制固體培養基時，所加的瓊脂是從紅藻中提取的多糖，A錯誤；劃線時要避免最后一次的劃線與第一次的劃線相連，因為最后一次的劃線菌種是最少的，而第一次的劃線菌種是最致密的，如果連在一起可能影響單個菌落的分離效果，B正確；平板劃線法只能用于分離單個菌落，不能用于計數，C錯誤；搖床應在液體培養基培養微生物時使用，培養皿中的是固體培養基，D錯誤。
5.(2021·山東日照聯考)“篩選”是分離和培養生物新類型常用的手段，下列有關技術中不能篩選成功的是(　　)
A.在牛肉膏蛋白胨培養基中，篩選大腸桿菌
B.在以尿素為唯一氮源的固體培養基中，篩選能夠分解尿素的微生物
C.用纖維素為唯一碳源的培養基，篩選能分解纖維素的微生物
D.在培養基中加入不同濃度的氯化鈉，篩選抗鹽突變體植物
答案　A
解析　在牛肉膏蛋白胨培養基中，幾乎所有細菌都能生長，不能篩選大腸桿菌，A符合題意；在以尿素為唯一氮源的固體培養基中，只有能分解尿素的微生物才能生長，B不符合題意；以纖維素為唯一碳源的培養基，只有能分解纖維素的微生物才能生長，C不符合題意；在培養基中加入不同濃度的氯化鈉，能夠篩選出抗鹽突變體植物，D不符合題意。
6.(2021·河北冀州中學聯考)下列關于細菌分離、培養的敘述中，正確的是(　　)
A.不同種類細菌的生長均需要相同碳源
B.常用液體培養基分離獲得細菌單菌落
C.用含尿素的培養基可選擇分離出能分解利用尿素的細菌
D.含有機磷農藥的培養基可分離出降解有機磷農藥的細菌
答案　D
解析　不同種類細菌的生長需要的碳源一般不同，A錯誤；常用固體或半固體培養基分離獲得細菌單菌落，B錯誤；用只含尿素作為氮源的培養基可選擇分離出能分解尿素的細菌，C錯誤；含有機磷農藥的培養基可分離出降解有機磷農藥的細菌，D正確。
7.(2021·河北承德一中聯考)某工廠產生的廢水中含有苯酚，為了降解廢水中的苯酚，研究人員從土壤中篩選獲得了只能利用苯酚的細菌菌株，篩選的主要步驟如下圖所示，①為土壤樣品懸液。下列相關敘述錯誤的是(　　)
A.圖中②培養目的菌株的選擇培養基中應加入苯酚作為唯一碳源
B.如果要測定②中活細菌數量，常采用稀釋涂布平板法
C.若圖中④為對照實驗，則其中應含除苯酚外的其他碳源
D.⑥上菌落分布均勻，是用平板劃線法獲得的單菌落
答案　D
解析　要篩選獲得只能降解利用苯酚的細菌菌株，圖中②培養目的菌株的選擇培養基中應加入苯酚作為唯一碳源，A正確；如果要測定②中活細菌的數量，常采用稀釋涂布平板法，B正確；④與⑤培養基的主要區別在于④的培養基沒有加入苯酚作為碳源，⑤的培養基中加入苯酚作為碳源，C正確；⑥上菌落分布均勻，是用稀釋涂布平板法獲得的單菌落，D錯誤。
8.(2020·濟南外國語學校聯考)某種菌在30 ℃的環境下，經過6周后會產生2種不同的酶，幾乎可將PET塑料完全分解。下圖是分離、純化和保存菌株的過程，相關敘述正確的是(　　)
A.塑料垃圾中含有大量微生物，是分離該菌株的首選樣品
B.篩選培養基中需要加入PET塑料粉末，通過菌落特征挑出分解PET塑料的菌落
C.通過涂布平板法可以獲得單菌落
D.斜面培養基中含有大量營養物質，可在常溫下長期保存菌株
答案　B
解析　塑料垃圾中含有大量微生物，但不一定含有分解PET塑料的菌株，A錯誤；篩選培養基中需要加PET塑料粉末，通過菌落特征挑出分解PET塑料的菌落，從而獲得分解PET塑料的菌株，B正確；在涂布平板上長出的菌落，可以通過劃線或稀釋涂布平板法進一步純化得到單個菌落，C錯誤；斜面培養基中含有大量營養物質，可在低溫下臨時保存菌株，如果長期保存菌種應選擇甘油管藏法，D錯誤。
9.(2019·全國卷Ⅱ，37)物質W是一種含氮有機物，會污染土壤。W在培養基中達到一定量時培養基表現為不透明。某研究小組欲從土壤中篩選出能降解W的細菌(目標菌)。回答下列問題。
(1)要從土壤中分離目標菌，所用選擇培養基中的氮源應該是________。
(2)在從土壤中分離目標菌的過程中，發現培養基上甲、乙兩種細菌都能生長并形成菌落(如圖所示)。如果要得到目標菌，應該選擇________菌落進一步純化，選擇的依據是
________________________________________________________________________。
(3)土壤中的某些微生物可以利用空氣中的氮氣作為氮源。若要設計實驗進一步確定甲、乙菌能否利用空氣中的氮氣作為氮源，請簡要寫出實驗思路、預期結果和結論，即
________________________________________________________________________。
(4)該小組將人工合成的一段DNA轉入大腸桿菌，使大腸桿菌產生能降解W的酶(酶E)。為了比較酶E與天然酶降解W能力的差異，該小組擬進行如下實驗，請完善相關內容。
①在含有一定濃度W的固體培養基上，A處滴加含有酶E的緩沖液，B處滴加含有相同濃度天然酶的緩沖液，C處滴加________，三處滴加量相同。
②一段時間后，測量透明圈的直徑。若C處沒有出現透明圈，說明________________；若A、B處形成的透明圈直徑大小相近，說明_________________________________________。
答案　(1)W
(2)乙　乙菌落周圍出現透明圈，說明乙菌能降解W
(3)將甲、乙菌分別接種在無氮源培養基上，若細菌能生長，則說明該細菌能利用空氣中的氮氣作為氮源
(4)①緩沖液?、诰彌_液不能降解W　酶E與天然酶降解W的能力相近
解析　(1)要從土壤中分離出能降解含氮有機物W的目標菌，所用選擇培養基應以該特定物質W為氮源。(2)圖示信息顯示，在乙菌落周圍出現透明圈，說明乙菌能降解W，若要得到目標菌，應該選擇乙菌落進一步純化。(3)若要通過設計實驗確定甲、乙兩種細菌能否利用空氣中的氮氣作為氮源，需將甲、乙菌分別接種在無氮源培養基上，若某細菌能生長，則說明該細菌能利用空氣中的氮氣作為氮源。(4)①實驗應遵循單一變量原則，故C處應滴加緩沖液。②一段時間后，測量透明圈的直徑。若C處沒有出現透明圈，說明緩沖液不能降解W；若A、B處形成的透明圈大小相近，說明酶E與天然酶降解W的能力相近。
10.(2021·云南昆明三中測試)某些菌可將尿素分解成CO2和NH3。欲從土壤中分離能分解尿素的細菌，某研究小組利用成分為KH2PO4、Na2HPO4、葡萄糖、瓊脂、尿素的培養基進行了相關實驗。請回答：
(1)在土壤微生物的培養過程中，培養基中的KH2PO4與Na2HPO4除了可以作為________被細菌利用外，它們還具有的功能為________________________。
(2)該培養基對土壤中的微生物具有選擇作用，理由是_________________________________。微生物能分解尿素的原因是其能合成________。
(3)為獲得目的菌的單菌落，常對土壤樣液做________處理。為便于確認目的菌，可在培養基中加入________指示劑，接種并培養菌種后，可根據菌落周圍________判斷出該菌能分解尿素。
答案　(1)無機鹽　維持培養基的pH相對穩定　(2)尿素為該培養基中的唯一氮源，只有能以尿素為氮源的微生物才能在此培養基上生長、增殖　脲酶　(3)稀釋　酚紅　出現紅色
解析　(1)培養基中的KH2PO4與Na2HPO4除可作為無機鹽被細菌利用外，還可構成緩沖液，維持培養基的pH相對穩定，利于微生物的生長與增殖。(2)該培養基中的尿素為唯一氮源，只有能以尿素為氮源的微生物才能在此培養基上生長、增殖，所以該培養基對土壤中的微生物具有選擇作用。微生物能分解尿素的原因是其能合成脲酶，脲酶可將尿素分解為氨。(3)為獲得目的菌的單一菌落，常用無菌水對土壤樣液做稀釋處理。尿素分解菌合成的脲酶可將尿素分解成氨，氨可使培養基的pH升高，進而使酚紅指示劑變紅，所以為便于確認目的菌，可在培養基中加入酚紅指示劑，接種并培養菌種后，可根據菌落周圍出現紅色判斷出該菌能分解尿素。
11.(2021·江蘇無錫期末)土壤中含有能將難溶性磷酸鹽轉變成植物可以吸收和利用的可溶性磷的優良解磷菌株Q。如圖1表示制備固體培養基過程中的某操作，圖2是科研人員從土壤中分離出菌株Q的部分過程示意圖。
請回答下列問題：
(1)圖1所示操作稱為________，待平板冷凝后需________，以防止________________________________________________________________________。
(2)圖2所示接種方法是__________________。在3個平板上分別接入0.1 mL稀釋液，經適當培養后，3個平板上菌落數分別是38、42、40，則1 g土壤中的活菌數約為________個。
(3)圖3是某同學利用不同于圖2的方法分離菌株Q的示意圖。下列對其操作及結果的敘述錯誤的有________。
圖3
a.操作前用無水乙醇對雙手進行消毒處理
b.劃線時將沾有菌種的接種環插入培養基
c.只有在⑤區域中才能得到所需菌落
d.整個過程需要對接種環進行6次灼燒
(4)固體培養基中難溶性磷酸鹽在菌株Q的作用下溶解，會在菌落周圍形成透明圈(圖4)，透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)的比值(D/d)代表微生物溶解難溶性磷酸鹽的能力大小。下表是初步篩選出的三種優良解磷菌株。
圖4
菌株 透明圈直徑(D) 菌落直徑(d)
M－3－01 18.8 12.3
B3－5－6 20.7 8.0
T－4－01 9.1 6.5
根據實驗結果分析溶解難溶性磷酸鹽能力最強的菌株是________。
答案　(1)倒平板　倒置　皿蓋上的冷凝水落入培養基　(2)稀釋涂布平板法　4×107　(3)a、b、c　(4)B3－5－6
解析　(1)圖1所示操作稱為倒平板，待平板冷凝后倒置，以防止皿蓋上的冷凝水落入培養基，造成污染。(2)圖2所示接種方法是稀釋涂布平板法。稱取1 g土壤，按如圖所示方法溶解和稀釋后，在三個平板上分別接入0.1 mL稀釋液，經適當培養后，3個平板上的菌落數分別是38、42、40，據此可計算出每克土樣中的活菌數為×103×100÷0.1 ＝4.0×107。(3)圖3是平板劃線的接種操作。操作前應用70%的乙醇溶液對接種人員的雙手進行消毒處理，a錯誤；劃線操作時將菌種涂抹在培養基表面，b錯誤；在5個區域中，只要有單個活細菌，通過培養都可獲得所需菌落，c錯誤；在每次劃線前后都要對接種環進行滅菌，接種環的滅菌方法應是在火焰上灼燒，整個過程需要對接種環進行6次灼燒，d正確。故選a、b、c。(4)根據實驗原理中“透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)的比值(D/d)代表微生物溶解難溶性磷酸鹽的能力大小”，結合表格中數據可以確定解磷能力最強的菌株是B3－5—6。

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