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易錯點1 基因工程的基本工具
和基本操作程序分析
易錯歸因
對基因工程中的基本工具等識記不清；不能正確分析基因工程中的基本操作程序。
典型易錯題
例1（2022·海南·模擬預測）科學家從某細菌中提取抗煙草花葉病毒基因并轉入煙草，培育成轉基因抗病毒煙草。如圖是轉基因抗病毒煙草的部分培育過程，含目的基因的外源DNA和質粒上的箭頭表示相關限制酶的切割位點。圖中各個限制酶切割后均獲得黏性末端，下列有關說法錯誤的是（ ）
A．為了防止目的基因與質粒反向連接應使用限制酶EcoR I和Hind Ⅲ切割
B．圖中限制酶均能在它們識別序列的中心軸線處切割DNA分子
C．圖中所使用的質粒是農桿菌的Ti質粒
D．通過煙草花葉病毒的侵染實驗可以檢測轉基因煙草是否培育成功
【答案】B
【解析】為了防止目的基因的外源DNA片段和質粒自身環化和反向連接，應選用EcoR I和Hind Ⅲ酶對外源DNA和質粒進行切割，這樣使目的基因兩端的黏性末端不同，可以防止反向連接，A正確；經限制酶沿識別序列的中心軸線處切割DNA分子后產生的一般是平末端，若不在中心軸線處切割DNA分子則產生黏性末端，B錯誤；重組質粒能夠導入農桿菌進行增殖，所以圖中所使用的質粒是農桿菌的Ti質粒，C正確；在個體水平上進行目的基因的檢測與鑒定，可以進行抗病鑒定，所以通過煙草花葉病毒的侵染實驗可以檢測轉基因煙草是否培育成功，D正確。故選B。
解題技巧
1．表格法辨析限制酶、DNA連接酶、DNA聚合酶等相關酶
項目 作用底物 作用結果
限制酶 DNA分子 切開磷酸二酯鍵，形成黏性末端或平末端
DNA連接酶 DNA分子片段 通過形成磷酸二酯鍵，進而形成新的DNA分子
DNA聚合酶 脫氧核苷酸 通過形成磷酸二酯鍵，進而形成新的DNA分子
DNA酶 DNA分子 斷開磷酸二酯鍵，形成脫氧核苷酸
解旋酶 DNA分子 斷開堿基對間的氫鍵，形成單鏈DNA分子
RNA聚合酶 核糖核苷酸 通過形成磷酸二酯鍵，進而形成新的RNA分子
2．圖解限制酶的選擇依據
（1）根據目的基因兩端的限制酶切割位點確定限制酶的種類
①應選擇位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲中可選擇Pst I。
②不能選擇目的基因內部的限制酶，如圖甲中不能選擇Sma I。
（2）根據質粒的特點確定限制酶的種類
①通常選擇與切割目的基因相同的限制酶，確保出現相同的黏性末端，如圖乙中Pst I。
②在只有一種標記基因時，選擇的限制酶不能破壞標記基因，如圖乙中限制酶Sma I會破壞標記基因。
3．“四步法”把控基因工程基本操作程序題
同類題練習
1．（2022·北京·中央民族大學附屬中學模擬預測）生物工程中，所用物質與其發揮的作用不能對應的是（ ）
A．限制酶——識別DNA分子特定核苷酸序列并斷開磷酸二酯鍵
B．載體——攜帶目的基因導入受體細胞
C．標記基因——鑒別篩選目的基因是否導入受體細胞
D．鈣離子——增大植物細胞的通透性
2．（2021·遼寧朝陽·模擬預測）下圖是三種限制酶的脫氧核苷酸識別序列和切割位點示意圖（↓表示切點）。下列相關分析錯誤的是（ ）
A．這三種限制酶切割出的DNA片段末端都是黏性末端
B．不同限制酶切割DNA所得的黏性末端可能相同
C．能被限制酶3切割的DNA也能被限制酶1切割
D．同一個DNA經限制酶1和限制酶3分別切割后所得片段數一定相等
3．（2022·江蘇泰州·模擬預測）在基因工程操作中，科研人員利用識別兩種不同序列的限制酶（R1和R2）處理基因載體，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結果如圖所示。以下相關敘述中，不正確的是（ ）
A．該載體最可能為環形DNA分子
B．兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點
C．限制酶R1與R2的切割位點最短相距200bp
D．限制酶作用與該載體會導致氫鍵和肽鍵斷裂
4．（2022·福建泉州·模擬預測）像Bcl Ⅰ（-T↓GATCA-）、Bgl Ⅱ（-A↓GATCT-）、Mbo Ⅰ（-↓GATC-）這樣，識別序列不同、但能產生相同的黏性末端的一類限制酶被稱為同尾酶。如圖表示目的基因及質粒上的酶切位點。選用不同的限制酶對質粒和目的基因進行切割，并用DNA連接酶進行連接。下列分析錯誤的是（ ）
選項 切割質粒 切割目的基因 結果分析
A Bcl I和Bgl Ⅱ Bcl I和Bgl Ⅱ 形成的重組質粒的堿基排列順序不一定相同
B Bcl I和Bgl Ⅱ Mbo I 切割后的質粒不可自我環化，切割后的目的基因可以自我環化
C Mbo I Bcl I和Bgl Ⅱ 形成的重組質粒可被Mbo I再次切開，但可能無法被Bcl I和Bgl Ⅱ再次切開
D Mbo I Mbo I 切割后的質粒可以自我環化，切割后的目的基因也可以自我環化
A．A B．B C．C D．D
5．（2022·湖北·房縣第一中學模擬預測）科學家將人的生長激素基因與大腸桿菌的DNA分子進行重組，并成功地在大腸桿菌中得以表達。該過程所用的質粒A與含生長激素基因的DNA上相關限制酶的酶切位點分別如圖1、圖2所示，其中切割位點相同的酶不重復標注。限制性核酸內切酶BamH I、Bcl I、Sau3A I、Hind Ⅲ，它們識別的堿基序列和酶切位點分別為G↓GATCC、T↓GATCA、↓GATC、A↓AGCTT，下列相關敘述錯誤的是（ ）
A．圖1質粒中沒有標注出來的基本結構是復制原點
B．圖2中的DNA用Sau3A I完全酶切后，反應管中有4種DNA片段
C．BamH I酶切的DNA末端與Sau3A I酶切的DNA末端連接，連接部位用BamH I一定能切開
D．在構建基因表達載體時，為防止目的基因的反向連接，應選用限制酶Hind Ⅲ和BamH I切割質粒，選用限制酶Hind Ⅲ和Bcl I切割含目的基因的DNA片段
6．（2022·江蘇·模擬預測）CRISPR/Cas9基因編輯技術可對基因進行定點編輯。其原理是由一條單鏈向導RNA引導核酸內切酶Cas9到一個特定的基因位點進行切割。通過設計向導RNA中20個堿基的識別序列，可人為選擇DNA上的目標位點進行切割（見下圖）。下列相關敘述錯誤的是（ ）
A．Cas9蛋白能斷開目標DNA分子中兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵
B．單鏈向導RNA雙鏈區中嘌呤數等于嘧啶數
C．該過程可以對基因進行定向改造
D．單鏈向導RNA可識別、切割DNA上的目標位點
7．（2022·湖北武漢·模擬預測）在研究擬南芥Q基因的功能，獲得了該基因T-DNA突變體，該突變體和野生型相比，對重金屬鎘（Cd）脅迫抗性明顯增加。T-DNA中含有植物生長素合成酶基因和細胞分裂素合成酶基因，它們的表達與否能影響相應植物激素含量，進而調節腫瘤組織生長和分化。有關敘述錯誤的是（ ）
A．Ti質粒的T-DNA整合到植物染色體DNA上的變異屬于基因重組
B．該基因有可能編碼一個根細胞膜的Cd2+吸收轉運載體蛋白質
C．可利用T-DNA的特性將目的基因整合到受體細胞染色體DNA中
D．可檢測擬南芥腫瘤組織的生長和分化情況初步判斷T-DNA是否轉移
8．（2022·湖北·華中師大一附中模擬預測）為了獲得抗蚜蟲棉花新品種，研究人員將雪花蓮凝集素基因（GNA）和尾穗莧凝集素基因（ACA）與載體（pBI121）結合，然后導入棉花細胞。下列敘述錯誤的是（ ）
A．用限制酶BsaB I和DNA連接酶處理兩種基因可獲得GNA-ACA融合基因
B．與只用Kpn I相比，Kpn I和Xho I處理融合基因和載體可保證基因轉錄方向正確
C．在含卡那霉素的培養基上能存活的植物細胞即為成功轉入目的基因的細胞
D．用PCR技術可檢測GNA和ACA基因是否導入棉花細胞中
9．（2022·湖北·恩施市第一中學模擬預測）在基因工程操作中，通常需要利用質粒作為載體將基因送入受體細胞。如圖1所示為pUC18/19的結構示意圖（AmpR是氨芐青霉素抗性基因），pUC18和pUC19除了MCS序列不同外，其他序列完全相同。圖2為pUC18和MCS序列。以下相關敘述正確的是（ ）
A．由環狀質粒pUC18/19得到圖2中的單鏈結構，只需要用到DNA解旋酶
B．由質粒pUC18和pUC19形成的圖2中的單鏈，彼此不能完全互補配對
C．用Bcg Ⅰ限制酶對質粒和目的基因進行酶切，導入成功的受體細胞的培養基中不需要添加氨芐青霉素
D．若將基因表達載體導入大腸桿菌細胞中，需使細胞處于興奮狀態
10．（2022·河北·高考真題）蛋白酶抑制劑基因轉化是作物抗蟲育種的新途徑。某研究團隊將胰蛋白酶抑制劑（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制劑（StPinlA）的基因單獨或共同轉化棉花，獲得了轉基因植株。回答下列問題：
（1）蛋白酶抑制劑的抗蟲機制是_____________________________。
（2）_________________是實施基因工程的核心。
（3）利用農桿菌轉化法時，必須將目的基因插入到質粒的________上，此方法的不足之處是_______________________。
（4）為檢測目的基因在受體細胞基因組中的整合及其轉錄和翻譯，可采用的檢測技術有___________________________________（寫出兩點即可）。
（5）確認抗蟲基因在受體細胞中穩定表達后，還需進一步做抗蟲的________以鑒定其抗性程度。下圖為三種不同遺傳操作產生的轉基因棉花抗蟲實驗結果，據結果分析______________（填“NaPI”或“StPinlA”或“NaPI＋StPinlA”）轉基因棉花的抗蟲效果最佳，其原因是______________________________________。
（6）基因突變可產生新的等位基因，在自然選擇的作用下，昆蟲種群的基因頻率會發生_____________。導致昆蟲朝著一定的方向不斷進化。提此推測，胰蛋白酶抑制劑轉基因作物長期選擇后，某些害蟲具有了抗胰蛋白酶抑制劑的能力，其分子機制可能是_________________________________________（寫出兩點即可）。
試卷第4頁，共5頁
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同類題練習參考答案
1．D 【解析】限制酶能識別DNA分子特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂，A正確；載體是基因的運輸工具，作用是攜帶目的基因導入受體細胞中，使之穩定存在并表達，B正確；存在于運載體上的標記基因，作用是鑒別篩選目的基因是否導入受體細胞，C正確；鈣離子不能增大植物細胞的通透性，用CaCl2處理細菌的目的是增加細菌細胞壁的通透性，有利于目的基因的導入，D錯誤。故選D。
2．D 【解析】據圖可知，這三種限制酶切割位點均位于中軸線一側，切割出的DNA片段末端都是黏性末端，A項正確；DNA經限制酶1和限制酶3分別切割，所得的DNA片段黏性末端相同，B項正確；能被限制酶3切割的DNA也能被限制酶1切割，但能被限制酶1切割的DNA不一定能被限制酶3切割，故同一個DNA經限制酶Ⅰ和限制酶3分別切割后所得片段數不一定相等，C項正確，D項錯誤。故選D。
3．D 【解析】由題可知，當僅用一種限制酶切割載體時，僅產生一種長度的DNA片段，因此該載體最有可能為環狀DNA分子，A正確；由題可知，當僅用一種限制酶切割載體時，兩種限制酶切割產生的DNA片段等長，而兩種限制酶同時切割時則產生兩種長度的DNA片段，所以兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點，B正確；由題可知，兩種限制酶同時切割時則產生600bp和200bp兩種長度的DNA片段，所以兩種限制酶的酶切位點至少相距200bp，C正確；限制酶切割DNA分子，破壞的是作用位點上兩個脫氧核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵，D錯誤。故選D。
4．B 【解析】切割質粒和切割目的基因用均用Bcl Ⅰ和Bgl Ⅱ，由于兩種酶切割后產生的黏性末端相同，形成的重組質粒時目的基因可能反向連接，形成的堿基排列順序不一定相同，A正確；切割質粒用Bcl Ⅰ和Bgl Ⅱ，切割后產生的黏性末端相同，切割后的質粒可能自我環化；切割目的基因用Mbo Ⅰ，切割后產生黏性末端，切割后的目的基因可以自我環化，B錯誤；切割質粒用Mbo Ⅰ，產生黏性末端，切割目的基因用Bcl Ⅰ和Bgl Ⅱ，產生黏性末端，形成的重組質粒中原來的Bcl Ⅰ和Bgl Ⅱ的切割位點的序列發生改變，不能再被這兩種酶切割，但不影響Mbo Ⅰ的作用，C正確；切割質粒用Mbo Ⅰ，切割目的基因用Mbo Ⅰ，產生的均為黏末端，切割后的質粒可自我環化，切割后的目的基因也可以自我環化，D正確。故選B。
5．C 【解析】質粒作為載體，需要有標記基因、限制酶切割位點、啟動子、終止子、復制原點等，圖中沒有顯示的是復制原點，A正確；根據Sau3A I的酶切位點知，BamH I、Bcl I這兩種酶能切割的位點，Sau3A I的酶也能切割，故將圖2中的DNA用Sau3A I完全酶切后，反應管中有4種DNA片段，B正確；根據BamH I的識別序列，若BamH I酶切的DNA末端與Sau3A I酶切的DNA末端連接，連接部位用Sau3A I能切開，連接部位用BamH I不一定能切開，C錯誤；在構建基因表達載體時，為防止目的基因的反向連接，不采用同種限制酶，應該選用兩種不同的酶，因此應選用限制酶Hind Ⅲ和BamH I切割質粒，選用限制酶Hind Ⅲ和Bcl I切割含目的基因的DNA片段，D正確。故選C。
6．D 【解析】Cas9蛋白是一種核酸內切酶，能斷開目標DNA分子中兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵，A正確；單鏈向導RNA雙鏈區中遵循堿基互補配對，嘌呤數等于嘧啶數，B正確；該過程的原理是由一條單鏈向導RNA引導核酸內切酶Cas9到一個特定的基因位點進行切割，因此能對基因進行定向改造，C正確；根據題圖和題意可知，單鏈向導RNA可識別目標位點，而DNA由核酸內切酶Cas9負責切割，D錯誤。故選D。
7．B 【解析】T質粒的T-DNA整合到植物染色體DNA上的過程發生基因重新組合，使得植物細胞具有T-DNA上的基因，該變異屬于基因重組，A正確；與野生型相比，含該基因的突變體對重金屬鎘（Cd）脅迫抗性明顯增加，說明突變體根細胞膜對Cd2+吸收減少，說明該基因編碼的不是Cd2+吸收轉運載體蛋白質，B錯誤；T-DNA又稱為“可轉移的DNA”，能轉移到受體細胞并整合到受體細胞染色體DNA中，可利用T-DNA這一特性完成目的基因整合到受體細胞染色體DNA中，C正確；T-DNA中含有植物生長素合成酶基因和細胞分裂素合成酶基因，含有T-DNA的擬南芥能表達生長素和細胞分裂素，因此可檢測擬南芥腫瘤組織的生長和分化情況初步判斷T-DNA是否轉移，D正確。故選B。
8．C 【解析】由圖可知，GNA、ACA都含有限制酶BsaB I的酶切位點，故用限制酶BsaB I和DNA連接酶處理兩種基因可獲得GNA-ACA融合基因，A正確；圖中質粒與ACA-GNA上都含有Kpn I和Xho I的酶切位點，與只用Kpn I相比，Kpn I和Xho I處理融合基因和載體可保證基因轉錄方向正確，避免反向連接，B正確；在含卡那霉素的培養基上能存活的植物細胞為成功轉入目的基因的細胞或含有普通質粒的細胞，C錯誤；PCR技術可用于基因探針的制備，可用來檢測目的基因是否導入受體細胞，即用PCR技術可檢測GNA和ACA基因是否導入棉花細胞中，D正確。故選C。
9．C 【解析】將環狀質粒打開成圖2中的單鏈結構需要用到限制酶（將環狀鏈切割成直鏈）及DNA解旋酶（解開雙鏈變成單鏈），A錯誤；pUC18和pUC19除了MCS序列不同外，其他序列完全相同。由圖可知，MCS序列已被切割，因此由質粒pUC18和pUC19形成的圖2中的單鏈，彼此能完全互補配對，B錯誤；若使用了Bcg Ⅰ限制酶同時對質粒和目的基因進行酶切，氨芐青霉素抗性基因被切斷而失活，故導入成功的受體細胞不能置于含有氨芐青霉素的培養基中，C正確；若將基因表達載體導入大腸桿菌細胞中，需用Ca2+處理細胞制備感受態細胞，D錯誤。故選C。
10．（1）調節害蟲胰蛋白酶活性，從而使害蟲不能正常消化食物達到抗蟲的目的
（2）基因表達載體的構建
（3）T-DNA 該方法不適用于單子葉植物
（4）DNA分子雜交技術、分子雜交技術、抗原-抗體雜交技術
（5）效果 NaPI 飼喂NaPI轉基因的蟲體質量較對照組差，且每株棉鈴數較對照組少
（6）定向改變 由于害蟲發生基因突變后，在胰蛋白酶抑制劑的選擇下，抗性基因頻率逐漸增高，從而提升了其抗胰蛋白酶抑制劑的能力，或胰蛋白酶抑制劑基因發生突變后不能編碼出胰蛋白酶抑制劑
【解析】（1）蛋白酶抑制劑的抗蟲機制是調節害蟲胰蛋白酶活性，從而使害蟲不能正常消化食物達到抗蟲的目的。
（2）基因工程的核心是基因表達載體的構建。
（3）農桿菌轉化法的原理：農桿菌中的Ti質粒上的T-DNA可轉移至受體細胞，并且整合到受體細胞染色體的DNA上。根據農桿菌的這一特點，如果將目的基因插入到Ti質粒的T-DNA上，通過農桿菌的轉化作用，就可以把目的基因整合到植物細胞中染色體的DNA上。其不足之處是該方法不適用于單子葉植物。
（4）目的基因是否整合的檢測，在分子水平上可通過檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因、是否能轉錄處目的基因對應的mRNA、是否能合成目的基因所控制合成的蛋白質等；在個體水平可檢測抗蟲性、抗病性、活性等。即可利用DNA分子雜交技術、分子雜交技術、抗原-抗體雜交技術等。
（5）抗蟲鑒定：確認抗蟲基因在受體細胞中穩定表達后，還需進一步做抗蟲的效果以鑒定其抗性程度。由圖可知，NaPI轉基因棉花的抗蟲效果最佳，因為飼喂NaPI轉基因的蟲體質量較對照組差，且每株棉鈴數較對照組少。
（6）在自然選擇的作用下，種群的基因頻率會發生定向改變，導致生物朝一定方向不斷進化。由于害蟲發生基因突變后，在胰蛋白酶抑制劑的選擇下，抗性基因頻率逐漸增高，從而提升了其抗胰蛋白酶抑制劑的能力，或胰蛋白酶抑制劑基因發生突變后不能編碼出胰蛋白酶抑制劑。
答案第1頁，共2頁

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