資源簡介

第2節　微生物的培養技術及應用
第2課時　微生物的選擇培養與計數
學習目標：
1.學會用生物與環境相適應的觀點理解選擇培養的原理
2.學會通過調整增養基的配方來有目的地培養某一種微生物
3.學會用多種方法測定微生物的數量
學習內容：
一、選擇培養基
1.自然界中目的菌的篩選：從目的菌株生存的 中找。
(1)實例：聚合酶鏈式反應(PCR)中用到的耐高溫的DNA聚合酶，是從熱泉中篩選出來的
中提取出來的。
(2)依據：水生棲熱菌能在 ℃的高溫條件下生存，而絕大多數微生物在此條件下不能生存。
2.選擇培養基：允許 的微生物生長，同時 其他種類微生物生長的培養基。
3.實驗室中目的菌的篩選
(1)原理：人為提供有利于 生長的條件(包括營養、溫度和pH等)，同時 其他微生物的生長。
(2)方法：利用 培養基分離。
二、微生物的選擇培養
1.方法：對樣品進行充分 ，然后將 涂布到制備好的 培養基上。也就是采用稀釋涂布平板法。
2.稀釋涂布平板法的操作過程
(1)系列稀釋操作
①將10 g土樣加入盛有 mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻。
②取1 mL上清液加入盛有 mL無菌水的試管中，依次等比 。
(2)涂布平板操作
①取菌液：取0.1 mL菌液，滴加到 表面。
②涂布器消毒：將涂布器浸在盛有 的燒杯中。
③涂布器滅菌：將涂布器放在火焰上 ，待酒精燃盡、涂布器 后，再進行涂布。
④涂布平板：用涂布器將 均勻地涂布在培養基表面。涂布時可轉動培養皿，使涂布 。
(3)培養：待涂布的菌液被培養基吸收后，將平板 ，放入30~37℃ 中培養1～2 d。
三、微生物的數量測定
1.稀釋涂布平板法
(1)原理：當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個 。通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少 。
(2)計數原則：
①一般選擇菌落數為 的平板進行計數。樣品的 將直接影響平板上的菌落數目，通常選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養。
②在一同稀釋度下，應至少對 個平板進行重復計數，然后求出 。
(3)結果分析：統計的菌落數往往比活菌的實際數目 ，這是因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是 。因此，統計結果一般用 而不是用活菌數來表示。
2.稀釋涂布平板法操作注意問題
(1)稀釋操作時：每支試管及其中的9 mL水、移液管等均需 ；操作時，試管口和移液管應在離火焰1～2 cm處。
(2)涂布操作中的注意事項
①涂布器浸在體積分數為 %的酒精中，取出時，讓多余酒精在燒杯中滴盡，然后將沾有少量酒精的涂布器在火焰上 。
②不要將過熱的涂布器放在盛放酒精的燒杯中，以免 。
(3)同一稀釋度的樣液加到 個或 的平板上，經涂布、培養，計算出菌落平均數。
(4)計算公式
每克樣品中的菌株數＝ 。
3.顯微鏡直接計數法：是一種常用的、快速 的測定微生物數量的方法。
(1)原理：利用特定的細菌計數板或 ，在顯微鏡下觀察、計數，然后再計算一定體積的樣品中微生物的數量，。
(2)結果：統計的結果一般是 的總和。
四、微生物兩種兩種接種方法的比較
主要方法 平板劃線法 稀釋涂布平板法
主要步驟 在 體培養基 表面 劃線 系列 操作和 操作
接種工具
能否用 于計數 ，但是操作復雜，需涂布多個平板
培養結果
共同點 都能將微生物分散到固體培養基表面，以獲得單細胞菌落，達到分離純化微生物的目的，也可用于觀察菌落特征
五、探究·實踐——土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
1.實驗原理
絕大多數微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以
氮源的 培養基，可以從土壤中分離出分解尿素的細菌。
2．實驗設計
(1)土壤取樣：在酸堿度接近中性的潮濕土壤，且距地表約3～8 cm的土壤層取樣。
(2)樣品的稀釋
測定土壤中細菌的數量，一般選用 倍稀釋的稀釋液進行平板培養，當第一次做這個實驗時可以將稀釋的范圍放寬一點。
(3)微生物的培養與觀察：
①培養：根據不同微生物的需要，控制適宜的培養 和培養 。細菌一般在
℃的溫度下培養 d。
②觀察
a．觀察方法：每隔 h統計一次菌落數目，選取菌落 時的記錄作為結果。
b．記錄菌落的特征：包括菌落的 、 和 等。
3.對微生物的分離與計數實驗結果的分析。
目的 現象 結論
是否有雜菌污染的判斷 對照的空白對照培養基中 未被雜菌污染
培養物中菌落數偏 被雜菌污染
培養物中菌落形態 ，菌落數偏高 培養物中混入其他雜菌
選擇培養基是否起篩選作用 牛肉膏蛋白胨培養基上的菌落數目 選擇培養基上的數目 選擇培養基具有篩選作用
4．操作提示
(1)無菌操作
①取土樣的用具在使用前都需要 。
②實驗操作均應在 進行。
(2)做好標記：本實驗使用的平板和試管較多，為避免混淆，最好在使用前做好標記。例如，在標記培養皿時應該注明組別、培養日期和平板上培養樣品的 等。
(3)制定計劃：對于耗時較長的生物實驗，需要事先規劃時間，以便提高 ，在操作時有條不紊。
5.需注意的問題
(1)為了保證結果準確，一般選擇菌落數在 的平板進行計數。
(2)恰當的 是成功統計菌落數目的關鍵。
(3)設計實驗時為了增強實驗的說服力與準確性，要設置 實驗，且一定要涂布至少 個平板作為重復組。涂布至少3個平板作為重復組，目的是排除實驗中偶然因素對實驗結果的影響。
(4)分析實驗結果時，要考慮重復組結果是否接近，如果 ，意味著操作有誤，需重新實驗。
(5)為防止培養時間不足導致菌落遺漏，在菌落計數時，每隔24 h統計一次菌落數目，選取菌落 時的記錄作為結果。
(6)統計的菌落數目往往比活菌實際數目 。
(7)要進一步鑒定選擇培養基上的菌落是分解尿素的細菌，可在培養基中添加 指示劑，培養基變 則可以初步鑒定為分解尿素的細菌。
答案
一、1.相應環境(1)水生棲熱菌(2) 70～80
2.特定種類 抑制或阻止
3. (1)目的菌 抑制或阻止 (2) 選擇
二、
1. 稀釋 菌液 選擇
2. (1) ①90 ②9 稀釋(2)①培養基 ②酒精 ③灼燒 冷卻 ④菌液
(3)倒置恒溫培養箱
三、1. (1)活菌 活菌
(2)①30～300 稀釋度 ②3 平均值
(3)少 一個菌落菌落數
2. (1)滅菌 (2)①70 灼燒 ②引燃其中的酒精(3)三 三個以上
(4)×稀釋倍數
3.直觀 (1)血細胞計數板 (2)活菌數和死菌數
四、接種環 固體 連續 梯度稀釋 涂布平板 接種環 涂布器 不能 能
五、1.尿素作為唯一
2． (2) 1×104、1×105和1×106
(3)①溫度 時間 30～37 1～2
②a．菌落數目穩定b．形狀 大小 顏色
3. 無菌落生長 高 多樣 高 大于
4．(1)①滅菌 ② 火焰
(2)稀釋度
(3)實驗效率
5. (1) 30～300
(2)恰當的稀釋度
(3)空白對照 排除實驗中偶然因素對實驗結果的影響
(4)相差太大
(5)菌落數目穩定 (6)低
(7)酚紅 紅

展開更多......

收起↑