資源簡介

第2節　微生物的培養技術及應用
學習目標：
1.了解培養基的概念。并知道如何配制培養基。
2.闡明無菌技術是在操作過程中.保持無菌物品與無菌區域不被微生物污染的技術。
3.概述平板劃線法和稀釋涂布平板法。
4.通過配制培養基、滅菌、接種和培養等實驗操作獲得純化的酵母菌落。
學習內容：
一、培養基的配制
1．培養基的概念：人們按照微生物對 的不同需求，配制出供其生長繁殖的 。
2．作用：用以 、 、 、保存微生物或積累其 。
3．培養基種類
標準 培養基種類 培養基特點 作用
物理性質 培養基 加凝固劑，如瓊脂 微生物的分離與鑒定，活菌計數，保藏菌種
培養基 容器放倒不致流出，劇烈震動則破散 觀察微生物的運動、分類鑒定
培養基 不加凝固劑 常用于工業生產
功能 培養基 根據某種微生物的特殊營養要求配制 選擇分離
培養基 加入能與目的菌的代謝產物發生顯色反應的指示劑 鑒定
來源 培養基 含化學成分不明確的天然物質 工業生產
培養基 用已知的化學物質配制 分類鑒定
(1)固體培養基中的瓊脂僅作為凝固劑， (“能”、“不能”)為微生物生長提供能量和碳源。
(2)病毒為非細胞結構生物，只能在活細胞中營寄生生活，目前 (“能”、“不能”)利用人工培養基來培養。
4．培養基的營養組成
(1)主要營養物質：水、 (提供碳元素的物質)、 (提供氮元素的物質)和無機鹽。
(2)某種常見的細菌培養基——牛肉膏蛋白胨培養基的營養構成
組分 含量 提供的主要營養
牛肉膏 5 g 、磷酸鹽和維生素等
蛋白胨 10 g 和維生素等
NaCl 5 g 無機鹽
H2O 定容至1 000 mL 水
(3)還需滿足微生物對pH、特殊營養物質以及O2的需求。例如：
①在培養乳酸桿菌時，需要在培養基中添加 ；
②在培養霉菌時，一般需要將培養基pH調至 性；
③在培養細菌時，一般需要將培養基pH調至 性或 性；
④在培養厭氧微生物時，需要提供 的條件。
二、無菌技術
1.獲得純凈的微生物培養物的關鍵是防止雜菌污染。無菌技術主要包括 和 。
2．消毒
(1)概念：指使用較為 的物理、化學或 等方法殺死物體表面或內部 微生物。
(2)適用對象：操作的 、操作者的 和手等。
(3)常用方法：煮沸消毒、巴氏消毒等。
項目 主要方法 應用范圍
消 毒 消毒法 62～65 ℃消毒30 min或80～90 ℃處理30 s～1 min 牛奶、啤酒、果酒和醬油等不耐高溫的液體
消毒法 100 ℃煮沸5～6 min 家庭餐具等生活用品
消毒 30 W紫外燈照射30 min(損傷細菌的DNA) 接種室、接種箱或超凈工作臺
化學藥劑 消毒 用體積分數為70%～75%的 、碘酒 皮膚、傷口、動植物組織表面消毒、空氣、手術器械、塑料或玻璃器皿
3．滅菌
(1)概念：指使用 的理化方法殺死物體內外 的微生物，包括 和
。
(2)適用對象：用于微生物培養的 、 用具和 等。
(3)常用方法：濕熱滅菌、干熱滅菌和灼燒滅菌等。
項目 主要方法 應用范圍
滅菌 滅菌 直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒 涂布器、接種環、接種針或其他金屬用具，試管口或瓶口等
滅菌 干熱滅菌箱中，160～170 ℃的熱空氣中維持2～3 h 耐高溫的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(如吸管、培養皿等)、金屬用具等
高壓蒸汽滅菌( 滅菌) 100 kPa、121 ℃維持15～30 min 培養基等
4. 消毒和滅菌的比較
項目 消毒 滅菌
作用強度 較為 的物理、化學因素
消滅微生物的數量 物體表面或內部 微生物 物體內外的 微生物
能否消滅芽孢、孢子 消滅 芽孢 能消滅 芽孢和孢子
適用對象 操作空間、操作者的衣著和手等 接種環、接種針、玻璃器皿、培養基等
常用方法 消毒法、巴氏消毒法、化學藥劑消毒法、紫外線消毒法 、 、
5.無菌技術可用來防止實驗室的培養物被其他外來微生物污染外，還能有效避免操作者自身被微生物感染。
三、微生物的純培養
(一)相關概念：
(1)將接種于培養基內，在合適條件下形成的含特定種類微生物的群體稱為 。
(2)由單一個體繁殖所獲得的微生物群體稱為 。
(3)獲得純培養物的過程就是 。
(二)純培養步驟：微生物的純培養包括 、 、 、 等。
(三)探究·實踐——酵母菌的純培養
1.實驗原理：分散的微生物在適宜的固體培養基表面或內部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態結構的子細胞群體，這就是 。
2. 實驗方法：采用 法和 法將單個微生物分散在固體培養基上，之后經培養得到的單菌落一般是由單個微生物繁殖形成的純培養物。
3. 實驗步驟
(1)制備培養基：① ；② ；③ 。
Ⅰ.如果需要調節培養基的pH，應該在定容完成后，滅菌之 進行操作。
Ⅱ.倒平板時，要使錐形瓶的瓶口迅速通過火焰。通過 滅菌，防止瓶口的微生物污染培養基。
Ⅲ.倒平板時應待培養基冷卻至 ℃左右時，在 附近倒平板。
Ⅳ.平板冷卻凝固后，要將平板 。既可以防止水分過快蒸發，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染。
(2)接種和分離酵母菌
通過接種環在固體培養基表面 的操作，將聚集的菌種逐步 到培養基表面。經過數次劃線后培養，可以分離得到單菌落。
(
②在火焰旁冷卻接種環。棉塞
放在操作臺上。
) (
③將試管口通過
。
) (
①將接種環放在
上灼燒
)
(
④在
附近用接種環蘸取一環菌液。
) (
⑤將試管口通過
，并塞上棉塞。
)
(
⑦第二次劃線。重復以上操作，作第三、四、五次劃線。注意
將最后一次的劃線與第一次的劃線相連。
) (
⑥在
附近將皿蓋打開一條縫隙，用接種環在培養基表面迅速劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。
)
Ⅰ．每次灼燒接種環的時間和目的
灼燒時期 目的
取菌種前
每次劃線前 殺死上次劃線時殘留菌種，使下一次劃線的菌種直接來源上次劃線的末端，從而使 ，直至得到單個細胞
接種結束后 殺死接種環上 ，避免細菌污染環境和感染操作者
Ⅱ．在第二次以及其后的劃線操作時，總是從上一次劃線的 端開始劃線的原因是：劃線后，線條末端酵母菌的數目比線條起始處要 ，每次從上一次劃線的末端開始，能使酵母菌的數目隨著劃線次數的增加而逐步 ，最終能得到由 個細胞繁殖而來的菌落。
Ⅲ．最后一次劃線與第一次的劃線 相連。因為最后一次劃線已經將細菌稀釋成單個的細胞，如果與第一次劃線相連則 了細菌的數目，得不到純化的效果。
(3)培養酵母菌
完成平板劃線后，待菌液被培養基吸收，將接種后的平板和一個 的平板 ，放入 ℃左右的恒溫培養箱中培養24～48 h。
4．實驗結果的分析
(1)培養未接種的培養基的目的是檢測 (或檢查 )。未接種的培養基表面若有菌落生長，則說明培養基 ，應該重新制備；若無菌落生長，則說明 。
(2)在接種酵母菌的培養基上可觀察到獨立的菌落，這些菌落在顏色、形狀和大小上 ，酵母菌菌落一般表面光滑，多呈乳白色。
(3)若在培養基中觀察到 的菌落，原因可能是菌液不純，混入其他雜菌，或在實驗操作過程中被雜菌污染。
5．平板劃線法接種菌種時，可防止雜菌污染的操作
(1)接種前將接種環放在 。
(2)劃線操作在 旁進行。
(3)接種環蘸取菌液前后，要將試管口通過 。
(4)劃線時將培養皿的皿蓋打開一條 ，用接種環在培養基表面 劃線，劃線后 。
答案
一、1．營養物質 營養基質
2．培養 分離 鑒定 代謝物
3． 固體 半固體 液體 選擇 鑒別 天然 合成(1)不能 (2)不能
4．(1)碳源 氮源 (2) 碳源 氮源 (3)①維生素 ②酸性 ③中 弱堿 ④無氧
二、1.消毒 滅菌
2．(1)溫和 生物 一部分(2)空間 衣著(3) 巴氏 煮沸 紫外線
3．(1)強烈 所有 芽孢 孢子(2) 器皿、接種 培養基 (3) 灼燒 干熱 濕熱
4. 溫和 強烈 一部分 所有 部分 全部 煮沸 灼燒滅菌 干熱滅菌 濕熱滅菌
三、(一)(1)培養物 (2)純培養物 (3)純培養 (二)配制培養基 滅菌 接種 分離和培養
(三) 1.菌落2.平板劃線 稀釋涂布平板
3. (1)①配制培養基 ②滅菌 ③倒平板Ⅰ.前 Ⅱ.火焰 Ⅲ. 50 酒精燈火焰Ⅳ.倒置
(2)連續劃線 稀釋分散 ①火焰 ②不能 ③火焰 ④火焰 ⑤火焰 ⑥火焰 ⑦不要
Ⅰ．殺死接種環上原有微生物 末 每次劃線時菌種數目逐漸減少 殘留的菌種
Ⅱ．末 少 減少 單 Ⅲ．不能 增加了細菌的數目 (3)未接種 倒置 28
4．(1)培養基是否被雜菌污染 培養基制備是否合格 被污染 未被污染 (2)相似
(3)不同形態
5．(1)酒精燈火焰上灼燒 (2)酒精燈火焰 (3)火焰 (4)縫隙 迅速 及時蓋上皿蓋

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