資源簡(jiǎn)介 中小學(xué)教育資源及組卷應(yīng)用平臺(tái)人教(2019)生物選擇性必修3(知識(shí)點(diǎn)+跟蹤檢測(cè))第1講 基因工程【課標(biāo)導(dǎo)航】5.1.1 概述基因工程是在遺傳學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的5.1.2 闡明DNA重組技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具5.1.3 闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)鑒定等步驟5.1.4 舉例說(shuō)明基因工程在農(nóng)牧、食品及醫(yī)藥等行業(yè)的廣泛應(yīng)用改善了人類的生活品質(zhì)5.2.1 概述人們根據(jù)基因工程原理,進(jìn)行蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)和改造,可以獲得性狀和功能更符合人類需求的蛋白質(zhì)5.2.2 舉例說(shuō)明依據(jù)人類需要對(duì)原有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行基因改造、生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的過(guò)程1.基因工程的基本工具2.基因工程的基本操作程序3.蛋白質(zhì)工程4.DNA的粗提取與鑒定1.實(shí)驗(yàn)原理2.實(shí)驗(yàn)流程[基礎(chǔ)微點(diǎn)練清]1.判斷正誤(1)海魚的抗凍蛋白基因是培育抗凍番茄的目的基因(√)[新人教版選擇性必修3 P83“概念檢測(cè)”T1(1)](2)切割質(zhì)粒的限制性核酸內(nèi)切酶均能特異性地識(shí)別6個(gè)核苷酸序列(×)(3)DNA連接酶能將兩堿基間通過(guò)氫鍵連接起來(lái)(×)(4)E·coliDNA連接酶既可連接平末端,又可連接黏性末端(×)(5)構(gòu)建含有目的基因的Ti質(zhì)粒需要限制酶、DNA連接酶和核酸酶(×)[新人教版選擇性必修3 P83“概念檢測(cè)”T1(2)](6)利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物屬于基因工程的應(yīng)用[新人教版選擇性必修3 P92“概念檢測(cè)”T2B](√)(7)提取DNA時(shí),如果沒(méi)有雞血材料,可用豬血代替(×)(8)在DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)中,用菜花替代雞血作為實(shí)驗(yàn)材料,其實(shí)驗(yàn)操作步驟相同(×)2.下列有關(guān)限制酶的敘述正確的是( )A.用限制酶切割一個(gè)DNA分子中部,獲得一個(gè)目的基因時(shí),被水解的磷酸二酯鍵有2個(gè)B.限制酶識(shí)別序列越短,則該序列在DNA中出現(xiàn)的概率就越大C.—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端堿基數(shù)不同D.只有用相同的限制酶處理含目的基因的片段和質(zhì)粒,才能形成重組質(zhì)粒解析:選B 用限制酶切割DNA分子中部獲得一個(gè)目的基因時(shí),需剪切2次,水解磷酸二酯鍵4個(gè);限制酶識(shí)別序列越短,則該序列在DNA中出現(xiàn)的概率就越大;—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端均有4個(gè)堿基;切割目的基因和載體并非只能用同一種限制酶,如果不同的限制酶切割DNA分子所產(chǎn)生的末端也存在互補(bǔ)關(guān)系,則兩末端也可連接。3.(新人教版選擇性必修3 P74“概念檢測(cè)”T1)DNA連接酶是重組DNA技術(shù)常用的一種工具酶。下列相關(guān)敘述正確的是( )A.能連接DNA分子雙鏈堿基對(duì)之間的氫鍵B.能將單個(gè)脫氧核苷酸加到DNA片段的末端,形成磷酸二酯鍵C.能連接用同種限制酶切開的兩條DNA片段,重新形成磷酸二酯鍵D.只能連接雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端,不能連接雙鏈DNA片段的平末端解析:選C DNA連接酶的作用是連接末端互補(bǔ)的兩條DNA片段,重新形成磷酸二酯鍵。4.(新人教版選擇性必修3 P74“拓展應(yīng)用”T1)想一想,為什么限制酶不切割細(xì)菌本身的DNA分子?提示:生物在長(zhǎng)期演化過(guò)程中,含有某種限制酶的細(xì)胞,其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列,或者通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上,使限制酶不能將其切開。這樣,盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷,并且可以防止外源DNA的入侵。一、基因工程的操作工具[試考題·查欠缺]1.(全國(guó)卷Ⅰ)基因工程中可以通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因。回答下列問(wèn)題。(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成,也可以從基因文庫(kù)中獲得。基因文庫(kù)包括__________________和________________。(2)生物體細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制開始時(shí),解開DNA雙鏈的酶是________。在體外利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí),使反應(yīng)體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是____________。上述兩個(gè)解鏈過(guò)程的共同點(diǎn)是破壞了DNA雙鏈分子中的________。(3)目前在PCR反應(yīng)中使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。解析:(1)基因工程中的基因文庫(kù)包括基因組文庫(kù)和部分基因文庫(kù)(cDNA文庫(kù))。(2)生物體細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制開始時(shí),通過(guò)解旋酶解開DNA雙鏈。在體外利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí),通過(guò)高溫(90~95 ℃)使反應(yīng)體系中的模板DNA解鏈為單鏈。上述兩個(gè)解鏈過(guò)程的共同點(diǎn)是破壞了DNA雙鏈分子中的氫鍵。(3)大腸桿菌DNA聚合酶不耐高溫,在高溫下會(huì)失活,而PCR反應(yīng)體系中加入的聚合酶需耐高溫,故在PCR反應(yīng)中要用能耐高溫的Taq酶。答案:(1)基因組文庫(kù) cDNA文庫(kù) (2)解旋酶 加熱至90~95 ℃ 氫鍵 (3)Taq酶熱穩(wěn)定性高,而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會(huì)失活2.(全國(guó)卷Ⅲ)圖(a)中的三個(gè)DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列與切割位點(diǎn),圖(b)為某種表達(dá)載體的示意圖(載體上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切點(diǎn)是唯一的)。根據(jù)基因工程的有關(guān)知識(shí),回答下列問(wèn)題:(1)經(jīng)BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以與上述表達(dá)載體被________酶切后的產(chǎn)物連接,理由是___________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)若某人利用圖(b)所示的表達(dá)載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組子,如圖(c)所示。這三種重組子中,不能在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的基因產(chǎn)物的有________,不能表達(dá)的原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)DNA連接酶是將兩個(gè)DNA片段連接起來(lái)的酶,常見的有________________和________________,其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是______________。解析:(1)由題圖可知,BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種限制性內(nèi)切酶的共同識(shí)別序列是,二者切割可以形成相同的黏性末端,因此經(jīng)BamHⅠ酶切得到的目的基因可以與圖(b)所示表達(dá)載體被Sau3AⅠ酶切后的產(chǎn)物連接。(2)在基因表達(dá)載體中,啟動(dòng)子應(yīng)位于目的基因的首端,終止子應(yīng)位于目的基因的尾端,這樣目的基因才能順利地轉(zhuǎn)錄,再完成翻譯過(guò)程。圖中甲所示的目的基因插入在啟動(dòng)子的上游,丙所示目的基因插入在終止子的下游,二者的目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄,因此目的基因不能表達(dá)。(3)常見的DNA連接酶有E·coli DNA連接酶和T4DNA連接酶,其中T4DNA連接酶既能連接黏性末端又能連接平末端。答案:(1)Sau3AⅠ 兩種酶切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端 (2)甲和丙 甲中目的基因插入在啟動(dòng)子的上游,丙中目的基因插入在終止子的下游,二者的目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄 (3)E·coli DNA連接酶 T4DNA連接酶 T4DNA連接酶[強(qiáng)知能·補(bǔ)欠缺](一)基因工程中兩種工具酶1.限制酶的特點(diǎn)與使用(1)限制酶具有特異性,即一種限制酶只能識(shí)別特定的核苷酸序列,并在特定的位點(diǎn)上進(jìn)行切割;限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已經(jīng)被修飾。(2)在獲取目的基因和切割載體時(shí)通常用同一種限制酶,以獲得相同的黏性末端。但如果用兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端相同,在DNA連接酶的作用下目的基因與載體也可以連接起來(lái)。(3)為了防止載體或目的基因的黏性末端自己連接即所謂“環(huán)化”,可用不同的限制酶分別處理含目的基因的DNA和載體,使目的基因兩側(cè)及載體上各自具有兩個(gè)不同的黏性末端。2.DNA連接酶種類 E·coli DNA連接酶 T4DNA連接酶來(lái)源 大腸桿菌 T4噬菌體特點(diǎn) 只縫合黏性末端 縫合黏性末端和平末端作用 恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵3.與DNA有關(guān)的酶的比較比較項(xiàng)目 限制酶 DNA連接酶 DNA聚合酶 解旋酶作用底物 DNA分子 DNA分子片段 脫氧核苷酸 DNA分子作用部位 磷酸二酯鍵 磷酸二酯鍵 磷酸二酯鍵 堿基對(duì)間的氫鍵形成產(chǎn)物 黏性末端或平末端 形成重組DNA分子 新的DNA分子 形成單鏈DNA(二)基因工程中的載體1.基因工程載體應(yīng)具備的條件(1)能在受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存,可使目的基因穩(wěn)定存在且數(shù)量可擴(kuò)大。(2)具有一個(gè)至多個(gè)限制酶切點(diǎn),可供外源DNA片段插入。(3)具有標(biāo)記基因,可供重組DNA的鑒定和選擇。2.基因工程載體與膜載體的區(qū)別基因工程中的載體是DNA分子,能將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞內(nèi),并利用它在宿主細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制;膜載體是蛋白質(zhì),與細(xì)胞膜的通透性有關(guān)。3.載體上標(biāo)記基因的標(biāo)記原理載體上的標(biāo)記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細(xì)胞沒(méi)有抵抗相關(guān)抗生素的能力。當(dāng)含有抗生素抗性基因的載體進(jìn)入受體細(xì)胞后,抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá),使受體細(xì)胞能夠抵抗相應(yīng)抗生素,所以在受體細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可以只保留轉(zhuǎn)入載體的受體細(xì)胞,原理如圖所示:[練題點(diǎn)·全過(guò)關(guān)]1.根據(jù)基因工程的有關(guān)知識(shí),回答下列問(wèn)題:(1)限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA分子后產(chǎn)生的片段,其末端類型有________和________。(2)質(zhì)粒載體用EcoRⅠ切割后產(chǎn)生的片段如下:AATTC……G G……CTTAA為使載體與目的基因相連,含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外,還可用另一種限制性核酸內(nèi)切酶切割,該酶必須具有的特點(diǎn)是______________________________________________________________________________。(3)反轉(zhuǎn)錄作用的模板是________,產(chǎn)物是________。若要在體外獲得大量反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,常采用________技術(shù)。(4)基因工程中除質(zhì)粒外,________和________也可作為載體。解析:(1)當(dāng)限制性核酸內(nèi)切酶在它識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開時(shí),產(chǎn)生的是黏性末端,而當(dāng)限制性核酸內(nèi)切酶在它識(shí)別序列的中心軸線處切開時(shí),產(chǎn)生的是平末端。(2)為使載體與目的基因相連,不同的限制性核酸內(nèi)切酶應(yīng)該切出相同的黏性末端。(3)反轉(zhuǎn)錄是指以RNA為模板在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成DNA的過(guò)程,可以在體外短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增DNA的技術(shù)叫PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。(4)基因工程中可以作為載體的除質(zhì)粒外,還有λ噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒等。答案:(1)黏性末端 平末端(2)切割產(chǎn)生的DNA片段末端與EcoRⅠ切割產(chǎn)生的相同(3)mRNA(或RNA) cDNA(或DNA) PCR(4)λ噬菌體的衍生物 動(dòng)植物病毒2.(2021年1月新高考8省聯(lián)考·福建卷,節(jié)選)閱讀下列材料,完成有關(guān)問(wèn)題。材料:在全球氣候變暖和水資源缺乏加劇的情況下,保障我國(guó)“糧食安全”問(wèn)題尤為重要。玉米是重要的糧食作物,其葉片細(xì)胞中的P蛋白是一種水通道蛋白,由P基因編碼,在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中對(duì)水分的吸收具有重要的調(diào)節(jié)功能。超量表達(dá)P蛋白轉(zhuǎn)基因玉米的獲得與鑒定在超量表達(dá)P基因載體的構(gòu)建中,所用DNA片段和Ti質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)如圖1所示;P蛋白在玉米株系的表達(dá)量如圖2所示。回答下列問(wèn)題:(1)強(qiáng)啟動(dòng)子是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段,能被____________識(shí)別并結(jié)合,驅(qū)動(dòng)基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄。為使P基因在玉米植株中超量表達(dá),應(yīng)優(yōu)先選用__________酶組合,將片段和Ti質(zhì)粒切開后構(gòu)建重組表達(dá)載體。T DNA在該實(shí)驗(yàn)中的作用是__________________________________________________________________________________________________。(2)將農(nóng)桿菌浸泡過(guò)的玉米愈傷組織進(jìn)行植物組織培養(yǎng),培養(yǎng)基中需加入__________進(jìn)行篩選,篩選出的愈傷組織________形成叢芽,最終獲得多個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米株系。(3)據(jù)圖2分析,選擇a1、a2、a3玉米株系,作為超量表達(dá)P蛋白轉(zhuǎn)基因玉米的生理特性研究的實(shí)驗(yàn)材料,理由是_______________________________________________________________________________________________________________________________。解析:(1)根據(jù)“驅(qū)動(dòng)基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄”可知,強(qiáng)啟動(dòng)子能被RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合。為使P基因在玉米植株中超量表達(dá),應(yīng)確保強(qiáng)啟動(dòng)子和P基因不被破壞,故應(yīng)優(yōu)先選用BamH Ⅰ和Sac Ⅰ酶組合,將片段和Ti質(zhì)粒切開后構(gòu)建重組表達(dá)載體。T DNA在該實(shí)驗(yàn)中的作用是將強(qiáng)啟動(dòng)子和P基因帶入玉米細(xì)胞并整合到玉米細(xì)胞的染色體DNA上。(2)由圖1可知,潮霉素抗性基因位于Ti質(zhì)粒的T DNA上,可以隨T DNA整合到玉米細(xì)胞的染色體上,故將農(nóng)桿菌浸泡過(guò)的玉米愈傷組織進(jìn)行植物組織培養(yǎng),培養(yǎng)基中需加入潮霉素進(jìn)行篩選,篩選出的愈傷組織可(再)分化形成叢芽,最終獲得多個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米株系。(3)據(jù)圖2分析,a1、a2、a3玉米株系的P蛋白表達(dá)量顯著高于野生型玉米,故可以選擇a1、a2、a3玉米株系,作為超量表達(dá)P蛋白轉(zhuǎn)基因玉米的生理特性研究的實(shí)驗(yàn)材料。答案:(1)RNA聚合酶 BamH Ⅰ和Sac Ⅰ 將強(qiáng)啟動(dòng)子和P基因帶入玉米細(xì)胞并整合到玉米細(xì)胞染色體DNA上 (2)潮霉素 (再)分化 (3)a1、a2、a3玉米株系的P蛋白表達(dá)量顯著高于野生型玉米二、基因工程的基本操作程序[試考題·查欠缺]1.(2021年1月新高考8省聯(lián)考·江蘇卷)啤酒生產(chǎn)需經(jīng)過(guò)制麥、糖化、發(fā)酵等主要環(huán)節(jié)。糖化主要是將麥芽中的淀粉等有機(jī)物水解為小分子的過(guò)程。主要工藝流程如下圖所示,請(qǐng)回答下列問(wèn)題:(1)大麥?zhǔn)瞧【瓢l(fā)酵的重要碳源,針對(duì)制麥及糖化步驟,下列說(shuō)法正確的有_________(填序號(hào))。①大麥萌發(fā)時(shí)僅產(chǎn)生淀粉酶,幾乎不產(chǎn)生蛋白酶②用赤霉素處理大麥,可誘導(dǎo)淀粉酶的合成③酵母不能直接利用淀粉,需要淀粉酶等將淀粉轉(zhuǎn)化成酵母可利用的糖④糖化采用的溫度越高,淀粉水解速度越快(2)啤酒發(fā)酵時(shí)具有活力的酵母需達(dá)到一定的數(shù)量,故在菌種活化的過(guò)程中,需定時(shí)取樣,檢測(cè)酵母的生長(zhǎng)狀況。若某次樣品經(jīng)2次10倍稀釋后,經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色(體積不計(jì)),在25×16型血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)_________色細(xì)胞,5個(gè)中格中的細(xì)胞數(shù)為244個(gè),該樣品中活酵母細(xì)胞的密度為_________個(gè)細(xì)胞/mL。(3)敲除釀酒酵母中的蛋白酶基因,減少發(fā)酵液中蛋白的水解,有助于增強(qiáng)啤酒泡沫的穩(wěn)定性,從而改善啤酒的品質(zhì)。以下是某科研小組的實(shí)驗(yàn):①已知編碼酵母蛋白酶A(PEP4)的基因序列如下(為非模板鏈):編碼該酶的mRNA,起始端的三個(gè)密碼子依次為______,終止密碼子為________。②Cas9蛋白可在人為設(shè)定的RNA序列(sgRNA)引導(dǎo)下,在選定位點(diǎn)切斷相應(yīng)的DNA鏈(如下圖),在DNA自我連接的修復(fù)過(guò)程中產(chǎn)生突變。DNA序列中含NGG的位點(diǎn)具有較高的編輯效率(N為任意堿基)。上述PEP4序列虛線框中有________處可作為Cas9的優(yōu)選剪切位點(diǎn)。Cas9的剪切位點(diǎn)在其NGG識(shí)別位點(diǎn)的________________(填“5′”或“3′”)側(cè)。③用酪蛋白固體培養(yǎng)基篩選突變體,野生型可以水解酪蛋白,在菌落周圍形成透明圈。需要篩選透明圈________的菌落,表明其蛋白酶活性__________。解析:(1)大麥萌發(fā)時(shí)會(huì)產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶等,①錯(cuò)誤;赤霉素處理大麥,可誘導(dǎo)淀粉酶的合成,促進(jìn)種子萌發(fā),②正確;酵母細(xì)胞呼吸的底物為葡萄糖,不能直接利用淀粉,需要淀粉酶等將淀粉轉(zhuǎn)化成酵母可利用的糖,③正確;酶的催化需要適宜的溫度,糖化采用的溫度過(guò)高,會(huì)影響酶的活性,使淀粉水解速度變慢,④錯(cuò)誤。(2)細(xì)胞膜具有選擇透過(guò)性,臺(tái)盼藍(lán)不能進(jìn)入活細(xì)胞,染色后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)對(duì)無(wú)色細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),若某次樣品經(jīng)2次10倍稀釋后,在25×16型血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù),5個(gè)中格中的細(xì)胞數(shù)為244個(gè),則該樣品中活酵母細(xì)胞的密度為244÷5×25÷0.1×102×103=1.22×109個(gè)/mL。(3)①已知編碼酵母蛋白酶A(PEP4)的基因序列為(為非模板鏈):5′ ATGTTCAGCTTCAAAGCATTATTGCCATTGGCCTTG TTGTGGTGAGCGCC……CAATTTGA 3′,模板鏈與非模板鏈方向相反,RNA 5′端為起始端,起始端的三個(gè)密碼子依次為AUG、UUC、AGC,終止密碼子為UGA。②DNA序列中含NGG的位點(diǎn)具有較高的編輯效率(N為任意堿基)。根據(jù)PEP4序列虛線框中的堿基序列,有4處可作為Cas9的優(yōu)選剪切位點(diǎn)。據(jù)圖可知,Cas9的剪切位點(diǎn)在其NGG識(shí)別位點(diǎn)的3′側(cè)。③敲除釀酒酵母中的蛋白酶基因,減少發(fā)酵液中蛋白的水解,有助于增強(qiáng)啤酒泡沫的穩(wěn)定性,從而改善啤酒的品質(zhì)。用酪蛋白固體培養(yǎng)基篩選突變體,野生型可以水解酪蛋白,在菌落周圍形成透明圈。因此需要篩選透明圈較小的菌落,表明其蛋白酶活性較低。答案:(1)②③ (2)無(wú) 1.22×109 (3)①AUC、UUC、ACC UGA ②4 3′ ③小 較低2.(2018·天津高考)甲型流感病毒為RNA病毒,易引起流感大規(guī)模流行。我國(guó)科學(xué)家在2017年發(fā)明了一種制備該病毒活疫苗的新方法,主要環(huán)節(jié)如下。(1)改造病毒的部分基因,使其失去在正常宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖能力。以病毒RNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄成對(duì)應(yīng)DNA后,利用________技術(shù)擴(kuò)增,并將其中某些基因(不包括表面抗原基因)內(nèi)個(gè)別編碼氨基酸的序列替換成編碼終止密碼子的序列。與改造前的基因相比,改造后的基因表達(dá)時(shí)不能合成完整長(zhǎng)度的________,因此不能產(chǎn)生子代病毒。將該改造基因、表面抗原等其他基因分別構(gòu)建重組質(zhì)粒,并保存。(2)構(gòu)建適合改造病毒增殖的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。設(shè)計(jì)合成一種特殊tRNA的基因,其產(chǎn)物的反密碼子能與(1)中的終止密碼子配對(duì)結(jié)合,并可攜帶一個(gè)非天然氨基酸(Uaa)。將該基因與________連接后導(dǎo)入宿主細(xì)胞。提取宿主細(xì)胞的________進(jìn)行分子雜交鑒定,篩選獲得成功表達(dá)上述tRNA的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。(3)利用轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞制備疫苗。將(1)中的重組質(zhì)粒導(dǎo)入(2)中的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞,并在補(bǔ)加______________的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),則該宿主細(xì)胞能利用上述特殊tRNA,翻譯出改造病毒基因的完整蛋白,產(chǎn)生大量子代病毒,用于制備疫苗。特殊tRNA基因轉(zhuǎn)錄時(shí),識(shí)別其啟動(dòng)子的酶是________(單選)。A.病毒的DNA聚合酶 B.宿主的DNA聚合酶C.病毒的RNA聚合酶 D.宿主的RNA聚合酶(4)上述子代病毒不能在正常宿主細(xì)胞中增殖,沒(méi)有致病性,因此不經(jīng)滅活或減毒即可制成疫苗。與不具侵染性的流感病毒滅活疫苗相比,該病毒活疫苗的優(yōu)勢(shì)之一是可引起________免疫,增強(qiáng)免疫保護(hù)效果。解析:(1)體外進(jìn)行DNA擴(kuò)增采用的技術(shù)手段是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))。將基因內(nèi)個(gè)別編碼氨基酸的序列改造成編碼終止密碼子的序列后,在翻譯時(shí)終止密碼子提前出現(xiàn),不能合成完整長(zhǎng)度的多肽(或蛋白質(zhì))。(2)為了使目的基因能夠在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并正常表達(dá),需要將目的基因與載體(運(yùn)載體)連接后導(dǎo)入受體細(xì)胞。利用分子雜交技術(shù),鑒定篩選獲得成功表達(dá)目的RNA的細(xì)胞時(shí),需提取宿主細(xì)胞的總RNA。(3)將(1)中的重組質(zhì)粒導(dǎo)入(2)中的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞,宿主細(xì)胞內(nèi)由于沒(méi)有Uaa,翻譯將會(huì)在終止密碼子處停止,將不能翻譯出改造病毒基因的完整蛋白,所以要想翻譯出完整蛋白,需要在培養(yǎng)基中加入U(xiǎn)aa。轉(zhuǎn)錄時(shí),識(shí)別啟動(dòng)子的酶為RNA聚合酶,因?yàn)檗D(zhuǎn)錄在宿主細(xì)胞中進(jìn)行,所以轉(zhuǎn)錄用的酶為宿主細(xì)胞的RNA聚合酶。(4)不具有感染性的滅活病毒不能進(jìn)入人體細(xì)胞內(nèi),只會(huì)引發(fā)體液免疫,而減毒的活疫苗雖然不能在人體細(xì)胞內(nèi)正常增殖,但可以侵入人體細(xì)胞,能引起人體產(chǎn)生細(xì)胞免疫,增強(qiáng)免疫保護(hù)效果。答案:(1)PCR 多肽(或蛋白質(zhì)) (2)載體 總RNA(3)非天然氨基酸(Uaa) D (4)細(xì)胞3.(2018·江蘇高考有改動(dòng))為生產(chǎn)具有特定性能的α 淀粉酶,研究人員從某種海洋細(xì)菌中克隆了α 淀粉酶基因(1 656個(gè)堿基對(duì)),利用基因工程大量制備α 淀粉酶,實(shí)驗(yàn)流程見下圖。請(qǐng)回答下列問(wèn)題:(1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增α 淀粉酶基因前,需先獲得細(xì)菌的________________。(2)為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接,需在引物的________端加上限制性酶切位點(diǎn),且常在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制性酶切位點(diǎn),主要目的是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí),反應(yīng)的溫度和時(shí)間需根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)定,下列選項(xiàng)中________的設(shè)定與引物有關(guān),________的設(shè)定與擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度有關(guān)。(填序號(hào))①變性溫度 ②退火溫度 ③延伸溫度 ④變性時(shí)間 ⑤退火時(shí)間 ⑥延伸時(shí)間(4)下圖表示篩選獲得的工程菌中編碼α 淀粉酶的mRNA 的部分堿基序列:圖中虛線框內(nèi)mRNA片段包含________個(gè)密碼子,如虛線框后的序列未知,預(yù)測(cè)虛線框后的第一個(gè)密碼子最多有________種。(5)獲得工程菌表達(dá)的α 淀粉酶后,為探究影響酶活性的因素,以濃度為1%的可溶性淀粉為底物測(cè)定酶活性,結(jié)果如下:緩沖液 50 mmol/L Na2HPO4 KH2PO4 50 mmol/L Tris HCl 50 mmol/L Gly NaOHpH 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 8.5 9.0 9.0 9.5 10.0 10.5酶相對(duì)活性% 25.4 40.2 49.8 63.2 70.1 95.5 99.5 85.3 68.1 63.7 41.5 20.8根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,初步判斷該α 淀粉酶活性最高的條件為________________________________________________________________________。解析:(1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增α 淀粉酶基因前,需先獲得細(xì)菌的基因組DNA作為模板,并依據(jù)α 淀粉酶基因兩端的部分核苷酸序列合成兩條引物。(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時(shí),只能從3′端延伸DNA子鏈,為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接,需在引物的5′端加上限制性酶切位點(diǎn),并且要注意在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制性酶切位點(diǎn),這樣既能防止目的基因、載體的自身連接,又能確保目的基因與表達(dá)載體的定向連接。(3)PCR技術(shù)包括變性、退火(復(fù)性)和延伸三步,變性溫度決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA的解鏈,且時(shí)間很短;退火時(shí)引物結(jié)合到互補(bǔ)的DNA單鏈上,退火溫度由引物復(fù)性溫度決定,其溫度設(shè)定與引物的長(zhǎng)度、堿基組成及濃度等有關(guān);延伸時(shí)間與產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度有關(guān),產(chǎn)物在1 kb以內(nèi)的延伸時(shí)間為1 min左右,3~4 kb的延伸時(shí)間為3~4 min。(4)圖中虛線框內(nèi)共含有24個(gè)堿基,mRNA上3個(gè)相鄰的堿基編碼1個(gè)氨基酸,故共包含8個(gè)密碼子。虛線框后的第1個(gè)密碼子的第1個(gè)堿基是U,第2和第3個(gè)堿基各有4種可能性,因此共有16種可能性。題干表明控制α 淀粉酶的基因有1 656個(gè)堿基對(duì),說(shuō)明圖中虛線框后的第一個(gè)密碼子肯定不是終止密碼子(3種終止密碼子為UAA、UAG、UGA),故虛線框后第一個(gè)密碼子實(shí)際最多有16-3=13(種)可能性。(5)分析表格中的數(shù)據(jù),酶相對(duì)活性最高為99.5%,對(duì)應(yīng)的條件是pH為8.5,緩沖液為50 mmol/L Tris HCl。答案:(1)基因組DNA (2)5′ 使DNA片段能定向插入表達(dá)載體,減少自連 (3)② ⑥ (4)8 13(5)pH為8.5,緩沖液為50 mmol/L Tris HCl[強(qiáng)知能·補(bǔ)欠缺]1.獲取目的基因的方法(1)幾種獲取目的基因方法的比較(2)詮釋PCR技術(shù)①PCR原理:DNA復(fù)制原理,即:②PCR反應(yīng)過(guò)程過(guò)程 說(shuō)明 圖解變性 溫度上升到90 ℃左右,雙鏈DNA解聚為單鏈復(fù)性 溫度下降到55 ℃左右,兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合延伸 溫度上升到72 ℃左右,Taq酶從引物起始合成互補(bǔ)鏈,可使新鏈由5′端向3′端延伸③結(jié)果:上述三步反應(yīng)完成后,一個(gè)DNA分子就變成了兩個(gè)DNA分子,隨著重復(fù)次數(shù)的增多,DNA分子以2n的形式增加。PCR的反應(yīng)過(guò)程都是在PCR擴(kuò)增儀中完成的。2.基因表達(dá)載體的組成目的基因 能夠控制特定性狀啟動(dòng)子 RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位,驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄終止子 RNA聚合酶脫離部位,終止轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因 鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞生物種類 植物 動(dòng)物 微生物常用方法 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 顯微注射技術(shù) 感受態(tài)細(xì)胞法受體細(xì)胞 體細(xì)胞或受精卵 受精卵 原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程 將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T DNA上→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上→表達(dá) 將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物 Ca2+處理細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→重組表達(dá)載體DNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子4.目的基因檢測(cè)與鑒定的方法[練題點(diǎn)·全過(guò)關(guān)]1.為生產(chǎn)高效價(jià)疫苗和簡(jiǎn)化計(jì)劃免疫程序,科學(xué)家研制出基因工程乙肝-百白破(rHBDTP)四聯(lián)疫苗,經(jīng)各項(xiàng)檢測(cè)均符合rHBDTP四聯(lián)疫苗制檢規(guī)程的要求。其有效成分是乙肝病毒表面抗原、百日咳桿菌、白喉?xiàng)U菌和破傷風(fēng)桿菌的四種類毒素。請(qǐng)分析回答下列問(wèn)題:(1)為獲取百日咳桿菌類毒素的基因,可從百日咳桿菌的細(xì)胞中提取對(duì)應(yīng)________,在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成雙鏈cDNA片段,獲得的cDNA片段與百日咳桿菌中該基因堿基序列________(填“相同”或“不同”)。(2)由于乙肝病毒表面抗原的基因序列比較小,且序列已知,獲得目的基因可采用__________________,然后通過(guò)________大量擴(kuò)增,此技術(shù)的前提是已知一段目的基因的核苷酸序列以便合成引物。(3)把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞時(shí),科學(xué)家采用了改造后的腺病毒作為載體,寫出選它的理由:________________________________________________(寫出2點(diǎn))。(4)研究發(fā)現(xiàn),如果將白喉?xiàng)U菌類毒素20位和24位的氨基酸改變?yōu)榘腚装彼幔庖咝Ч茫?qǐng)寫出此種技術(shù)的基本流程:__________________________________________________________________________________________________________________。(5)實(shí)驗(yàn)證明,一定時(shí)間內(nèi)間隔注射該疫苗3次效果更好,其主要原因是體內(nèi)產(chǎn)生的_________數(shù)量增多,當(dāng)同種抗原再次侵入人體時(shí)會(huì)引發(fā)二次免疫,二次免疫的特點(diǎn)是________________,免疫預(yù)防作用更強(qiáng)。解析:(1)為獲取百日咳桿菌類毒素的基因,可從百日咳桿菌的細(xì)胞中提取對(duì)應(yīng)mRNA,在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成雙鏈cDNA片段,獲得的cDNA片段與百日咳桿菌中該基因堿基序列不同。(2)由于乙肝病毒表面抗原的基因序列比較小,且序列已知,獲得目的基因可采用化學(xué)方法人工合成,然后通過(guò)PCR技術(shù)大量擴(kuò)增。(3)改造后的腺病毒有多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)、有標(biāo)記基因,且能自主復(fù)制,因此可作為載體將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞。(4)將白喉?xiàng)U菌類毒素20位和24位的氨基酸改變?yōu)榘腚装彼崂玫氖堑鞍踪|(zhì)工程的原理,基本流程:從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)→設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列→找到相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列。(5)實(shí)驗(yàn)證明,一定時(shí)間內(nèi)間隔注射該疫苗3次效果更好,其主要原因是體內(nèi)產(chǎn)生的記憶細(xì)胞數(shù)量增多,當(dāng)同種抗原再次侵入人體時(shí)會(huì)引發(fā)二次免疫,二次免疫的特點(diǎn)是短時(shí)間內(nèi)迅速產(chǎn)生大量的抗體和記憶細(xì)胞,免疫預(yù)防作用更強(qiáng)。答案:(1)mRNA 不同 (2)化學(xué)方法人工合成 PCR技術(shù) (3)能自主復(fù)制;有多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)、有標(biāo)記基因 (4)從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)→設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列→找到相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列(基因) (5)記憶細(xì)胞 短時(shí)間內(nèi)迅速產(chǎn)生大量的抗體和記憶細(xì)胞2.(2020·北京高考)枯草芽孢桿菌可分泌纖維素酶。研究者篩選到一株降解纖維素能力較強(qiáng)的枯草芽孢桿菌菌株(B菌),從中克隆得到了一種纖維素酶(C1酶)基因。將獲得的C1酶基因與高效表達(dá)載體(HT質(zhì)粒)連接,再導(dǎo)入B菌,以期獲得降解纖維素能力更強(qiáng)的工程菌。(1)纖維素屬于________糖,因此經(jīng)過(guò)一系列酶催化最終可降解成單糖,該單糖是____________。(2)對(duì)克隆得到的C1酶基因測(cè)序,與數(shù)據(jù)庫(kù)中的C1酶基因編碼序列相比有兩個(gè)堿基對(duì)不同,但兩者編碼出的蛋白質(zhì)的氨基酸序列相同,這是因?yàn)開_______________________________________________________________________。(3)C1酶基因以B鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈,轉(zhuǎn)錄時(shí)mRNA自身的延伸方向?yàn)?′→3′。為了使C1酶基因按照正確的方向與已被酶切的HT質(zhì)粒連接,克隆C1酶基因時(shí)在其兩端添加了SmaⅠ和BamHⅠ的酶切位點(diǎn)。該基因內(nèi)部沒(méi)有這兩種酶切位點(diǎn)。圖1中酶切位點(diǎn)1和2所對(duì)應(yīng)的酶分別是____________________________。(4)將纖維素含量為20%的培養(yǎng)基分為三組,一組接種工程菌,對(duì)照組1不進(jìn)行處理,對(duì)照組2進(jìn)行相應(yīng)處理。在相同條件下培養(yǎng)96小時(shí),檢測(cè)培養(yǎng)基中纖維素的含量。結(jié)果(圖2)說(shuō)明工程菌降解纖維素的能力最強(qiáng)。對(duì)照組2的處理應(yīng)為_____________________________________________________________________。(5)預(yù)期該工程菌在處理廢棄物以保護(hù)環(huán)境方面可能的應(yīng)用。(舉一例)解析:(1)纖維素是由葡萄糖聚合形成的多糖,所以纖維素經(jīng)過(guò)酶的催化作用可降解為葡萄糖。(2)一種氨基酸具有兩個(gè)或更多個(gè)密碼子的現(xiàn)象稱為密碼子的簡(jiǎn)并性。由于密碼子具有簡(jiǎn)并性,即使克隆得到的C1酶基因序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的C1酶基因編碼序列相比有兩個(gè)堿基對(duì)不同,但兩者編碼出的蛋白質(zhì)的氨基酸序列仍相同。(3)根據(jù)題干信息,C1酶基因以B鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈,轉(zhuǎn)錄時(shí)mRNA自身的延伸方向?yàn)?′→3′,根據(jù)質(zhì)粒上啟動(dòng)子的方向可判斷酶切位點(diǎn)1對(duì)應(yīng)的酶為BamHⅠ,而酶切位點(diǎn)2對(duì)應(yīng)的酶為SmaⅠ。(4)比較圖2中三組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,工程菌降解纖維素的能力最強(qiáng),對(duì)照組2次之,對(duì)照組1中纖維素含量最高,由此判斷,對(duì)照組2接種了降解纖維素能力較強(qiáng)的枯草芽孢桿菌(B菌)。(5)該工程菌可以高效降解纖維素,所以可以用該工程菌降解秸稈,以減少秸稈燃燒帶來(lái)的環(huán)境污染。答案:(1)多 葡萄糖 (2)密碼子具有簡(jiǎn)并性 (3)BamHⅠ、Sma Ⅰ(順序不能調(diào)換) (4)接種降解纖維素能力較強(qiáng)的枯草芽孢桿菌(B菌) (5)降解秸稈,減少秸稈燃燒帶來(lái)的環(huán)境污染。三、基因工程的應(yīng)用與蛋白質(zhì)工程[試考題·查欠缺]1.(2018·全國(guó)卷Ⅰ)回答下列問(wèn)題:(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)。該研究除證明了質(zhì)粒可以作為載體外,還證明了________________________________________________________________________________________________________________________________________________(答出兩點(diǎn)即可)。(2)體外重組的質(zhì)粒可通過(guò)Ca2+參與的________方法導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞;而體外重組的噬菌體DNA通常需與______________組裝成完整噬菌體后,才能通過(guò)侵染的方法將重組的噬菌體DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞。在細(xì)菌、心肌細(xì)胞、葉肉細(xì)胞中,可作為重組噬菌體宿主細(xì)胞的是________。(3)真核生物基因(目的基因)在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí),表達(dá)出的蛋白質(zhì)可能會(huì)被降解。為防止蛋白質(zhì)被降解,在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選用__________________的大腸桿菌作為受體細(xì)胞,在蛋白質(zhì)純化的過(guò)程中應(yīng)添加________的抑制劑。解析:(1)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導(dǎo)入大腸桿菌中,該過(guò)程利用的技術(shù)是轉(zhuǎn)基因技術(shù)。該研究除了證明質(zhì)粒可作為載體外,還證明了體外重組的質(zhì)粒可以進(jìn)入受體細(xì)胞,真核生物的基因可在原核細(xì)胞中表達(dá)等。(2)重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞可采用Ca2+參與的轉(zhuǎn)化方法;體外重組噬菌體要通過(guò)將體外重組的噬菌體DNA和外殼蛋白(或噬菌體蛋白)進(jìn)行組裝獲得;因?yàn)槭删w是專門寄生在細(xì)菌中的病毒,所以宿主細(xì)胞選用細(xì)菌。(3)為防止蛋白質(zhì)被降解,在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選用蛋白酶缺陷型的大腸桿菌作為受體細(xì)胞;在蛋白質(zhì)純化過(guò)程中,為防止目的蛋白質(zhì)被降解,需要添加蛋白酶的抑制劑。答案:(1)體外重組的質(zhì)粒可以進(jìn)入受體細(xì)胞;真核生物基因可在原核細(xì)胞中表達(dá) (2)轉(zhuǎn)化 外殼蛋白(或答噬菌體蛋白) 細(xì)菌 (3)蛋白酶缺陷型 蛋白酶2.(2019·海南高考)人的T細(xì)胞可以產(chǎn)生某種具有臨床價(jià)值的蛋白質(zhì)(Y),該蛋白質(zhì)由一條多肽鏈組成。目前可以利用現(xiàn)代生物技術(shù)生產(chǎn)Y。回答下列問(wèn)題。(1)若要獲得Y的基因,可從人的T細(xì)胞中提取________作為模板,在________催化下合成cDNA,再利用______技術(shù)在體外擴(kuò)增獲得大量Y的基因。(2)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。若將上述所得Y的基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的________中,得到含目的基因的重組Ti質(zhì)粒,則可用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將該基因?qū)肽撤N植物的葉肉細(xì)胞中。若該葉肉細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)、篩選等得到了能穩(wěn)定表達(dá)Y的愈傷組織,則說(shuō)明Y的基因已經(jīng)_______________________________________________________________________________________________________________________________。(3)天然的Y通常需要在低溫條件下保存。假設(shè)將Y的第6位氨基酸甲改變?yōu)榘被嵋铱商岣咂錈岱€(wěn)定性,若要根據(jù)蛋白質(zhì)工程的原理對(duì)Y進(jìn)行改造以提高其熱穩(wěn)定性,具體思路是________________________________________________________________________。解析:(1)由于人的T細(xì)胞可以產(chǎn)生蛋白質(zhì)Y,要獲得Y的基因,可從人的T細(xì)胞中提取mRNA作為模板,在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下,利用四種游離的脫氧核苷酸合成cDNA,再利用PCR技術(shù)在體外擴(kuò)增獲得大量Y的基因。(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中,T DNA可以攜帶目的基因轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞,并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上,故需要將Y的基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T DNA中得到含目的基因的重組Ti質(zhì)粒,把含目的基因的重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入到農(nóng)桿菌中,再讓含目的基因的農(nóng)桿菌侵染植物的葉肉細(xì)胞。若該葉肉細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)、篩選等得到了能穩(wěn)定表達(dá)Y的愈傷組織,則說(shuō)明Y的基因已經(jīng)整合到葉肉細(xì)胞染色體DNA上。(3)蛋白質(zhì)工程需要從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā),設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),推出相應(yīng)的氨基酸序列,找到相應(yīng)的脫氧核苷酸序列,故對(duì)Y進(jìn)行改造以提高其熱穩(wěn)定性,需要找到第6位氨基酸中的堿基所在的基因位置,參照密碼子表,將第6位氨基酸甲的堿基替換為氨基酸乙的堿基。答案:(1)mRNA 逆轉(zhuǎn)錄酶 PCR (2)T DNA 整合到葉肉細(xì)胞染色體DNA上 (3)找到第6位氨基酸中的堿基所在的基因位置,參照密碼子表,將第6位氨基酸甲的堿基替換為氨基酸乙的堿基3.(2020·山東等級(jí)考)水稻胚乳中含直鏈淀粉和支鏈淀粉,直鏈淀粉所占比例越小糯性越強(qiáng)。科研人員將能表達(dá)出基因編輯系統(tǒng)的DNA序列轉(zhuǎn)入水稻,實(shí)現(xiàn)了對(duì)直鏈淀粉合成酶基因(Wx基因)啟動(dòng)子序列的定點(diǎn)編輯,從而獲得了3個(gè)突變品系。(1)將能表達(dá)出基因編輯系統(tǒng)的DNA序列插入Ti質(zhì)粒構(gòu)建重組載體時(shí),所需的酶是________________________,重組載體進(jìn)入水稻細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程稱為________。(2)根據(jù)啟動(dòng)子的作用推測(cè),Wx基因啟動(dòng)子序列的改變影響了__________________________,從而改變了Wx基因的轉(zhuǎn)錄水平。與野生型水稻相比,3個(gè)突變品系中Wx基因控制合成的直鏈淀粉合成酶的氨基酸序列__________(填“發(fā)生”或“不發(fā)生”)改變,原因是__________________________________________________________________________________。(3)為檢測(cè)啟動(dòng)子變化對(duì)Wx基因表達(dá)的影響,科研人員需要檢測(cè)Wx基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA(Wx mRNA)的量。檢測(cè)時(shí)分別提取各品系胚乳中的總RNA,經(jīng)________________過(guò)程獲得總cDNA。通過(guò)PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性地?cái)U(kuò)增出Wx基因的cDNA,原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)各品系Wx mRNA量的檢測(cè)結(jié)果如圖所示,據(jù)圖推測(cè)糯性最強(qiáng)的品系為________,原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。解析:(1)限制性核酸內(nèi)切酶能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列,并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開;DNA連接酶能將DNA片段拼接起來(lái)。將能表達(dá)出基因編輯系統(tǒng)的DNA序列插入Ti質(zhì)粒構(gòu)建重組載體時(shí),需要限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶的參與。轉(zhuǎn)化是指目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi),并在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。(2)啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位,能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。Wx基因啟動(dòng)子序列的改變影響了RNA聚合酶與啟動(dòng)子的識(shí)別和結(jié)合,從而改變了Wx基因的轉(zhuǎn)錄水平,使直鏈淀粉合成酶基因的表達(dá)量改變。根據(jù)題干信息可知,基因編輯系統(tǒng)是對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行定點(diǎn)編輯,由于編碼直鏈淀粉合成酶的堿基序列中不含啟動(dòng)子,所以與野生型水稻相比,3個(gè)突變品系中Wx基因控制合成的直鏈淀粉合成酶的氨基酸序列沒(méi)有發(fā)生變化。(3)用提取的各品系胚乳中的總RNA合成總cDNA的過(guò)程為逆轉(zhuǎn)錄(或反轉(zhuǎn)錄),需要逆轉(zhuǎn)錄酶的參與。由于引物能與Wx基因的cDNA特異性結(jié)合,故通過(guò)PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性地?cái)U(kuò)增出Wx基因的cDNA。(4)mRNA是蛋白質(zhì)合成的直接模板,根據(jù)題圖分析可知,3個(gè)突變品系中品系3的Wx mRNA量最低,控制合成的直鏈淀粉合成酶最少,直鏈淀粉合成量最少,糯性最強(qiáng)。答案:(1)限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶 轉(zhuǎn)化 (2)RNA聚合酶與啟動(dòng)子的識(shí)別和結(jié)合 不發(fā)生 編碼直鏈淀粉合成酶的堿基序列中不含啟動(dòng)子 (3)逆轉(zhuǎn)錄(或反轉(zhuǎn)錄) 引物是根據(jù)Wx基因的一段已知序列設(shè)計(jì)合成的(或引物能與Wx基因的cDNA特異性結(jié)合) (4)品系3 品系3的Wx mRNA最少,控制合成的直鏈淀粉合成酶最少,直鏈淀粉合成量最少,糯性最強(qiáng)[強(qiáng)知能·補(bǔ)欠缺]1.基因工程的應(yīng)用(1)動(dòng)物基因工程:用于提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度從而提高產(chǎn)品產(chǎn)量;用于改善畜產(chǎn)品品質(zhì);用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物;用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作器官移植的供體等。(2)植物基因工程:培育抗蟲轉(zhuǎn)基因植物、抗病轉(zhuǎn)基因植物和抗逆轉(zhuǎn)基因植物;利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)。(3)比較基因治療與基因診斷原理 操作過(guò)程 進(jìn)展基因治療 基因表達(dá) 利用正常基因?qū)胗谢蛉毕莸募?xì)胞中,以表達(dá)出正常性狀來(lái)治療(疾病) 臨床實(shí)驗(yàn)基因診斷 堿基互補(bǔ)配對(duì) 制作特定DNA探針與病人樣品DNA混合,分析雜交帶情況 臨床應(yīng)用2.蛋白質(zhì)工程(1)流程圖(2)結(jié)果:改造了現(xiàn)有蛋白質(zhì)或制造出新的蛋白質(zhì)。(3)應(yīng)用:主要集中應(yīng)用于對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造,改良生物性狀。3.蛋白質(zhì)工程與基因工程的關(guān)系蛋白質(zhì)工程 基因工程區(qū) 別 過(guò)程 預(yù)期蛋白質(zhì)功能→設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列→找到相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列 獲取目的基因→構(gòu)建基因表達(dá)載體→將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞→目的基因的檢測(cè)與鑒定實(shí)質(zhì) 定向改造或生產(chǎn)人類所需的蛋白質(zhì) 定向改造生物的遺傳特性,以獲得人類所需的類型或生物產(chǎn)品結(jié)果 可生產(chǎn)自然界沒(méi)有的蛋白質(zhì) 只能生產(chǎn)自然界已有的蛋白質(zhì)聯(lián)系 ①蛋白質(zhì)工程是在基因工程基礎(chǔ)上延伸出來(lái)的第二代基因工程 ②基因工程中所利用的某些酶需要通過(guò)蛋白質(zhì)工程進(jìn)行修飾、改造[練題點(diǎn)·全過(guò)關(guān)]1.通過(guò)DNA重組技術(shù)使原有基因得以改造的動(dòng)物稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。運(yùn)用這一技術(shù)使羊奶中含有人體蛋白質(zhì)。下圖表示了這一技術(shù)的基本過(guò)程,在該工程中所用的基因“手術(shù)刀”能識(shí)別的序列和切點(diǎn)是,請(qǐng)回答下列問(wèn)題:(1)從羊染色體中“切下”羊蛋白質(zhì)基因的酶是________,人體蛋白質(zhì)基因“插入”后連接在羊體細(xì)胞染色體中時(shí)需要的酶是____________等。(2)請(qǐng)寫出質(zhì)粒被切割形成黏性末端的過(guò)程。(3)人體蛋白質(zhì)基因之所以能“插入”到羊的染色體內(nèi),原因是____________________________________,“插入”時(shí)用的工具是________,其種類有________________________________________________________________________等。解析:(1)限制酶可以識(shí)別并切割特定的脫氧核苷酸序列,可用于從羊染色體中“切下”羊蛋白質(zhì)基因。“切下”的羊蛋白質(zhì)基因,使用DNA連接酶將其與載體縫合,然后“插入”到羊的染色體中。 (2)圖示的限制酶識(shí)別的序列為—GGATCC—,并且在G與G之間切開,因此形成的黏性末端為反向重復(fù)的,其過(guò)程見答案。(3)羊的染色體的主要成分是DNA和蛋白質(zhì),其中DNA上的基因與人體蛋白質(zhì)基因的結(jié)構(gòu)是相同的,因此人體蛋白質(zhì)基因能“插入”到羊的染色體內(nèi)。“插入”時(shí)用的工具是載體,其種類有質(zhì)粒、動(dòng)植物病毒、λ噬菌體的衍生物等。答案:(1)限制酶 DNA連接酶(2)(3)基因的結(jié)構(gòu)相同 載體 質(zhì)粒、動(dòng)植物病毒、λ噬菌體的衍生物2.(2019·江蘇高考)圖1是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過(guò)程示意圖,載體質(zhì)粒P0具有四環(huán)素抗性基因(Tetr)和氨芐青霉素抗性基因(AmpR)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題:(1)EcoR Ⅴ酶切位點(diǎn)為,EcoR Ⅴ酶切出來(lái)的線性載體P1為________末端。(2)用Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的目的基因片段,其兩端各自帶有一個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸。載體P1用酶處理,在兩端各添加了一個(gè)堿基為__________的脫氧核苷酸,形成P2;P2和目的基因片段在________酶作用下,形成重組質(zhì)粒P3。(3)為篩選出含有重組質(zhì)粒P3的菌落,采用含有不同抗生素的平板進(jìn)行篩選,得到A、B、C三類菌落,其生長(zhǎng)情況如表(“+”代表生長(zhǎng),“-”代表不生長(zhǎng))。根據(jù)表中結(jié)果判斷,應(yīng)選擇的菌落是________(填表中字母)類,另外兩類菌落質(zhì)粒導(dǎo)入情況分別是________________________、____________________________。平板類型 A B C無(wú)抗生素 + + +氨芐青霉素 + + -四環(huán)素 + - -氨芐青霉素+四環(huán)素 + - -(4)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒,擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖2所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置,PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇的一對(duì)引物是______。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對(duì)引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400 bp片段,原因是______________________________________________________________________________________________________________________________________。解析:(1)從圖中可以看出,EcoR Ⅴ酶切出來(lái)的載體質(zhì)粒為平末端。(2)從圖中可以看出,目的基因的兩端各有一個(gè)游離的腺嘌呤脫氧核苷酸,由于載體P1為平末端,所以載體P1的兩端應(yīng)該各添加一個(gè)胸腺嘧啶脫氧核苷酸,形成P2,這樣在DNA連接酶的作用下才能把目的基因和載體P2連接起來(lái)。(3)由題意可知,構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)四環(huán)素抗性基因被破壞,所以導(dǎo)入目的基因的菌落只能在沒(méi)有抗生素或含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中存活,應(yīng)該選B類菌落。A類菌落能在表中條件下存活,說(shuō)明導(dǎo)入的是P0質(zhì)粒。C類菌落只能在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中存活,說(shuō)明C類菌落沒(méi)有導(dǎo)入質(zhì)粒。(4)據(jù)圖分析,目的基因的外側(cè)鏈只能用丙作引物,內(nèi)側(cè)鏈可用甲、乙作引物,如果用甲、丙作引物,則無(wú)論目的基因是否插入正確,都能通過(guò)PCR擴(kuò)增大量目的基因,如果用乙、丙作為引物,當(dāng)目的基因插入不正確(反向插入)時(shí),則乙、丙兩引物都結(jié)合在外側(cè),PCR不能正常進(jìn)行,無(wú)法進(jìn)行擴(kuò)增鑒定,因此只能選用乙、丙作為引物,通過(guò)PCR鑒定目的基因是否插入正確。若擴(kuò)增出的DNA片段為400 bp,則正好是目的基因反向連接后,外側(cè)鏈用乙作引物,內(nèi)側(cè)鏈用甲作引物擴(kuò)增出的片段。答案:(1)平 (2)胸腺嘧啶(T) DNA連接 (3)B A類菌落含有P0 C類菌落未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒 (4)乙、丙 目的基因反向連接四、DNA的粗提取與鑒定[試考題·查欠缺]1.(2020·海南高考)下列關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述,錯(cuò)誤的是( )A.羊的成熟紅細(xì)胞可作為提取DNA的材料B.提取植物細(xì)胞的DNA時(shí),需要加入一定量的洗滌劑和食鹽C.預(yù)冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性,防止DNA水解D.在沸水浴條件下,DNA與二苯胺反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色解析:選A 羊是哺乳動(dòng)物,哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核,因此羊的成熟紅細(xì)胞不能作為提取DNA的材料,A錯(cuò)誤;提取植物細(xì)胞的DNA時(shí),需要加入一定量的洗滌劑和食鹽,洗滌劑的作用是溶解細(xì)胞膜,而食鹽的作用是溶解DNA,B正確;冷卻的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性,防止DNA水解,C正確;在沸水浴條件下,DNA與二苯胺反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色,D正確。2.(2019·江蘇高考)下列關(guān)于DNA粗提取與鑒定的敘述,錯(cuò)誤的是( )A.用同樣方法從等體積兔血和雞血中提取的DNA量相近B.DNA析出過(guò)程中,攪拌操作要輕柔以防DNA斷裂C.預(yù)冷的乙醇可用來(lái)進(jìn)一步純化粗提的DNAD.用二苯胺試劑鑒定DNA需要進(jìn)行水浴加熱解析:選A 哺乳動(dòng)物(如兔)成熟的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核和細(xì)胞器,細(xì)胞內(nèi)基本不含DNA,故兔血不宜作為該實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)材料,A錯(cuò)誤;DNA析出過(guò)程中,攪拌要輕柔且沿著一個(gè)方向,以防止DNA斷裂,B正確;DNA不溶于冷乙醇,向DNA提取液中加入適量預(yù)冷的乙醇溶液,會(huì)使DNA析出,從而進(jìn)一步提純DNA,C正確;向溶有DNA的溶液中加入二苯胺試劑,沸水浴加熱數(shù)分鐘,溶液出現(xiàn)藍(lán)色,D正確。[強(qiáng)知能·補(bǔ)欠缺]1.DNA與蛋白質(zhì)在物理、化學(xué)性質(zhì)方面的差異比較項(xiàng)目 DNA 蛋白質(zhì)溶解性 2 mol/L NaCl溶液中 溶解 析出0.14 mol/L NaCl溶液中 析出 溶解酒精溶液中 析出 溶解耐受性 蛋白酶 無(wú)影響 水解高溫 80 ℃以上變性 不能忍受60~80 ℃的高溫2.DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)中的“2、3、4”加蒸餾水2次 ①加到雞血細(xì)胞液中,使血細(xì)胞吸收水破裂; ②加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中,使NaCl溶液的物質(zhì)的量濃度下降到0.14 mol/L,使DNA析出用紗布過(guò)濾3次 ①過(guò)濾血細(xì)胞破裂液,得到含細(xì)胞核物質(zhì)的濾液; ②濾取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物); ③過(guò)濾溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液用NaCl溶液4次 ①加2 mol/L的NaCl溶液,溶解提取的細(xì)胞核物質(zhì); ②用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出; ③用2 mol/L的NaCl溶液,溶解濾取的DNA黏稠物; ④用2 mol/L的NaCl溶液,溶解絲狀物用于鑒定DNA3.DNA粗提取實(shí)驗(yàn)中的三個(gè)注意點(diǎn)(1)本實(shí)驗(yàn)不能用哺乳動(dòng)物成熟紅細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料,原因是哺乳動(dòng)物成熟紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核。(2)因DNA容易被玻璃容器吸附,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中最好使用塑料的燒杯和試管,減少提取過(guò)程中DNA的損失。(3)每次用玻璃棒攪拌時(shí)都要沿同一方向,防止打碎DNA分子。[練題點(diǎn)·全過(guò)關(guān)]1.關(guān)于還原糖、蛋白質(zhì)和DNA的鑒定實(shí)驗(yàn),下列敘述正確的是( )A.在甘蔗莖的組織樣液中加入雙縮脲試劑,溫水浴后液體由藍(lán)色變成磚紅色B.在大豆種子勻漿液中加入斐林試劑,液體由藍(lán)色變成紫色C.提取DNA時(shí),在切碎的洋蔥中加入適量洗滌劑和食鹽,充分研磨,過(guò)濾并棄去濾液D.將DNA粗提物溶解在2 mol/LNaCl溶液中,加入二苯胺試劑,沸水浴后液體由無(wú)色變成藍(lán)色解析:選D 甘蔗莖的組織樣液富含蔗糖,而蔗糖屬于非還原糖,且不能用斐林試劑檢測(cè),A錯(cuò)誤;大豆種子中富含蛋白質(zhì),先后加入雙縮脲試劑A液和B液搖勻后,液體由藍(lán)色變?yōu)樽仙珺錯(cuò)誤;提取DNA時(shí),在切碎的洋蔥中加入適量的洗滌劑和食鹽,充分研磨,過(guò)濾并棄去濾紙上的黏稠物,留下濾液,C錯(cuò)誤;將DNA粗提物溶解在2 mol/LNaCl溶液中,加入二苯胺試劑并水浴加熱,溶液由無(wú)色變?yōu)樗{(lán)色,D正確。2.在“DNA的粗提取與鑒定”的實(shí)驗(yàn)中,對(duì)DNA進(jìn)行鑒定時(shí),做如下操作: 步驟 A B1 加2 mol/L的NaCl溶液5 mL 加2 mol/L的NaCl溶液5 mL2 不加 加入提取的DNA絲狀物并攪拌3 加4 mL二苯胺,混勻 加4 mL二苯胺,混勻4 沸水浴5 min 沸水浴5 min實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)結(jié)論(1)根據(jù)如圖,完成表格空白處的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。(2)對(duì)于B試管,完成1、2、3的操作后溶液的顏色為______________________________________________________________________________________________。(3)在沸水浴中加熱的目的是____________________,同時(shí)說(shuō)明DNA對(duì)高溫有較強(qiáng)的__________________。(4)A試管在實(shí)驗(yàn)中的作用是____________。(5)B試管中溶液顏色的變化程度主要與________________________________________________________________________有關(guān)。答案:(1)溶液不變藍(lán)色 溶液變藍(lán)色 DNA在沸水浴的條件下遇二苯胺會(huì)變成藍(lán)色(2)基本不變(不呈藍(lán)色)(3)加快顏色反應(yīng)速度 耐受性 (4)對(duì)照(5)DNA(絲狀物)的多少科學(xué)探究——探討基因工程操作中限制酶的選擇方法1.根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點(diǎn)確定限制酶的種類(1)應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶,如圖甲可選擇PstⅠ。(2)不能選擇切點(diǎn)位于目的基因和標(biāo)記基因內(nèi)部的限制酶,如圖甲、乙不能選擇SmaⅠ。(3)為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒,如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點(diǎn))。2.根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類3.根據(jù)Ti質(zhì)粒的TDNA片段選擇限制酶圖中甲、乙、丁Ti質(zhì)粒均不宜選取,而丙Ti質(zhì)粒宜選取(設(shè)切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ),分析如下:[素養(yǎng)訓(xùn)練]1.(2021·泉州月考)圖甲、乙中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。據(jù)此判斷下列關(guān)于培育轉(zhuǎn)基因大腸桿菌的敘述,錯(cuò)誤的是( )A.若通過(guò)PCR技術(shù)提取該目的基因,應(yīng)該選用引物甲和引物丙B.圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建表達(dá)載體,應(yīng)選用BclⅠ和HindⅢ剪切C.若將基因表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞中,需選用感受態(tài)的大腸桿菌D.在受體細(xì)胞中,氨芐青霉素抗性基因和目的基因可同時(shí)表達(dá)解析:選D PCR技術(shù)要求兩種引物分別和目的基因的兩條單鏈結(jié)合,沿相反的方向合成子鏈,故所用的引物組成為圖乙中引物甲和引物丙,A正確;選擇的限制酶應(yīng)在目的基因兩端存在識(shí)別位點(diǎn),但BamHⅠ可能使質(zhì)粒中的啟動(dòng)子丟失,因此只能選BclⅠ和HindⅢ兩種限制酶切割,B正確;將目的基因?qū)胛⑸锎竽c桿菌細(xì)胞中,需要用Ca2+處理,使之成為感受態(tài)細(xì)胞,C正確;在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí),使用BclⅠ和HindⅢ兩種限制酶切割質(zhì)粒,氨芐青霉素抗性基因已被破壞,因此氨芐青霉素抗性基因在受體細(xì)胞中不能表達(dá),D錯(cuò)誤。2.人體內(nèi)的t PA蛋白能高效降解由纖維蛋白凝聚而成的血栓,是心梗和腦血栓的急救藥。然而,為心梗患者注射大劑量的基因工程t PA會(huì)誘發(fā)顱內(nèi)出血,其原因在于tPA與纖維蛋白結(jié)合的特異性不高。研究證實(shí),將tPA第84位的半胱氨酸換成絲氨酸,能顯著降低出血副作用。據(jù)此,先對(duì)天然的tPA基因進(jìn)行序列改造,然后再采取傳統(tǒng)的基因工程方法表達(dá)該改造后的基因,可制造出性能優(yōu)異的改良tPA蛋白(注:如圖表示相關(guān)的目的基因、載體、限制酶識(shí)別序列和切割位點(diǎn),pCLY11為質(zhì)粒,新霉素為抗生素)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題:(1)以上制造出性能優(yōu)異的改良tPA蛋白的過(guò)程被稱為____________工程。(2)已知人tPA基因序列已測(cè)出,且第84位半胱氨酸的模板鏈堿基序列為ACA,而絲氨酸的模板鏈堿基序列為AGA,因此要獲得改造后的目的基因最好采用____________________方法獲得。(3)若tPA改良基因的黏性末端如圖所示,那么需選用限制酶XmaⅠ和__________切開質(zhì)粒pCLY11,才能與tPA改良基因高效連接。在基因工程中,最核心的一步為________________________________。(4)一般選擇在未加入新霉素的培養(yǎng)基中生存的大腸桿菌作為受體細(xì)胞,目的是__________________________________________。在加入新霉素的培養(yǎng)基中形成菌落的受體細(xì)胞并非都是目的菌株,原因是______________________________________________,這時(shí)需選擇呈__________色的菌落,進(jìn)一步培養(yǎng)、檢測(cè)和鑒定,以選育出能生產(chǎn)改良tPA蛋白的工程菌株。解析:(1)在原有的tPA蛋白基礎(chǔ)上改良蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),屬于蛋白質(zhì)工程。(2)由于tPA蛋白基因的序列已知,因此可以使用化學(xué)方法人工合成的方法獲得目的基因。(3)目的基因的黏性末端圖中已經(jīng)給出,觀察各限制酶的識(shí)別序列可知所使用的限制酶為XmaⅠ和BglⅡ,要想把目的基因與載體拼接起來(lái)需要得到相同的黏性末端,因此載體也需要XmaⅠ和BglⅡ切割;基因工程中最核心的一個(gè)環(huán)節(jié)為基因表達(dá)載體的構(gòu)建。(4)選擇未加入新霉素的培養(yǎng)基中生存的大腸桿菌作為受體細(xì)胞,這些細(xì)胞沒(méi)有新霉素的抗性,當(dāng)其導(dǎo)入重組質(zhì)粒后,質(zhì)粒上的標(biāo)記基因使得大腸桿菌具有新霉素抗性,這樣可以選擇導(dǎo)入質(zhì)粒pCLY11的大腸桿菌;由于標(biāo)記基因存在于原有質(zhì)粒上,若未連目的基因的質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌中,這些大腸桿菌也可以獲得新霉素的抗性;而區(qū)分重組質(zhì)粒和原有質(zhì)粒的一個(gè)標(biāo)志可以觀察mlacZ基因的表達(dá)情況,由于重組質(zhì)粒拼接了目的基因,破壞了mlacZ基因,因此在重組質(zhì)粒中該基因不表達(dá),菌落呈現(xiàn)白色,而導(dǎo)入非重組質(zhì)粒的大腸桿菌由于該基因保存完整,可以表達(dá),所以菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。答案:(1)蛋白質(zhì) (2)化學(xué)方法人工合成 (3)BglⅡ 基因表達(dá)載體的構(gòu)建 (4)以便篩選出導(dǎo)入質(zhì)粒pCLY11的大腸桿菌 含有未連目的基因質(zhì)粒的大腸桿菌也可以在這種培養(yǎng)基上生長(zhǎng) 白一、對(duì)點(diǎn)練小題,落實(shí)主干知識(shí)1.如圖為DNA分子的某一片段,其中①②③分別表示某種酶的作用部位,則相應(yīng)的酶依次是( )A.限制酶、解旋酶、DNA連接酶B.解旋酶、限制酶、DNA連接酶C.解旋酶、DNA連接酶、限制酶D.限制酶、DNA連接酶、解旋酶解析:選B ①處為氫鍵,是解旋酶的作用部位;②處為磷酸二酯鍵,是限制酶的作用部位;③處為兩個(gè)DNA片段的缺口,是DNA連接酶的作用部位。2.如圖表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相關(guān)的酶作用位點(diǎn)。下列敘述錯(cuò)誤的是( )A.甲、乙、丙都屬于黏性末端B.甲、乙片段可形成重組DNA分子,但甲、丙不能C.DNA連接酶的作用位點(diǎn)在乙圖中b處D.切割甲的限制酶不能識(shí)別由甲、乙片段形成的重組DNA分子解析:選C 由圖可知,甲、乙、丙都屬于黏性末端,A正確;甲、乙的黏性末端相同,因此可在DNA連接酶的作用下形成重組DNA分子,但甲、丙的黏性末端不同,它們之間不能形成重組DNA分子,B正確;DNA連接酶將兩個(gè)DNA片段連接為一個(gè)DNA分子,作用部位是磷酸二酯鍵,C錯(cuò)誤;切割甲的限制酶的識(shí)別序列為:GAATTC∥CTTAAG,而甲、乙片段形成的重組DNA分子序列為:GAATTG∥CTTAAC,因此切割甲的限制酶不能識(shí)別由甲、乙片段形成的重組DNA分子,D正確。3.下列關(guān)于目的基因的檢測(cè)與鑒定的敘述,錯(cuò)誤的是( )A.目的基因在真核細(xì)胞中能否穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵是目的基因是否插入質(zhì)粒DNA中B.檢測(cè)受體細(xì)胞是否含有目的基因及其是否成功轉(zhuǎn)錄可使用PCR等技術(shù)C.目的基因表達(dá)的鑒定通常是在個(gè)體水平上進(jìn)行的D.如在受體細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì),可確定目的基因上游含有啟動(dòng)子解析:選A 目的基因在真核細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵是目的基因是否插入轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上,A錯(cuò)誤;通過(guò)抗原抗體雜交可以檢測(cè)目的基因是否翻譯成了蛋白質(zhì),檢測(cè)受體細(xì)胞是否含有目的基因及其是否成功轉(zhuǎn)錄可使用PCR等技術(shù),B正確;目的基因表達(dá)的鑒定通常是在個(gè)體水平上進(jìn)行的,如抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,C正確;如在受體細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì),可確定目的基因上游含有啟動(dòng)子,D正確。4.下列是“肝臟細(xì)胞DNA粗提取”實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)關(guān)鍵操作步驟,相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是( )A.步驟1中,加入檸檬酸鈉緩沖液的目的是維持pH的穩(wěn)定B.步驟1中,冰浴處理的主要原理是低溫下DNA酶容易變性C.步驟2中,異戊醇的作用可能是使與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)因變性而沉淀D.步驟2中,離心后應(yīng)取上清液,因?yàn)镈NA在2 mol/L NaCl溶液中溶解度比較大解析:選B 步驟1中,加入檸檬酸鈉緩沖液的目的是維持pH的穩(wěn)定,A正確;低溫不會(huì)使酶變性失活,只能降低酶的活性,B錯(cuò)誤;步驟2中,異戊醇的作用可能是使與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)因變性而沉淀,C正確;DNA在2 mol/L的NaCl溶液中的溶解度比較大,因此加固體NaCl使溶液濃度達(dá)到2 mol/L后再離心過(guò)濾取上清液,D正確。5.為了增加菊花花色類型,研究者從其他植物中克隆出花色基因C(圖1),擬將其與質(zhì)粒(圖2)重組,再借助農(nóng)桿菌導(dǎo)入菊花中。下列操作與實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟环氖? )A.用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒B.用含C基因的農(nóng)桿菌侵染菊花愈傷組織,將C基因?qū)爰?xì)胞C.在培養(yǎng)基中添加卡那霉素,篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細(xì)胞D.用分子雜交方法檢測(cè)C基因是否整合到菊花染色體上解析:選C 目的基因C和質(zhì)粒都有可被EcoRⅠ切割的酶切位點(diǎn),另外需要DNA連接酶將切好的目的基因和質(zhì)粒連接起來(lái);愈傷組織全能性較高,是理想的植物受體細(xì)胞,將目的基因?qū)胫参锸荏w細(xì)胞的方法通常為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法;質(zhì)粒中含有潮霉素抗性基因,因此選擇培養(yǎng)基中應(yīng)該加入潮霉素;使用分子雜交方法可檢測(cè)目的基因是否整合到受體染色體上。6.若要利用某目的基因(圖甲)和質(zhì)粒載體(圖乙)構(gòu)建重組DNA(圖丙),限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)分別是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理的是( )A.用EcoRⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體B.用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體C.用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體D.用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體解析:選D 根據(jù)題意并分析圖示可知,只有EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體,在構(gòu)建的重組DNA中,RNA聚合酶在插入目的基因上的移動(dòng)方向才與圖丙相同。二、系統(tǒng)練大題,強(qiáng)化科學(xué)思維7.科學(xué)家將擬南芥的抗寒基因(CBFl),轉(zhuǎn)入香蕉以獲得抗寒的香蕉品種。如圖是某質(zhì)粒載體上的SacⅠ、XbaⅠ、EcoRⅠ、Hind Ⅲ四種限制酶的切割位點(diǎn)示意圖。據(jù)圖回答問(wèn)題:(1)在該實(shí)驗(yàn)中為構(gòu)建基因表達(dá)載體,用SacⅠ、XbaⅠ切下CBFl基因后,對(duì)質(zhì)粒載體進(jìn)行切割的限制酶是________________,理由是________________________________________________________________________。(2)連接CBFl基因到該質(zhì)粒載體后,作為基因表達(dá)載體的組成還必須有__________________。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入香蕉細(xì)胞最常用的方法是__________________________。(3)為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有CBFl基因,可用含______________的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。(4)科學(xué)家將生長(zhǎng)健壯、苗齡一致的轉(zhuǎn)基因香蕉(實(shí)驗(yàn)組)與非轉(zhuǎn)基因香蕉(對(duì)照組)進(jìn)行______________處理,鑒定兩組之間的抗寒性差異,如果__________________________________,則說(shuō)明獲得了抗寒的香蕉優(yōu)質(zhì)品種。解析:(1)在基因工程中,用相同限制酶切割來(lái)源不同的DNA后,可產(chǎn)生相同的末端,所以和含目的基因的DNA一樣,質(zhì)粒也應(yīng)使用SacⅠ、XbaⅠ進(jìn)行切割。(2)基因表達(dá)載體的組成包括啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因、目的基因等。香蕉細(xì)胞是植物細(xì)胞,將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。(3)據(jù)圖分析可知,質(zhì)粒上的標(biāo)記基因是氨芐青霉素抗性基因,所以為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有CBFl基因,可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。(4)根據(jù)題干信息已知目的基因是抗寒基因,所以科學(xué)家將生長(zhǎng)健壯、苗齡一致的轉(zhuǎn)基因香蕉(實(shí)驗(yàn)組)與非轉(zhuǎn)基因香蕉(對(duì)照組)進(jìn)行低溫處理,鑒定兩組之間的抗寒性差異,如果實(shí)驗(yàn)組的抗寒能力明顯高于對(duì)照組,則說(shuō)明獲得了抗寒的香蕉優(yōu)質(zhì)品種。答案:(1)SacⅠ、XbaⅠ 用相同限制酶切割來(lái)源不同的DNA后,可產(chǎn)生相同的末端 (2)啟動(dòng)子和終止子 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 (3)氨芐青霉素 (4)低溫 實(shí)驗(yàn)組的抗寒能力明顯高于對(duì)照組8.某實(shí)驗(yàn)小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育耐鹽水稻,如圖1表示含有耐鹽基因的外源DNA分子,圖2表示質(zhì)粒,其上含有BamHⅠ、SmaⅠ和HindⅢ三種限制酶的酶切位點(diǎn)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題:(1)分析上圖可知,欲構(gòu)建重組DNA分子,應(yīng)選用________________兩種限制酶切割質(zhì)粒和外源DNA分子,使用兩種不同的限制酶切割含目的基因的外源DNA和質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)題(1)中不使用另外一種限制酶切割的原因是__________________,題(1)中構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒若用該酶切割能產(chǎn)生________種不同的DNA片段。(3)質(zhì)粒中抗性基因的作用是__________________。成功導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞(受體細(xì)胞本身不含四環(huán)素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因),不能在含______(填“氨芐青霉素”或“四環(huán)素”)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。(4)從個(gè)體水平上鑒定耐鹽基因是否成功表達(dá)的方法是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。解析:(1)外源DNA和質(zhì)粒上都含有限制酶BamHⅠ、HindⅢ和SmaⅠ的識(shí)別序列和切割位點(diǎn),但限制酶SmaⅠ的識(shí)別序列位于目的基因中,因此構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí),應(yīng)該選用限制酶BamHⅠ和HindⅢ切割質(zhì)粒和外源DNA分子;使用兩種不同的限制酶切割含目的基因的外源DNA和質(zhì)粒可防止質(zhì)粒和目的基因的自身環(huán)化及質(zhì)粒與目的基因的反向連接。(2)構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒含有3個(gè)限制酶SmaⅠ的識(shí)別序列和切割位點(diǎn),因此若用該酶切割構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒能產(chǎn)生3種不同的DNA片段。(3)質(zhì)粒中抗性基因的作用是篩選和鑒定目的基因;構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí),四環(huán)素抗性基因被破壞,但氨芐青霉素抗性基因沒(méi)有被破壞,因此成功導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞(受體細(xì)胞本身不含四環(huán)素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因),不能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。(4)從個(gè)體水平上鑒定耐鹽基因是否成功表達(dá)的方法是將轉(zhuǎn)基因水稻置于鹽堿地中培育(或用一定濃度的鹽水澆灌轉(zhuǎn)基因水稻),觀察其能否正常生長(zhǎng)。答案:(1)BamHⅠ和HindⅢ 防止質(zhì)粒和目的基因的自身環(huán)化及質(zhì)粒與目的基因的反向連接 (2)SmaⅠ會(huì)破壞目的基因 3 (3)篩選和鑒定目的基因 四環(huán)素 (4)將轉(zhuǎn)基因水稻置于鹽堿地中培育(或用一定濃度的鹽水澆灌轉(zhuǎn)基因水稻),觀察其能否正常生長(zhǎng)9.科學(xué)家通過(guò)利用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)改造Rubisco酶基因,提高了光合作用過(guò)程中Rubisco酶基因?qū)O2的親和力,從而顯著提高了植物的光合速率。請(qǐng)回答下列問(wèn)題:(1)PCR過(guò)程所依據(jù)的原理是______________,該過(guò)程需要加入的酶是________________。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根據(jù)這一序列合成________。(2)該技術(shù)不直接改造Rubisco酶,而是通過(guò)Rubisco酶基因進(jìn)行改造,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Rubisco酶的改造,其原因是______________________________。和傳統(tǒng)基因工程技術(shù)相比較,定點(diǎn)突變最突出的優(yōu)點(diǎn)是獲得的產(chǎn)物一般是自然界中________(填“存在的”或“不存在的”),PCR定點(diǎn)突變技術(shù)屬于________工程的范疇。解析:(1)PCR過(guò)程所依據(jù)的原理是DNA雙鏈復(fù)制,該過(guò)程需要加入的酶是耐高溫的DNA聚合酶。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根據(jù)這一序列合成引物。(2)該技術(shù)不直接改造Rubisco酶,而是通過(guò)對(duì)Rubisco酶基因進(jìn)行改造,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Rubisco酶的改造,其原因是蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜,改造困難。和傳統(tǒng)基因工程技術(shù)相比較,定點(diǎn)突變最突出的優(yōu)點(diǎn)是獲得的產(chǎn)物一般是自然界中不存在的,PCR定點(diǎn)突變技術(shù)屬于蛋白質(zhì)工程的范疇。答案:(1)DNA雙鏈復(fù)制 耐高溫的DNA聚合酶(或Taq酶) 引物 (2)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜,改造困難 不存在的 蛋白質(zhì)10.回答與利用生物技術(shù)培育抗病品種有關(guān)的問(wèn)題:(1)通過(guò)抗病性強(qiáng)的植株獲取抗病目的基因有多種方法。現(xiàn)已獲得純度高的抗病蛋白(可作為抗原),可通過(guò)______________技術(shù)獲得特異性探針,并將________中所有基因進(jìn)行表達(dá),然后利用該探針,找出能與探針特異性結(jié)合的表達(dá)產(chǎn)物,進(jìn)而獲得與之對(duì)應(yīng)的目的基因。(2)將上述抗病基因通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法導(dǎo)入植物的分生組織可獲得抗病性強(qiáng)的植株。若在試管苗期間用分子水平方法判斷抗病基因是否表達(dá),應(yīng)檢測(cè)________(A.質(zhì)粒載體 B.轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 C.抗性基因 D.病原微生物)。(3)植物細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中往往會(huì)發(fā)生________,可利用這一特性篩選抗致病真菌能力強(qiáng)的細(xì)胞。篩選時(shí)在培養(yǎng)基中加入________________,并將存活的細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)至再生植株。若利用________培養(yǎng)建立的細(xì)胞系用于篩選,則可快速獲得穩(wěn)定遺傳的抗病植株。(4)用抗病品種與高產(chǎn)品種進(jìn)行雜交育種過(guò)程中,有時(shí)會(huì)遇到因胚發(fā)育中止而得不到可育種子的情況。若要使該胚繼續(xù)發(fā)育獲得植株,可采用的方法是__________________。解析:(1)該特異性探針作用的對(duì)象是蛋白質(zhì)類抗原,所以該探針是抗體,可通過(guò)單克隆抗體技術(shù)獲得特異性探針。用基因文庫(kù)篩選某種目的基因的操作過(guò)程可以是先將基因文庫(kù)中所有基因進(jìn)行表達(dá),然后利用該探針,找出能與探針特異性結(jié)合的表達(dá)產(chǎn)物,進(jìn)而獲得與之對(duì)應(yīng)的目的基因。(2)用分子水平方法判斷抗病基因是否表達(dá),應(yīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。(3)植物細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中往往會(huì)發(fā)生變異,篩選抗致病真菌能力強(qiáng)的細(xì)胞時(shí)可在培養(yǎng)基中加入高濃度致病真菌,并將存活的細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)至再生植株。若要快速獲得穩(wěn)定遺傳的抗病植株,可用花粉離體培養(yǎng)建立的細(xì)胞系用于篩選。(4)若要使該胚繼續(xù)發(fā)育獲得植株,可采用的方法是胚的離體培養(yǎng)。答案:(1)單克隆抗體 基因文庫(kù) (2)B (3)變異 高濃度致病真菌 花粉離體 (4)胚的離體培養(yǎng)11.(2021年1月新高考8省聯(lián)考·湖北卷)某實(shí)驗(yàn)室需構(gòu)建含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)基因的表達(dá)載體用于科學(xué)研究。相關(guān)資料如下:(1)雙鏈DNA的每一條鏈有兩個(gè)末端,分別是5′端和3′端,從左到右的5′—3′DNA鏈?zhǔn)蔷幋a鏈,從左到右的3′—5′DNA鏈?zhǔn)悄0彐湣?br/>(2)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)在自然光下顯示綠色,已知該基因的DNA編碼序列如下:5′ATGGTGAGC……AAGTAA 3′。(3)質(zhì)粒載體中含有EcoRⅠ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ、Xba Ⅰ和Not Ⅰ等酶的酶切位點(diǎn)(這些酶各自的識(shí)別序列不同),如下圖所示。回答下列問(wèn)題:①增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)錄的mRNA堿基序列為________________________________________________________________________。②通過(guò)PCR方法獲得eGFP目的片段,首先需要設(shè)計(jì)________(填“一對(duì)”或“一個(gè)”)引物,在體外選擇性擴(kuò)增eGFP目的片段,PCR反應(yīng)一般由95 ℃熱變性、55~60 ℃引物和模板配對(duì)、72 ℃延伸三個(gè)步驟,經(jīng)過(guò)多次循環(huán)完成。延伸階段選用72 ℃是綜合考慮了兩個(gè)因素,這兩個(gè)因素是________________和________________。③eGFP的PCR產(chǎn)物兩端分別含有BamH Ⅰ和Not Ⅰ的酶切位點(diǎn),構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí),用這兩種酶酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體。與單一酶酶切相比,該實(shí)驗(yàn)采用的雙酶切方法的優(yōu)點(diǎn)是__________________________(答一點(diǎn)即可)。④將所構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌,涂布含有卡那霉素的平板,若表達(dá)載體構(gòu)建成功,可觀察到多個(gè)________單菌落。解析:①增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)的編碼序列為5′ATGGTGAGC……AAGTAA 3′,則模板鏈序列(3′—5′DNA鏈)應(yīng)為與之互補(bǔ)的另一條DNA鏈,故轉(zhuǎn)錄的mRNA堿基序列為5′AUGGUGAGC……AAGUAA 3′。②通過(guò)PCR方法獲得eGFP目的片段,需要兩種引物分別與兩條模板鏈結(jié)合,因此首先需要設(shè)計(jì)一對(duì)引物。延伸階段選用72 ℃是綜合考慮了兩個(gè)因素,一是防止DNA變性,二是保持Taq酶所需溫度條件。③與單一酶酶切相比,采用的雙酶切方法可以形成不同的黏性末端,防止目的基因與質(zhì)粒任意連接。④將所構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌,涂布含有卡那霉素的平板,若表達(dá)載體構(gòu)建成功,能表達(dá)出抗卡那霉素的物質(zhì)和綠色熒光,含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌能在該培養(yǎng)基上生存,因此可觀察到多個(gè)含有綠色熒光的大腸桿菌單菌落。答案:(1)5′AUGGUGAGC……AAGUAA 3′ (2)一對(duì) 防止DNA變性 保持Taq酶所需溫度條件 (3)防止目的基因與質(zhì)粒任意連接 (4)綠色熒光12.探針是指以放射性同位素、生物素或熒光染料等進(jìn)行標(biāo)記的已知核苷酸序列的核酸片段,可用于核酸分子雜交以檢測(cè)目標(biāo)核苷酸序列是否存在。圖1是某實(shí)驗(yàn)小組制備的兩種探針,圖2是探針與目的基因雜交的示意圖。請(qǐng)回答下列有關(guān)問(wèn)題:(1)核酸探針與目標(biāo)核苷酸序列間的分子雜交遵循__________________ 。設(shè)計(jì)核苷酸序列是核酸探針技術(shù)關(guān)鍵步驟之一,圖1所示的兩種核酸探針(探針2只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理,原因是探針1______________________,導(dǎo)致特異性差;而探針2____________________________,導(dǎo)致探針失效。(2)cDNA探針是目前應(yīng)用最為廣泛的一種探針。制備cDNA探針時(shí),首先需提取、分離獲得________作為模板,在________的催化下合成cDNA探針。利用制備好的β珠蛋白基因的cDNA探針與β珠蛋白基因雜交后,出現(xiàn)了如圖2中甲、乙、丙、丁等所示的“發(fā)夾結(jié)構(gòu)”,原因是______________________ 。(3)探針常用于基因工程的檢測(cè),如基因工程中利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)α 抗胰蛋白酶,應(yīng)將α 抗胰蛋白酶基因與______________________的啟動(dòng)子重組在一起,導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的________中,再利用SRY基因(Y染色體上的性別決定基因)探針進(jìn)行檢測(cè),將檢測(cè)反應(yīng)呈________(填“陽(yáng)”或“陰”)性的胚胎進(jìn)行移植培養(yǎng)。解析:(1)核酸探針是單鏈DNA分子,其與目標(biāo)核苷酸序列間的分子雜交遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。圖1中探針1堿基序列過(guò)短,特異性差;探針2自身折疊后會(huì)出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效,因此這兩種探針都不合理。(2)cDNA是以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄形成的,該過(guò)程需要逆轉(zhuǎn)錄酶的催化。逆轉(zhuǎn)錄法合成的cDNA不含內(nèi)含子,而β 珠蛋白基因中含有不表達(dá)序列,因此利用制備好的β 珠蛋白基因的cDNA探針與β 珠蛋白基因雜交后,出現(xiàn)了如圖2中甲、乙、丙、丁等所示的“發(fā)夾結(jié)構(gòu)”。(3)利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)α 抗胰蛋白酶時(shí),應(yīng)將α 抗胰蛋白酶基因與乳腺蛋白基因的啟動(dòng)子重組在一起,將構(gòu)建好的重組DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的受精卵中,再利用SRY探針進(jìn)行檢測(cè),將檢測(cè)反應(yīng)呈陰性(雌性)的胚胎進(jìn)行移植。答案:(1)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則 堿基序列過(guò)短 自身會(huì)出現(xiàn)部分堿基互補(bǔ)配對(duì) (2)mRNA 逆轉(zhuǎn)錄酶 β 珠蛋白基因中含有內(nèi)含子 (3)乳腺蛋白基因 受精卵 陰 展開更多...... 收起↑ 資源預(yù)覽 縮略圖、資源來(lái)源于二一教育資源庫(kù)