資源簡介

中小學(xué)教育資源及組卷應(yīng)用平臺
新高考生物一輪考點梳理&分層訓(xùn)練
第35講　基因工程
內(nèi)容比較——知考向 核心素養(yǎng)——提考能
內(nèi)容要求 1.概述基因工程的誕生 2.闡明基因工程的原理及技術(shù)(含PCR技術(shù)) 3.舉例說明基因工程在農(nóng)牧、食品及醫(yī)藥等行業(yè)的應(yīng)用 4.概述蛋白質(zhì)工程的原理及應(yīng)用 5.活動：DNA的粗提取與鑒定 6.活動：利用PCR擴(kuò)增DNA片段并完成電泳鑒定，或運(yùn)用軟件進(jìn)行虛擬PCR實驗 生命觀念 基因結(jié)構(gòu)決定其功能；掌握目的基因的篩選與獲取方法；理解蛋白質(zhì)工程的原理
科學(xué)思維 建立基因工程的操作流程模型，掌握目的基因的檢測與鑒定方法
科學(xué)探究 探究基因工程在生產(chǎn)上的應(yīng)用和蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用，掌握DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定的方法
社會責(zé)任 基因工程和蛋白質(zhì)工程在生產(chǎn)實踐上的應(yīng)用
與舊教 材對比 增：①DNA的粗提取與鑒定；②DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定；③基因工程在食品工業(yè)中的應(yīng)用。 刪：①基因文庫的構(gòu)建；②基因槍法；③基因治療。 改：①PCR技術(shù)內(nèi)容更充實；②DNA重組技術(shù)改為重組DNA技術(shù)；③限制性核酸內(nèi)切酶改為限制性內(nèi)切核酸酶。 淡化：①從基因文庫中獲取目的基因精減為一句話；②農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法變?yōu)橘Y料卡。
考點一　重組DNA技術(shù)的基本工具
1.基因工程的概念　原理是基因重組
(1)手段：按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性。
(2)目的：創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。
(3)水平：分子水平。
與雜交育種相比與誘變育種相比
(4)優(yōu)點：克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，定向改造生物的遺傳性狀。
2.基因工程的基本工具　3種工具，其中有2種工具酶
(1)限制性內(nèi)切核酸酶　限制酶是一類酶，而不是一種酶
提醒　①限制酶的識別序列與被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6個核苷酸組成，少數(shù)由4個、8個或其他數(shù)量的核苷酸組成；后者是雙鏈序列。
②判斷黏性末端是否由同一種限制酶切割形成的方法是將黏性末端旋轉(zhuǎn)180 °，同一種限制酶切割形成的黏性末端應(yīng)該是完全相同的結(jié)構(gòu)。
③限制酶作用的化學(xué)鍵只能是磷酸二酯鍵，而不能是氫鍵。
④在切割含目的基因的DNA分子時，需用限制酶切割兩次此DNA分子，產(chǎn)生4個末端。只有這樣，才能使目的基因的兩端都有可連接的黏性末端或平末端。
(2)DNA連接酶
(3)載體
提醒　與膜載體的區(qū)別：基因工程中的載體是DNA分子，能將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞內(nèi)，并利用它在宿主細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制；膜載體是蛋白質(zhì)，與細(xì)胞膜的通透性有關(guān)。
(1)DNA連接酶能將兩堿基間的氫鍵連接起來(×)
(2)E·coli DNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端(×)
(3)限制酶也可以識別和切割RNA(×)
(4)質(zhì)粒是小型環(huán)狀DNA分子，是基因工程常用的載體(√)
(5)載體的作用是將攜帶的目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞中，使之穩(wěn)定存在并表達(dá)(√)
(6)外源DNA必在位于重組質(zhì)粒的啟動子和終止子之間才能進(jìn)行復(fù)制(×)
1.DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？
提示　不是。DNA連接酶連接的是兩個DNA片段，而DNA聚合酶是把單個的脫氧核苷酸連接到已有的DNA片段上。
2.想一想，為什么限制酶不切割細(xì)菌本身的DNA分子？
提示　細(xì)菌中的限制酶之所以不剪切自身DNA，是因為細(xì)菌在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到限制酶所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。
3.天然的DNA分子是否可以直接用做基因工程載體？為什么？
提示　不可以。具有能自我復(fù)制、有一個或多個限制酶切割位點、有標(biāo)記基因及對受體細(xì)胞無害等特點的DNA分子才可以直接用作基因工程的載體。實際上天然的DNA分子一般不完全具備上述條件，往往需要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。
1.基因工程的理論基礎(chǔ)
2.限制酶的選擇方法
根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點、質(zhì)粒上的限制酶切割位點以及是否破壞目的基因和標(biāo)記基因來確定限制酶的種類。
(1)應(yīng)選擇酶切位點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇Pst Ⅰ；不能選擇酶切位點位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。
(2)為避免目的基因及質(zhì)粒的自身環(huán)化、反向連接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和質(zhì)粒(雙酶切)，如圖甲可選擇用Pst Ⅰ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切割位點)。
(3)切割質(zhì)粒的限制酶不能同時切開質(zhì)粒上的所有標(biāo)記基因，即至少要保留一個標(biāo)記基因，以用于重組DNA的鑒定和篩選，如圖乙中的質(zhì)粒不能使用Sma Ⅰ切割。
3.標(biāo)記基因的作用
標(biāo)記基因可用于檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞：
4.與DNA有關(guān)的幾種酶的比較
考向1　結(jié)合基因工程所需工具酶，考查科學(xué)實踐中的探究能力
1.(2021·福建三明質(zhì)檢)限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的識別序列及切割位點分別是—C↓TTAAG—和—G↓AATTC—。如下圖表示四種質(zhì)粒和目的基因，其中，質(zhì)粒上箭頭所指部位為酶的識別位點，陰影部分表示標(biāo)記基因。適于作為圖示目的基因載體的質(zhì)粒是(　　)
答案　A
解析　用限制酶MunⅠ切割A(yù)質(zhì)粒后，不會破壞標(biāo)記基因，而且還能產(chǎn)生與目的基因兩側(cè)黏性末端相同的末端，適于作為目的基因的載體，A正確；質(zhì)粒沒有標(biāo)記基因，不適于作為目的基因的載體，B錯誤；C、D質(zhì)粒含有標(biāo)記基因，但用限制酶切割后，標(biāo)記基因會被破壞，因此不適于作為目的基因的載體，C、D兩項錯誤。
2.(2016·全國卷Ⅲ，40)圖(a)中的三個DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制性內(nèi)切酶的識別序列與切割位點，圖(b)為某種表達(dá)載體的示意圖(載體上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切點是唯一的)。
根據(jù)基因工程的有關(guān)知識，回答下列問題：
(1)經(jīng)BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以與上述表達(dá)載體被　　　　酶切后的產(chǎn)物連接，理由是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)若某人利用圖(b)所示的表達(dá)載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組子，如圖(c)所示，這三種重組子中，不能在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的基因產(chǎn)物的有　　　　，不能表達(dá)的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
圖(c)
(3)DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，常見的有　　　　　　　　和　　　　　　　　，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是________________________________________________________________________。
答案　(1)Sau3AⅠ　兩種酶切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端　(2)甲、丙　甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄　(3)E·coliDNA連接酶　T4DNA連接酶　T4DNA連接酶
解析　(1)由于限制酶Sau3AⅠ與BamHⅠ切割DNA后形成的黏性末端相同，所以經(jīng)BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以與上述表達(dá)載體被Sau3AⅠ酶切后的產(chǎn)物連接。(2)在基因表達(dá)載體中，啟動子應(yīng)位于目的基因的首端，終止子應(yīng)位于目的基因的尾端，這樣目的基因才能表達(dá)。圖中甲、丙均不符合，所以不能表達(dá)目的基因的產(chǎn)物。(3)常見的DNA連接酶有E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是T4DNA連接酶。
考向2　結(jié)合載體的作用及特點，考查科學(xué)思維的能力
3.(2020·南昌高三一模節(jié)選)質(zhì)粒A和質(zhì)粒B各自有一個限制酶EcoR Ⅰ和限制酶BamH Ⅰ的識別位點，兩種酶切割DNA產(chǎn)生的黏性末端不同。限制酶EcoR Ⅰ剪切位置旁邊的數(shù)字表示其與限制酶BamH Ⅰ剪切部位之間的堿基對數(shù)(bp)。在含有質(zhì)粒A和B的混合溶液中加入限制酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ，令其反應(yīng)充分；然后，向剪切產(chǎn)物中加入DNA連接酶進(jìn)行反應(yīng)，再將其產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌中。(實驗中不考慮無ori的質(zhì)粒、擁有兩個或兩個以上ori的質(zhì)粒、兩個或兩個以上質(zhì)粒同時進(jìn)入大腸桿菌、三個或三個以上DNA片段發(fā)生連接)請回答下列問題：
ori：質(zhì)粒復(fù)制原點；tet：四環(huán)素抗性基因；amp：氨芐青霉素抗性基因；gfp：基因產(chǎn)物在紫外線照射下可發(fā)出綠色熒光；lac：基因控制合成的半乳糖苷酶可以水解乳糖
(1)只擁有質(zhì)粒A的大腸桿菌　　　　(填“可以”或“不可以”)在含有氨芐青霉素及乳糖作為唯一碳元素來源的培養(yǎng)基中生存。說明理由：_____________________________________
________________________________________________________________________。
(2)DNA連接酶進(jìn)行反應(yīng)后，存在　　　　種大小不同的質(zhì)粒，有　　　　種質(zhì)粒使大腸桿菌能夠在含有氨芐青霉素及乳糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中生存。
(3)綠色熒光蛋白基因是標(biāo)記基因的一種，標(biāo)記基因的功能是　　　　　　　　。
答案　(1)可以　質(zhì)粒A含有氨芐青霉素抗性基因，使大腸桿菌能夠在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生存，還含有半乳糖苷酶基因，使大腸桿菌合成半乳糖苷酶，并水解乳糖獲得能量和碳源　(2)4　2　(3)供重組DNA的選擇和鑒定
解析　由題圖可知，質(zhì)粒A含有氨芐青霉素抗性基因和半乳糖苷酶基因，用EcoR Ⅰ和BamHⅠ酶切后，形成2 000 bp(含amp)和1 000 bp(含lac)兩段；質(zhì)粒B含氨芐青霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因和綠色熒光蛋白基因，用EcoRⅠ和BamH Ⅰ酶切后，形成3 000 bp(含amp、gfp)和2 500 bp(含tet)兩段。由題干“兩種酶切割DNA產(chǎn)生的黏性末端不同”可知，酶切后質(zhì)粒自身兩端不能連接。DNA連接酶進(jìn)行反應(yīng)后，由于實驗中不考慮無ori的質(zhì)粒、擁有兩個或兩個以上ori的質(zhì)粒、兩個或兩個以上質(zhì)粒同時進(jìn)入大腸桿菌及三個或三個以上DNA片段發(fā)生連接，因此可存在4種大小不同的質(zhì)粒，即：①質(zhì)粒A兩個片段連接3 000 bp(2 000 bp＋1 000 bp)、②質(zhì)粒A含ori的片段和質(zhì)粒B不含ori的片段連接4 500 bp(2 000 bp＋2 500 bp)、③質(zhì)粒A不含ori的片段和質(zhì)粒B含ori的片段連接4 000 bp(1 000 bp＋3 000 bp)、④質(zhì)粒B兩個片段連接5 500 bp(3 000 bp＋2 500 bp)。有2種質(zhì)粒使大腸桿菌能夠在含有氨芐青霉素及乳糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中生存，即①③。
考點二　基因工程的基本操作程序
1.目的基因的篩選與獲取
(1)篩選目的基因：從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。
(2)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因
①原理：DNA半保留復(fù)制
②條件：
參與的組分 在DNA復(fù)制中的作用
解旋酶(體外用高溫代替) 打開DNA雙鏈
DNA母鏈 提供DNA復(fù)制的模板
4種脫氧核苷酸 合成DNA子鏈的原料
耐高溫的DNA聚合酶 催化合成DNA子鏈
引物 使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸
緩沖液 維持反應(yīng)體系pH穩(wěn)定
③過程：PCR過程包括變性、復(fù)性和延伸三步
結(jié)果：DNA分子以指數(shù)形式擴(kuò)增(約為2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)次數(shù))
提醒　①在PCR過程中實際加入的為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。
②引物既可以是DNA單鏈，也可以為RNA單鏈。細(xì)胞內(nèi)的DNA進(jìn)行復(fù)制時，也需要引物，一般為RNA片段。
③真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2＋。
2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心
(1)目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。
(2)組成
提醒　啟動子≠起始密碼子　終止子≠終止密碼子
①啟動子是位于基因首端的一段特殊序列，它是RNA聚合酶識別、結(jié)合的部位。終止子是位于基因尾端的一段特殊序列，作用是使轉(zhuǎn)錄過程停止。
②起始密碼子和終止密碼子均位于mRNA上，分別控制翻譯過程的啟動和終止。
(3)構(gòu)建過程
3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
只有該步驟沒涉及到堿基互補(bǔ)配對現(xiàn)象　
提醒　①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入
第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上；第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。
②導(dǎo)入目的基因，可能存在于細(xì)胞質(zhì)中，也可能集合到染色體DNA上。存在于染色體DNA上的目的基因有可能通過花粉傳播進(jìn)入雜草或其他作物中，造成“基因污染”。
4.目的基因的檢測與鑒定
(1)用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時不必知道基因的全部序列(√)
(2)為培育抗除草劑的作物新品種，導(dǎo)入抗除草劑基因時只能以受精卵為受體(×)
(3)抗蟲基因即使成功地插入植物細(xì)胞染色體上也未必能正常表達(dá)(√)
(4)檢測目的基因是否成功表達(dá)可用抗原—抗體雜交技術(shù)(√)
(5)應(yīng)用DNA探針技術(shù)，可以檢測轉(zhuǎn)基因抗凍番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表達(dá)(×)
1.PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？
提示　不可以，因為PCR是用DNA雙鏈做模板的，不能直接用單鏈RNA做PCR，必須把mRNA逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA之后再做PCR。
2.利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細(xì)胞器功能的知識，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？
選擇性必修3 P83“到社會中去”拓展
提示　有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。
3.為什么不直接把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，而要用載體？
提示　游離的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，一般會直接被分解，就算可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無法隨著細(xì)胞分裂而進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞中不再含有目的基因。若將目的基因插入載體，由于載體可以在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，隨著細(xì)胞分裂，載體會帶著目的基因存在于每個子代細(xì)胞中。這樣，基因工程才有意義。
4.你知道新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒的檢測原理嗎？
提示　新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒是用于快速進(jìn)行體外定性檢測新型冠狀病毒的醫(yī)療檢測用品，它的工作原理是通過提取病人樣本中的RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT－PCR)，通過擴(kuò)增反應(yīng)將樣本中微量的病毒信息進(jìn)行放大，最后以熒光的方式讀取信號。如果PCR之后信號為陽性，那么就可以認(rèn)為樣本中存在病毒(已經(jīng)感染)，反之表明樣本中沒有病毒(未感染)。
1.PCR技術(shù)的過程
關(guān)于引物：
①引物是一小段單鏈的DNA或RNA，作為新子鏈的合成起點，只能結(jié)合在母鏈的3′端；
②只有通過引物，DNA才可以開始進(jìn)行復(fù)制。
2.PCR技術(shù)和DNA復(fù)制的比較
3.目的基因的篩選與獲取
(1)目的基因的篩選：從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中篩選。
(2)目的基因的獲取方法
①利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因。
②人工合成目的基因
a.反轉(zhuǎn)錄法：主要用于相對分子質(zhì)量較大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA為模板，借助逆轉(zhuǎn)錄酶合成雙鏈DNA，其過程如下：
b．化學(xué)合成法：依據(jù)某一蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出其基因序列，然后直接合成目的基因，其過程如下：
③從基因文庫中獲取目的基因
根據(jù)目的基因的有關(guān)信息，例如，根據(jù)基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物——mRNA，以及基因的表達(dá)產(chǎn)物——蛋白質(zhì)等特性來獲取目的基因。
考向1　結(jié)合PCR技術(shù)的應(yīng)用，考查科學(xué)思維能力
1．（2021·北京東城區(qū)期末）PCR是一種體外擴(kuò)增DNA的技術(shù)，模擬了體內(nèi)的DNA復(fù)制過程。下圖為PCR技術(shù)原理示意圖，對于圖中物質(zhì)和過程的說明，錯誤的是(　　)
A.物質(zhì)a：游離的脫氧核苷酸
B.過程①：氫鍵斷裂
C.過程②：邊解旋邊復(fù)制
D.過程③：遵循堿基互補(bǔ)配對原則
答案　C
解析　PCR模擬了體內(nèi)的DNA復(fù)制，所以a是DNA復(fù)制的原料——脫氧核苷酸，A正確；在94 ℃高溫條件下，DNA分子雙螺旋解開，形成單鏈，此時氫鍵斷裂，B正確；體外模擬DNA的復(fù)制依據(jù)了DNA的熱變性原理，該過程DNA分子不是邊解旋邊復(fù)制，C錯誤；DNA復(fù)制需要遵循堿基互補(bǔ)配對原則，D正確。
2.(2019·全國卷Ⅰ，38節(jié)選)基因工程中可以通過PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因。回答下列問題。
(1)生物體細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制開始時，解開DNA雙鏈的酶是　　　　。在體外利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時，使反應(yīng)體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是　　　　。上述兩個解鏈過程的共同點是破壞了DNA雙鏈分子中的　　　　。
(2)目前在PCR反應(yīng)中使用耐高溫的DNA聚合酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案　(1)解旋酶　加熱至90 ℃以上　氫鍵
(2)耐高溫的DNA聚合酶熱穩(wěn)定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活
解析　(1)生物體細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制開始時是利用解旋酶進(jìn)行解旋的，而在體外利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時，則是通過加熱至90～95 ℃進(jìn)行解旋的，二者都破壞了堿基對中的氫鍵。(2)在PCR過程中，要加熱至90 ℃以上，所以使用耐高溫的DNA聚合酶，而不使用在高溫下會失活的大腸桿菌DNA聚合酶。
3.(2020·江蘇卷，33改編)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如圖(以EcoR Ⅰ酶切為例)：
請據(jù)圖回答問題：
(1)步驟Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一種　　　　酶，它通過識別特定的　　　　切割特定位點。
(2)步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′－羥基與5′－磷酸間形成　　　　；PCR循環(huán)中，升溫到95 ℃是為了獲得　　　　；耐高溫的DNA聚合酶的作用是催化________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)若如表所列為已知的DNA序列和設(shè)計的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是　　　　(從引物①②③④中選擇，填編號)。
DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)
已知 序列
PCR 引物 ①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′ ②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′ ③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′ ④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
(4)對PCR產(chǎn)物測序，經(jīng)分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列)，結(jié)果正確的是　　　　。
A.5′－AACTATGCG┈┈AGCCCTT－3′
B.5′－AATTCCATG┈┈CTGAATT－3′
C.5′－GCAATGCGT┈┈TCGGGAA－3′
D.5′－TTGATACGC┈┈CGAGTAC－3′
答案　(1)限制性內(nèi)切核酸(或限制)　核苷酸序列
(2)磷酸二酯鍵　DNA單鏈　以DNA為模板的DNA鏈的延伸　(3)②④　(4)B
解析　(1)根據(jù)題圖可知，步驟Ⅰ是獲取目的DNA片段，所用的酶EcoR Ⅰ是一種限制酶，其能識別特定的核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。(2)步驟Ⅱ是將目的DNA片段連接成環(huán)狀，其中DNA連接酶的作用是催化相鄰核苷酸之間的3′—羥基和5′—磷酸間形成磷酸二酯鍵。PCR循環(huán)中，升高溫度到95 ℃是為了打開氫鍵使雙鏈解旋，獲得DNA單鏈，耐高溫的DNA聚合酶的作用是催化游離的脫氧核苷酸連接到引物3′端，合成DNA子鏈。(3)引物的作用是使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始延伸DNA子鏈，因為DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸，故為擴(kuò)增未知序列，選擇的與模板鏈相結(jié)合的引物應(yīng)為5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′(引物④)和5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′(引物②)。(4)分析題意可知，片段F的兩端為限制酶EcoR Ⅰ切割后產(chǎn)生的黏性末端，因此其5′端序列應(yīng)為AATT－，3′端序列應(yīng)為－TTAA，B正確。
　獲取目的基因方法的選擇
(1)如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通過構(gòu)建基因文庫的方法，即通過受體菌儲存并擴(kuò)增目的基因后，從基因文庫中獲取目的基因。
(2)如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比較小，可以通過DNA合成儀利用化學(xué)方法直接人工合成。
(3)如果知道要擴(kuò)增的目的基因及兩端的核苷酸序列，而且基因又比較大，可以通過PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因。
考向2　結(jié)合基因工程的操作程序，考查科學(xué)實踐能力
4.(2018·全國卷Ⅰ，38)回答下列問題：
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)。該研究除證明了質(zhì)粒可以作為載體外，還證明了________________________________________________________________________
________________________________________________________________________(答出兩點即可)。
(2)體外重組的質(zhì)粒可通過Ca2＋參與的　　　　方法導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞；而體外重組的噬菌體DNA通常需與　　　　組裝成完整噬菌體后，才能通過侵染的方法將重組的
噬菌體DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞。在細(xì)菌、心肌細(xì)胞、葉肉細(xì)胞中，可作為重組噬菌體宿主細(xì)胞的是　　　　。
(3)真核生物基因(目的基因)在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時，表達(dá)出的蛋白質(zhì)可能會被降解。為防止蛋白質(zhì)被降解，在實驗中應(yīng)選用　　　　的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，在蛋白質(zhì)純化的過程中應(yīng)添加　　　　的抑制劑。
答案　(1)體外重組的質(zhì)粒可以進(jìn)入受體細(xì)胞；真核生物基因可在原核細(xì)胞中表達(dá)　(2)轉(zhuǎn)化　外殼蛋白(或答噬菌體蛋白)　細(xì)菌　(3)蛋白酶缺陷型　蛋白酶
解析　(1)兩位科學(xué)家將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞中并進(jìn)行了表達(dá)，因此，該研究可以證明：質(zhì)粒可以作為載體，真核細(xì)胞的基因在原核細(xì)胞中也可以表達(dá)(不同生物共用一套密碼子)、體外重組的質(zhì)粒可以進(jìn)入受體細(xì)胞等。(2)目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程稱為轉(zhuǎn)化，將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌時，常用的轉(zhuǎn)化方法是首先用Ca2＋處理大腸桿菌細(xì)胞，使其成為感受態(tài)細(xì)胞。噬菌體DNA沒有侵染能力，體外重組的噬菌體DNA通常需與外殼蛋白組裝成完整噬菌體才能完成侵染過程。噬菌體多寄生在細(xì)菌中，但不能寄生在心肌細(xì)胞和葉肉細(xì)胞中。(3)若要使蛋白質(zhì)不被降解，則大腸桿菌體內(nèi)不能存在蛋白酶，因此，實驗中應(yīng)選用蛋白酶缺陷型的大腸桿菌作為受體細(xì)胞。同理，在蛋白質(zhì)純化過程中，也不能使蛋白質(zhì)降解，因此，應(yīng)添加蛋白酶抑制劑。
5.(2021·中原名校聯(lián)盟)某質(zhì)粒上有Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ三種限制酶切割位點，同時還含有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素基因。利用此質(zhì)粒獲得轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草的過程，如下圖所示。請回答下列問題：
(1)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞，采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。其中用到的質(zhì)粒是　　　　；該質(zhì)粒含有一段特殊的DNA片段，稱為　　　　。該方法中農(nóng)桿菌的作用是
________________________________________________________________________。
(2)在構(gòu)建重組質(zhì)粒時，和只用一種酶切割目的基因的兩端及質(zhì)粒相比，選用Hind Ⅲ和Sal Ⅰ兩種酶的好處是____________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)含有目的基因的農(nóng)桿菌可根據(jù)標(biāo)記基因進(jìn)行篩選。若農(nóng)桿菌在含有氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基上都可以生長繁殖，農(nóng)桿菌中是否已含有目的基因？　　　　(填“是”或“否”)。為什么？______________________________________________________________________。
(4)將已經(jīng)轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌進(jìn)行如下操作，篩選出符合要求的農(nóng)桿菌。先把轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌接種到A培養(yǎng)基中培養(yǎng)，長出菌落后，用無菌牙簽挑取A上的單個菌落，分別接種到B(含氨芐青霉素)和C(含四環(huán)素和氨芐青霉素)兩個培養(yǎng)基的相同位置上，一段時間后，菌落的生長狀況如圖所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？請在圖中相應(yīng)的位置上圈出來。
答案　(1)Ti質(zhì)粒　T DNA　感染煙草細(xì)胞，把目的基因插入到煙草細(xì)胞的染色體DNA上
(2)防止目的基因自連和質(zhì)粒自連，以提高帶有目的基因的重組質(zhì)粒的合成效率
(3)否　含有目的基因的質(zhì)粒中抗四環(huán)素基因被破壞
(4)
　如何篩選出含有目的基因的受體細(xì)胞
(1)原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，如果插入某種抗生素抗性基因內(nèi)部，則會導(dǎo)致該抗生素抗性基因失活。如圖，目的基因插入了四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)素抗性基因失活。
(2)被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌有三種：含環(huán)狀目的基因的細(xì)菌、含重組質(zhì)粒的細(xì)菌、含自身環(huán)化質(zhì)粒的細(xì)菌。
(3)篩選方法：將混合處理后的細(xì)菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長的是含重組質(zhì)粒的細(xì)菌和含自身環(huán)化質(zhì)粒的細(xì)菌，如圖1、2、3、4、5菌落，再利用無菌的絨布影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長的即為含有目的基因的菌落，如圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進(jìn)行培養(yǎng)。
考點三　DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定
1.DNA的粗提取與鑒定
(1)原理
(2)方法步驟
提醒　①提取植物細(xì)胞的DNA時，加入的研磨液成分中含有洗滌劑和食鹽(NaCl)，洗滌劑能瓦解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；加入食鹽的目的是溶解DNA。
②加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絲狀沉淀。
③本實驗不能用哺乳動物成熟的紅細(xì)胞作為實驗材料，原因是哺乳動物成熟的紅細(xì)胞無細(xì)胞核(無DNA)。可選用雞血細(xì)胞作為材料。
④鑒定DNA時，一支試管為對照組，另一支試管為實驗組。兩支試管中都先加物質(zhì)的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液；在實驗組試管中加DNA絲狀物，對照組不加；加入二苯胺試劑后沸水浴加熱。結(jié)果可以看到加DNA絲狀物的試管呈現(xiàn)藍(lán)色，對照組無色。如果實驗組藍(lán)色較淺，說明提取出的DNA量太少。
2.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定
(1)原理
①PCR原理：DNA熱變性原理。
②電泳
(2)方法步驟
①PCR擴(kuò)增
②鑒定PCR產(chǎn)物—瓊脂糖凝膠電泳法—配制瓊脂糖溶液→制備瓊脂糖凝膠→電泳緩沖液加入電泳槽中→加樣→電泳→取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。
提醒　①為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。
②該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在－20 ℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。
③在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換，避免試劑的污染。
④在進(jìn)行操作時，一定要戴好一次性手套。
⑤觀察DNA帶的分布及粗細(xì)程度來評價擴(kuò)增的效果。
1.DNA的粗提取實驗中過濾能否用濾紙代替紗布？
選擇性必修3 P74“探究·實踐”選擇性必修3 P74“探究·實踐”
提示　不可以，因為DNA會被吸附到濾紙上而大量損失，影響最終提取的DNA量。
2.DNA片段電泳鑒定的原理是什么？
選擇性必修3 P84“探究·實踐”
提示　DNA分子帶負(fù)電，在電場力的驅(qū)動下，從負(fù)極向正極在瓊脂糖凝膠的孔洞中蠕動；核酸染料帶正電，在電場力的驅(qū)動下，從正極向負(fù)極運(yùn)動，遇到DNA就嵌入其中完成染色，但這個顏色可見光下看不到，需要紫外光激發(fā)。
3.DNA的電泳鑒定實驗中，影響DNA分子遷移速率的因素有哪些？
選擇性必修3 P84“探究·實踐”
提示　電泳時，DNA分子的相對分子質(zhì)量越大，受到的阻力越大，遷移速率越慢，DNA分子的相對分子質(zhì)量越小，受到的阻力越小，遷移速率越快。
4.你進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請分析產(chǎn)生這個結(jié)果的可能原因。
選擇性必修3 P85“探究·實踐”
提示　多條條帶。不止一條條帶的原因：操作過程中混入限制酶將DNA片段切割成片段或還有其他DNA片段，以此為模板，進(jìn)行了擴(kuò)增。
考向1　結(jié)合DNA的粗提取，考查科學(xué)探究能力
1.(2020·江蘇卷，17)生物學(xué)實驗常呈現(xiàn)“五顏六色”的變化。下列實驗中溶液顏色變化的敘述正確的是(　　)
A.在新鮮的梨汁中加入斐林試劑，混勻后在加熱條件下由無色變成磚紅色
B.在厭氧發(fā)酵的果汁中加入酸性重鉻酸鉀溶液，混勻后由藍(lán)色變成灰綠色
C.在DNA溶液中加入二苯胺試劑，混勻后在沸水浴條件下逐漸變成藍(lán)色
D.在氨基酸溶液中加入雙縮脲試劑，混勻后逐漸變成紫色
答案　C
解析　斐林試劑為藍(lán)色，在新鮮的梨汁中加入斐林試劑，混勻后在加熱條件下由藍(lán)色變成磚紅色，A錯誤；厭氧發(fā)酵時果汁中有酒精生成，在厭氧發(fā)酵的果汁中加入酸性重鉻酸鉀溶液，混勻后由橙色變成灰綠色，B錯誤；在DNA溶液中加入二苯胺試劑，混勻后在沸水浴條件下逐漸變成藍(lán)色，C正確；蛋白質(zhì)和多肽中含有肽鍵，與雙縮脲試劑可發(fā)生作用，產(chǎn)生紫色反應(yīng)，但氨基酸中不含有肽鍵，不能與雙縮脲試劑發(fā)生紫色反應(yīng)，D錯誤。
2.(2021·貴州遵義聯(lián)考)下圖是“DNA的粗提取與鑒定”實驗中的兩個操作步驟示意圖，相關(guān)敘述正確的是(　　)
A.圖1中溶液a是物質(zhì)的量濃度為0.14 mol/L的NaCl溶液
B.圖2所示實驗操作中有一處明顯錯誤，可能導(dǎo)致試管2中藍(lán)色變化不明顯
C.圖1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不溶
D.圖2試管1的作用是證明物質(zhì)的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺出現(xiàn)藍(lán)色
答案　B
解析　圖1中溶液a是NaCl溶液，其目的是溶解DNA，DNA在物質(zhì)的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液中的溶解度較高，在物質(zhì)的量濃度為0.14 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最低，A錯誤；圖2所示實驗的試管中溶液的液面高于燒杯中的液面，可能導(dǎo)致加熱不充分，試管2中藍(lán)色變化不明顯，B正確；圖1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)能溶，C錯誤；圖2試管1起對照作用，目的是證明沸水浴下物質(zhì)的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺不會出現(xiàn)藍(lán)色，而DNA遇二苯胺出現(xiàn)藍(lán)色，D錯誤。
考向2　圍繞PCR技術(shù)，考查社會責(zé)任
3.(2021·天津南開中學(xué)期中)下列關(guān)于PCR操作過程的敘述，錯誤的是(　　)
A.PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌
B.PCR利用了DNA的熱變性原理
C.PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化
D.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換
答案　C
解析　為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌，A正確；PCR利用了DNA的熱變性原理，B正確；緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，在－20 ℃儲存，使用前，將所需試劑從冰箱取出，放在冰塊上緩慢融化，C錯誤；在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換，以免其他成分的污染，D正確。
4.(2020·北京海淀區(qū)二模)在基因工程操作過程中，科研人員利用識別兩種不同序列的限制酶(R1和R2)處理基因載體，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結(jié)果如下圖所示。以下相關(guān)敘述中，不正確的是(　　)
A.該載體最可能為環(huán)狀DNA分子
B.兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點
C.限制酶R1與R2的切點最短相距約200 bp
D.限制酶作用位點會導(dǎo)致氫鍵和肽鍵斷裂
答案　D
解析　當(dāng)僅用一種限制酶切割載體時，僅產(chǎn)生一種長度的DNA片段，因此該載體最有可能為環(huán)狀DNA分子，A正確；當(dāng)僅用一種限制酶切割載體時，兩種限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段等長，而兩種限制酶同時切割時則產(chǎn)生兩種長度的DNA片段，所以兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點，B正確；兩種限制酶同時切割時則產(chǎn)生600 bp和200 bp兩種長度的DNA片段，所以兩種限制酶的酶切位點至少相距200 bp，C正確；限制酶切割DNA分子，破壞的是作用位點上兩個脫氧核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵，D錯誤。
考點四　基因工程的應(yīng)用及蛋白質(zhì)工程
1.基因工程的應(yīng)用
(1)食品工業(yè)方面
生產(chǎn)食品工業(yè)用酶、氨基酸和維生素等。例如，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)大量生產(chǎn)凝乳酶
(2)醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域
①器官移植：用轉(zhuǎn)基因動物作器官移植的供體，例如抑制或除去抗原決定基因，結(jié)合克隆技術(shù)培育出沒有免疫排斥反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因克隆豬器官。
②乳腺生物反應(yīng)器：讓外源基因在哺乳動物的乳腺中特異性表達(dá)，利用動物的乳腺組織生產(chǎn)藥物蛋白。
提醒　乳腺生物反應(yīng)器與膀胱生物反應(yīng)器
①乳腺生物反應(yīng)器是利用轉(zhuǎn)基因動物的乳汁生產(chǎn)藥用蛋白，而膀胱生物反應(yīng)器是利用轉(zhuǎn)基因動物的尿液生產(chǎn)藥用蛋白，二者的優(yōu)點是：產(chǎn)量高、質(zhì)量好、成本低、易提取，且不必對動物造成傷害。
②乳腺生物反應(yīng)器需是處于生殖期的雌性動物才可生產(chǎn)藥用蛋白，而膀胱生物反應(yīng)器則是任何生長期的雌雄動物均可生產(chǎn)。
2.蛋白質(zhì)工程　第二代基因工程，可生產(chǎn)自然界中不存在的蛋白質(zhì)
(1)概念
以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過改造或合成基因，來改造現(xiàn)有蛋白質(zhì)，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類生產(chǎn)和生活的需求。
(2)操作手段和結(jié)果
(3)基本思路
→→→
找到并改變相對應(yīng)的脫氧核苷
酸序列(基因)或合成新的基因→
3.蛋白質(zhì)工程與基因工程的區(qū)別和聯(lián)系
(1)將人的干擾素基因重組到質(zhì)粒后導(dǎo)入大腸桿菌，獲得能產(chǎn)生人干擾素的菌株(√)
(2)利用乳腺生物反應(yīng)器能夠獲得一些重要的醫(yī)藥產(chǎn)品，如人的血清白蛋白，這是因為將人的血清白蛋白基因?qū)肓藙游锏娜橄偌?xì)胞中(×)
(3)由大腸桿菌工程菌獲得人的干擾素后可直接應(yīng)用(×)
(4)蛋白質(zhì)工程的目的是改造或合成人類需要的蛋白質(zhì)(√)
(5)蛋白質(zhì)工程是在分子水平上對蛋白質(zhì)分子直接進(jìn)行操作，定向改變分子的結(jié)構(gòu)(×)
1.基因工程培育的抗蟲、抗病作物有哪些優(yōu)點？
提示　減少環(huán)境污染，降低生產(chǎn)成本。
2.蛋白質(zhì)工程為什么通過對基因操作來實現(xiàn)對天然蛋白質(zhì)的改造？
提示　①蛋白質(zhì)具有十分復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，基因的結(jié)構(gòu)相對簡單，容易改造；②改造后的基因可以遺傳給下一代，被改造的蛋白質(zhì)無法遺傳。
1.(2021·河北定州期中)乙烯生物合成酶基因可以控制乙烯的合成，科學(xué)家將該基因的反義基因?qū)敕鸭?xì)胞內(nèi)，培育轉(zhuǎn)基因延熟番茄，延長其儲藏期。反義基因的作用機(jī)制如下圖所示，下列說法錯誤的是(　　)
A.有意義mRNA和反義mRNA是通過相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄而來的
B.乙烯生物合成酶基因的模板鏈的序列與反義基因的是互補(bǔ)的
C.乙烯是乙烯生物合成酶基因的表達(dá)產(chǎn)物，可促進(jìn)果實成熟
D.因為mRNA形成雙鏈后無法進(jìn)行翻譯，所以無乙烯生物合成酶生成
答案　C
解析　由題圖可以看出，有意義mRNA和反義mRNA是通過相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄而來的，A正確；反義mRNA能夠與有意義mRNA進(jìn)行雜交形成雙鏈，并且有意義mRNA和反義mRNA是通過相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄而來的，所以乙烯生物合成酶基因的模板鏈的序列與反義基因的模板鏈的序列是互補(bǔ)的，B正確；乙烯生物合成酶基因的表達(dá)產(chǎn)物可以控制乙烯的合成，乙烯不是其表達(dá)產(chǎn)物，C錯誤；翻譯過程是以mRNA為模板合成蛋白質(zhì)的過程，題圖中兩種mRNA雜交在一起進(jìn)而阻斷了乙烯生物合成酶基因的有意義mRNA的翻譯過程，D正確。
2.(2021·安徽亳州聯(lián)考)下圖表示蛋白質(zhì)工程的操作過程，相關(guān)說法不正確的是(　　)
A.a、b過程分別是轉(zhuǎn)錄、翻譯
B.蛋白質(zhì)工程中對蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的了解是非常關(guān)鍵的工作
C.蛋白質(zhì)工程是完全擺脫基因工程技術(shù)的一項全新的生物工程技術(shù)
D.蛋白質(zhì)工程中可能構(gòu)建出一種全新的基因
答案　C
解析　a過程是以DNA的一條鏈為模板合成mRNA的轉(zhuǎn)錄過程，b過程是以mRNA為模板合成具有一定氨基酸順序的多肽鏈的翻譯過程，A正確；蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類的生產(chǎn)和生活需求，因此蛋白質(zhì)工程中對蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的了解是非常關(guān)鍵的工作，B、D正確；蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上延伸出來的第二代基因工程，C錯誤。
3.(2021·湖北華中師大一附中期中)中國T2DM(胰島β細(xì)胞功能衰退型糖尿病)的發(fā)病率由1979年的1.00%上升到2019年的4.37%，補(bǔ)充胰島素是控制和緩解病情的重要途徑。胰島素(由α、β兩條多肽鏈組成)的生產(chǎn)由提取動物胰島素發(fā)展到了利用基因工程生產(chǎn)重組人胰島素。
(1)構(gòu)建重組質(zhì)粒時(如圖所示)，為避免目的基因任意連接和載體的自身環(huán)化，應(yīng)選用　　　　酶切處理目的基因和載體。構(gòu)建完成的表達(dá)載體除了目的基因、標(biāo)記基因以外，還必須有　　　　　　　　等調(diào)控組件。
(2)利用大腸桿菌生產(chǎn)重組人胰島素時，構(gòu)建表達(dá)載體的目的基因應(yīng)從　　　　文庫中獲取，重組大腸桿菌合成的人胰島素原沒有活性，需用　　　　酶將其加工成含α、β兩條多肽鏈的胰島素。
(3)利用奶牛設(shè)計乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)人胰島素，為使人胰島素基因在奶牛乳腺中特異表達(dá)，構(gòu)建表達(dá)載體時應(yīng)將目的基因與　　　　　　　　的啟動子等調(diào)控組件重組在一起，并選用　　　　為受體細(xì)胞。
(4)重組人胰島素分子容易發(fā)生聚合而影響作用效果，可將胰島素分子的氨基酸序列及結(jié)構(gòu)進(jìn)行局部調(diào)整，形成胰島素類似物加以避免。請根據(jù)上述設(shè)想，補(bǔ)充完善其基本研發(fā)流程：預(yù)期蛋白質(zhì)功能→設(shè)計預(yù)期蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)→推測氨基酸序列→　　　　　　　　　　　　→構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)基因獲得胰島素類似物。
答案　(1)SmaⅠ、PstⅠ　啟動子、終止子、復(fù)制原點
(2)cDNA　蛋白　(3)奶牛乳腺蛋白基因　受精卵　(4)找到相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列(基因)
解析　(1)外源DNA分子中含有限制酶SmaⅠ、PstⅠ、AluⅠ的識別序列和切割位點，其中限制酶AluⅠ的切割位點位于目的基因上，因此不能用該酶進(jìn)行切割；若只用PstⅠ切割會導(dǎo)致目的基因和載體自身環(huán)化或反向連接，因此構(gòu)建重組質(zhì)粒時，應(yīng)選用限制酶SmaⅠ、PstⅠ處理目的基因和載體。基因表達(dá)載體的組成包括目的基因、標(biāo)記基因、啟動子、終止子、復(fù)制原點等。(2)將真核基因?qū)朐松飼r，一般從cDNA文庫中獲取目的基因；重組大腸桿菌合成的人胰島素原沒有活性，需用蛋白酶將其加工成含α、β兩條多肽鏈的胰島素。(3)利用奶牛設(shè)計乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)人胰島素，為使人胰島素基因在奶牛乳腺中特異表達(dá)，構(gòu)建表達(dá)載體時應(yīng)將目的基因與奶牛乳腺蛋白基因的啟動子等調(diào)控組件重組在一起，并選用受精卵為受體細(xì)胞。(4)題述設(shè)想需要采用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，因此基本研發(fā)流程：預(yù)期蛋白質(zhì)功能→設(shè)計預(yù)期蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)→推測氨基酸序列→找到相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列(基因)→構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)基因獲得胰島素類似物。
4.(2020·山西太原一模)Ⅰ.轉(zhuǎn)基因草莓中有能表達(dá)乙肝病毒表面抗原的基因，由此可獲得用來預(yù)防乙肝的一種新型疫苗，其培育過程如圖所示(①至④代表過程，A至C代表結(jié)構(gòu)或細(xì)胞)。請據(jù)圖回答：
(1)圖中①過程用到的酶是　　　　，所形成的B叫　　　　　　　　。
(2)②過程常用　　　　處理農(nóng)桿菌，使之成為　　　　細(xì)胞，以利于完成轉(zhuǎn)化過程。
(3)圖中③過程需要用到的激素有　。
Ⅱ.黃瓜花葉病毒(CMV)是能侵染多種植物的RNA病毒，可危害番茄的正常生長并造成減產(chǎn)，研究人員通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將該病毒外殼蛋白的cDNA導(dǎo)入番茄植株，成功獲得抗CMV的番茄植株。
(1)獲得CMV的RNA后，需在　　　　的催化下才能合成CMV外殼蛋白的cDNA。
(2)獲得cDNA后，需先通過一定方法將其插入農(nóng)桿菌的　　　　　　　　片段中，然后將番茄子葉切段與該農(nóng)桿菌共同培養(yǎng)，以實現(xiàn)番茄細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
(3)將共同培養(yǎng)后的番茄外植體接種在含有卡那霉素和青霉素的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間，只有部分外植體生出愈傷組織。研究人員據(jù)此確定這些生出愈傷組織的外植體都已成功導(dǎo)入了cDNA，你認(rèn)為他們作出以上判斷的理由是________________________________________。
(4)要想確定轉(zhuǎn)基因番茄已經(jīng)成功表達(dá)出CMV外殼蛋白，需要進(jìn)行　　　　　　　　實驗。
(5)若要驗證轉(zhuǎn)基因番茄具有較好的抗CMV能力，請寫出實驗設(shè)計思路：　
_______________________________________。
轉(zhuǎn)基因番茄自交，子代中抗性植株與敏感植株數(shù)量之比接近3∶1，由此可以得出的結(jié)論是_______________________________________(答出兩點)。
答案　Ⅰ.(1)DNA連接酶　基因表達(dá)載體(或重組質(zhì)粒)　(2)CaCl2溶液(或Ca2＋)　感受態(tài)　(3)生長素和細(xì)胞分裂素
Ⅱ.(1)逆轉(zhuǎn)錄酶　(2)Ti質(zhì)粒的T－DNA　(3)重組表達(dá)載體同時含有卡那霉素抗性基因和青霉素抗性基因，只有成功導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的外植體才能在含有卡那霉素和青霉素的選擇培養(yǎng)基上生出愈傷組織　(4)抗原—抗體雜交　(5)用CMV分別感染轉(zhuǎn)基因番茄與未轉(zhuǎn)基因的番茄，一段時間后觀察結(jié)果，分析兩組番茄的抗性　目的基因已經(jīng)整合到受體細(xì)胞的染色體上、獲得的轉(zhuǎn)基因親本為雜合子
解析　Ⅰ.(1)①表示基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程，需用DNA連接酶將目的基因和運(yùn)載體(質(zhì)粒)連接形成重組質(zhì)粒。B是基因表達(dá)載體，由啟動子、終止子、目的基因和標(biāo)記基因等部分構(gòu)成。(2)②過程表示將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞，常用CaCl2溶液或Ca2＋處理微生物細(xì)胞(農(nóng)桿菌)，使之成為易于吸收周圍環(huán)境中DNA分子的感受態(tài)細(xì)胞，以利于重組質(zhì)粒進(jìn)入微生物細(xì)胞(農(nóng)桿菌)，完成轉(zhuǎn)化過程。(3)圖中③過程為脫分化，需要用到的激素有生長素和細(xì)胞分裂素。
Ⅱ.(1)以RNA為模板合成DNA的過程稱為逆轉(zhuǎn)錄，該過程需要逆轉(zhuǎn)錄酶的催化。(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的原理：農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T－DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上，因此獲得cDNA后，需先通過一定方法將其插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T－DNA片段中，然后將番茄子葉切段與該農(nóng)桿菌共同培養(yǎng)，以實現(xiàn)番茄細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。(3)重組表達(dá)載體同時含有卡那霉素抗性基因和青霉素抗性基因，只有成功導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的外植體才能在含有卡那霉素和青霉素的選擇培養(yǎng)基上生出愈傷組織，據(jù)此可知生出愈傷組織的外植體都已成功導(dǎo)入了cDNA。(4)檢測目的基因是否表達(dá)產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白質(zhì)，需要進(jìn)行抗原—抗體雜交實驗。(5)若要驗證轉(zhuǎn)基因番茄具有較好的抗CMV能力，可用CMV分別感染轉(zhuǎn)基因番茄與未轉(zhuǎn)基因的番茄，一段時間后觀察結(jié)果，分析兩組番茄的抗性。轉(zhuǎn)基因番茄自交，子代中抗性植株與敏感植株數(shù)量之比接近3∶1，符合基因分離定律，由此可以得出的結(jié)論是目的基因已經(jīng)整合到受體細(xì)胞的染色體上、獲得的轉(zhuǎn)基因親本為雜合子。
重溫真題　經(jīng)典再現(xiàn)
1.(2018·高考北京卷，5改編)用Xho I和Sal I兩種限制性內(nèi)切核酸酶分別處理同一DNA片段，酶切位點及酶切產(chǎn)物分離結(jié)果如圖。以下敘述不正確的是(　　)
A.圖1中兩種酶識別的核苷酸序列不同
B.圖2中酶切產(chǎn)物可用于構(gòu)建重組DNA
C.泳道①中是用Sal I處理得到的酶切產(chǎn)物
D.圖中被酶切的DNA片段是單鏈DNA
答案　D
解析　不同的限制酶識別核苷酸的序列不同，A正確；限制酶切割的產(chǎn)物可用于構(gòu)建重組DNA，B正確；泳道①顯示四個條帶，是Sal Ⅰ處理后的酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果，泳道②顯示三個條帶，是Xho Ⅰ處理后的酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果，C正確；限制酶的作用特點是識別特定DNA序列，并在DNA兩條鏈特定部位切割產(chǎn)生黏性末端或平末端，D錯誤。
2.(2020·全國卷Ⅲ，38改編)W是一種具有特定功能的人體蛋白質(zhì)。某研究小組擬仿照制備乳腺生物反應(yīng)器的研究思路，制備一種膀胱生物反應(yīng)器來獲得W，基本過程如圖所示。
回答下列問題：
(1)步驟①中需要使用的工具酶有　　　　　　　　　　　　　　　　　　。步驟②和③所代表的操作分別是　　　　和　　　　。步驟④稱為　　　　。
(2)與乳腺生物反應(yīng)器相比，用膀胱生物反應(yīng)器生產(chǎn)W的優(yōu)勢在于不受轉(zhuǎn)基因動物的　　　　　　(答出2點即可)的限制。
(3)一般來說，在同一動物個體中，乳腺上皮細(xì)胞與膀胱上皮細(xì)胞的細(xì)胞核中染色體DNA所含的遺傳信息　　　　(填“相同”或“不同”)，原因是____________________________
________________________________________________________________________。
(4)從上述流程可知，制備生物反應(yīng)器涉及胚胎工程，胚胎工程中所用到的主要技術(shù)有　　　　　　　　　　　　　　(答出2點即可)。
答案　(1)限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶　顯微注射　體外培養(yǎng)　胚胎移植　(2)性別、年齡　(3)相同　兩種上皮細(xì)胞都是體細(xì)胞，且來源于同一個受精卵
(4)體外受精、胚胎移植
解析　(1)步驟①是基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程，該過程需要使用的工具酶有限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)和DNA連接酶，用限制酶分別切割載體和目的基因，用DNA連接酶將目的基因和載體連接起來。步驟②和③所代表的操作分別是顯微注射和體外培養(yǎng)。步驟④是將早期胚胎植入到代孕母體內(nèi)，稱為胚胎移植。(2)與乳腺生物反應(yīng)器相比，用膀胱生物反應(yīng)器生產(chǎn)W的優(yōu)勢在于不受轉(zhuǎn)基因動物的性別和年齡的限制。(3)乳腺上皮細(xì)胞和膀胱上皮細(xì)胞都是體細(xì)胞。一般來說，在同一動物個體中，其體細(xì)胞都是由同一個受精卵分裂、分化而來的，細(xì)胞在分裂、分化過程中，其細(xì)胞核中染色體DNA所含的遺傳信息一般是不變的，因此兩種上皮細(xì)胞的染色體DNA所含的遺傳信息相同。(4)據(jù)題述流程可知，胚胎工程中所用到的主要技術(shù)有體外受精、早期胚胎培養(yǎng)、胚胎移植等。
3.(2019·海南卷，31)人的T細(xì)胞可以產(chǎn)生某種具有臨床價值的蛋白質(zhì)(Y)，該蛋白質(zhì)由一條多肽鏈組成。目前可以利用現(xiàn)代生物技術(shù)生產(chǎn)Y。回答下列問題。
(1)若要獲得Y的基因，可從人的T細(xì)胞中提取　　　　作為模板，在　　　　催化下合成cDNA，再利用　　　　技術(shù)在體外擴(kuò)增獲得大量Y的基因。
(2)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。若將上述所得Y的基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的　　　　中，得到含目的基因的重組Ti質(zhì)粒，則可用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將該基因?qū)肽撤N植物的葉肉細(xì)胞中。若該葉肉細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)、篩選等得到了能穩(wěn)定表達(dá)Y的愈傷組織，則說明Y的基因已經(jīng)_____________________________________________________。
(3)天然的Y通常需要在低溫條件下保存。假設(shè)將Y的第6位氨基酸甲改變?yōu)榘被嵋铱商岣咂錈岱€(wěn)定性，若要根據(jù)蛋白質(zhì)工程的原理對Y進(jìn)行改造以提高其熱穩(wěn)定性，具體思路是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案　(1)mRNA　逆轉(zhuǎn)錄酶　PCR　(2)T－DNA　整合到葉肉細(xì)胞染色體DNA上　(3)找到第6位氨基酸甲對應(yīng)的堿基所在的基因位置，參照密碼子表，將第6位氨基酸甲對應(yīng)的堿基替換為氨基酸乙的堿基
解析　(1)由于人的T細(xì)胞可以產(chǎn)生蛋白質(zhì)Y，要獲得Y的基因，可從人的T細(xì)胞中提取mRNA作為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下，利用四種游離的脫氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技術(shù)(體外擴(kuò)增DNA的技術(shù))在體外擴(kuò)增獲得大量Y的基因。
(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，T－DNA可以攜帶目的基因轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，故需要Y的基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T－DNA中得到含目的基因的重組Ti質(zhì)粒，把含目的基因的重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入到農(nóng)桿菌中，再讓含目的基因的農(nóng)桿菌侵染植物的葉肉細(xì)胞。若該葉肉細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)、篩選等得到了能穩(wěn)定表達(dá)Y的愈傷組織，則說明Y的基因已經(jīng)整合到葉肉細(xì)胞染色體DNA上。
(3)蛋白質(zhì)工程需要從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)，設(shè)計預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，推出相應(yīng)的氨基酸序列，找到相應(yīng)的脫氧核苷酸序列，故對Y進(jìn)行改造以提高其熱穩(wěn)定性，需要找到第6位氨基酸甲對應(yīng)的堿基所在的基因位置，參照密碼子表，將第6位氨基酸甲對應(yīng)的堿基替換為氨基酸乙的堿基。
課后·分層訓(xùn)練
(時間：35分鐘)
1.(2021·山東棗莊測試)下列關(guān)于基因工程基本工具的描述，錯誤的是(　　)
A.只有用相同的限制酶處理含目的基因的DNA片段和質(zhì)粒，才能形成重組質(zhì)粒
B.不同的核苷酸序列被不同的限制酶識別也有可能切出相同的黏性末端
C.限制酶識別序列越短，則該序列在DNA中出現(xiàn)的概率就越大
D.限制酶、DNA連接酶都是工具酶
答案　A
解析　用不同的限制酶處理含目的基因的DNA片段和質(zhì)粒，也可能形成相同的黏性末端，進(jìn)而形成重組質(zhì)粒，A錯誤，B正確；限制酶識別的序列越短，如序列CG//GC，在DNA中出現(xiàn)的概率就越大，C正確；重組DNA技術(shù)的基本工具有限制酶、DNA連接酶和載體，其中限制酶、DNA連接酶是工具酶，D正確。
2.(2021·合肥一六八中學(xué)測試)下表為常用的限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)及其識別序列和切割位點，由此推斷的以下說法中，正確的是(　　)
限制酶名稱 識別序列和切割位點 限制酶名稱 識別序列和切割位點
BamH Ⅰ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoRⅠ C↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
HindⅢ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
注：Y＝C或T，R＝A或G。
A.一種限制酶只能識別一種核苷酸序列
B.限制酶切割后一定形成黏性末端
C.不同的限制酶可以切出相同的黏性末端
D.限制酶的切割位點都在識別序列內(nèi)部
答案　C
解析　HindⅢ既能識別GTCAAC，也能識別GTTAAC，A錯誤；限制酶切割后可能形成黏性末端，如BamHⅠ、EcoRⅠ、KpnⅠ、Sau3AⅠ，也可能形成平末端，如HindⅢ、SmaⅠ，B錯誤；不同限制酶切割后可形成相同的黏性末端，如BamHⅠ和Sau3AⅠ，C正確；限制酶的切割位點可能在序列內(nèi)部，如BamHⅠ、EcoRⅠ、KpnⅠ、HindⅢ、SmaⅠ，也可能在序列外部，如Sau3AⅠ，D錯誤。
3.(2021·天津南開中學(xué)聯(lián)考)下圖為基因表達(dá)載體的模式圖，下列有關(guān)基因工程中載體的說法，錯誤的是(　　)
A.基因工程的核心步驟是基因表達(dá)載體的構(gòu)建
B.基因表達(dá)載體的構(gòu)建并不一定相同
C.圖中啟動子位于目的基因的首端，是核糖體識別和結(jié)合的部位
D.抗生素抗性基因的作用是作為標(biāo)記基因，用于鑒別受體細(xì)胞中是否導(dǎo)入了目的基因
答案　C
解析　由于受體細(xì)胞有植物、動物、微生物之分，以及目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法不同，因此基因表達(dá)載體的構(gòu)建也會有所差別，不可能是千篇一律的；啟動子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于目的基因的上游，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。
4.(2021·北京中央民族大學(xué)附中期末)下圖是利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖。以下相關(guān)敘述，正確的是(　　)
A.⑤只要表現(xiàn)出抗蟲性狀就表明植株發(fā)生了可遺傳變異
B.③侵染植物細(xì)胞后，重組Ti質(zhì)粒整合到④的染色體上
C.④的染色體上若含抗蟲基因，則⑤就表現(xiàn)出抗蟲性狀
D.②的構(gòu)建需要限制性內(nèi)切核酸酶和DNA聚合酶參與
答案　A
解析　⑤為轉(zhuǎn)基因植物，只要表現(xiàn)出抗蟲性狀就說明轉(zhuǎn)入的目的基因成功表達(dá)了，基因工程的原理是基因重組，屬于可遺傳變異，A正確；③侵染植物細(xì)胞后，重組Ti質(zhì)粒上的T－DNA整合到棉花細(xì)胞的染色體上，B錯誤；受體細(xì)胞的染色體上可能含抗蟲基因，但不代表該基因就一定成功表達(dá)，因此不能確定⑤是否表現(xiàn)出抗蟲性狀，C錯誤；基因表達(dá)載體的構(gòu)建需要限制性內(nèi)切核酸酶和DNA連接酶參與，D錯誤。
5.(2021·山東棗莊測試)以下為形成cDNA過程和PCR擴(kuò)增過程示意圖。據(jù)圖分析，下列說法正確的是(　　)
A.催化②⑤過程的酶都是DNA聚合酶，都能耐高溫
B.催化①過程的酶是RNA聚合酶
C.④過程發(fā)生的變化是引物與單鏈DNA結(jié)合
D.如果RNA單鏈中A與U之和占該鏈堿基含量的40%，則一個雙鏈DNA中，A與U之和也占該DNA堿基含量的40%
答案　C
解析　題圖中②⑤過程均為DNA的復(fù)制，這兩個過程都需要DNA聚合酶的催化，其中⑤過程進(jìn)行的溫度是70～75 ℃，因此催化該過程的DNA聚合酶要能耐高溫，但催化②過程的酶不需要耐高溫，A錯誤；①為逆轉(zhuǎn)錄過程，該過程需要逆轉(zhuǎn)錄酶的催化，B錯誤；④為復(fù)性過程，該過程兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合，C正確；DNA分子中不含堿基U，D錯誤。
6.(2021·北京海淀區(qū)期中)用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因植株是否成功導(dǎo)入目的基因時，得到以下電泳圖譜，其中1號為DNA標(biāo)準(zhǔn)樣液(Marker)，10號為蒸餾水。PCR時加入的模板DNA如下圖所示。據(jù)此作出的分析，不合理的是(　　)
A.PCR產(chǎn)物的分子大小為250～500 bp
B.3號樣品為不含目的基因的載體DNA
C.9號樣品對應(yīng)植株不是所需的轉(zhuǎn)基因植株
D.10號的電泳結(jié)果能確定反應(yīng)體系等對實驗結(jié)果沒有干擾
答案　B
解析　PCR過程中，可以通過設(shè)計特定的引物來擴(kuò)增特定的DNA片段。4～9號是轉(zhuǎn)基因植株，理論上應(yīng)包含目的基因，結(jié)合2號野生型和10號蒸餾水組的結(jié)果，推測包含目的基因的片段大小應(yīng)為250～500 bp，A正確；3號PCR結(jié)果包含250～500 bp片段，應(yīng)包含目的基因，B錯誤；9號PCR結(jié)果不包含250～500 bp片段，所以不是所需轉(zhuǎn)基因植株，C正確；10號放入蒸餾水，可排除反應(yīng)體系等對實驗結(jié)果的干擾，D正確。
7.(2020·山東濰坊模擬)蛋白質(zhì)工程中，要對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計改造，必須通過基因修飾或基因合成來完成，而不直接改造蛋白質(zhì)的主要原因是(　　)
A.缺乏改造蛋白質(zhì)所必需的工具酶
B.蛋白質(zhì)中氨基酸的排列順序千變?nèi)f化，操作難度大
C.人類對大多數(shù)蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)知之甚少
D.改造基因易于操作且改造后能夠遺傳
答案　D
解析　蛋白質(zhì)工程應(yīng)該從對基因的操作來實現(xiàn)對天然蛋白質(zhì)的改造，原因是：(1)任何一種天然蛋白質(zhì)都是由基因編碼的，改造了基因即對蛋白質(zhì)進(jìn)行了改造，而且改造過后的基因可以遺傳下去。如果對蛋白質(zhì)直接進(jìn)行改造，即使改造成功，被改造過的蛋白質(zhì)分子還是無法遺傳的。
8.(2020·海南學(xué)業(yè)水平選擇性考試，10)下列關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實驗的敘述，錯誤的是(　　)
A.羊的成熟紅細(xì)胞可作為提取DNA的材料
B.提取植物細(xì)胞的DNA時，需要加入一定量的洗滌劑和食鹽
C.預(yù)冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解
D.在沸水浴條件下，DNA與二苯胺反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色
答案　A
解析　羊的成熟紅細(xì)胞沒有細(xì)胞核，因此不可作為提取DNA的材料，A錯誤；提取植物細(xì)胞的DNA時，需要加入一定量的洗滌劑和食鹽，洗滌劑的作用是瓦解細(xì)胞膜，而食鹽的作用是提高DNA的溶解度，B正確；預(yù)冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解，同時根據(jù)蛋白質(zhì)易溶于酒精，而DNA不溶于酒精的特性將其析出，C正確；在沸水浴條件下，DNA與二苯胺反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色，D正確。
9.(2021·江蘇揚(yáng)州中學(xué)期中)PCR技術(shù)是把某一DNA片段在酶的作用下，在體外合成許多相同片段的一種方法，利用它能快速而特異地擴(kuò)增任何要求的目的基因或DNA分子片段；電泳技術(shù)則是在外電場作用下，利用分子攜帶的凈電荷不同，把待測分子的混合物放在一定的介質(zhì)(如瓊脂糖凝膠)中進(jìn)行分離和分析的實驗技術(shù)，利用它可分離氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等物質(zhì)進(jìn)行親子鑒定。下圖是電泳裝置及相應(yīng)電泳結(jié)果。
(1)電泳和葉綠體色素分離采用的紙層析法比較，后者使用的介質(zhì)是　　　　，葉綠體中的色素能夠在濾紙條上彼此分離開的原因是_____________________________________
________________________________________________________________________。
(2)PCR技術(shù)能把某一DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，依據(jù)的原理是
________________________________________________________________________。
(3)圖3是把含21個氨基酸的多肽進(jìn)行水解，得到的氨基酸混合物進(jìn)行電泳的結(jié)果，據(jù)圖可推知該多肽由　　　　種氨基酸構(gòu)成。(不同氨基酸電泳形成的條帶不同)
(4)圖4通過提取某小孩和其母親以及待測定的四位男性的DNA，分別由酶處理后，生成含有若干DNA片段并進(jìn)行擴(kuò)增得到混合物，然后進(jìn)行電泳所得到的一組DNA指紋圖譜。請分析：F1～F4中，誰是該小孩真正生物學(xué)上的父親？　　　　。為什么？________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案　(1)層析液　各種色素隨層析液在濾紙上的擴(kuò)散速度不同　(2)DNA半保留復(fù)制　(3)6　(4)F2　該小孩有一半DNA與M相同，另一半與F2相同，故F2是小孩真正生物學(xué)上的父親
解析　(1)紙層析法應(yīng)用的是層析液。層析液能分離色素的原理是各種色素在層析液中的溶解度不同，隨之在濾紙上的擴(kuò)散速度不同。(2)PCR的原理是DNA半保留復(fù)制。(3)由題圖可知出現(xiàn)了6種電泳條帶，說明水解后形成了6種氨基酸，即該多肽應(yīng)由6種氨基酸組成。(4)由題中的電泳圖分析可知該小孩生物學(xué)上的父親應(yīng)是F2，因為從F1到F4中只有F2和該小孩有相同的DNA。
10.(2020·海南學(xué)業(yè)水平選擇性考試，25)某課題組用生物技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因小鼠的過程，如圖所示。
回答下列問題。
(1)通常把目的基因轉(zhuǎn)入雄原核而不是雌原核，從兩者形態(tài)差異上分析，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)把桑葚胚植入假孕母鼠子宮前，需要對胚胎進(jìn)行性別鑒定，目前最有效的方法是SRY PCR法。操作的基本程序是：先從被測胚胎中取出幾個細(xì)胞，提取DNA，然后用位于Y染色體的性別決定基因，即SRY基因的一段堿基設(shè)計　　　　，以胚胎細(xì)胞中的DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后用SRY特異性探針檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。出現(xiàn)陽性反應(yīng)者，胚胎為　　　　；出現(xiàn)陰性反應(yīng)者，胚胎為　　　　。
(3)若目的基因的表達(dá)產(chǎn)物是某種特定的蛋白質(zhì)，檢測目的基因在子代轉(zhuǎn)基因小鼠中是否成功表達(dá)，常用的分子檢測方法是　　　　，檢測的基本思路是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案　(1)雄原核較大，更容易容納外源DNA　(2)引物　雄性小鼠　雌性小鼠　(3)抗原—抗體雜交技術(shù)
從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體(對抗體進(jìn)行同位素標(biāo)記)進(jìn)行抗原—抗體雜交，如果出現(xiàn)雜交帶，表明目的基因已經(jīng)表達(dá)成功
解析　(1)通常來自精子的雄原核較大，更容易容納外源DNA，因此外源基因能夠更容易整合到精子的染色體上，這是提高轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵。
(2)目前，對胚胎的性別進(jìn)行鑒定的最有效最準(zhǔn)確的方法是SRY PCR法，操作的基本程序是：從被測的囊胚中取出幾個滋養(yǎng)層細(xì)胞，提取DNA，然后用位于Y染色體上的性別決定基因(即SRY基因)的一段堿基作引物，在熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶)催化作用下，以胚胎細(xì)胞中的DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再用SRY特異性探針檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，與SRY特異性探針出現(xiàn)陽性反應(yīng)者，說明其含有Y染色體，胚胎為雄性；出現(xiàn)陰性反應(yīng)者，說明其不含Y染色體，胚胎為雌性。
(3)檢測目的基因在子代轉(zhuǎn)基因小鼠中是否成功表達(dá)，常用的分子檢測方法是抗原—抗體雜交技術(shù)。檢測的基本思路如下：從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體(對抗體進(jìn)行同位素標(biāo)記)進(jìn)行抗原—抗體雜交，如果出現(xiàn)雜交帶，表明目的基因已表達(dá)出蛋白質(zhì)。
11.(2020·北京等級模考，17)淀粉酶在食品加工及輕工業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛用途。研究人員從細(xì)菌中克隆了一種淀粉酶基因，為了獲得高產(chǎn)淀粉酶菌株，按下圖所示流程進(jìn)行基因工程操作。
(1)將淀粉酶基因與質(zhì)粒載體重組時需要使用的酶包括
________________________________________________________________________。
(2)大腸桿菌經(jīng)過　　　　　　處理后，可作為感受態(tài)細(xì)胞使用。
(3)為了初步篩選高產(chǎn)菌株，研究人員將得到的3個工程菌株接種到以淀粉為唯一碳源的培養(yǎng)基上，經(jīng)過培養(yǎng)后用稀碘液處理，可觀察到以菌落為中心的透明圈。測量不同菌株形成的菌落及透明圈直徑，結(jié)果見下表。
工程菌 菌落直徑(C，mm) 透明圈直徑(H，mm) H/C
菌株Ⅰ 8.1 13.0 1.6
菌株Ⅱ 5.1 11.2 2.2
菌株Ⅲ 9.5 17.1 1.8
①表中菌落直徑(C)的大小反映了　　　　，透明圈直徑(H)的大小反映了________________________________________________________________________。
②根據(jù)表中數(shù)據(jù)，可推斷其中淀粉酶產(chǎn)量最高的菌株是
________________________________________________________________________。
(4)基因工程技術(shù)已成功應(yīng)用于人類生產(chǎn)生活中的諸多方面。請從植物育種或人類疾病預(yù)防與治療方面舉一實例，并說明制備該轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的基本技術(shù)流程。(限100字以內(nèi))　
______________________________________________________________
答案　(1)限制酶(限制性內(nèi)切核酸酶)、DNA連接酶
(2)Ca2＋(或氯化鈣)　(3)①細(xì)菌的增殖速度　細(xì)菌分解淀粉的能力　②菌株Ⅱ　(4)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花。從細(xì)菌中克隆Bt毒蛋白基因，構(gòu)建重組載體，導(dǎo)入棉花細(xì)胞后進(jìn)行組織培養(yǎng)。經(jīng)對再生植株中目的基因的檢測，獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花。(或基因工程胰島素。克隆人的胰島素基因，構(gòu)建重組載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，檢測目的基因，篩選高產(chǎn)菌株并進(jìn)行培養(yǎng)，生產(chǎn)胰島素。)
解析　(1)將淀粉酶基因與質(zhì)粒載體重組構(gòu)建基因表達(dá)載體需要用限制酶和DNA連接酶。(2)用Ca2＋處理大腸桿菌細(xì)胞，使其成為易于吸收周圍環(huán)境中DNA分子的感受態(tài)細(xì)胞。(3)①菌落是由一個細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體，菌落直徑的大小反映了細(xì)菌的增殖速度。工程菌株含有淀粉酶基因，能夠產(chǎn)生淀粉酶，從而將菌落周圍的淀粉水解而出現(xiàn)透明圈，因此透明圈直徑的大小反映了細(xì)菌分解淀粉的能力。②分析表中數(shù)據(jù)，菌落直徑越大說明該菌的增殖速度越快，即單位時間內(nèi)產(chǎn)生的細(xì)菌數(shù)量越多，而透明圈直徑越大說明細(xì)菌分解淀粉的能力越強(qiáng)，H/C的值越大，說明淀粉酶產(chǎn)量越高，圖中菌株Ⅱ的該比值最大，故其淀粉酶產(chǎn)量最高。(4)基因工程技術(shù)可應(yīng)用于植物育種方面，如培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，即從細(xì)菌中克隆Bt毒蛋白基因，構(gòu)建基因表達(dá)載體，導(dǎo)入棉花細(xì)胞，然后進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，最后對再生植株中的目的基因進(jìn)行檢測，獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花。將基因工程技術(shù)應(yīng)用于治療人類疾病方面，如通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)胰島素，即克隆人的胰島素基因，構(gòu)建基因表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌內(nèi)，檢測目的基因是否表達(dá)，篩選出高產(chǎn)胰島素菌株進(jìn)行培養(yǎng)，生產(chǎn)胰島素。

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