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【生物新高考一輪復習】
熱點微練30　基因工程的操作程序
1.(2020·云南昆明“三診一模”)2020年3月16日，中國科學家陳薇院士團隊研制的重組新冠疫苗通過臨床研究注冊審評，獲批進入臨床試驗。重組新冠疫苗的制備流程如圖。回答下列問題。
(1)步驟②需要　　　　作為原料。步驟③需要的工具酶主要是　　　　。
(2)被用作載體的Ad5應具有的特點是　　　　　　　　　　　　　　　　(答出1點即可)。
(3)步驟④是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)重組疫苗注入志愿者體內后，S蛋白基因指導合成的S蛋白作為　　　　，刺激機體產生能與之相結合的抗體，抗體的分泌量可作為檢測疫苗對志愿者免疫效果的指標。參加臨床試驗的志愿者需要滿足的條件之一是　　　　(填“有”或“無”)SARS－CoV－2感染史，理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(5)為探究疫苗的注射劑量對志愿者產生的免疫效果，需進一步試驗，請寫出試驗思路：　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
答案　(1)脫氧核苷酸　Taq酶　(2)能自我復制(或有一個或多個限制酶切割位點、有標記基因位點、對受體細胞無害)　(3)基因表達載體的構建　(4)抗原　無　有SARS－CoV－2感染史的志愿者血清中存在一定量的相應抗體，會對試驗結果產生干擾　(5)給不同組志愿者分別注射不同劑量的疫苗，一段時間后采集血樣并檢測相應抗體的水平
解析　(1)步驟②為逆轉錄過程，合成的產物是cDNA，因此需要脫氧核苷酸作為原料。步驟③為利用PCR技術擴增獲得S蛋白基因的過程，該過程需要的酶是Taq酶(耐高溫的DNA聚合酶)。(2)Ad5作為載體應具有的特點是能自我復制、有多個限制酶切割位點、有標記基因、在宿主細胞中可以存活并表達、對宿主細胞無害等。(3)步驟④為構建目的基因表達載體的過程，即重組新冠疫苗的過程。(4)重組疫苗注入志愿者體內后，S蛋白基因指導合成的S蛋白可作為抗原，刺激機體產生特異性免疫過程，使機體免疫系統產生能與之相結合的抗體，抗體的分泌量可作為檢測疫苗對志愿者免疫效果的指標。參加臨床試驗的志愿者需要滿足無SARS－CoV－2感染史的條件，即未感染過新冠病毒的志愿者，因為感染過新冠病毒的人體內含有相應的記憶細胞，若注射疫苗，則會出現二次免疫的特征，即體內的記憶細胞會迅速增殖分化，產生大量的漿細胞，漿細胞合成并分泌大量的抗體，從而導致無法檢測出該疫苗的真正效果。(5)實驗目的為探究疫苗的注射劑量對志愿者產生的免疫效果，根據實驗目的可知，該實驗的自變量為疫苗的注射劑量，因變量為抗體產生量，因此設計實驗如下：將同性別且年齡相當的志愿者隨機分成若干組，然后給不同組別的志愿者注射不同劑量的疫苗，一段時間之后，檢測志愿者體內的抗體產生量，作好記錄并進行比較、分析，從而得出結論。
2.(2020·山東等級考試二模，23)大腸桿菌β 半乳糖苷酶(Z酶)可催化底物(X gal)水解產生藍色物質。在pUC18質粒中，lacZ′ 編碼Z酶氨基端的一個片段(稱為α 肽)，該質粒結構及限制酶識別位點如圖甲所示。已知α 肽、缺失α 肽的Z酶片段單獨存在時均無Z酶活性，共同存在時就會表現出Z酶活性。利用圖乙中的DNA片段與pUC18質粒進行基因工程操作。
(1)限制酶能催化雙鏈DNA分子中　　　　(填化學鍵名稱)的斷裂。本實驗可使用限制酶　　　　處理pUC18質粒和圖乙中的DNA片段，再通過DNA連接酶連接，獲得含目的基因的重組質粒。
(2)用重組質粒轉化大腸桿菌，然后將大腸桿菌接種到含氨芐青霉素的固體培養基上進行培養，由于未發生轉化的大腸桿菌沒有該質粒，因而不具有　　　　，在該培養基上不能生長。從功能上劃分，該培養基屬于　　　　培養基。
(3)當上述培養基中含有X gal時，生長出的菌落有藍色和白色兩種類型，其中含有重組質粒的大腸桿菌的菌落顏色為　　　　，這是因為_________________________________
________________________________________________________________________。
為保證能通過菌落顏色辨別出含有重組質粒的大腸桿菌，本實驗作為受體細胞的大腸桿菌中Z酶基因應滿足的條件是______________________________________。
答案　(1)磷酸二酯鍵　SalⅠ
(2)氨芐青霉素抗性　選擇
(3)白色　目的基因與質粒連接后使lacZ′ 被破壞，不能合成α 肽　編碼α 肽的DNA序列缺失，其他序列正常
解析　(1)限制酶能催化雙鏈DNA分子中特定部位磷酸二酯鍵的斷裂，將DNA斷開。從圖中可知，酶HindⅢ可破壞目的基因，而質粒和目的基因兩側都有酶SalⅠ識別位點，因此本實驗可使用限制酶SalⅠ處理pUC18質粒和圖乙中的DNA片段。
(2)重組質粒上有氨芐青霉素抗性基因，由于未發生轉化的大腸桿菌沒有該質粒，因而不具有氨芐青霉素抗性，在含氨芐青霉素培養基上不能生長。從功能上劃分，該培養基屬于選擇培養基，選擇了含重組質粒的大腸桿菌。
(3)從圖中可知，重組質粒是用酶SalⅠ分別處理過的質粒和目的基因片段形成的，重組質粒的lacZ′基因被破壞，不能合成β 半乳糖苷酶(Z酶)，不能催化底物(X gal)水解產生藍色物質，故呈菌落白色。已知α 肽、缺失α 肽的Z酶片段單獨存在時均無Z酶活性，共同存在時就會表現出Z酶活性，為保證能通過菌落顏色辨別出含有重組質粒的大腸桿菌，本實驗作為受體細胞的大腸桿菌中Z酶基因應滿足的條件是編碼α 肽的DNA序列缺失，其他序列正常。
3.(2021·福建福州適應性練習)乙烯具有促進果實成熟的作用，ACC氧化酶和ACC合成酶是番茄細胞內合成乙烯的兩個關鍵酶。利用反義基因技術(原理如圖1)，可以抑制這兩個基因的表達，從而使番茄具有耐儲存、宜運輸的優點。圖2為融合ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因的反義基因表達載體的結構示意圖。
圖1　反義基因技術
圖2　反義基因表達載體
(1)圖2中的2A11為特異性啟動子，則2A11應在番茄的　　　　(填器官名稱)中表達。
(2)從番茄成熟果實中提取　　　　作為模板，利用反轉錄法合成ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因，對它們進行拼接構成融合基因并擴增。
(3)合成出的ACC氧化酶基因兩端分別含限制酶BamHⅠ和XbaⅠ的酶切位點，ACC合成酶基因兩端含SacⅠ和Xba Ⅰ的酶切位點，用限制酶　　　　對上述兩個基因進行切割后，再將它們拼接成融合基因，相應的Ti質粒和融合基因均使用限制酶　　　　　　　　　　　　進行切割，以確保融合基因能夠插入載體中。
(4)為了實現圖1中反義基因的效果，應將融合基因　　　　(填“正向”或“反向”)插入啟動子2A11的下游即可構成反義融合基因。
(5)在檢測番茄細胞中是否存在反義融合基因時，　　　　(填“能”或“不能”)用放射性物質標記的ACC氧化(合成)酶基因片段作探針進行檢測，理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
答案　(1)果實　(2)RNA　(3)Xba Ⅰ　BamH Ⅰ和Sac Ⅰ　(4)反向　(5)不能　番茄細胞內本來就存在ACC氧化(合成)酶基因，能與ACC氧化(合成)酶基因探針發生分子雜交
解析　(1)番茄食用的是果實，因此，啟動子2A11應在番茄的果實中表達。(2)從番茄成熟果實中提取RNA作為模板，利用反轉錄法合成ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因。(3)使用限制酶Xba Ⅰ對合成出的ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因進行切割后，兩種基因有相同的黏性末端，可將二者拼接形成融合基因。相應的Ti質粒和融合基因均使用限制酶BamH Ⅰ和Sac Ⅰ進行切割，然后再連接，可以確保融合基因能夠插入載體中。(4)為了實現圖1中反義基因的效果，應將融合基因反向插入啟動子2A11的下游。(5)番茄細胞內本來就存在ACC氧化(合成)酶基因，能與ACC氧化(合成)酶基因探針發生分子雜交，因此，不能用放射性物質標記的ACC氧化(合成)酶基因作為探針進行檢測。
4.(2021·遼寧錦州聯合校期末)通過把編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因定向插入酵母菌細胞中，使之充分表達，再經純化可制得乙型肝炎疫苗。回答下列問題：
(1)人體接種乙型肝炎疫苗后，該疫苗可作為　　　　刺激機體發生特異性免疫反應。乙型肝炎疫苗先后需要接種多次，其目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)如果已知乙型肝炎病毒表面抗原的氨基酸序列，則可以推測出相應目的基因的核苷酸序列，但推測出的目的基因核苷酸序列并不是唯一的，其原因是　　　　　　　　　　　　　　。
(3)將編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因導入酵母菌細胞之前需要構建基因表達載體，這一過程中需要的工具酶主要有　　　　　　　　　　　　。構建的基因表達載體中，編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因應該位于　　　　　　　　　　　　之間。
(4)將編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因導入酵母菌細胞時，使該基因在酵母菌細胞中得以穩定遺傳的關鍵是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
答案　(1)抗原　使人體產生更多的抗體和記憶細胞　(2)決定氨基酸的密碼子具有簡并性(或決定一種氨基酸的密碼子往往不是只有一種)　(3)限制酶和DNA連接酶　啟動子和終止子　(4)確保編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因插入到酵母菌細胞的染色體DNA上
解析　(1)乙型肝炎疫苗可作為抗原引起人體產生特異性免疫反應。乙型肝炎疫苗需先后接種多次的目的是使人體產生更多的抗體和記憶細胞，以發揮最大的免疫效果。(2)由于mRNA上的密碼子具有簡并性，根據蛋白質的氨基酸序列推測出的mRNA的核苷酸序列不是唯一的，所以推測出的基因的核苷酸序列不是唯一的。(3)在構建基因表達載體過程中，需要用限制酶切割目的基因片段與載體，再用DNA連接酶把目的基因與載體連接起來。構建的基因表達載體中，啟動子和終止子分別是基因表達中轉錄起始和終止的調控序列，目的基因需要插在啟動子和終止子之間。(4)真核細胞分裂時細胞質DNA隨機分配，應將目的基因插入到酵母菌細胞的染色體DNA上，以確保目的基因在酵母菌細胞中穩定遺傳。

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