資源簡介

第2節　基因工程的基本操作程序
學習目標:
1.簡述PCR的原理、條件及過程。
2.簡述基因表達載體的組成及構建過程。
3.闡明將目的基因導入受體細胞的方法。
4.闡明目的基因的檢測與鑒定的方法。
學習內容：
一、目的基因的篩選與獲取
1.篩選合適的目的基因
(1)目的基因的概念：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期
等的基因。
(2)主要類型：主要是 的基因，如與生物抗逆性、生產藥物、毒物降解、工業用酶等相關的基因。
(3)選方法：從相關的 的基因中進行篩選。
2.利用PCR獲取和擴增目的基因
(1)原理： 。
(2)PCR反應的條件
參與的組分 在DNA復制中的作用
DNA母鏈 提供DNA復制的
4種脫氧核苷酸 合成DNA 的原料
(體外用高溫代替) 打開DNA雙鏈
(耐高溫的) 催化合成DNA子鏈
引物(長度通常為20～30個核苷酸) 分為2種，分別與兩條模板鏈結合，使DNA聚合酶能夠從引物的 端開始連接脫氧核苷酸
溫度 控制溫度使 在體外反復進行
緩沖液(含Mg2＋) 真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要 激活
(3)PCR擴增的過程
①變性：當溫度超過 ℃時，目的基因DNA受熱變性后解聚為 。
②復性：當溫度下降到 ℃左右時， 通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。
③延伸：當溫度上升到 ℃左右時，以 為模板，在耐高溫的DNA聚合酶作用下進行延伸,即將4種脫氧核苷酸加到 的3’端。
3.用PCR方法擴增目的基因時 知道基因的全部序列。
4.PCR技術中，DNA模板鏈上堿基G和C的比例越高，DNA變性解鏈的溫度就越 。
5.PCR的每一個循環都包括 → → 三個步驟，延伸后的產物又可以作為下一個循環的模板。
二、基因表達載體的構建
1.操作目的
使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠
作用。
2.基因表達載體的組成及其作用
一個基因表達載體的組成，除了 、 外，還必須有 、
等(如圖所示)。
3.基因表達載體的構建過程
(1)用一定的 切割載體，使其出現一個有黏性末端(或平末端)的切口。
(2)用 種或 的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
(3)加入適量 ，使切下的目的基因片段拼接到載體的切口處。
三、將目的基因導入受體細胞
1.導入植物細胞
①花粉管通道法
方法一：用微量注射器將含 的DNA溶液直接注入 中。
方法二：在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將 溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助 進入胚囊。
②農桿菌轉化法
a．原理：農桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下侵染 植物和裸子植物，而對大多數 植物沒有侵染能力
b．農桿菌的特點：農桿菌細胞內含有 質粒，侵染植物細胞后，能將Ti質粒上的 轉移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的 。
c．方法一：將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與 共培養→篩選轉化細胞→再生成植株
方法二：將花序直接浸沒在含有 的溶液中→培養植物并獲得種子→篩選、鑒定
2.導入動物細胞：利用 將目的基因注入動物的 中
3.導入原核細胞：通常選用 作為受體細胞，用 處理大腸桿菌細胞→將重組的 導入其中。
四、目的基因的檢測與鑒定
1.分子水平的檢測
(1)導入水平
①技術手段： 等技術。
②檢測目的：檢測受體細胞的 上是否插入了 。
(2)轉錄水平
①技術手段： 等技術。
②檢測目的：檢測目的基因是否轉錄出了 。
(3)翻譯水平
①技術手段： 技術。
②檢測目的：檢測目的基因是否 。
2.個體水平的鑒定
(1)鑒定方法：例如通過采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲
(2)鑒定目的：確定目的基因是否賦予了轉基因生物特定的 及程度。
課堂練習：
1.以下關于基因表達載體的構建的說法正確的是(　　)
A.基因表達載體的構建是在生物體的細胞內完成的
B.基因表達載體中只有啟動子才能驅動目的基因轉錄出mRNA
C.基因表達載體的組成應包括啟動子、終止密碼子、目的基因、標記基因等
D.基因表達載體通常采用抗生素合成基因作為標記基因
2.科學家構建了含有大洋鱈魚抗凍蛋白基因啟動子和大鱗鮭魚生長激素基因的表達載體，并將其導入了大西洋鮭的細胞中，獲得了生長速度加快的轉基因大西洋鮭。相關敘述正確的是(　　)
A.轉基因大西洋鮭體內抗凍蛋白明顯增加
B.構建基因表達載體需要限制酶和DNA聚合酶
C.大鱗鮭魚生長激素基因不能通過PCR技術擴增獲得
D.轉基因大西洋鮭生長激素含量增加導致生長速度加快
3.下列關于目的基因導入受體細胞的方法中，不正確的是(　　)
A.我國利用花粉管通道法培育了轉基因抗蟲棉
B.用Ca2＋處理大腸桿菌，使之成為感受態細胞
C.將目的基因導入動物細胞最常用、最有效的方法是顯微注射法
D.利用農桿菌轉化法培育大多單子葉轉基因植物
4.下圖表示用化學方法合成目的基因Ⅰ的過程。據圖分析下列敘述正確的是(　　)
A.過程①需要DNA連接酶
B.過程②需要限制酶
C.目的基因Ⅰ的堿基序列是已知的
D.若某質粒能與目的基因Ⅰ重組，則該質粒和Ⅰ的堿基序列相同
答案
一、1.(1)表達產物
(2)編碼蛋白質
(3)知結構和功能清晰
2. (1) DNA半保留復制
(2) 模板 子鏈 解旋酶 DNA聚合酶 3′ DNA復制 Mg2＋
(3)①90 單鏈 ②50 兩種引物 ③72 單鏈DNA 引物
3.不必
4.高
5.變性→復性→延伸
二、1.表達和發揮
2.目的基因 標記基因 啟動子 終止子
啟動子 上游 RNA聚合酶 終止子 下游 轉錄 標記
3.(1) 限制酶 (2) 同 產生相同末端
(3) DNA連接酶
限制酶 相同 DNA連接酶
三、1.①目的基因 子房 DNA 花粉管通道
②a．雙子葉 單子葉b． Ti T DNA 染色體DNA上c．農桿菌 農桿菌
2.顯微注射 受精卵
3.大腸桿菌 Ca2＋ 基因表達載體
四、1. (1)①PCR ②染色體DNA 目的基因
(2)①PCR ② mRNA
(3)①抗原—抗體雜交 ②翻譯出特定的蛋白質
2.(2)遺傳特性
課堂練習：
1.答案　B
解析　基因表達載體的構建是在生物體外完成的，A錯誤；基因表達載體的組成應包括啟動子、終止子、目的基因、標記基因等，終止密碼子位于mRNA上，C錯誤；基因表達載體通常采用抗生素抗性基因作為標記基因，D錯誤。
2.答案　D
解析　轉基因大西洋鮭體內生長激素明顯增加，A錯誤；構建基因表達載體需要限制酶和DNA連接酶，B錯誤；大鱗鮭魚生長激素基因能通過PCR技術擴增獲得，C錯誤；轉基因大西洋鮭生長激素含量增加導致生長速度加快，D正確。
3.答案　D
解析　目前我國的轉基因抗蟲棉是利用花粉管通道法培育的，A正確；為使大腸桿菌易吸收DNA分子，應先用氯化鈣溶液進行處理，使大腸桿菌處于易于吸收周圍環境中DNA分子的感受態，B正確；顯微注射技術是將目的基因導入動物細胞最為有效的一種方法，C正確；農桿菌對大多數單子葉植物沒有侵染能力，D錯誤。
4.答案　C
解析　過程①發生堿基互補配對，不需要DNA連接酶，A錯誤；過程②發生堿基互補配對，不需要限制酶，B錯誤；用人工的方法化學合成目的基因必須知道目的基因的堿基序列，C正確；某質粒能與目的基因重組，只需要有相同的黏性末端即可，不必所有序列都相同，D錯誤。

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