資源簡(jiǎn)介

中小學(xué)教育資源及組卷應(yīng)用平臺(tái)
人教(2019)生物選擇性必修3（知識(shí)點(diǎn)+跟蹤檢測(cè)）
第1講 基因工程
【課標(biāo)導(dǎo)航】
5.1.1　概述基因工程是在遺傳學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的
5.1.2　闡明DNA重組技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具
5.1.3　闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)鑒定等步驟
5.1.4　舉例說(shuō)明基因工程在農(nóng)牧、食品及醫(yī)藥等行業(yè)的廣泛應(yīng)用改善了人類的生活品質(zhì)
5.2.1　概述人們根據(jù)基因工程原理，進(jìn)行蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)和改造，可以獲得性狀和功能更符合人類需求的蛋白質(zhì)
5.2.2　舉例說(shuō)明依據(jù)人類需要對(duì)原有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行基因改造、生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的過(guò)程
1．基因工程的基本工具
2．基因工程的基本操作程序
3．蛋白質(zhì)工程
4．DNA的粗提取與鑒定
1．實(shí)驗(yàn)原理
2．實(shí)驗(yàn)流程
[基礎(chǔ)微點(diǎn)練清]
1．判斷正誤
(1)海魚的抗凍蛋白基因是培育抗凍番茄的目的基因(√)
[新人教版選擇性必修3 P83“概念檢測(cè)”T1(1)]
(2)切割質(zhì)粒的限制性核酸內(nèi)切酶均能特異性地識(shí)別6個(gè)核苷酸序列(×)
(3)DNA連接酶能將兩堿基間通過(guò)氫鍵連接起來(lái)(×)
(4)E·coliDNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端(×)
(5)構(gòu)建含有目的基因的Ti質(zhì)粒需要限制酶、DNA連接酶和核酸酶(×)
[新人教版選擇性必修3 P83“概念檢測(cè)”T1(2)]
(6)利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物屬于基因工程的應(yīng)用[新人教版選擇性必修3 P92“概念檢測(cè)”T2B](√)
(7)提取DNA時(shí)，如果沒(méi)有雞血材料，可用豬血代替(×)
(8)在DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)中，用菜花替代雞血作為實(shí)驗(yàn)材料，其實(shí)驗(yàn)操作步驟相同(×)
2．下列有關(guān)限制酶的敘述正確的是(　　)
A．用限制酶切割一個(gè)DNA分子中部，獲得一個(gè)目的基因時(shí)，被水解的磷酸二酯鍵有2個(gè)
B．限制酶識(shí)別序列越短，則該序列在DNA中出現(xiàn)的概率就越大
C．—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端堿基數(shù)不同
D．只有用相同的限制酶處理含目的基因的片段和質(zhì)粒，才能形成重組質(zhì)粒
解析：選B　用限制酶切割DNA分子中部獲得一個(gè)目的基因時(shí)，需剪切2次，水解磷酸二酯鍵4個(gè)；限制酶識(shí)別序列越短，則該序列在DNA中出現(xiàn)的概率就越大；—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端均有4個(gè)堿基；切割目的基因和載體并非只能用同一種限制酶，如果不同的限制酶切割DNA分子所產(chǎn)生的末端也存在互補(bǔ)關(guān)系，則兩末端也可連接。
3．(新人教版選擇性必修3 P74“概念檢測(cè)”T1)DNA連接酶是重組DNA技術(shù)常用的一種工具酶。下列相關(guān)敘述正確的是(　　 )
A．能連接DNA分子雙鏈堿基對(duì)之間的氫鍵
B．能將單個(gè)脫氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵
C．能連接用同種限制酶切開的兩條DNA片段，重新形成磷酸二酯鍵
D．只能連接雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，不能連接雙鏈DNA片段的平末端
解析：選C　DNA連接酶的作用是連接末端互補(bǔ)的兩條DNA片段，重新形成磷酸二酯鍵。
4．(新人教版選擇性必修3 P74“拓展應(yīng)用”T1)想一想，為什么限制酶不切割細(xì)菌本身的DNA分子？
提示：生物在長(zhǎng)期演化過(guò)程中，含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。
一、基因工程的操作工具
[試考題·查欠缺]
1．(全國(guó)卷Ⅰ)基因工程中可以通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因。回答下列問(wèn)題。
(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以從基因文庫(kù)中獲得。基因文庫(kù)包括__________________和________________。
(2)生物體細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制開始時(shí)，解開DNA雙鏈的酶是________。在體外利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，使反應(yīng)體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是____________。上述兩個(gè)解鏈過(guò)程的共同點(diǎn)是破壞了DNA雙鏈分子中的________。
(3)目前在PCR反應(yīng)中使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)基因工程中的基因文庫(kù)包括基因組文庫(kù)和部分基因文庫(kù)(cDNA文庫(kù))。(2)生物體細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制開始時(shí)，通過(guò)解旋酶解開DNA雙鏈。在體外利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，通過(guò)高溫(90～95 ℃)使反應(yīng)體系中的模板DNA解鏈為單鏈。上述兩個(gè)解鏈過(guò)程的共同點(diǎn)是破壞了DNA雙鏈分子中的氫鍵。(3)大腸桿菌DNA聚合酶不耐高溫，在高溫下會(huì)失活，而PCR反應(yīng)體系中加入的聚合酶需耐高溫，故在PCR反應(yīng)中要用能耐高溫的Taq酶。
答案：(1)基因組文庫(kù)　cDNA文庫(kù)　(2)解旋酶　加熱至90～95 ℃　氫鍵　(3)Taq酶熱穩(wěn)定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會(huì)失活
2．(全國(guó)卷Ⅲ)圖(a)中的三個(gè)DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列與切割位點(diǎn)，圖(b)為某種表達(dá)載體的示意圖(載體上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切點(diǎn)是唯一的)。
根據(jù)基因工程的有關(guān)知識(shí)，回答下列問(wèn)題：
(1)經(jīng)BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以與上述表達(dá)載體被________酶切后的產(chǎn)物連接，理由是___________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)若某人利用圖(b)所示的表達(dá)載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組子，如圖(c)所示。這三種重組子中，不能在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的基因產(chǎn)物的有________，不能表達(dá)的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)DNA連接酶是將兩個(gè)DNA片段連接起來(lái)的酶，常見的有________________和________________，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是______________。
解析：(1)由題圖可知，BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種限制性內(nèi)切酶的共同識(shí)別序列是，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此經(jīng)BamHⅠ酶切得到的目的基因可以與圖(b)所示表達(dá)載體被Sau3AⅠ酶切后的產(chǎn)物連接。(2)在基因表達(dá)載體中，啟動(dòng)子應(yīng)位于目的基因的首端，終止子應(yīng)位于目的基因的尾端，這樣目的基因才能順利地轉(zhuǎn)錄，再完成翻譯過(guò)程。圖中甲所示的目的基因插入在啟動(dòng)子的上游，丙所示目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄，因此目的基因不能表達(dá)。(3)常見的DNA連接酶有E·coli DNA連接酶和T4DNA連接酶，其中T4DNA連接酶既能連接黏性末端又能連接平末端。
答案：(1)Sau3AⅠ　兩種酶切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端　(2)甲和丙　甲中目的基因插入在啟動(dòng)子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄　(3)E·coli DNA連接酶　T4DNA連接酶　T4DNA連接酶
[強(qiáng)知能·補(bǔ)欠缺]
(一)基因工程中兩種工具酶
1．限制酶的特點(diǎn)與使用
(1)限制酶具有特異性，即一種限制酶只能識(shí)別特定的核苷酸序列，并在特定的位點(diǎn)上進(jìn)行切割；限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已經(jīng)被修飾。
(2)在獲取目的基因和切割載體時(shí)通常用同一種限制酶，以獲得相同的黏性末端。但如果用兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA連接酶的作用下目的基因與載體也可以連接起來(lái)。
(3)為了防止載體或目的基因的黏性末端自己連接即所謂“環(huán)化”，可用不同的限制酶分別處理含目的基因的DNA和載體，使目的基因兩側(cè)及載體上各自具有兩個(gè)不同的黏性末端。
2．DNA連接酶
種類 E·coli DNA連接酶 T4DNA連接酶
來(lái)源 大腸桿菌 T4噬菌體
特點(diǎn) 只縫合黏性末端 縫合黏性末端和平末端
作用 恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵
3．與DNA有關(guān)的酶的比較
比較項(xiàng)目 限制酶 DNA連接酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用底物 DNA分子 DNA分子片段 脫氧核苷酸 DNA分子
作用部位 磷酸二酯鍵 磷酸二酯鍵 磷酸二酯鍵 堿基對(duì)間的氫鍵
形成產(chǎn)物 黏性末端或平末端 形成重組DNA分子 新的DNA分子 形成單鏈DNA
(二)基因工程中的載體
1．基因工程載體應(yīng)具備的條件
(1)能在受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存，可使目的基因穩(wěn)定存在且數(shù)量可擴(kuò)大。
(2)具有一個(gè)至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，可供外源DNA片段插入。
(3)具有標(biāo)記基因，可供重組DNA的鑒定和選擇。
2．基因工程載體與膜載體的區(qū)別
基因工程中的載體是DNA分子，能將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞內(nèi)，并利用它在宿主細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制；膜載體是蛋白質(zhì)，與細(xì)胞膜的通透性有關(guān)。
3．載體上標(biāo)記基因的標(biāo)記原理
載體上的標(biāo)記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細(xì)胞沒(méi)有抵抗相關(guān)抗生素的能力。當(dāng)含有抗生素抗性基因的載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，使受體細(xì)胞能夠抵抗相應(yīng)抗生素，所以在受體細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可以只保留轉(zhuǎn)入載體的受體細(xì)胞，原理如圖所示：
[練題點(diǎn)·全過(guò)關(guān)]
1．根據(jù)基因工程的有關(guān)知識(shí)，回答下列問(wèn)題：
(1)限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA分子后產(chǎn)生的片段，其末端類型有________和________。
(2)質(zhì)粒載體用EcoRⅠ切割后產(chǎn)生的片段如下：
AATTC……G
　　　　　G……CTTAA
為使載體與目的基因相連，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，還可用另一種限制性核酸內(nèi)切酶切割，該酶必須具有的特點(diǎn)是_____________________________________
_________________________________________。
(3)反轉(zhuǎn)錄作用的模板是________，產(chǎn)物是________。若要在體外獲得大量反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，常采用________技術(shù)。
(4)基因工程中除質(zhì)粒外，________和________也可作為載體。
解析：(1)當(dāng)限制性核酸內(nèi)切酶在它識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開時(shí)，產(chǎn)生的是黏性末端，而當(dāng)限制性核酸內(nèi)切酶在它識(shí)別序列的中心軸線處切開時(shí)，產(chǎn)生的是平末端。(2)為使載體與目的基因相連，不同的限制性核酸內(nèi)切酶應(yīng)該切出相同的黏性末端。(3)反轉(zhuǎn)錄是指以RNA為模板在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成DNA的過(guò)程，可以在體外短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增DNA的技術(shù)叫PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。(4)基因工程中可以作為載體的除質(zhì)粒外，還有λ噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒等。
答案：(1)黏性末端　平末端
(2)切割產(chǎn)生的DNA片段末端與EcoRⅠ切割產(chǎn)生的相同
(3)mRNA(或RNA)　cDNA(或DNA)　PCR
(4)λ噬菌體的衍生物　動(dòng)植物病毒
2．(2021年1月新高考8省聯(lián)考·福建卷，節(jié)選)閱讀下列材料，完成有關(guān)問(wèn)題。
材料：在全球氣候變暖和水資源缺乏加劇的情況下，保障我國(guó)“糧食安全”問(wèn)題尤為重要。玉米是重要的糧食作物，其葉片細(xì)胞中的P蛋白是一種水通道蛋白，由P基因編碼，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中對(duì)水分的吸收具有重要的調(diào)節(jié)功能。
超量表達(dá)P蛋白轉(zhuǎn)基因玉米的獲得與鑒定
在超量表達(dá)P基因載體的構(gòu)建中，所用DNA片段和Ti質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)如圖1所示；P蛋白在玉米株系的表達(dá)量如圖2所示。
回答下列問(wèn)題：
(1)強(qiáng)啟動(dòng)子是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，能被____________識(shí)別并結(jié)合，驅(qū)動(dòng)基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄。為使P基因在玉米植株中超量表達(dá)，應(yīng)優(yōu)先選用__________酶組合，將片段和Ti質(zhì)粒切開后構(gòu)建重組表達(dá)載體。T DNA在該實(shí)驗(yàn)中的作用是________________________________________________________________________
__________________________。
(2)將農(nóng)桿菌浸泡過(guò)的玉米愈傷組織進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，培養(yǎng)基中需加入__________進(jìn)行篩選，篩選出的愈傷組織________形成叢芽，最終獲得多個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米株系。
(3)據(jù)圖2分析，選擇a1、a2、a3玉米株系，作為超量表達(dá)P蛋白轉(zhuǎn)基因玉米的生理特性研究的實(shí)驗(yàn)材料，理由是_______________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)根據(jù)“驅(qū)動(dòng)基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄”可知，強(qiáng)啟動(dòng)子能被RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合。為使P基因在玉米植株中超量表達(dá)，應(yīng)確保強(qiáng)啟動(dòng)子和P基因不被破壞，故應(yīng)優(yōu)先選用BamH Ⅰ和Sac Ⅰ酶組合，將片段和Ti質(zhì)粒切開后構(gòu)建重組表達(dá)載體。T DNA在該實(shí)驗(yàn)中的作用是將強(qiáng)啟動(dòng)子和P基因帶入玉米細(xì)胞并整合到玉米細(xì)胞的染色體DNA上。(2)由圖1可知，潮霉素抗性基因位于Ti質(zhì)粒的T DNA上，可以隨T DNA整合到玉米細(xì)胞的染色體上，故將農(nóng)桿菌浸泡過(guò)的玉米愈傷組織進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，培養(yǎng)基中需加入潮霉素進(jìn)行篩選，篩選出的愈傷組織可(再)分化形成叢芽，最終獲得多個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米株系。(3)據(jù)圖2分析，a1、a2、a3玉米株系的P蛋白表達(dá)量顯著高于野生型玉米，故可以選擇a1、a2、a3玉米株系，作為超量表達(dá)P蛋白轉(zhuǎn)基因玉米的生理特性研究的實(shí)驗(yàn)材料。
答案：(1)RNA聚合酶　BamH Ⅰ和Sac Ⅰ　將強(qiáng)啟動(dòng)子和P基因帶入玉米細(xì)胞并整合到玉米細(xì)胞染色體DNA上　(2)潮霉素　(再)分化　(3)a1、a2、a3玉米株系的P蛋白表達(dá)量顯著高于野生型玉米
二、基因工程的基本操作程序
[試考題·查欠缺]
1．(2021年1月新高考8省聯(lián)考·江蘇卷)啤酒生產(chǎn)需經(jīng)過(guò)制麥、糖化、發(fā)酵等主要環(huán)節(jié)。糖化主要是將麥芽中的淀粉等有機(jī)物水解為小分子的過(guò)程。主要工藝流程如下圖所示，請(qǐng)回答下列問(wèn)題：
(1)大麥?zhǔn)瞧【瓢l(fā)酵的重要碳源，針對(duì)制麥及糖化步驟，下列說(shuō)法正確的有_________(填序號(hào))。
①大麥萌發(fā)時(shí)僅產(chǎn)生淀粉酶，幾乎不產(chǎn)生蛋白酶
②用赤霉素處理大麥，可誘導(dǎo)淀粉酶的合成
③酵母不能直接利用淀粉，需要淀粉酶等將淀粉轉(zhuǎn)化成酵母可利用的糖
④糖化采用的溫度越高，淀粉水解速度越快
(2)啤酒發(fā)酵時(shí)具有活力的酵母需達(dá)到一定的數(shù)量，故在菌種活化的過(guò)程中，需定時(shí)取樣，檢測(cè)酵母的生長(zhǎng)狀況。若某次樣品經(jīng)2次10倍稀釋后，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色(體積不計(jì))，在25×16型血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)_________色細(xì)胞，5個(gè)中格中的細(xì)胞數(shù)為244個(gè)，該樣品中活酵母細(xì)胞的密度為_________個(gè)細(xì)胞/mL。
(3)敲除釀酒酵母中的蛋白酶基因，減少發(fā)酵液中蛋白的水解，有助于增強(qiáng)啤酒泡沫的穩(wěn)定性，從而改善啤酒的品質(zhì)。以下是某科研小組的實(shí)驗(yàn)：
①已知編碼酵母蛋白酶A(PEP4)的基因序列如下(為非模板鏈)：
編碼該酶的mRNA，起始端的三個(gè)密碼子依次為______，終止密碼子為________。
②Cas9蛋白可在人為設(shè)定的RNA序列(sgRNA)引導(dǎo)下，在選定位點(diǎn)切斷相應(yīng)的DNA鏈(如下圖)，在DNA自我連接的修復(fù)過(guò)程中產(chǎn)生突變。DNA序列中含NGG的位點(diǎn)具有較高的編輯效率(N為任意堿基)。
上述PEP4序列虛線框中有________處可作為Cas9的優(yōu)選剪切位點(diǎn)。Cas9的剪切位點(diǎn)在其NGG識(shí)別位點(diǎn)的________________(填“5′”或“3′”)側(cè)。
③用酪蛋白固體培養(yǎng)基篩選突變體，野生型可以水解酪蛋白，在菌落周圍形成透明圈。需要篩選透明圈________的菌落，表明其蛋白酶活性__________。
解析：(1)大麥萌發(fā)時(shí)會(huì)產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶等，①錯(cuò)誤；赤霉素處理大麥，可誘導(dǎo)淀粉酶的合成，促進(jìn)種子萌發(fā)，②正確；酵母細(xì)胞呼吸的底物為葡萄糖，不能直接利用淀粉，需要淀粉酶等將淀粉轉(zhuǎn)化成酵母可利用的糖，③正確；酶的催化需要適宜的溫度，糖化采用的溫度過(guò)高，會(huì)影響酶的活性，使淀粉水解速度變慢，④錯(cuò)誤。(2)細(xì)胞膜具有選擇透過(guò)性，臺(tái)盼藍(lán)不能進(jìn)入活細(xì)胞，染色后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)對(duì)無(wú)色細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，若某次樣品經(jīng)2次10倍稀釋后，在25×16型血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，5個(gè)中格中的細(xì)胞數(shù)為244個(gè)，則該樣品中活酵母細(xì)胞的密度為244÷5×25÷0.1×102×103＝1.22×109個(gè)/mL。(3)①已知編碼酵母蛋白酶A(PEP4)的基因序列為(為非模板鏈)：
5′ ATGTTCAGCTTCAAAGCATTATTGCCATTGGCCTTG
TTGTGGTGAGCGCC……CAATTTGA 3′，模板鏈與非模板鏈方向相反，RNA 5′端為起始端，起始端的三個(gè)密碼子依次為AUG、UUC、AGC，終止密碼子為UGA。②DNA序列中含NGG的位點(diǎn)具有較高的編輯效率(N為任意堿基)。根據(jù)PEP4序列虛線框中的堿基序列，有4處可作為Cas9的優(yōu)選剪切位點(diǎn)。據(jù)圖可知，Cas9的剪切位點(diǎn)在其NGG識(shí)別位點(diǎn)的3′側(cè)。③敲除釀酒酵母中的蛋白酶基因，減少發(fā)酵液中蛋白的水解，有助于增強(qiáng)啤酒泡沫的穩(wěn)定性，從而改善啤酒的品質(zhì)。用酪蛋白固體培養(yǎng)基篩選突變體，野生型可以水解酪蛋白，在菌落周圍形成透明圈。因此需要篩選透明圈較小的菌落，表明其蛋白酶活性較低。
答案：(1)②③　(2)無(wú)　1.22×109　(3)①AUC、UUC、ACC　UGA　②4　3′　③小　較低
2．(2018·天津高考)甲型流感病毒為RNA病毒，易引起流感大規(guī)模流行。我國(guó)科學(xué)家在2017年發(fā)明了一種制備該病毒活疫苗的新方法，主要環(huán)節(jié)如下。
(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖能力。以病毒RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成對(duì)應(yīng)DNA后，利用________技術(shù)擴(kuò)增，并將其中某些基因(不包括表面抗原基因)內(nèi)個(gè)別編碼氨基酸的序列替換成編碼終止密碼子的序列。與改造前的基因相比，改造后的基因表達(dá)時(shí)不能合成完整長(zhǎng)度的________，因此不能產(chǎn)生子代病毒。將該改造基因、表面抗原等其他基因分別構(gòu)建重組質(zhì)粒，并保存。
(2)構(gòu)建適合改造病毒增殖的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。設(shè)計(jì)合成一種特殊tRNA的基因，其產(chǎn)物的反密碼子能與(1)中的終止密碼子配對(duì)結(jié)合，并可攜帶一個(gè)非天然氨基酸(Uaa)。將該基因與________連接后導(dǎo)入宿主細(xì)胞。提取宿主細(xì)胞的________進(jìn)行分子雜交鑒定，篩選獲得成功表達(dá)上述tRNA的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。
(3)利用轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞制備疫苗。將(1)中的重組質(zhì)粒導(dǎo)入(2)中的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，并在補(bǔ)加______________的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，則該宿主細(xì)胞能利用上述特殊tRNA，翻譯出改造病毒基因的完整蛋白，產(chǎn)生大量子代病毒，用于制備疫苗。特殊tRNA基因轉(zhuǎn)錄時(shí)，識(shí)別其啟動(dòng)子的酶是________(單選)。
A．病毒的DNA聚合酶　　　　 B．宿主的DNA聚合酶
C．病毒的RNA聚合酶 D．宿主的RNA聚合酶
(4)上述子代病毒不能在正常宿主細(xì)胞中增殖，沒(méi)有致病性，因此不經(jīng)滅活或減毒即可制成疫苗。與不具侵染性的流感病毒滅活疫苗相比，該病毒活疫苗的優(yōu)勢(shì)之一是可引起________免疫，增強(qiáng)免疫保護(hù)效果。
解析：(1)體外進(jìn)行DNA擴(kuò)增采用的技術(shù)手段是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))。將基因內(nèi)個(gè)別編碼氨基酸的序列改造成編碼終止密碼子的序列后，在翻譯時(shí)終止密碼子提前出現(xiàn)，不能合成完整長(zhǎng)度的多肽(或蛋白質(zhì))。(2)為了使目的基因能夠在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并正常表達(dá)，需要將目的基因與載體(運(yùn)載體)連接后導(dǎo)入受體細(xì)胞。利用分子雜交技術(shù)，鑒定篩選獲得成功表達(dá)目的RNA的細(xì)胞時(shí)，需提取宿主細(xì)胞的總RNA。(3)將(1)中的重組質(zhì)粒導(dǎo)入(2)中的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，宿主細(xì)胞內(nèi)由于沒(méi)有Uaa，翻譯將會(huì)在終止密碼子處停止，將不能翻譯出改造病毒基因的完整蛋白，所以要想翻譯出完整蛋白，需要在培養(yǎng)基中加入U(xiǎn)aa。轉(zhuǎn)錄時(shí)，識(shí)別啟動(dòng)子的酶為RNA聚合酶，因?yàn)檗D(zhuǎn)錄在宿主細(xì)胞中進(jìn)行，所以轉(zhuǎn)錄用的酶為宿主細(xì)胞的RNA聚合酶。(4)不具有感染性的滅活病毒不能進(jìn)入人體細(xì)胞內(nèi)，只會(huì)引發(fā)體液免疫，而減毒的活疫苗雖然不能在人體細(xì)胞內(nèi)正常增殖，但可以侵入人體細(xì)胞，能引起人體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，增強(qiáng)免疫保護(hù)效果。
答案：(1)PCR　多肽(或蛋白質(zhì))　(2)載體　總RNA
(3)非天然氨基酸(Uaa)　D　(4)細(xì)胞
3．(2018·江蘇高考有改動(dòng))為生產(chǎn)具有特定性能的α 淀粉酶，研究人員從某種海洋細(xì)菌中克隆了α 淀粉酶基因(1 656個(gè)堿基對(duì))，利用基因工程大量制備α 淀粉酶，實(shí)驗(yàn)流程見下圖。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：
(1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增α 淀粉酶基因前，需先獲得細(xì)菌的________________。
(2)為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的________端加上限制性酶切位點(diǎn)，且常在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制性酶切位點(diǎn)，主要目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)的溫度和時(shí)間需根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)定，下列選項(xiàng)中________的設(shè)定與引物有關(guān)，________的設(shè)定與擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度有關(guān)。(填序號(hào))
①變性溫度　②退火溫度　③延伸溫度　④變性時(shí)間　
⑤退火時(shí)間　⑥延伸時(shí)間
(4)下圖表示篩選獲得的工程菌中編碼α 淀粉酶的mRNA 的部分堿基序列：
圖中虛線框內(nèi)mRNA片段包含________個(gè)密碼子，如虛線框后的序列未知，預(yù)測(cè)虛線框后的第一個(gè)密碼子最多有________種。
(5)獲得工程菌表達(dá)的α 淀粉酶后，為探究影響酶活性的因素，以濃度為1%的可溶性淀粉為底物測(cè)定酶活性，結(jié)果如下：
緩沖液 50 mmol/L Na2HPO4 KH2PO4 50 mmol/L Tris HCl 50 mmol/L Gly NaOH
pH 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 8.5 9.0 9.0 9.5 10.0 10.5
酶相對(duì)活性% 25.4 40.2 49.8 63.2 70.1 95.5 99.5 85.3 68.1 63.7 41.5 20.8
根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步判斷該α 淀粉酶活性最高的條件為________________________________________________________________________。
解析：(1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增α 淀粉酶基因前，需先獲得細(xì)菌的基因組DNA作為模板，并依據(jù)α 淀粉酶基因兩端的部分核苷酸序列合成兩條引物。(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時(shí)，只能從3′端延伸DNA子鏈，為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的5′端加上限制性酶切位點(diǎn)，并且要注意在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制性酶切位點(diǎn)，這樣既能防止目的基因、載體的自身連接，又能確保目的基因與表達(dá)載體的定向連接。(3)PCR技術(shù)包括變性、退火(復(fù)性)和延伸三步，變性溫度決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA的解鏈，且時(shí)間很短；退火時(shí)引物結(jié)合到互補(bǔ)的DNA單鏈上，退火溫度由引物復(fù)性溫度決定，其溫度設(shè)定與引物的長(zhǎng)度、堿基組成及濃度等有關(guān)；延伸時(shí)間與產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度有關(guān)，產(chǎn)物在1 kb以內(nèi)的延伸時(shí)間為1 min左右，3～4 kb的延伸時(shí)間為3～4 min。(4)圖中虛線框內(nèi)共含有24個(gè)堿基，mRNA上3個(gè)相鄰的堿基編碼1個(gè)氨基酸，故共包含8個(gè)密碼子。虛線框后的第1個(gè)密碼子的第1個(gè)堿基是U，第2和第3個(gè)堿基各有4種可能性，因此共有16種可能性。題干表明控制α 淀粉酶的基因有1 656個(gè)堿基對(duì)，說(shuō)明圖中虛線框后的第一個(gè)密碼子肯定不是終止密碼子(3種終止密碼子為UAA、UAG、UGA)，故虛線框后第一個(gè)密碼子實(shí)際最多有16－3＝13(種)可能性。(5)分析表格中的數(shù)據(jù)，酶相對(duì)活性最高為99.5%，對(duì)應(yīng)的條件是pH為8.5，緩沖液為50 mmol/L Tris HCl。
答案：(1)基因組DNA　(2)5′　使DNA片段能定向插入表達(dá)載體，減少自連　(3)②　⑥　(4)8　13
(5)pH為8.5，緩沖液為50 mmol/L Tris HCl
[強(qiáng)知能·補(bǔ)欠缺]
1．獲取目的基因的方法
(1)幾種獲取目的基因方法的比較
(2)詮釋PCR技術(shù)
①PCR原理：DNA復(fù)制原理，即：
②PCR反應(yīng)過(guò)程
過(guò)程 說(shuō)明 圖解
變性 溫度上升到90 ℃左右，雙鏈DNA解聚為單鏈
復(fù)性 溫度下降到55 ℃左右，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合
延伸 溫度上升到72 ℃左右，Taq酶從引物起始合成互補(bǔ)鏈，可使新鏈由5′端向3′端延伸
③結(jié)果：上述三步反應(yīng)完成后，一個(gè)DNA分子就變成了兩個(gè)DNA分子，隨著重復(fù)次數(shù)的增多，DNA分子以2n的形式增加。PCR的反應(yīng)過(guò)程都是在PCR擴(kuò)增儀中完成的。
2．基因表達(dá)載體的組成
目的基因 能夠控制特定性狀
啟動(dòng)子 RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄
終止子 RNA聚合酶脫離部位，終止轉(zhuǎn)錄
標(biāo)記基因 鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因
3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
生物種類 植物 動(dòng)物 微生物
常用方法 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 顯微注射技術(shù) 感受態(tài)細(xì)胞法
受體細(xì)胞 體細(xì)胞或受精卵 受精卵 原核細(xì)胞
轉(zhuǎn)化過(guò)程 將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T DNA上→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上→表達(dá) 將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物 Ca2＋處理細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→重組表達(dá)載體DNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子
4．目的基因檢測(cè)與鑒定的方法
[練題點(diǎn)·全過(guò)關(guān)]
1．為生產(chǎn)高效價(jià)疫苗和簡(jiǎn)化計(jì)劃免疫程序，科學(xué)家研制出基因工程乙肝－百白破(rHBDTP)四聯(lián)疫苗，經(jīng)各項(xiàng)檢測(cè)均符合rHBDTP四聯(lián)疫苗制檢規(guī)程的要求。其有效成分是乙肝病毒表面抗原、百日咳桿菌、白喉?xiàng)U菌和破傷風(fēng)桿菌的四種類毒素。請(qǐng)分析回答下列問(wèn)題：
(1)為獲取百日咳桿菌類毒素的基因，可從百日咳桿菌的細(xì)胞中提取對(duì)應(yīng)________，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成雙鏈cDNA片段，獲得的cDNA片段與百日咳桿菌中該基因堿基序列________(填“相同”或“不同”)。
(2)由于乙肝病毒表面抗原的基因序列比較小，且序列已知，獲得目的基因可采用__________________，然后通過(guò)________大量擴(kuò)增，此技術(shù)的前提是已知一段目的基因的核苷酸序列以便合成引物。
(3)把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞時(shí)，科學(xué)家采用了改造后的腺病毒作為載體，寫出選它的理由：________________________________________________(寫出2點(diǎn))。
(4)研究發(fā)現(xiàn)，如果將白喉?xiàng)U菌類毒素20位和24位的氨基酸改變?yōu)榘腚装彼幔庖咝Ч茫?qǐng)寫出此種技術(shù)的基本流程：__________________________________________
________________________________________________________________________。
(5)實(shí)驗(yàn)證明，一定時(shí)間內(nèi)間隔注射該疫苗3次效果更好，其主要原因是體內(nèi)產(chǎn)生的_________數(shù)量增多，當(dāng)同種抗原再次侵入人體時(shí)會(huì)引發(fā)二次免疫，二次免疫的特點(diǎn)是________________，免疫預(yù)防作用更強(qiáng)。
解析：(1)為獲取百日咳桿菌類毒素的基因，可從百日咳桿菌的細(xì)胞中提取對(duì)應(yīng)mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成雙鏈cDNA片段，獲得的cDNA片段與百日咳桿菌中該基因堿基序列不同。(2)由于乙肝病毒表面抗原的基因序列比較小，且序列已知，獲得目的基因可采用化學(xué)方法人工合成，然后通過(guò)PCR技術(shù)大量擴(kuò)增。(3)改造后的腺病毒有多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)、有標(biāo)記基因，且能自主復(fù)制，因此可作為載體將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞。(4)將白喉?xiàng)U菌類毒素20位和24位的氨基酸改變?yōu)榘腚装彼崂玫氖堑鞍踪|(zhì)工程的原理，基本流程：從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)→設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列→找到相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列。(5)實(shí)驗(yàn)證明，一定時(shí)間內(nèi)間隔注射該疫苗3次效果更好，其主要原因是體內(nèi)產(chǎn)生的記憶細(xì)胞數(shù)量增多，當(dāng)同種抗原再次侵入人體時(shí)會(huì)引發(fā)二次免疫，二次免疫的特點(diǎn)是短時(shí)間內(nèi)迅速產(chǎn)生大量的抗體和記憶細(xì)胞，免疫預(yù)防作用更強(qiáng)。
答案：(1)mRNA　不同　(2)化學(xué)方法人工合成　PCR技術(shù)　(3)能自主復(fù)制；有多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)、有標(biāo)記基因　(4)從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)→設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列→找到相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列(基因)　(5)記憶細(xì)胞　短時(shí)間內(nèi)迅速產(chǎn)生大量的抗體和記憶細(xì)胞
2．(2020·北京高考)枯草芽孢桿菌可分泌纖維素酶。研究者篩選到一株降解纖維素能力較強(qiáng)的枯草芽孢桿菌菌株(B菌)，從中克隆得到了一種纖維素酶(C1酶)基因。將獲得的C1酶基因與高效表達(dá)載體(HT質(zhì)粒)連接，再導(dǎo)入B菌，以期獲得降解纖維素能力更強(qiáng)的工程菌。
(1)纖維素屬于________糖，因此經(jīng)過(guò)一系列酶催化最終可降解成單糖，該單糖是____________。
(2)對(duì)克隆得到的C1酶基因測(cè)序，與數(shù)據(jù)庫(kù)中的C1酶基因編碼序列相比有兩個(gè)堿基對(duì)不同，但兩者編碼出的蛋白質(zhì)的氨基酸序列相同，這是因?yàn)開_______________________________________________________________________。
(3)C1酶基因以B鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈，轉(zhuǎn)錄時(shí)mRNA自身的延伸方向?yàn)?′→3′。為了使C1酶基因按照正確的方向與已被酶切的HT質(zhì)粒連接，克隆C1酶基因時(shí)在其兩端添加了SmaⅠ和BamHⅠ的酶切位點(diǎn)。該基因內(nèi)部沒(méi)有這兩種酶切位點(diǎn)。圖1中酶切位點(diǎn)1和2所對(duì)應(yīng)的酶分別是____________________________。
(4)將纖維素含量為20%的培養(yǎng)基分為三組，一組接種工程菌，對(duì)照組1不進(jìn)行處理，對(duì)照組2進(jìn)行相應(yīng)處理。在相同條件下培養(yǎng)96小時(shí)，檢測(cè)培養(yǎng)基中纖維素的含量。結(jié)果(圖2)說(shuō)明工程菌降解纖維素的能力最強(qiáng)。對(duì)照組2的處理應(yīng)為_____________________________________________________________________。
(5)預(yù)期該工程菌在處理廢棄物以保護(hù)環(huán)境方面可能的應(yīng)用。(舉一例)
解析：(1)纖維素是由葡萄糖聚合形成的多糖，所以纖維素經(jīng)過(guò)酶的催化作用可降解為葡萄糖。(2)一種氨基酸具有兩個(gè)或更多個(gè)密碼子的現(xiàn)象稱為密碼子的簡(jiǎn)并性。由于密碼子具有簡(jiǎn)并性，即使克隆得到的C1酶基因序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的C1酶基因編碼序列相比有兩個(gè)堿基對(duì)不同，但兩者編碼出的蛋白質(zhì)的氨基酸序列仍相同。(3)根據(jù)題干信息，C1酶基因以B鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈，轉(zhuǎn)錄時(shí)mRNA自身的延伸方向?yàn)?′→3′，根據(jù)質(zhì)粒上啟動(dòng)子的方向可判斷酶切位點(diǎn)1對(duì)應(yīng)的酶為BamHⅠ，而酶切位點(diǎn)2對(duì)應(yīng)的酶為SmaⅠ。(4)比較圖2中三組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，工程菌降解纖維素的能力最強(qiáng)，對(duì)照組2次之，對(duì)照組1中纖維素含量最高，由此判斷，對(duì)照組2接種了降解纖維素能力較強(qiáng)的枯草芽孢桿菌(B菌)。(5)該工程菌可以高效降解纖維素，所以可以用該工程菌降解秸稈，以減少秸稈燃燒帶來(lái)的環(huán)境污染。
答案：(1)多　葡萄糖　(2)密碼子具有簡(jiǎn)并性　(3)BamHⅠ、Sma Ⅰ(順序不能調(diào)換)　(4)接種降解纖維素能力較強(qiáng)的枯草芽孢桿菌(B菌)　(5)降解秸稈，減少秸稈燃燒帶來(lái)的環(huán)境污染。
三、基因工程的應(yīng)用與蛋白質(zhì)工程
[試考題·查欠缺]
1．(2018·全國(guó)卷Ⅰ)回答下列問(wèn)題：
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)。該研究除證明了質(zhì)粒可以作為載體外，還證明了________________________________________________________________________
________________________________________________________________________(答出兩點(diǎn)即可)。
(2)體外重組的質(zhì)粒可通過(guò)Ca2＋參與的________方法導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞；而體外重組的噬菌體DNA通常需與______________組裝成完整噬菌體后，才能通過(guò)侵染的方法將重組的噬菌體DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞。在細(xì)菌、心肌細(xì)胞、葉肉細(xì)胞中，可作為重組噬菌體宿主細(xì)胞的是________。
(3)真核生物基因(目的基因)在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，表達(dá)出的蛋白質(zhì)可能會(huì)被降解。為防止蛋白質(zhì)被降解，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選用__________________的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，在蛋白質(zhì)純化的過(guò)程中應(yīng)添加________的抑制劑。
解析：(1)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導(dǎo)入大腸桿菌中，該過(guò)程利用的技術(shù)是轉(zhuǎn)基因技術(shù)。該研究除了證明質(zhì)粒可作為載體外，還證明了體外重組的質(zhì)粒可以進(jìn)入受體細(xì)胞，真核生物的基因可在原核細(xì)胞中表達(dá)等。(2)重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞可采用Ca2＋參與的轉(zhuǎn)化方法；體外重組噬菌體要通過(guò)將體外重組的噬菌體DNA和外殼蛋白(或噬菌體蛋白)進(jìn)行組裝獲得；因?yàn)槭删w是專門寄生在細(xì)菌中的病毒，所以宿主細(xì)胞選用細(xì)菌。(3)為防止蛋白質(zhì)被降解，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選用蛋白酶缺陷型的大腸桿菌作為受體細(xì)胞；在蛋白質(zhì)純化過(guò)程中，為防止目的蛋白質(zhì)被降解，需要添加蛋白酶的抑制劑。
答案：(1)體外重組的質(zhì)粒可以進(jìn)入受體細(xì)胞；真核生物基因可在原核細(xì)胞中表達(dá)　(2)轉(zhuǎn)化　外殼蛋白(或答噬菌體蛋白)　細(xì)菌　(3)蛋白酶缺陷型　蛋白酶
2．(2019·海南高考)人的T細(xì)胞可以產(chǎn)生某種具有臨床價(jià)值的蛋白質(zhì)(Y)，該蛋白質(zhì)由一條多肽鏈組成。目前可以利用現(xiàn)代生物技術(shù)生產(chǎn)Y。回答下列問(wèn)題。
(1)若要獲得Y的基因，可從人的T細(xì)胞中提取________作為模板，在________催化下合成cDNA，再利用______技術(shù)在體外擴(kuò)增獲得大量Y的基因。
(2)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。若將上述所得Y的基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的________中，得到含目的基因的重組Ti質(zhì)粒，則可用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將該基因?qū)肽撤N植物的葉肉細(xì)胞中。若該葉肉細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)、篩選等得到了能穩(wěn)定表達(dá)Y的愈傷組織，則說(shuō)明Y的基因已經(jīng)_______________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)天然的Y通常需要在低溫條件下保存。假設(shè)將Y的第6位氨基酸甲改變?yōu)榘被嵋铱商岣咂錈岱€(wěn)定性，若要根據(jù)蛋白質(zhì)工程的原理對(duì)Y進(jìn)行改造以提高其熱穩(wěn)定性，具體思路是________________________________________________________________________。
解析：(1)由于人的T細(xì)胞可以產(chǎn)生蛋白質(zhì)Y，要獲得Y的基因，可從人的T細(xì)胞中提取mRNA作為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下，利用四種游離的脫氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技術(shù)在體外擴(kuò)增獲得大量Y的基因。(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，T DNA可以攜帶目的基因轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，故需要將Y的基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T DNA中得到含目的基因的重組Ti質(zhì)粒，把含目的基因的重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入到農(nóng)桿菌中，再讓含目的基因的農(nóng)桿菌侵染植物的葉肉細(xì)胞。若該葉肉細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)、篩選等得到了能穩(wěn)定表達(dá)Y的愈傷組織，則說(shuō)明Y的基因已經(jīng)整合到葉肉細(xì)胞染色體DNA上。(3)蛋白質(zhì)工程需要從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)，設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，推出相應(yīng)的氨基酸序列，找到相應(yīng)的脫氧核苷酸序列，故對(duì)Y進(jìn)行改造以提高其熱穩(wěn)定性，需要找到第6位氨基酸中的堿基所在的基因位置，參照密碼子表，將第6位氨基酸甲的堿基替換為氨基酸乙的堿基。
答案：(1)mRNA　逆轉(zhuǎn)錄酶　PCR　(2)T DNA　整合到葉肉細(xì)胞染色體DNA上　(3)找到第6位氨基酸中的堿基所在的基因位置，參照密碼子表，將第6位氨基酸甲的堿基替換為氨基酸乙的堿基
3．(2020·山東等級(jí)考)水稻胚乳中含直鏈淀粉和支鏈淀粉，直鏈淀粉所占比例越小糯性越強(qiáng)。科研人員將能表達(dá)出基因編輯系統(tǒng)的DNA序列轉(zhuǎn)入水稻，實(shí)現(xiàn)了對(duì)直鏈淀粉合成酶基因(Wx基因)啟動(dòng)子序列的定點(diǎn)編輯，從而獲得了3個(gè)突變品系。
(1)將能表達(dá)出基因編輯系統(tǒng)的DNA序列插入Ti質(zhì)粒構(gòu)建重組載體時(shí)，所需的酶是________________________，重組載體進(jìn)入水稻細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程稱為________。
(2)根據(jù)啟動(dòng)子的作用推測(cè)，Wx基因啟動(dòng)子序列的改變影響了__________________________，從而改變了Wx基因的轉(zhuǎn)錄水平。與野生型水稻相比，3個(gè)突變品系中Wx基因控制合成的直鏈淀粉合成酶的氨基酸序列__________(填“發(fā)生”或“不發(fā)生”)改變，原因是__________________________________________________________
________________________。
(3)為檢測(cè)啟動(dòng)子變化對(duì)Wx基因表達(dá)的影響，科研人員需要檢測(cè)Wx基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA(Wx mRNA)的量。檢測(cè)時(shí)分別提取各品系胚乳中的總RNA，經(jīng)________________過(guò)程獲得總cDNA。通過(guò)PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性地?cái)U(kuò)增出Wx基因的cDNA，原因是
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)各品系Wx mRNA量的檢測(cè)結(jié)果如圖所示，據(jù)圖推測(cè)糯性最強(qiáng)的品系為________，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)限制性核酸內(nèi)切酶能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開；DNA連接酶能將DNA片段拼接起來(lái)。將能表達(dá)出基因編輯系統(tǒng)的DNA序列插入Ti質(zhì)粒構(gòu)建重組載體時(shí)，需要限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶的參與。轉(zhuǎn)化是指目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。(2)啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。Wx基因啟動(dòng)子序列的改變影響了RNA聚合酶與啟動(dòng)子的識(shí)別和結(jié)合，從而改變了Wx基因的轉(zhuǎn)錄水平，使直鏈淀粉合成酶基因的表達(dá)量改變。根據(jù)題干信息可知，基因編輯系統(tǒng)是對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行定點(diǎn)編輯，由于編碼直鏈淀粉合成酶的堿基序列中不含啟動(dòng)子，所以與野生型水稻相比，3個(gè)突變品系中Wx基因控制合成的直鏈淀粉合成酶的氨基酸序列沒(méi)有發(fā)生變化。(3)用提取的各品系胚乳中的總RNA合成總cDNA的過(guò)程為逆轉(zhuǎn)錄(或反轉(zhuǎn)錄)，需要逆轉(zhuǎn)錄酶的參與。由于引物能與Wx基因的cDNA特異性結(jié)合，故通過(guò)PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性地?cái)U(kuò)增出Wx基因的cDNA。(4)mRNA是蛋白質(zhì)合成的直接模板，根據(jù)題圖分析可知，3個(gè)突變品系中品系3的Wx mRNA量最低，控制合成的直鏈淀粉合成酶最少，直鏈淀粉合成量最少，糯性最強(qiáng)。
答案：(1)限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶　轉(zhuǎn)化　(2)RNA聚合酶與啟動(dòng)子的識(shí)別和結(jié)合　不發(fā)生　編碼直鏈淀粉合成酶的堿基序列中不含啟動(dòng)子　(3)逆轉(zhuǎn)錄(或反轉(zhuǎn)錄)　引物是根據(jù)Wx基因的一段已知序列設(shè)計(jì)合成的(或引物能與Wx基因的cDNA特異性結(jié)合)　(4)品系3　品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直鏈淀粉合成酶最少，直鏈淀粉合成量最少，糯性最強(qiáng)
[強(qiáng)知能·補(bǔ)欠缺]
1．基因工程的應(yīng)用
(1)動(dòng)物基因工程：用于提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度從而提高產(chǎn)品產(chǎn)量；用于改善畜產(chǎn)品品質(zhì)；用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物；用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作器官移植的供體等。
(2)植物基因工程：培育抗蟲轉(zhuǎn)基因植物、抗病轉(zhuǎn)基因植物和抗逆轉(zhuǎn)基因植物；利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)。
(3)比較基因治療與基因診斷
原理 操作過(guò)程 進(jìn)展
基因治療 基因表達(dá) 利用正常基因?qū)胗谢蛉毕莸募?xì)胞中，以表達(dá)出正常性狀來(lái)治療(疾病) 臨床實(shí)驗(yàn)
基因診斷 堿基互補(bǔ)配對(duì) 制作特定DNA探針與病人樣品DNA混合，分析雜交帶情況 臨床應(yīng)用
2．蛋白質(zhì)工程
(1)流程圖
(2)結(jié)果：改造了現(xiàn)有蛋白質(zhì)或制造出新的蛋白質(zhì)。
(3)應(yīng)用：主要集中應(yīng)用于對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，改良生物性狀。
3．蛋白質(zhì)工程與基因工程的關(guān)系
蛋白質(zhì)工程 基因工程
區(qū)　別 過(guò)程 預(yù)期蛋白質(zhì)功能→設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列→找到相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列 獲取目的基因→構(gòu)建基因表達(dá)載體→將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞→目的基因的檢測(cè)與鑒定
實(shí)質(zhì) 定向改造或生產(chǎn)人類所需的蛋白質(zhì) 定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的類型或生物產(chǎn)品
結(jié)果 可生產(chǎn)自然界沒(méi)有的蛋白質(zhì) 只能生產(chǎn)自然界已有的蛋白質(zhì)
聯(lián)系 ①蛋白質(zhì)工程是在基因工程基礎(chǔ)上延伸出來(lái)的第二代基因工程 ②基因工程中所利用的某些酶需要通過(guò)蛋白質(zhì)工程進(jìn)行修飾、改造
[練題點(diǎn)·全過(guò)關(guān)]
1．通過(guò)DNA重組技術(shù)使原有基因得以改造的動(dòng)物稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。運(yùn)用這一技術(shù)使羊奶中含有人體蛋白質(zhì)。下圖表示了這一技術(shù)的基本過(guò)程，在該工程中所用的基因“手術(shù)刀”能識(shí)別的序列和切點(diǎn)是，請(qǐng)回答下列問(wèn)題：
(1)從羊染色體中“切下”羊蛋白質(zhì)基因的酶是________，人體蛋白質(zhì)基因“插入”后連接在羊體細(xì)胞染色體中時(shí)需要的酶是____________等。
(2)請(qǐng)寫出質(zhì)粒被切割形成黏性末端的過(guò)程。
(3)人體蛋白質(zhì)基因之所以能“插入”到羊的染色體內(nèi)，原因是____________________________________，“插入”時(shí)用的工具是________，其種類有________________________________________________________________________等。
解析：(1)限制酶可以識(shí)別并切割特定的脫氧核苷酸序列，可用于從羊染色體中“切下”羊蛋白質(zhì)基因。“切下”的羊蛋白質(zhì)基因，使用DNA連接酶將其與載體縫合，然后“插入”到羊的染色體中。 (2)圖示的限制酶識(shí)別的序列為—GGATCC—，并且在G與G之間切開，因此形成的黏性末端為反向重復(fù)的，其過(guò)程見答案。(3)羊的染色體的主要成分是DNA和蛋白質(zhì)，其中DNA上的基因與人體蛋白質(zhì)基因的結(jié)構(gòu)是相同的，因此人體蛋白質(zhì)基因能“插入”到羊的染色體內(nèi)。“插入”時(shí)用的工具是載體，其種類有質(zhì)粒、動(dòng)植物病毒、λ噬菌體的衍生物等。
答案：(1)限制酶　DNA連接酶
(2)
(3)基因的結(jié)構(gòu)相同　載體　質(zhì)粒、動(dòng)植物病毒、λ噬菌體的衍生物
2．(2019·江蘇高考)圖1是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過(guò)程示意圖，載體質(zhì)粒P0具有四環(huán)素抗性基因(Tetr)和氨芐青霉素抗性基因(AmpR)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：
(1)EcoR Ⅴ酶切位點(diǎn)為，EcoR Ⅴ酶切出來(lái)的線性載體P1為________末端。
(2)用Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的目的基因片段，其兩端各自帶有一個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸。載體P1用酶處理，在兩端各添加了一個(gè)堿基為__________的脫氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在________酶作用下，形成重組質(zhì)粒P3。
(3)為篩選出含有重組質(zhì)粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板進(jìn)行篩選，得到A、B、C三類菌落，其生長(zhǎng)情況如表(“＋”代表生長(zhǎng)，“－”代表不生長(zhǎng))。根據(jù)表中結(jié)果判斷，應(yīng)選擇的菌落是________(填表中字母)類，另外兩類菌落質(zhì)粒導(dǎo)入情況分別是________________________、____________________________。
平板類型 A B C
無(wú)抗生素 ＋ ＋ ＋
氨芐青霉素 ＋ ＋ －
四環(huán)素 ＋ － －
氨芐青霉素＋四環(huán)素 ＋ － －
(4)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖2所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇的一對(duì)引物是______。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對(duì)引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400 bp片段，原因是______________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)從圖中可以看出，EcoR Ⅴ酶切出來(lái)的載體質(zhì)粒為平末端。(2)從圖中可以看出，目的基因的兩端各有一個(gè)游離的腺嘌呤脫氧核苷酸，由于載體P1為平末端，所以載體P1的兩端應(yīng)該各添加一個(gè)胸腺嘧啶脫氧核苷酸，形成P2，這樣在DNA連接酶的作用下才能把目的基因和載體P2連接起來(lái)。(3)由題意可知，構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)四環(huán)素抗性基因被破壞，所以導(dǎo)入目的基因的菌落只能在沒(méi)有抗生素或含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中存活，應(yīng)該選B類菌落。A類菌落能在表中條件下存活，說(shuō)明導(dǎo)入的是P0質(zhì)粒。C類菌落只能在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中存活，說(shuō)明C類菌落沒(méi)有導(dǎo)入質(zhì)粒。(4)據(jù)圖分析，目的基因的外側(cè)鏈只能用丙作引物，內(nèi)側(cè)鏈可用甲、乙作引物，如果用甲、丙作引物，則無(wú)論目的基因是否插入正確，都能通過(guò)PCR擴(kuò)增大量目的基因，如果用乙、丙作為引物，當(dāng)目的基因插入不正確(反向插入)時(shí)，則乙、丙兩引物都結(jié)合在外側(cè)，PCR不能正常進(jìn)行，無(wú)法進(jìn)行擴(kuò)增鑒定，因此只能選用乙、丙作為引物，通過(guò)PCR鑒定目的基因是否插入正確。若擴(kuò)增出的DNA片段為400 bp，則正好是目的基因反向連接后，外側(cè)鏈用乙作引物，內(nèi)側(cè)鏈用甲作引物擴(kuò)增出的片段。
答案：(1)平　(2)胸腺嘧啶(T)　DNA連接　(3)B　A類菌落含有P0　C類菌落未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒　(4)乙、丙　目的基因反向連接
四、DNA的粗提取與鑒定
[試考題·查欠缺]
1．(2020·海南高考)下列關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，錯(cuò)誤的是(　　)
A．羊的成熟紅細(xì)胞可作為提取DNA的材料
B．提取植物細(xì)胞的DNA時(shí)，需要加入一定量的洗滌劑和食鹽
C．預(yù)冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解
D．在沸水浴條件下，DNA與二苯胺反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色
解析：選A　羊是哺乳動(dòng)物，哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核，因此羊的成熟紅細(xì)胞不能作為提取DNA的材料，A錯(cuò)誤；提取植物細(xì)胞的DNA時(shí)，需要加入一定量的洗滌劑和食鹽，洗滌劑的作用是溶解細(xì)胞膜，而食鹽的作用是溶解DNA，B正確；冷卻的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解，C正確；在沸水浴條件下，DNA與二苯胺反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色，D正確。
2．(2019·江蘇高考)下列關(guān)于DNA粗提取與鑒定的敘述，錯(cuò)誤的是(　　)
A．用同樣方法從等體積兔血和雞血中提取的DNA量相近
B．DNA析出過(guò)程中，攪拌操作要輕柔以防DNA斷裂
C．預(yù)冷的乙醇可用來(lái)進(jìn)一步純化粗提的DNA
D．用二苯胺試劑鑒定DNA需要進(jìn)行水浴加熱
解析：選A　哺乳動(dòng)物(如兔)成熟的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核和細(xì)胞器，細(xì)胞內(nèi)基本不含DNA，故兔血不宜作為該實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)材料，A錯(cuò)誤；DNA析出過(guò)程中，攪拌要輕柔且沿著一個(gè)方向，以防止DNA斷裂，B正確；DNA不溶于冷乙醇，向DNA提取液中加入適量預(yù)冷的乙醇溶液，會(huì)使DNA析出，從而進(jìn)一步提純DNA，C正確；向溶有DNA的溶液中加入二苯胺試劑，沸水浴加熱數(shù)分鐘，溶液出現(xiàn)藍(lán)色，D正確。
[強(qiáng)知能·補(bǔ)欠缺]
1．DNA與蛋白質(zhì)在物理、化學(xué)性質(zhì)方面的差異
比較項(xiàng)目 DNA 蛋白質(zhì)
溶解性 2 mol/L NaCl溶液中 溶解 析出
0.14 mol/L NaCl溶液中 析出 溶解
酒精溶液中 析出 溶解
耐受性 蛋白酶 無(wú)影響 水解
高溫 80 ℃以上變性 不能忍受60～80 ℃的高溫
2．DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)中的“2、3、4”
加蒸餾水2次 ①加到雞血細(xì)胞液中，使血細(xì)胞吸收水破裂； ②加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物質(zhì)的量濃度下降到0.14 mol/L，使DNA析出
用紗布過(guò)濾3次 ①過(guò)濾血細(xì)胞破裂液，得到含細(xì)胞核物質(zhì)的濾液； ②濾取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)； ③過(guò)濾溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液
用NaCl溶液4次 ①加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的細(xì)胞核物質(zhì)； ②用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出； ③用2 mol/L的NaCl溶液，溶解濾取的DNA黏稠物； ④用2 mol/L的NaCl溶液，溶解絲狀物用于鑒定DNA
3．DNA粗提取實(shí)驗(yàn)中的三個(gè)注意點(diǎn)
(1)本實(shí)驗(yàn)不能用哺乳動(dòng)物成熟紅細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料，原因是哺乳動(dòng)物成熟紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核。
(2)因DNA容易被玻璃容器吸附，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中最好使用塑料的燒杯和試管，減少提取過(guò)程中DNA的損失。
(3)每次用玻璃棒攪拌時(shí)都要沿同一方向，防止打碎DNA分子。
[練題點(diǎn)·全過(guò)關(guān)]
1．關(guān)于還原糖、蛋白質(zhì)和DNA的鑒定實(shí)驗(yàn)，下列敘述正確的是(　　)
A．在甘蔗莖的組織樣液中加入雙縮脲試劑，溫水浴后液體由藍(lán)色變成磚紅色
B．在大豆種子勻漿液中加入斐林試劑，液體由藍(lán)色變成紫色
C．提取DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入適量洗滌劑和食鹽，充分研磨，過(guò)濾并棄去濾液
D．將DNA粗提物溶解在2 mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺試劑，沸水浴后液體由無(wú)色變成藍(lán)色
解析：選D　甘蔗莖的組織樣液富含蔗糖，而蔗糖屬于非還原糖，且不能用斐林試劑檢測(cè)，A錯(cuò)誤；大豆種子中富含蛋白質(zhì)，先后加入雙縮脲試劑A液和B液搖勻后，液體由藍(lán)色變?yōu)樽仙珺錯(cuò)誤；提取DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入適量的洗滌劑和食鹽，充分研磨，過(guò)濾并棄去濾紙上的黏稠物，留下濾液，C錯(cuò)誤；將DNA粗提物溶解在2 mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺試劑并水浴加熱，溶液由無(wú)色變?yōu)樗{(lán)色，D正確。
2．在“DNA的粗提取與鑒定”的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)DNA進(jìn)行鑒定時(shí)，做如下操作：　　
步驟 A B
1 加2 mol/L的NaCl溶液5 mL 加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
2 不加 加入提取的DNA絲狀物并攪拌
3 加4 mL二苯胺，混勻 加4 mL二苯胺，混勻
4 沸水浴5 min 沸水浴5 min
實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
(1)根據(jù)如圖，完成表格空白處的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。
(2)對(duì)于B試管，完成1、2、3的操作后溶液的顏色為________________________________________________________________________
______________________。
(3)在沸水浴中加熱的目的是____________________，同時(shí)說(shuō)明DNA對(duì)高溫有較強(qiáng)的__________________。
(4)A試管在實(shí)驗(yàn)中的作用是____________。
(5)B試管中溶液顏色的變化程度主要與___________________________________
_____________________________________有關(guān)。
答案：(1)溶液不變藍(lán)色　溶液變藍(lán)色　DNA在沸水浴的條件下遇二苯胺會(huì)變成藍(lán)色
(2)基本不變(不呈藍(lán)色)
(3)加快顏色反應(yīng)速度　耐受性　(4)對(duì)照
(5)DNA(絲狀物)的多少
科學(xué)探究——探討基因工程操作中限制酶的選擇方法
1．根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點(diǎn)確定限制酶的種類
(1)應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。
(2)不能選擇切點(diǎn)位于目的基因和標(biāo)記基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲、乙不能選擇SmaⅠ。
(3)為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點(diǎn))。
2．根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類
3．根據(jù)Ti質(zhì)粒的TDNA片段選擇限制酶
圖中甲、乙、丁Ti質(zhì)粒均不宜選取，而丙Ti質(zhì)粒宜選取(設(shè)切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下：
[素養(yǎng)訓(xùn)練]
1．(2021·泉州月考)圖甲、乙中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。據(jù)此判斷下列關(guān)于培育轉(zhuǎn)基因大腸桿菌的敘述，錯(cuò)誤的是(　　)
A．若通過(guò)PCR技術(shù)提取該目的基因，應(yīng)該選用引物甲和引物丙
B．圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建表達(dá)載體，應(yīng)選用BclⅠ和HindⅢ剪切
C．若將基因表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞中，需選用感受態(tài)的大腸桿菌
D．在受體細(xì)胞中，氨芐青霉素抗性基因和目的基因可同時(shí)表達(dá)
解析：選D　PCR技術(shù)要求兩種引物分別和目的基因的兩條單鏈結(jié)合，沿相反的方向合成子鏈，故所用的引物組成為圖乙中引物甲和引物丙，A正確；選擇的限制酶應(yīng)在目的基因兩端存在識(shí)別位點(diǎn)，但BamHⅠ可能使質(zhì)粒中的啟動(dòng)子丟失，因此只能選BclⅠ和HindⅢ兩種限制酶切割，B正確；將目的基因?qū)胛⑸锎竽c桿菌細(xì)胞中，需要用Ca2＋處理，使之成為感受態(tài)細(xì)胞，C正確；在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，使用BclⅠ和HindⅢ兩種限制酶切割質(zhì)粒，氨芐青霉素抗性基因已被破壞，因此氨芐青霉素抗性基因在受體細(xì)胞中不能表達(dá)，D錯(cuò)誤。
2．人體內(nèi)的t　PA蛋白能高效降解由纖維蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和腦血栓的急救藥。然而，為心梗患者注射大劑量的基因工程t　PA會(huì)誘發(fā)顱內(nèi)出血，其原因在于tPA與纖維蛋白結(jié)合的特異性不高。研究證實(shí)，將tPA第84位的半胱氨酸換成絲氨酸，能顯著降低出血副作用。據(jù)此，先對(duì)天然的tPA基因進(jìn)行序列改造，然后再采取傳統(tǒng)的基因工程方法表達(dá)該改造后的基因，可制造出性能優(yōu)異的改良tPA蛋白(注：如圖表示相關(guān)的目的基因、載體、限制酶識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，pCLY11為質(zhì)粒，新霉素為抗生素)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：
(1)以上制造出性能優(yōu)異的改良tPA蛋白的過(guò)程被稱為____________工程。
(2)已知人tPA基因序列已測(cè)出，且第84位半胱氨酸的模板鏈堿基序列為ACA，而絲氨酸的模板鏈堿基序列為AGA，因此要獲得改造后的目的基因最好采用____________________方法獲得。
(3)若tPA改良基因的黏性末端如圖所示，那么需選用限制酶XmaⅠ和__________切開質(zhì)粒pCLY11，才能與tPA改良基因高效連接。在基因工程中，最核心的一步為________________________________。
(4)一般選擇在未加入新霉素的培養(yǎng)基中生存的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，目的是__________________________________________。在加入新霉素的培養(yǎng)基中形成菌落的受體細(xì)胞并非都是目的菌株，原因是______________________________________________，這時(shí)需選擇呈__________色的菌落，進(jìn)一步培養(yǎng)、檢測(cè)和鑒定，以選育出能生產(chǎn)改良tPA蛋白的工程菌株。
解析：(1)在原有的tPA蛋白基礎(chǔ)上改良蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，屬于蛋白質(zhì)工程。(2)由于tPA蛋白基因的序列已知，因此可以使用化學(xué)方法人工合成的方法獲得目的基因。(3)目的基因的黏性末端圖中已經(jīng)給出，觀察各限制酶的識(shí)別序列可知所使用的限制酶為XmaⅠ和BglⅡ，要想把目的基因與載體拼接起來(lái)需要得到相同的黏性末端，因此載體也需要XmaⅠ和BglⅡ切割；基因工程中最核心的一個(gè)環(huán)節(jié)為基因表達(dá)載體的構(gòu)建。(4)選擇未加入新霉素的培養(yǎng)基中生存的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，這些細(xì)胞沒(méi)有新霉素的抗性，當(dāng)其導(dǎo)入重組質(zhì)粒后，質(zhì)粒上的標(biāo)記基因使得大腸桿菌具有新霉素抗性，這樣可以選擇導(dǎo)入質(zhì)粒pCLY11的大腸桿菌；由于標(biāo)記基因存在于原有質(zhì)粒上，若未連目的基因的質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌中，這些大腸桿菌也可以獲得新霉素的抗性；而區(qū)分重組質(zhì)粒和原有質(zhì)粒的一個(gè)標(biāo)志可以觀察mlacZ基因的表達(dá)情況，由于重組質(zhì)粒拼接了目的基因，破壞了mlacZ基因，因此在重組質(zhì)粒中該基因不表達(dá)，菌落呈現(xiàn)白色，而導(dǎo)入非重組質(zhì)粒的大腸桿菌由于該基因保存完整，可以表達(dá)，所以菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。
答案：(1)蛋白質(zhì)　(2)化學(xué)方法人工合成　(3)BglⅡ　基因表達(dá)載體的構(gòu)建　(4)以便篩選出導(dǎo)入質(zhì)粒pCLY11的大腸桿菌　含有未連目的基因質(zhì)粒的大腸桿菌也可以在這種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)　白
一、對(duì)點(diǎn)練小題，落實(shí)主干知識(shí)
1．如圖為DNA分子的某一片段，其中①②③分別表示某種酶的作用部位，則相應(yīng)的酶依次是(　　)
A．限制酶、解旋酶、DNA連接酶
B．解旋酶、限制酶、DNA連接酶
C．解旋酶、DNA連接酶、限制酶
D．限制酶、DNA連接酶、解旋酶
解析：選B　①處為氫鍵，是解旋酶的作用部位；②處為磷酸二酯鍵，是限制酶的作用部位；③處為兩個(gè)DNA片段的缺口，是DNA連接酶的作用部位。
2．如圖表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相關(guān)的酶作用位點(diǎn)。下列敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A．甲、乙、丙都屬于黏性末端
B．甲、乙片段可形成重組DNA分子，但甲、丙不能
C．DNA連接酶的作用位點(diǎn)在乙圖中b處
D．切割甲的限制酶不能識(shí)別由甲、乙片段形成的重組DNA分子
解析：選C　由圖可知，甲、乙、丙都屬于黏性末端，A正確；甲、乙的黏性末端相同，因此可在DNA連接酶的作用下形成重組DNA分子，但甲、丙的黏性末端不同，它們之間不能形成重組DNA分子，B正確；DNA連接酶將兩個(gè)DNA片段連接為一個(gè)DNA分子，作用部位是磷酸二酯鍵，C錯(cuò)誤；切割甲的限制酶的識(shí)別序列為：GAATTC∥CTTAAG，而甲、乙片段形成的重組DNA分子序列為：GAATTG∥CTTAAC，因此切割甲的限制酶不能識(shí)別由甲、乙片段形成的重組DNA分子，D正確。
3．下列關(guān)于目的基因的檢測(cè)與鑒定的敘述，錯(cuò)誤的是(　　)
A．目的基因在真核細(xì)胞中能否穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵是目的基因是否插入質(zhì)粒DNA中
B．檢測(cè)受體細(xì)胞是否含有目的基因及其是否成功轉(zhuǎn)錄可使用PCR等技術(shù)
C．目的基因表達(dá)的鑒定通常是在個(gè)體水平上進(jìn)行的
D．如在受體細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，可確定目的基因上游含有啟動(dòng)子
解析：選A　目的基因在真核細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵是目的基因是否插入轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上，A錯(cuò)誤；通過(guò)抗原抗體雜交可以檢測(cè)目的基因是否翻譯成了蛋白質(zhì)，檢測(cè)受體細(xì)胞是否含有目的基因及其是否成功轉(zhuǎn)錄可使用PCR等技術(shù)，B正確；目的基因表達(dá)的鑒定通常是在個(gè)體水平上進(jìn)行的，如抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等，C正確；如在受體細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，可確定目的基因上游含有啟動(dòng)子，D正確。
4．下列是“肝臟細(xì)胞DNA粗提取”實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)關(guān)鍵操作步驟，相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A．步驟1中，加入檸檬酸鈉緩沖液的目的是維持pH的穩(wěn)定
B．步驟1中，冰浴處理的主要原理是低溫下DNA酶容易變性
C．步驟2中，異戊醇的作用可能是使與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)因變性而沉淀
D．步驟2中，離心后應(yīng)取上清液，因?yàn)镈NA在2 mol/L NaCl溶液中溶解度比較大
解析：選B　步驟1中，加入檸檬酸鈉緩沖液的目的是維持pH的穩(wěn)定，A正確；低溫不會(huì)使酶變性失活，只能降低酶的活性，B錯(cuò)誤；步驟2中，異戊醇的作用可能是使與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)因變性而沉淀，C正確；DNA在2 mol/L的NaCl溶液中的溶解度比較大，因此加固體NaCl使溶液濃度達(dá)到2 mol/L后再離心過(guò)濾取上清液，D正確。
5．為了增加菊花花色類型，研究者從其他植物中克隆出花色基因C(圖1)，擬將其與質(zhì)粒(圖2)重組，再借助農(nóng)桿菌導(dǎo)入菊花中。
下列操作與實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟环氖?　　)
A．用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒
B．用含C基因的農(nóng)桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因?qū)爰?xì)胞
C．在培養(yǎng)基中添加卡那霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細(xì)胞
D．用分子雜交方法檢測(cè)C基因是否整合到菊花染色體上
解析：選C　目的基因C和質(zhì)粒都有可被EcoRⅠ切割的酶切位點(diǎn)，另外需要DNA連接酶將切好的目的基因和質(zhì)粒連接起來(lái)；愈傷組織全能性較高，是理想的植物受體細(xì)胞，將目的基因?qū)胫参锸荏w細(xì)胞的方法通常為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；質(zhì)粒中含有潮霉素抗性基因，因此選擇培養(yǎng)基中應(yīng)該加入潮霉素；使用分子雜交方法可檢測(cè)目的基因是否整合到受體染色體上。
6．若要利用某目的基因(圖甲)和質(zhì)粒載體(圖乙)構(gòu)建重組DNA(圖丙)，限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)分別是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理的是(　　)
A．用EcoRⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體
B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體
C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體
D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體
解析：選D　根據(jù)題意并分析圖示可知，只有EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體，在構(gòu)建的重組DNA中，RNA聚合酶在插入目的基因上的移動(dòng)方向才與圖丙相同。
二、系統(tǒng)練大題，強(qiáng)化科學(xué)思維
7．科學(xué)家將擬南芥的抗寒基因(CBFl)，轉(zhuǎn)入香蕉以獲得抗寒的香蕉品種。如圖是某質(zhì)粒載體上的SacⅠ、XbaⅠ、EcoRⅠ、Hind Ⅲ四種限制酶的切割位點(diǎn)示意圖。據(jù)圖回答問(wèn)題：
(1)在該實(shí)驗(yàn)中為構(gòu)建基因表達(dá)載體，用SacⅠ、XbaⅠ切下CBFl基因后，對(duì)質(zhì)粒載體進(jìn)行切割的限制酶是________________，理由是________________________________________________________________________。
(2)連接CBFl基因到該質(zhì)粒載體后，作為基因表達(dá)載體的組成還必須有__________________。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入香蕉細(xì)胞最常用的方法是__________________________。
(3)為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有CBFl基因，可用含______________的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。
(4)科學(xué)家將生長(zhǎng)健壯、苗齡一致的轉(zhuǎn)基因香蕉(實(shí)驗(yàn)組)與非轉(zhuǎn)基因香蕉(對(duì)照組)進(jìn)行______________處理，鑒定兩組之間的抗寒性差異，如果__________________________________，則說(shuō)明獲得了抗寒的香蕉優(yōu)質(zhì)品種。
解析：(1)在基因工程中，用相同限制酶切割來(lái)源不同的DNA后，可產(chǎn)生相同的末端，所以和含目的基因的DNA一樣，質(zhì)粒也應(yīng)使用SacⅠ、XbaⅠ進(jìn)行切割。(2)基因表達(dá)載體的組成包括啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因、目的基因等。香蕉細(xì)胞是植物細(xì)胞，將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。(3)據(jù)圖分析可知，質(zhì)粒上的標(biāo)記基因是氨芐青霉素抗性基因，所以為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有CBFl基因，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。(4)根據(jù)題干信息已知目的基因是抗寒基因，所以科學(xué)家將生長(zhǎng)健壯、苗齡一致的轉(zhuǎn)基因香蕉(實(shí)驗(yàn)組)與非轉(zhuǎn)基因香蕉(對(duì)照組)進(jìn)行低溫處理，鑒定兩組之間的抗寒性差異，如果實(shí)驗(yàn)組的抗寒能力明顯高于對(duì)照組，則說(shuō)明獲得了抗寒的香蕉優(yōu)質(zhì)品種。
答案：(1)SacⅠ、XbaⅠ　用相同限制酶切割來(lái)源不同的DNA后，可產(chǎn)生相同的末端　(2)啟動(dòng)子和終止子　農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法　(3)氨芐青霉素　(4)低溫　實(shí)驗(yàn)組的抗寒能力明顯高于對(duì)照組
8．某實(shí)驗(yàn)小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育耐鹽水稻，如圖1表示含有耐鹽基因的外源DNA分子，圖2表示質(zhì)粒，其上含有BamHⅠ、SmaⅠ和HindⅢ三種限制酶的酶切位點(diǎn)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：
(1)分析上圖可知，欲構(gòu)建重組DNA分子，應(yīng)選用________________兩種限制酶切割質(zhì)粒和外源DNA分子，使用兩種不同的限制酶切割含目的基因的外源DNA和質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)題(1)中不使用另外一種限制酶切割的原因是__________________，題(1)中構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒若用該酶切割能產(chǎn)生________種不同的DNA片段。
(3)質(zhì)粒中抗性基因的作用是__________________。成功導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞(受體細(xì)胞本身不含四環(huán)素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因)，不能在含______(填“氨芐青霉素”或“四環(huán)素”)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
(4)從個(gè)體水平上鑒定耐鹽基因是否成功表達(dá)的方法是
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)外源DNA和質(zhì)粒上都含有限制酶BamHⅠ、HindⅢ和SmaⅠ的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，但限制酶SmaⅠ的識(shí)別序列位于目的基因中，因此構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)該選用限制酶BamHⅠ和HindⅢ切割質(zhì)粒和外源DNA分子；使用兩種不同的限制酶切割含目的基因的外源DNA和質(zhì)粒可防止質(zhì)粒和目的基因的自身環(huán)化及質(zhì)粒與目的基因的反向連接。(2)構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒含有3個(gè)限制酶SmaⅠ的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，因此若用該酶切割構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒能產(chǎn)生3種不同的DNA片段。(3)質(zhì)粒中抗性基因的作用是篩選和鑒定目的基因；構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，四環(huán)素抗性基因被破壞，但氨芐青霉素抗性基因沒(méi)有被破壞，因此成功導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞(受體細(xì)胞本身不含四環(huán)素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因)，不能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。(4)從個(gè)體水平上鑒定耐鹽基因是否成功表達(dá)的方法是將轉(zhuǎn)基因水稻置于鹽堿地中培育(或用一定濃度的鹽水澆灌轉(zhuǎn)基因水稻)，觀察其能否正常生長(zhǎng)。
答案：(1)BamHⅠ和HindⅢ　防止質(zhì)粒和目的基因的自身環(huán)化及質(zhì)粒與目的基因的反向連接　(2)SmaⅠ會(huì)破壞目的基因　3　(3)篩選和鑒定目的基因　四環(huán)素　(4)將轉(zhuǎn)基因水稻置于鹽堿地中培育(或用一定濃度的鹽水澆灌轉(zhuǎn)基因水稻)，觀察其能否正常生長(zhǎng)
9．科學(xué)家通過(guò)利用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)改造Rubisco酶基因，提高了光合作用過(guò)程中Rubisco酶基因?qū)O2的親和力，從而顯著提高了植物的光合速率。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：
(1)PCR過(guò)程所依據(jù)的原理是______________，該過(guò)程需要加入的酶是________________。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成________。
(2)該技術(shù)不直接改造Rubisco酶，而是通過(guò)Rubisco酶基因進(jìn)行改造，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Rubisco酶的改造，其原因是______________________________。和傳統(tǒng)基因工程技術(shù)相比較，定點(diǎn)突變最突出的優(yōu)點(diǎn)是獲得的產(chǎn)物一般是自然界中________(填“存在的”或“不存在的”)，PCR定點(diǎn)突變技術(shù)屬于________工程的范疇。
解析：(1)PCR過(guò)程所依據(jù)的原理是DNA雙鏈復(fù)制，該過(guò)程需要加入的酶是耐高溫的DNA聚合酶。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。(2)該技術(shù)不直接改造Rubisco酶，而是通過(guò)對(duì)Rubisco酶基因進(jìn)行改造，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Rubisco酶的改造，其原因是蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，改造困難。和傳統(tǒng)基因工程技術(shù)相比較，定點(diǎn)突變最突出的優(yōu)點(diǎn)是獲得的產(chǎn)物一般是自然界中不存在的，PCR定點(diǎn)突變技術(shù)屬于蛋白質(zhì)工程的范疇。
答案：(1)DNA雙鏈復(fù)制　耐高溫的DNA聚合酶(或Taq酶)　引物　(2)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，改造困難　不存在的　蛋白質(zhì)
10．回答與利用生物技術(shù)培育抗病品種有關(guān)的問(wèn)題：
(1)通過(guò)抗病性強(qiáng)的植株獲取抗病目的基因有多種方法。現(xiàn)已獲得純度高的抗病蛋白(可作為抗原)，可通過(guò)______________技術(shù)獲得特異性探針，并將________中所有基因進(jìn)行表達(dá)，然后利用該探針，找出能與探針特異性結(jié)合的表達(dá)產(chǎn)物，進(jìn)而獲得與之對(duì)應(yīng)的目的基因。
(2)將上述抗病基因通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法導(dǎo)入植物的分生組織可獲得抗病性強(qiáng)的植株。若在試管苗期間用分子水平方法判斷抗病基因是否表達(dá)，應(yīng)檢測(cè)________(A.質(zhì)粒載體　B．轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物　C．抗性基因　D．病原微生物)。
(3)植物細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中往往會(huì)發(fā)生________，可利用這一特性篩選抗致病真菌能力強(qiáng)的細(xì)胞。篩選時(shí)在培養(yǎng)基中加入________________，并將存活的細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)至再生植株。若利用________培養(yǎng)建立的細(xì)胞系用于篩選，則可快速獲得穩(wěn)定遺傳的抗病植株。
(4)用抗病品種與高產(chǎn)品種進(jìn)行雜交育種過(guò)程中，有時(shí)會(huì)遇到因胚發(fā)育中止而得不到可育種子的情況。若要使該胚繼續(xù)發(fā)育獲得植株，可采用的方法是__________________。
解析：(1)該特異性探針作用的對(duì)象是蛋白質(zhì)類抗原，所以該探針是抗體，可通過(guò)單克隆抗體技術(shù)獲得特異性探針。用基因文庫(kù)篩選某種目的基因的操作過(guò)程可以是先將基因文庫(kù)中所有基因進(jìn)行表達(dá)，然后利用該探針，找出能與探針特異性結(jié)合的表達(dá)產(chǎn)物，進(jìn)而獲得與之對(duì)應(yīng)的目的基因。(2)用分子水平方法判斷抗病基因是否表達(dá)，應(yīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。(3)植物細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中往往會(huì)發(fā)生變異，篩選抗致病真菌能力強(qiáng)的細(xì)胞時(shí)可在培養(yǎng)基中加入高濃度致病真菌，并將存活的細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)至再生植株。若要快速獲得穩(wěn)定遺傳的抗病植株，可用花粉離體培養(yǎng)建立的細(xì)胞系用于篩選。(4)若要使該胚繼續(xù)發(fā)育獲得植株，可采用的方法是胚的離體培養(yǎng)。
答案：(1)單克隆抗體　基因文庫(kù)　(2)B　(3)變異　高濃度致病真菌　花粉離體　(4)胚的離體培養(yǎng)
11．(2021年1月新高考8省聯(lián)考·湖北卷)某實(shí)驗(yàn)室需構(gòu)建含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)基因的表達(dá)載體用于科學(xué)研究。相關(guān)資料如下：
(1)雙鏈DNA的每一條鏈有兩個(gè)末端，分別是5′端和3′端，從左到右的5′—3′DNA鏈?zhǔn)蔷幋a鏈，從左到右的3′—5′DNA鏈?zhǔn)悄０彐湣?br/>(2)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)在自然光下顯示綠色，已知該基因的DNA編碼序列如下：5′ATGGTGAGC……AAGTAA 3′。
(3)質(zhì)粒載體中含有EcoRⅠ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ、Xba Ⅰ和Not Ⅰ等酶的酶切位點(diǎn)(這些酶各自的識(shí)別序列不同)，如下圖所示。
回答下列問(wèn)題：
①增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)錄的mRNA堿基序列為
________________________________________________________________________。
②通過(guò)PCR方法獲得eGFP目的片段，首先需要設(shè)計(jì)________(填“一對(duì)”或“一個(gè)”)引物，在體外選擇性擴(kuò)增eGFP目的片段，PCR反應(yīng)一般由95 ℃熱變性、55～60 ℃引物和模板配對(duì)、72 ℃延伸三個(gè)步驟，經(jīng)過(guò)多次循環(huán)完成。延伸階段選用72 ℃是綜合考慮了兩個(gè)因素，這兩個(gè)因素是________________和________________。
③eGFP的PCR產(chǎn)物兩端分別含有BamH Ⅰ和Not Ⅰ的酶切位點(diǎn)，構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，用這兩種酶酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體。與單一酶酶切相比，該實(shí)驗(yàn)采用的雙酶切方法的優(yōu)點(diǎn)是__________________________(答一點(diǎn)即可)。
④將所構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌，涂布含有卡那霉素的平板，若表達(dá)載體構(gòu)建成功，可觀察到多個(gè)________單菌落。
解析：①增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)的編碼序列為5′ATGGTGAGC……AAGTAA 3′，則模板鏈序列(3′—5′DNA鏈)應(yīng)為與之互補(bǔ)的另一條DNA鏈，故轉(zhuǎn)錄的mRNA堿基序列為5′AUGGUGAGC……AAGUAA 3′。
②通過(guò)PCR方法獲得eGFP目的片段，需要兩種引物分別與兩條模板鏈結(jié)合，因此首先需要設(shè)計(jì)一對(duì)引物。延伸階段選用72 ℃是綜合考慮了兩個(gè)因素，一是防止DNA變性，二是保持Taq酶所需溫度條件。③與單一酶酶切相比，采用的雙酶切方法可以形成不同的黏性末端，防止目的基因與質(zhì)粒任意連接。④將所構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌，涂布含有卡那霉素的平板，若表達(dá)載體構(gòu)建成功，能表達(dá)出抗卡那霉素的物質(zhì)和綠色熒光，含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌能在該培養(yǎng)基上生存，因此可觀察到多個(gè)含有綠色熒光的大腸桿菌單菌落。
答案：(1)5′AUGGUGAGC……AAGUAA 3′　(2)一對(duì)　防止DNA變性　保持Taq酶所需溫度條件　(3)防止目的基因與質(zhì)粒任意連接　(4)綠色熒光
12．探針是指以放射性同位素、生物素或熒光染料等進(jìn)行標(biāo)記的已知核苷酸序列的核酸片段，可用于核酸分子雜交以檢測(cè)目標(biāo)核苷酸序列是否存在。圖1是某實(shí)驗(yàn)小組制備的兩種探針，圖2是探針與目的基因雜交的示意圖。請(qǐng)回答下列有關(guān)問(wèn)題：
(1)核酸探針與目標(biāo)核苷酸序列間的分子雜交遵循__________________ 。設(shè)計(jì)核苷酸序列是核酸探針技術(shù)關(guān)鍵步驟之一，圖1所示的兩種核酸探針(探針2只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理，原因是探針1______________________，導(dǎo)致特異性差；而探針2____________________________，導(dǎo)致探針失效。
(2)cDNA探針是目前應(yīng)用最為廣泛的一種探針。制備cDNA探針時(shí)，首先需提取、分離獲得________作為模板，在________的催化下合成cDNA探針。利用制備好的β珠蛋白基因的cDNA探針與β珠蛋白基因雜交后，出現(xiàn)了如圖2中甲、乙、丙、丁等所示的“發(fā)夾結(jié)構(gòu)”，原因是______________________ 。
(3)探針常用于基因工程的檢測(cè)，如基因工程中利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)α 抗胰蛋白酶，應(yīng)將α 抗胰蛋白酶基因與______________________的啟動(dòng)子重組在一起，導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的________中，再利用SRY基因(Y染色體上的性別決定基因)探針進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)反應(yīng)呈________(填“陽(yáng)”或“陰”)性的胚胎進(jìn)行移植培養(yǎng)。
解析：(1)核酸探針是單鏈DNA分子，其與目標(biāo)核苷酸序列間的分子雜交遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。圖1中探針1堿基序列過(guò)短，特異性差；探針2自身折疊后會(huì)出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效，因此這兩種探針都不合理。(2)cDNA是以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄形成的，該過(guò)程需要逆轉(zhuǎn)錄酶的催化。逆轉(zhuǎn)錄法合成的cDNA不含內(nèi)含子，而β 珠蛋白基因中含有不表達(dá)序列，因此利用制備好的β 珠蛋白基因的cDNA探針與β 珠蛋白基因雜交后，出現(xiàn)了如圖2中甲、乙、丙、丁等所示的“發(fā)夾結(jié)構(gòu)”。(3)利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)α 抗胰蛋白酶時(shí)，應(yīng)將α 抗胰蛋白酶基因與乳腺蛋白基因的啟動(dòng)子重組在一起，將構(gòu)建好的重組DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的受精卵中，再利用SRY探針進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)反應(yīng)呈陰性(雌性)的胚胎進(jìn)行移植。
答案：(1)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則　堿基序列過(guò)短　自身會(huì)出現(xiàn)部分堿基互補(bǔ)配對(duì)　(2)mRNA　逆轉(zhuǎn)錄酶　β 珠蛋白基因中含有內(nèi)含子　(3)乳腺蛋白基因　受精卵　陰

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