資源簡介

中小學教育資源及組卷應用平臺
人教(2019)生物高考知識點梳理&對點訓練
14.2　基因工程操作中限制酶的選擇和PCR技術
基因工程操作中目的基因的獲取和基因表達載體的構建都離不開限制性內切核酸酶，只有選取合適的限制酶才能準確切取目的基因，因此限制酶的選取是基因工程操作的重點也是難點，近年來較難的高考試題大都圍繞限制酶的選取進行考查。PCR技術既可以用于獲取目的基因，又可以用于目的基因的檢測與鑒定，是基因工程中重要技術之一，其應用較強，因此對PCR技術的考查也成為命題的熱點。
1．(2021·全國乙卷)用DNA重組技術可以賦予生物以新的遺傳特性，創造出更符合人類需要的生物產品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性內切核酸酶的切割位點如圖所示。
回答下列問題：
(1)常用的DNA連接酶有E.coli DNA連接酶和T4 DNA連接酶。上圖中____________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA連接酶連接。上圖中__________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA連接酶連接。
(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質粒載體片段之間形成的化學鍵是____________。
(3)DNA重組技術中所用的質粒載體具有一些特征，如質粒DNA分子上有復制原點，可以保證質粒在受體細胞中能________；質粒DNA分子上有____________________，便于外源DNA插入；質粒DNA分子上有標記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質粒載體的宿主細胞，方法是____________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)表達載體含有啟動子，啟動子是指___________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coli DNA連接酶來源于大腸桿菌，只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來，而T4 DNA連接酶來源于T4噬菌體，可用于連接黏性末端和平末端，但連接效率較低。因此圖中EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)既可以用E.coli DNA連接酶連接，又可以用T4 DNA連接酶連接，而限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割后的DNA片段(平末端)只能用T4 DNA連接酶連接。(2)DNA連接酶將兩個DNA片段連接形成磷酸二酯鍵。(3)質粒是小型環狀的DNA分子，常作為基因表達的載體。質粒上含有復制原點，能保證質粒在受體細胞中自我復制；質粒DNA分子上有一個至多個限制酶的酶切位點，便于目的基因的導入；質粒上的標記基因是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因，具體做法是用含有該抗生素的培養基培養宿主細胞，能夠存活的即為含有質粒載體的宿主細胞。(4)啟動子是一段特殊序列結構的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得需要的蛋白質。
答案：(1)EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ　EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ、Sma Ⅰ和EcoR Ⅴ　(2)磷酸二酯鍵　(3)自我復制　一個至多個限制酶切割位點　用含有該抗生素的培養基培養宿主細胞，能夠存活的即為含有質粒載體的宿主細胞　(4)位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶識別及結合的部位，能驅動轉錄過程
2．(2021·山東高考)人類γ基因啟動子上游的調控序列中含有BCL11A蛋白結合位點，該位點結合BCL11A蛋白后，γ基因的表達被抑制。通過改變該結合位點的序列，解除對γ基因表達的抑制，可對某種地中海貧血癥進行基因治療。科研人員擴增了γ基因上游不同長度的片段，將這些片段分別插入表達載體中進行轉化和熒光檢測，以確定BCL11A蛋白結合位點的具體位置。相關信息如圖所示。
(1)為將擴增后的產物定向插入載體指導熒光蛋白基因表達，需在引物末端添加限制酶識別序列。據圖可知，在 F1～F7末端添加的序列所對應的限制酶是______，在 R 末端添加的序列所對應的限制酶是________。本實驗中，從產物擴增到載體構建完成的整個過程共需要________種酶。
(2)將構建的載體導入除去 BCL11A 基因的受體細胞，成功轉化后，含 F1～F6與 R 擴增產物的載體表達熒光蛋白，受體細胞有熒光，含 F7與 R 擴增產物的受體細胞無熒光。含F7 與 R 擴增產物的受體細胞無熒光的原因是_____________________________________。
(3)向培養液中添加適量的雌激素，含 F1～F4與 R 擴增產物的受體細胞不再有熒光，而含 F5～F6與 R 擴增產物的受體細胞仍有熒光。若γ基因上游調控序列上與引物序列所對應的位置不含有 BCL11A 蛋白的結合位點序列，據此結果可推測，BCL11A 蛋白結合位點位于______________________________________________，理由是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)據題意可知，需要將擴增后的產物定向插入并指導熒光蛋白基因的表達，則含有啟動子P的擴增后的產物讀取方向與熒光蛋白基因的讀取方向一致，故擴增后的產物中的R端與熒光蛋白基因中限制酶MunⅠ 識別序列端結合，才能保證擴增后的產物定向插入并指導熒光蛋白基因的表達。要做到定向插入，需要引物末端兩端添加限制酶的識別序列，且被限制酶識別并切割后，兩端的黏性末端不能相同。而擴增后的產物中可能含有MunⅠ 和 XhoⅠ 的識別位點，故在引物末端添加限制酶的識別序列不能被限制酶MunⅠ和Xho Ⅰ所識別，故應該選用添加限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ識別序列，據圖中對限制酶的注釋可知，限制酶MunⅠ與限制酶EcoRⅠ 識別并切割后的黏性末端相同，故 R 末端添加的序列所對應的限制酶是EcoRⅠ，在 F1～F7 末端添加的序列所對應的限制酶是SalⅠ；熒光蛋白基因中含有限制酶EcoRⅠ的識別位點，故對載體使用限制酶MunⅠ 和XhoⅠ 切割。綜上所述，對載體使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割，對擴增后的產物選用添加限制酶EcoR Ⅰ和限制酶SalⅠ識別序列，然后在DNA連接酶的催化作用下，連接形成重組載體；產物擴增中需要使用Taq酶催化，合成更多的產物，故從產物擴增到載體構建完成的整個過程共需要6種酶，分別是Taq酶、限制酶EcoR Ⅰ、限制酶Sal Ⅰ、限制酶Mun Ⅰ、限制酶Xho Ⅰ、DNA連接酶。(2)受體細胞中已經除去BCL11A基因，故擴增產物中的 BCL11A 蛋白結合位點，不會抑制熒光蛋白基因的表達；基因的表達需要RNA聚合酶與啟動子結合，才能完成熒光蛋白基因的轉錄過程；含 F1～F6與 R 擴增產物的載體表達熒光蛋白，受體細胞有熒光，含 F7 與 R 擴增產物的受體細胞無熒光，則可能是F7與R擴增產物不含完整的啟動子，熒光蛋白基因不表達。(3)向培養液中添加適量的雌激素，此時重組載體上的BCL11A基因表達，產生 BCL11A 蛋白， BCL11A 蛋白與BCL11A 蛋白結合位點結合后，導致熒光蛋白基因被抑制；含 F1～F4 與 R 擴增產物的受體細胞不再有熒光，則說明BCL11A 蛋白結合位點結合后在引物F4與引物R之間的序列上；含 F5～F6 與 R 擴增產物的受體細胞仍有熒光，則說明BCL11A 蛋白結合位點結合后在引物F5的上游序列，故據此結果可推測，BCL11A 蛋白結合位點位于引物 F4 與 F5 在調控序列上所對應序列之間的區段上。
答案：(1)SalⅠ　EcoRⅠ　6　(2)F7與R擴增產物不含完整的啟動子，熒光蛋白基因不表達　(3)引物 F4 與 F5 在調控序列上所對應序列之間的區段上　根據有無熒光情況判斷，F1～F4 與 R 擴增產物上均有結合位點，因此結合位點位于 F4所對應調控序列的下游(右側)；F5～F6 與 R 擴增產物上均無結合位點，可知結合位點位于 F5 所對應調控序列的上游(左側)，所以結合位點位于引物 F4 與 F5 在調控序列上所對應序列之間的區段上
3．(2020·江蘇高考)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側的序列，具體流程如圖(以EcoRⅠ酶切為例)：
請據圖回答問題：
(1)步驟Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一種______________酶，它通過識別特定的________________切割特定位點。
(2)步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′ 羥基與5′ 磷酸間形成____________；PCR循環中，升溫到95 ℃是為了獲得__________；Taq DNA聚合酶的作用是催化________________________________________________________________________。
(3)若如表所列為已知的DNA序列和設計的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是________(從引物①②③④中選擇，填編號)。
項目 DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物
(4)對PCR產物測序，經分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列)，結果正確的是________。
A．5′ AACTATGCG……AGCCCTT 3′
B．5′ AATTCCATG……CTGAATT 3′
C．5′ GCAATGCGT……TCGGGAA 3′
D．5′ TTGATACGC……CGAGTAC 3′
解析：(1)根據題圖可知，步驟Ⅰ是獲取目的DNA片段，所用的酶EcoR Ⅰ是一種限制酶，其能識別特定的核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。(2)步驟Ⅱ是將目的DNA片段連接成環狀，其中DNA連接酶的作用是催化相鄰核苷酸之間的3′ 羥基和5′ 磷酸間形成磷酸二酯鍵。PCR循環中，升高溫度到95 ℃是為了打開氫鍵使雙鏈解旋，獲得DNA單鏈，Taq DNA聚合酶的作用是催化游離的脫氧核苷酸連接到引物3′端，合成DNA子鏈。(3)引物的作用是使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始延伸DNA子鏈，因為DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸，故為擴增未知序列，選擇的與模板鏈相結合的引物應為④和②。(4)分析題意可知，片段F的兩端為限制酶EcoR Ⅰ切割后產生的黏性末端，因此其5′端序列應為AATT ，3′端序列應為 TTAA，B正確。
答案：(1)限制性內切核酸(或限制)　核苷酸序列
(2)磷酸二酯鍵　DNA單鏈　以DNA為模板的DNA鏈的延伸　(3)②④　(4)B
[知識梳理]
知能集成(一)　探討基因工程操作中限制酶的選擇方法
1．根據目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類
(1)應選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。
(2)不能選擇切點位于目的基因和標記基因內部的限制酶，如圖甲、乙不能選擇SmaⅠ。
(3)為避免目的基因和質粒的自身環化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質粒上也有這兩種酶的切點)。
2．根據質粒的特點確定限制酶的種類
3．根據Ti質粒的T DNA片段選擇限制酶
圖中甲、乙、丁Ti質粒均不宜選取，而丙Ti質粒宜選取(設切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下：
[典例]　(2022·衡水模擬)玉米是重要的糧食作物，其葉片細胞中的P蛋白是一種水通道蛋白，由P基因編碼，在植物生長發育過程中對水分的吸收具有重要的調節功能。科研人員成功培育出超量表達P蛋白轉基因玉米，所用DNA片段和Ti質粒的酶切位點如圖所示。
請回答下列問題：
(1)強啟動子是一段有特殊結構的DNA片段，能被 ________________識別并結合，驅動基因的持續轉錄。為使P基因在玉米植株中超量表達，應優先選用 ____________________酶組合，將Ti質粒切開后構建重組表達載體。T DNA在該實驗中的作用是 ________________________________________________________________________
____________________________。
(2)將農桿菌浸泡過的玉米愈傷組織去菌后進行植物組織培養，培養基中需加入______進行篩選，此物質屬于氨基糖苷類抗生素，它能抑制蛋白質在葉綠體和線粒體中合成，使植物的光合作用和 ________受到干擾，從而引起植物細胞死亡。
(3)愈傷組織是一種相對沒有分化的 ________團，經液體懸浮培養可以分散成胚性單細胞，在適宜的培養基中，這種單細胞可以發育成 __________，再繼續發育成轉基因玉米株系。
[解析]　(1)啟動子是RNA聚合酶識別并結合的位點，能驅動基因的轉錄。為使P基因在玉米植株中超量表達，則需要強啟動子，因此應優先選用BamHⅠ和SacⅠ酶組合，將Ti質粒切開后構建重組表達載體。農桿菌中Ti質粒上的T DNA可轉移至受體細胞，并且整合到受體細胞染色體的DNA上，因此T DNA在該實驗中的作用是將強啟動子和P基因帶入玉米細胞并整合到玉米細胞染色體DNA上。(2)由圖可知，標記基因是G418抗性基因，因此將農桿菌浸泡過的玉米愈傷組織去菌后進行植物組織培養，培養基中需加入G418進行篩選，此物質屬于氨基糖苷類抗生素，它能抑制蛋白質在葉綠體和線粒體中合成，其中葉綠體是光合作用的場所，線粒體是細胞有氧呼吸的主要場所，因此其可使植物的光合作用和呼吸作用(能量代謝)受到干擾，從而引起植物細胞死亡。(3)愈傷組織是一種相對沒有分化的薄壁細胞團，經液體懸浮培養可以分散成胚性單細胞，在適宜的培養基中，這種單細胞可以發育成胚狀體，再繼續發育成轉基因玉米株系。
[答案]　(1)RNA聚合酶　BamHⅠ和SacⅠ　將強啟動子和P基因帶入玉米細胞并整合到玉米細胞染色體DNA上　(2)G418　呼吸作用(能量代謝)　(3)薄壁細胞　胚狀體
[針對訓練]
1．(2022·東城區二模)為了獲得抗蚜蟲棉花新品種，研究人員將雪花蓮凝集素基因(GNA)和尾穗莧凝集素基因(ACA)與載體(pBI 121)結合，然后導入棉花細胞。下列操作與實驗目的不符的是(　 )
A．用限制酶BsaBⅠ和DNA連接酶處理兩種基因可獲得GNA ACA融合基因
B．與只用KpnⅠ相比，Kpn Ⅰ和XhoⅠ處理融合基因和載體可保證基因轉錄方向正確
C．將棉花細胞接種在含氨芐青霉素的培養基上可篩選出轉基因細胞
D．用PCR技術可檢測GNA和ACA基因是否導入棉花細胞中
解析：選C　由圖可知：GNA、ACA都含有限制酶BsaBⅠ的酶切位點，故用限制酶BsaBⅠ和DNA連接酶處理兩種基因可獲得GNA ACA融合基因，A正確；圖中質粒與GNA ACA上都含有KpnⅠ和XhoⅠ的酶切位點，與只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ處理融合基因和載體可保證基因轉錄方向正確，B正確；由于重組質粒含有卡那霉素的抗性基因，故將棉花細胞接種在含卡那霉素的培養基上可篩選出轉基因細胞，C錯誤；PCR技術可用于基因探針的制備，可用來檢測目的基因是否導入受體細胞，D正確。
2．(2022·寧德模擬)將小菜蛾細胞的羧酸酯酶基因(CarE)導入水稻細胞，培育抗農藥水稻新品種，過程如圖所示。下列敘述錯誤的是(　 )
A．必須將含CarE基因的質粒導入水稻的受精卵
B．構建重組質粒時，應選用PstⅠ和SmaⅠ分別切割質粒和含CarE基因的DNA
C．Tetr的作用是鑒別和篩選含CarE基因的細胞
D．通過檢測表達產物來判斷CarE基因在水稻細胞中是否發揮功能作用
解析：選A　不一定要將含CarE基因的質粒導入水稻的受精卵，但是導入受精卵效果要好，A錯誤；Tetr是標記基因，是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來，C正確。
知能集成(二)　PCR技術中引物的相關問題分析
1．PCR技術和DNA復制的比較
項目 PCR技術 DNA復制
場所 體外(PCR擴增儀中) 細胞內(主要是細胞核內)
解旋方式 DNA在高溫下變性解旋 解旋酶催化
酶 耐高溫的DNA聚合酶 解旋酶、DNA聚合酶
溫度條件 在較高溫度下進行需控制溫度 細胞內溫和條件
合成對象 DNA片段 DNA分子
相同點 均需要模板(DNA雙鏈)、原料(四種脫氧核苷酸)、能量
2.與引物相關的問題歸納概括
(1)PCR技術需要引物的原因。
DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈，因此，DNA的復制需要引物。當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，因此DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。
(2)PCR擴增中需要引物數目的計算規律。
若一個DNA分子在PCR中經過n輪循環，理論上需要消耗引物數為2n＋1－2，第n輪循環需要消耗的引物數為2n個。
[典例]　(2022·天津二模)IKK激酶參與動物體內免疫細胞的分化。臨床上發現某重癥聯合免疫缺陷(SCID)患兒IKK基因編碼區第1 183位堿基T突變為C，導致IKK上第395位酪氨酸被組氨酸代替。為研究該患兒發病機制，研究人員利用純合野生鼠應用大引物PCR定點誘變技術培育出SCID模型小鼠(純合)，主要過程如圖1、2。分析回答：
(1)在PCR反應體系中，除加入引物、IKK基因、緩沖液、Mg2＋等外，還需加入________________________________________________________________________等。
(2)在圖1獲取突變基因過程中，需要以下3種引物：
引物A 5′ CCCCAACCGGAAAGTGTCA 3′(下劃線字母為突變堿基)
引物B 5′ TAAGCTTCGAACATCCTA 3′(下劃線部分為限制酶HindⅢ識別序列)
引物C 5′ GTGAGCTCGCTGCCCCAA 3′(下劃線部分為限制酶SacⅠ識別序列)
則PCR1中使用的引物有______________，PCR2中使用的引物有__________和圖中大引物的________(填“①”或“②”)鏈。
(3)PCR的反應程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s,30個循環。在循環之前的94 ℃ 3 min處理為預變性；循環中72 ℃處理的目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)據圖2分析代孕母鼠對移入子宮的胚胎基本不發生免疫反應，這為________________________提供了可能。
(5)研究人員經鑒定、篩選獲得一只轉基因雜合鼠F0，并確認突變基因已經穩定同源替代IKK基因，請你設計完成獲得SCID模型鼠的實驗步驟：
①雜交親本：______________，雜交得F1；
②F1雌雄鼠隨機交配得F2；
③提取F2每只小鼠的基因組DNA，采用分子生物學方法，利用IKK基因探針和突變基因探針進行篩選，則____________________________________________________為模型鼠。
[解析]　(1)在PCR反應體系中，除加入引物、IKK基因、緩沖液、Mg2＋等外，還需加入耐高溫DNA聚合酶、4種脫氧核苷酸等。(2)在PCR1中，獲取的是大引物，大引物中含有突變基因，所以應含有引物A，在基因的右端有限制酶HindⅢ識別的序列，所以要用到引物B；在PCR2中，有一個引物結合到了基因的左端，在它從5′到3′的序列的開始部位應含有限制酶SacⅠ識別的序列，所以要用到引物C；而另外的一個引物就是大引物中的一條鏈，它應該結合到基因的右端，且從5′到3′端的序列中開始部位應含有HindⅢ識別的序列，從圖中看，它是大引物的②鏈。(3)在PCR循環之前的94 ℃ 3 min處理為預變性，使DNA雙鏈解開；循環中72 ℃處理的目的是使Taq酶從引物起始通過堿基互補配對進行互補鏈合成。(4)代孕母鼠對移入子宮的胚胎基本不發生免疫反應，這為胚胎在受體內存活提供了可能。(5)①研究人員經鑒定、篩選獲得一只轉基因雜合鼠F0，并確認突變基因已經穩定同源替代IKK基因，若要獲得SCID模型鼠，可讓F0與野生鼠雜交得F1；②F1雌雄鼠隨機交配得F2；③模型鼠中應含有突變基因，但不含IKK基因，故提取F2每只小鼠的基因組DNA，利用IKK基因探針和突變基因探針進行篩選，若IKK基因探針檢測未出現雜交帶，突變基因探針檢測出現雜交帶的則為模型鼠。
[答案]　(1)Taq酶(或熱穩定DNA聚合酶)、4種脫氧核苷酸　(2)引物A和引物B　引物C　②　(3)使Taq酶從引物起始進行互補鏈合成　(4)胚胎在受體內存活　(5)①F0×野生鼠　③IKK基因探針檢測未出現雜交帶，突變基因探針檢測出現雜交帶
[針對訓練]
1．據研究，新冠病毒表面的S蛋白是其主要的病毒抗原，在康復病人的血清中有抗S蛋白的特異性抗體。如圖為某機構研制新冠病毒疫苗的部分過程。下列敘述錯誤的是(　 )
A．對發熱病人進行核酸檢測可使用帶標記的S基因做探針
B．使用PCR選擇性擴增的前提條件是掌握S基因的核苷酸序列
C．過程②通常是將S基因和質粒連接以構建重組表達載體
D．S基因與培養的動物細胞核DNA整合是其穩定遺傳的關鍵
解析：選B　對發熱病人進行核酸檢測時以S基因單鏈作為探針，若出現雜交鏈則細胞內有病毒存在，A正確；使用PCR選擇性擴增的前提是有一段已知目的基因的核苷酸序列，便于根據這一序列合成引物，不需要掌握S基因的全部序列，B錯誤；過程②是基因表達載體的構建，通常是將S基因和質粒用相同的限制酶處理后連接以構建重組表達載體，C正確；S基因整合到細胞核DNA分子中后能使S基因在細胞內穩定存在，是其穩定遺傳的關鍵，D正確。
2．(2022·連云港期末)中國科學家陳薇院士團隊研制的重組新冠疫苗制備流程如圖1所示。回答下列問題：
(1)基因工程的核心步驟是____________________，被用作載體的Ad5應具有的特點有____________________________________________等。
(2)對疫情重點地區輸入的人員進行核酸檢測需要用到用含放射性同位素的__________ 做探針，進行血清抗體檢測的方法是________________雜交。
(3)為探究疫苗的注射劑量對志愿者產生的免疫效果，需要給不同組志愿者分別注射____________的疫苗，一段時間后采集血樣檢測相應抗體的水平。
(4)新型冠狀病毒的檢測最常見的方法是熒光定量RT PCR(逆轉錄聚合酶鏈式反應)，RT PCR 的具體過程如圖2所示。
①過程Ⅰ和Ⅱ都需要加入緩沖液、原料、酶和引物等，其中加入的酶分別是________________________________________________________________________。
②RT PCR過程通過對________的控制影響酶的活性和DNA分子結構，從而使得整個反應過程有序地進行。
③過程Ⅱ擬對單鏈cDNA進行n次循環擴增，理論上需要引物B為____________個。
解析：(1)基因工程的核心步驟是基因表達載體的構建；作為基因工程的載體需要具備的條件有：能自我復制、有一個或多個切割位點、有標記基因位點、對受體細胞無害等。(2)探針是指放射性同位素或熒光分子標記的目的基因；進行血清抗體檢測的方法是抗原—抗體雜交。(3)探究疫苗的注射劑量對志愿者產生的免疫效果時，自變量是疫苗的劑量，因此需要給不同組志愿者分別注射不同劑量的疫苗，一段時間后采集血樣檢測相應抗體的水平。(4)①Ⅰ為逆轉錄過程，該過程需要逆轉錄酶的催化；Ⅱ為PCR技術擴增過程，該過程需要耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶)。②RT PCR過程通過對溫度的控制影響酶的活性和DNA分子結構，從而使得整個反應過程有序地進行。③過程Ⅱ擬對單鏈cDNA進行n次循環的擴增，由于起點是單鏈DNA，經過依次循環形成一個雙鏈DNA分子，每個雙鏈DNA分子都需要一個引物B，因此經過n次循環形成2n－1個子代DNA分子，也需要2n－1個引物B。
答案：(1)基因表達載體的構建　有一個或多個切割位點、有標記基因位點、對受體細胞無害　(2)目的基因　抗原—抗體　(3)不同劑量　(4)①逆轉錄酶、耐高溫的DNA聚合酶　②溫度　③2n－1
[課時驗收評價]
1．為增強玉米抗旱性，研究者構建含有某微生物抗旱基因E的重組質粒，用農桿菌轉化法轉入玉米幼胚組織細胞中，獲得抗旱的轉基因玉米。下列相關敘述不正確的是(　 )
A．提取該微生物mRNA逆轉錄為cDNA，通過PCR可獲得大量目的基因
B．將重組質粒置于經CaCl2處理的農桿菌懸液中，可以獲得轉化的農桿菌
C．用農桿菌轉化法將E基因轉入玉米幼胚組織細胞需要嚴格進行無菌操作
D．用E蛋白的抗體進行抗原—抗體雜交，可在個體水平檢測轉基因玉米的抗旱性狀
解析：選D　用E蛋白的抗體進行抗原—抗體雜交，可在分子水平檢測轉基因玉米的抗旱性狀，D錯誤。
2．(2022·撫順二模)如圖是三種限制酶的脫氧核苷酸識別序列和切割位點示意圖(↓表示切點)。下列相關分析錯誤的是(　 )
A．這三種限制酶切割出的DNA片段末端都是黏性末端
B．不同限制酶切割DNA所得的黏性末端可能相同
C．能被限制酶3切割的DNA也能被限制酶1切割
D．同一個DNA經限制酶1和限制酶3分別切割后所得片段數一定相等
解析：選D　能被限制酶3切割的DNA也能被限制酶1切割，但能被限制酶1切割的DNA不一定能被限制酶3切割，故同一個DNA經限制酶1和限制酶3分別切割后所得片段數不一定相等，C正確，D錯誤。
3．(2022·濟南模擬)現有重組質粒甲(共含2 686個堿基對，不含T DNA)和乙(共13 400個堿基對)，為避免基因反接，研究人員用限制酶Ⅰ和Ⅱ切割重組質粒甲、乙，再利用所得片段構建了重組質粒丙(如圖所示)，然后采用農桿菌轉化法將丙導入胡蘿卜愈傷組織細胞。培養后得到轉VP1基因胡蘿卜植株。將重組質粒甲、乙和丙進行分組，每組只含其中一種重組質粒，同時用限制酶Ⅰ和Ⅱ切割，哪一組是切割重組質粒丙的結果(　 )
A．只得到含有2 146和540個堿基對的2種DNA片段
B．只得到含有540和12 400個堿基對的2種DNA片段
C．只得到含有12 400和1 000個堿基對的2種DNA片段
D．只得到含有540和13 400個堿基對的2種DNA片段
解析：選B　由題意知，重組質粒甲含有2 686個堿基對，若只得到含有2 146和540個堿基對的2種DNA片段，則是切割重組質粒甲的結果，A錯誤；由A項分析可知，限制酶Ⅰ切割可產生540個堿基對，那另外的12 400個堿基對片段，則是同時用限制酶Ⅰ和Ⅱ切割，B正確；重組質粒乙共13 400個堿基對，若只得到含有12 400和1 000個堿基對的2種DNA片段，則是切割重組質粒乙的結果，C錯誤；若得到含有13 400個堿基對的DNA片段，說明重組質粒乙未被限制酶識別并切割，D錯誤。
4．(2022·泰安模擬)限制酶的發現為DNA的切割和功能基因的獲得創造了條件。限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的識別序列及切割位點分別為↓GATC、G↓AATTC、C↓GATCC。含某目的基因的DNA片段如圖所示，若利用質粒A(含限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點各1個)構建基因表達載體，為克服目的基因和質粒A的自身環化以及目的基因與質粒的任意連接等。下列對限制酶的選擇，正確的是(　 )
A．用限制酶EcoRⅠ或BamHⅠ處理含某目的基因的DNA和質粒A
B．用限制酶Sau3AⅠ和BamHⅠ處理含某目的基因的DNA和質粒A
C．用限制酶Sau3AⅠ和EcoRⅠ處理含某目的基因的DNA和質粒A
D．用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ處理含某目的基因的DNA和質粒A
解析：選D　用限制酶Sau3AⅠ切割目的基因會破壞目的基因，質粒含有限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點，獲取目的基因也可以用限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ進行切割，但為了防止目的基因或質粒自身環化，需要使用不同種限制酶進行切割，則可以使用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ切割質粒和目的基因。
5．植株在干旱、低溫等逆境中，脫水素(具有一定抗干旱脅迫和耐冷凍能力的蛋白質)被誘導表達，脫水素基因編碼區共含678個堿基對。科學家利用如圖所示PBⅠ121質粒，以及XbaⅠ和SacⅠ兩種限制酶，運用農桿菌轉化法，將脫水素基因導入草莓試管苗葉片細胞，再經植物組織培養獲得脫水素基因過量表達的轉基因草莓植株。下列相關敘述錯誤的是(　 )
A．重組質粒利用SacⅠ和HindⅢ切割后能得到1 500 bp片段，則表明目的基因正確插入質粒
B．組織培養過程中，培養基需添加卡那霉素和新霉素以便篩選轉基因植株
C．可以利用PCR技術鑒定目的基因是否整合到草莓染色體的DNA上
D．轉基因草莓植株批量生產前需進行抗干旱、耐冷凍實驗
解析：選B　根據分析可知，由于重組質粒上移除1 900 bp而補充了脫水素基因的678個堿基對，加上未移除的822 bp，所以用SacⅠ和HindⅢ切割重組質粒后，可得到822＋678＝1 500 bp的新片段，據此可確定目的基因正確插入了質粒，A正確；題中提供的限制酶切割位點對卡那霉素抗性基因沒有影響，所以無論是否插入了目的基因，卡那霉素抗性基因都可以表達，起不到篩選轉基因植株的作用，B錯誤；PCR技術是進行DNA擴增的技術，需要一段引物來進行擴增，依照脫水素基因的核苷酸序列設計一段引物，若能進行擴增，說明轉入目的基因成功，C正確；植株批量生產前，需要在個體水平上進行抗干旱、耐冷凍實驗，以確保轉基因植物中的脫水素基因表達出了蛋白質并發揮了作用，使植物表現為抗干旱、耐冷凍，D正確。
6．研究表明，服用α 干擾素在慢性乙肝、丙肝及部分腫瘤的治療中有一定療效。人參是一種名貴藥材，具有較好的滋補作用。如圖為科研人員制備能合成干擾素的人參愈傷組織細胞的流程，①～④表示相關的操作。若限制酶EcoRⅠ識別，BamHⅠ識別。下列說法錯誤的是(　 )
A．步驟①中，利用PCR技術擴增干擾素基因時，設計引物序列的主要依據是干擾素基因兩端的部分核苷酸序列
B．在過程③中T DNA整合到受體細胞的染色體DNA上
C．科研人員在兩種引物的一端分別加上了GAATTC和GGATCC序列，目的是方便后續的剪切和連接
D．過程④中，科研人員最終未能檢測出干擾素基因，其原因可能是干擾素基因未能導入人參愈傷組織細胞
解析：選B　步驟①中，利用PCR技術擴增干擾素基因時，設計引物序列的主要依據是干擾素基因兩端的部分核苷酸序列，A正確；過程③是將重組質粒導入根瘤農桿菌，而在侵染人參愈傷組織細胞時，T DNA整合到受體細胞的染色體DNA上，B錯誤；由于需要用EcoRⅠ、BamHⅠ兩種限制酶切割目的基因和質粒，因此在兩種引物的一端分別加上了GAATTC和GGATCC序列，以便后續的剪切和連接，C正確；干擾素基因未能導入人參愈傷組織細胞或導入人參愈傷組織細胞的干擾素基因未能轉錄，均會導致不能檢測出干擾素基因，D正確。
7．吡咯啉 5 羧酸合成酶(P5CS)是植物體合成脯氨酸的一種關鍵酶，脯氨酸是植物體內最有效的一種滲透壓調節物質，具有很強的水溶性，其含量增加可使植物忍耐和抵御干旱的逆境。我國山東地區分布有大量鹽堿地，為了獲得更加耐旱的大豆，科研人員按照如圖過程進行培育。
(1)通過PCR技術擴增P5CS基因，首先需要根據 __________________________________設計引物，設計的引物為何是成對的？________________________________________。PCR擴增過程中冷卻至50 ℃左右的目的是 ________________________。
(2)將目的基因導入植物細胞時，常采用農桿菌轉化法，并將目的基因插入Ti質粒中。利用Ti質粒、通過農桿菌轉化法可將P5CS基因導入大豆愈傷組織細胞的理論依據是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)將幼胚誘導成愈傷組織的過程為 __________，該過程所用的培養基中能發揮誘導作用的成分是____________________________________。
(4)若現已成功獲得導入P5CS基因的大豆，請分析轉基因大豆更加耐旱的原因是 ________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)設計引物要根據已知目的基因的核苷酸序列進行設計。DNA由兩條鏈構成，PCR擴增時基因的兩條鏈都要作為模板，且兩條鏈的堿基排列順序不同，故需要加入成對的引物分別與兩條模板鏈結合。PCR擴增過程中冷卻至50 ℃左右時引物可與模板鏈結合，為接下來子鏈的延伸做準備。(2)農桿菌轉化法中，目的基因要插入到Ti質粒的T DNA上，該序列可轉移，這樣農桿菌感染植物細胞后，其中Ti質粒上的T DNA即可攜帶目的基因轉移到受體細胞的染色體DNA上。(3)通過脫分化，可將已分化的幼胚誘導成愈傷組織，這與培養基中含有的生長素與細胞分裂素的含量和比例有關。(4)由題意可知，P5CS是植物體合成脯氨酸過程的一種關鍵酶，因此轉基因大豆中脯氨酸的合成量增加，細胞質濃度增大，滲透壓更高，更加耐旱。
答案：(1)已知目的基因的核苷酸序列　基因由兩條鏈構成，其兩條鏈都要作為模板合成子鏈　使引物與模板鏈結合　(2)Ti質粒上的T DNA具有可轉移的特性，而農桿菌在自然條件下可感染雙子葉植物。這樣農桿菌中Ti質粒上的T DNA即可轉移至受體細胞，并攜帶目的基因轉移到受體細胞的染色體DNA上　(3)脫分化　植物激素(生長素和細胞分裂素)　(4)與普通大豆相比，轉基因大豆可合成P5CS，細胞內的脯氨酸含量更高，細胞質的滲透壓更大

展開更多......

收起↑