資源簡介

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高三生物二輪復習專題突破
專題八　生物技術與工程
&核心知識梳理
選擇性必修3 P5～6
1.某些種類的細菌會在營養缺乏或代謝產物積累的環境中形成沒有繁殖功能的休眠構造，稱為芽孢。
2.在固體培養基上采用劃線或稀釋涂布的方法接種，通過培養獲得由一個細胞分裂形成的、肉眼可見的、有一定形態構造的子細胞集團，這樣的細胞集團稱為單菌落。
3.通常人工種子包括體細胞胚、人工胚乳和人工種皮三部分。其最外層為有機的薄膜包裹(人工種皮)，中間含有體細胞胚萌發所需要的營養成分和植物激素(人工胚乳)，最里面是體細胞胚等。
選擇性必修3 P123
4.基因治療是指向有基因缺陷的細胞中引入正常功能的基因，以糾正或補償基因的缺陷，從而達到治療的目的。
1.下列是關于微生物的培養與培養基的相關敘述，請判斷正誤
(1)“細菌喜葷”，是說細菌培養基中要含有較高的有機氮。(√)
(2)利用LB液體培養基和LB固體培養基分別進行分離培養和擴大培養微生物。(×)
(3)配制培養基在制作棉塞時應使用脫脂棉，不能用普遍棉花。(×)
(4)用稀釋涂布平板法純化大腸桿菌時，只要稀釋度足夠高，就能在培養基表面形成單個菌落。(√)
(5)平板劃線法簡單并且可以用來計數，稀釋涂布平板法使單菌落更易分開，但操作復雜些。(×)
2.按照生物類型的不同，細胞工程可分為植物細胞工程和動物細胞工程等。請判斷下列有關細胞工程敘述的正誤：
(1)植物組織培養過程中，需要對外植體進行高壓蒸汽滅菌，以提供無菌的條件。(×)
(2)植物體細胞雜交就是利用一定的方法將去除細胞壁的不同來源的植物細胞融合為雜種細胞的過程。(×)
(3)取一定大小的莖尖進行培養，再生的植株有可能不帶病毒。(√)
(4)在酶解法降解植物細胞壁時，應在等滲溶液中進行，以防止原生質體失水死亡。(×)
(5)培養液中的海拉細胞，生長到表面相互接觸時，通常會停止分裂增殖，稱為接觸抑制。(×)
(6)動物細胞融合只能在同種生物的不同細胞間進行。(×)
(7)雜交瘤細胞不僅能分泌特異性抗體，而且還能無限增殖。(√)
(8)單克隆抗體具純度高、特異性強、靈敏度高且可大量制備的優點。(√)
3.判斷下列關于基因工程敘述的正誤：
(1)基因工程通過在分子水平對基因進行直接操控，打破常規育種難以突破的物種間的界限。(√)
(2)細菌自身DNA經過相應的化學修飾，因而不會被自身的限制酶破壞。(√)
(3)載體能與外源DNA相連接并將其送入受體細胞中進行擴增。(√)
(4)啟動子位于基因上游，有DNA聚合酶結合的位點，控制復制的開始。(×)
(5)不同組織細胞的cDNA文庫是不同的，同一組織細胞在不同的發育階段，cDNA文庫也會有差異。(√)
(6)電泳技術是分離、鑒定、純化核酸和蛋白質的常用方法。(√)
(7)鈣離子能增強細菌捕獲外源DNA的能力，使之成為感受態細胞。(√)
(8)觀察測定個體是否表現出目的基因控制的特定性狀并穩定遺傳，是判斷轉基因成功的直接證據。(√)
(9)核酸探針是帶有放射性或熒光標記的具有特定核苷酸序列的DNA。(×)
1.倒平板操作中，平板冷凝后，要將平板倒置，其主要原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
提示　防止冷凝后形成的水珠滴落在培養基上(污染培養基和破壞菌落)和防止培養基水分過快蒸發
2.某同學在通過發酵制作果酒時，發現在制作原料中添加一定量的糖，可以提高酒精度，原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
在家庭中以葡萄為原料制作葡萄酒時，可以不添加酵母菌，原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
提示　糖可以為酵母菌的生長、繁殖提供能源物質，還可以作為酒精發酵的原料　葡萄皮上附著有大量的不同種類的野生酵母菌
3.在進行植物組織培養的實驗時，要嚴格控制雜菌污染的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
提示　雜菌可以在培養基上生長并爭奪營養，雜菌產生的物質影響植物組織的生長
4.為確定轉基因抗鹽煙草是否培育成功，既要用放射性同位素標記的　　　　　　　　作探針進行分子雜交檢測，又要在個體水平上鑒定，后者的具體過程是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
提示　抗鹽基因(或目的基因)　將培育的煙草幼苗栽培于含有一定鹽的土壤中，觀察該煙草植株的生長狀態
1.(2022·浙江6月選考，23)下列關于菊花組織培養的敘述，正確的是(　　)
A.用自然生長的莖進行組培須用適宜濃度的乙醇和次氯酸鈉的混合液消毒
B.培養瓶用專用封口膜封口可防止外界雜菌侵入并阻止瓶內外的氣體交換
C.組培苗鍛煉時采用蛭石作為栽培基質的原因是蛭石帶菌量低且營養豐富
D.不帶葉片的菊花莖切段可以通過器官發生的途徑形成完整的菊花植株
答案　D
解析　自然生長莖段的消毒屬于外植體消毒，先用70%酒精，再用無菌水清洗，再用5%次氯酸鈉消毒處理，最后再用無菌水清洗，A錯誤；培養瓶用專用封口膜封口的目的是防止雜菌污染，并不影響氣體交換，B錯誤；組培苗鍛煉時采用蛭石作為栽培基質的原因是蛭石比較松軟，持水性也較好，有利于幼苗的生根和葉片的生長，C錯誤；不帶葉片的菊花莖的切段可通過植物組織培養分化出芽和根這種器官發生的途徑形成完整的菊花植株，D正確。
2.(2021·浙江6月選考，20)采用CRISPR/Cas9基因編輯技術可將增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因定點插入到受精卵的Y染色體上，獲得轉基因雄性小鼠。該轉基因小鼠與野生型雌性小鼠交配，通過觀察熒光可確定早期胚胎的性別。下列操作錯誤的是(　　)
A.基因編輯處理的受精卵在體外培養時，不同發育階段的胚胎需用不同成分的培養液
B.基因編輯處理的受精卵經體外培養至2細胞期，須將其植入同期發情小鼠的子宮，才可獲得表達EGFP的小鼠
C.分離能表達EGFP的胚胎干細胞，通過核移植等技術可獲得大量的轉基因小鼠
D.通過觀察早期胚胎的熒光，能表達EGFP的即為雄性小鼠胚胎
答案　B
解析　進行胚胎體外培養過程中，不同發育階段需要不同成分的培養液，其目的是促進細胞分化，以培養不同時期的胚胎，A正確；小鼠受精卵應在體外培養至桑葚胚，再植入同期發情小鼠的子宮，B錯誤；胚胎干細胞中均含有EGFP基因，分離能表達EGFP的胚胎干細胞，通過核移植等技術可獲得大量的轉基因小鼠，C正確；將增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因定點插入到受精卵的Y染色體上，能表達EGFP的胚胎均含Y染色體，即為雄性小鼠胚胎，D正確。
3.(2022·浙江6月選考，29)回答下列(一)、(二)小題：
(一)回答與產淀粉酶的枯草桿菌育種有關的問題：
(1)為快速分離產淀粉酶的枯草桿菌，可將土樣用________制成懸液，再將含有懸液的三角瓶置于80 ℃的________中保溫一段時間，其目的是________________________。
(2)為提高篩選效率，可將菌種的________過程與菌種的產酶性能測定一起進行：將上述懸液稀釋后涂布于淀粉為唯一碳源的固體培養基上培養，采用________顯色方法，根據透明圈與菌落直徑比值的大小，可粗略估計出菌株是否產酶及產酶性能。
(3)為了獲得高產淀粉酶的枯草桿菌，可利用現有菌種，通過________后再篩選獲得，或利用轉基因、________等技術獲得。
(二)回答與植物轉基因和植物克隆有關的問題：
(1)在用農桿菌侵染的方法進行植物轉基因過程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制________生長，二是篩選轉化細胞。當選擇培養基中抗生素濃度________時，通常會出現較多假陽性植株，因此在轉基因前需要對受體進行抗生素的________檢測。
(2)為提高培育轉基因植株的成功率，植物轉基因受體需具有較強的________能力和遺傳穩定性。對培養的受體細胞遺傳穩定性的早期檢測，可通過觀察細胞內________形態是否改變進行判斷，也可通過觀察分裂期染色體的________，分析染色體組型是否改變進行判斷。
(3)植物轉基因受體全能性表達程度的高低主要與受體的基因型、培養環境、繼代次數和________長短等有關。同時也與受體的取材有關，其中受體為________時全能性表達能力最高。
答案　(一)(1)無菌水　水浴　殺死不耐熱微生物　(2)分離　KI－I2　(3)人工誘變　原生質體融合
(二)(1)農桿菌　過低　敏感性　(2)再生　細胞核　形態特征和數量　(3)培養時間　受精卵
解析　(一)(1)產生淀粉酶的枯草桿菌的最適生長溫度為50～75 ℃，要快速分離枯草桿菌，先將土樣加入無菌水制成枯草桿菌懸液，再將含有懸液的三角瓶置于80 ℃的水浴中保溫一段時間，殺死不耐熱的微生物。(2)將菌種的分離過程與菌種的產酶性能測定同時進行可以提高篩選效率。用稀釋涂布平板法可以分離枯草桿菌，在培養基中添加淀粉作為唯一碳源，并且在培養基中添加KI－I2，能合成淀粉酶的枯草桿菌因為能利用淀粉而存活，同時淀粉由于被分解在菌落周圍會出現透明圈，比較透明圈與菌落直徑比值的大小，比值大的說明該菌株產酶性能較高。(3)要獲得高產淀粉酶的枯草桿菌，可利用誘變育種，由于變異的不定向性，人工誘變后還需要再篩選才能獲得高產淀粉酶的枯草桿菌。也可以利用轉基因、原生質體融合等技術，從其他生物那里獲得與高產淀粉酶有關的基因，進而獲得相應的高產性狀。
(二)(1)野生的農桿菌沒有抗性基因，用于轉化植物細胞的農桿菌一般在其T－DNA中插入一種抗生素抗性基因。抗生素的作用是抑制細菌生長，農桿菌屬于細菌，在其侵染植物過程中，可以用另一種抗生素抑制農桿菌的生長，從而達到在后續實驗中消除轉化植物細胞中農桿菌的作用。具有T－DNA中抗性基因的細胞能在含有相應抗生素的培養基上存活。當培養基中抗生素濃度過低時，很多沒有抗性的細胞也存活下來，因此出現假陽性，故在轉基因前要對受體進行抗生素的敏感性檢測。(2)轉基因植株要經過植物組織培育，要提高培育轉基因植株的成功率，應該選再生能力和遺傳穩定性較強的受體，這種受體全能性較高，能保持生物的性狀。對培養的受體細胞遺傳穩定性的早期檢測，可通過觀察細胞核形態是否改變進行判斷，也可以直接在光學顯微鏡下觀察分裂期染色體的形態特征和數量，分析染色體組型是否改變。(6)植物轉基因受體全能性表達程度高低除了與受體基因型、培養環境、繼代次數有關外，還與培養時間長短和受體的取材有關，受精卵是沒分化的細胞，分裂和分化能力都很強，故受體為受精卵時全能性表達能力最高。
微專題1　發酵工程
1.培養基相關考點盤點
　培養基一般采用高壓蒸汽滅菌，金屬器具一般采用灼燒滅菌，受熱易分解的尿素和易焦糊的葡萄糖等需用G6玻璃砂漏斗進行過濾除菌。
2.微生物與發酵工程相關考點盤點
3.分離與純化微生物的兩種方法
4.能分解尿素的微生物的分離與計數
考向1　考查無菌操作及單菌落分離技術
1.(真題重組)回答下列關于無菌操作和單菌落分離的相關問題：
(1)對培養基進行高壓蒸汽滅菌時，滅菌時間應從________________________時開始計時。對于不耐熱的液體培養基，一般可將其轉入G6玻璃砂漏斗中，采用________方式可較快地進行過濾除菌。(2018·浙江11月選考，32節選改編)
(2)[2017·浙江4月選考32(一)(1)]制作泡菜時，為縮短發酵周期，腌制前可加入乳酸菌。取少量酸奶，用無菌蒸餾水稀釋后，再用________蘸取少量的稀釋液，在MRS 乳酸菌專用培養基的平板上劃線，以獲得乳酸菌單菌落。下圖所示的劃線分離操作，正確的是________。
答案　(1)達到設定的溫度或壓力值　抽濾
(2)接種環　B
解析　(1)由于高壓蒸汽滅菌鍋的升溫升壓需要一定時間，而未達設定溫度和壓力將導致滅菌不徹底，因此對培養基進行高壓蒸汽滅菌時，滅菌時間應從達到設定的溫度或壓力值時開始計時。對于不耐熱的液體培養基，如尿素培養基，一般可將其轉入G6玻璃砂漏斗中過濾除菌，采用抽濾方式可加快過濾速度。(2)獲得單菌落時應在固體培養基平板上連續劃線如圖B所示。
考向2　考查微生物菌種的篩選與分離
2.[2018·浙江11月選考，32(一)(2)(3)]
(2)與釀造果醋相比，利用大米、高粱等富含淀粉的原料制醋，需增加________________的過程。某醋化醋桿菌培養基由蛋白胨、酵母提取物和甘露醇組成，其中甘露醇的主要作用是________。
(3)為篩選胞外α－淀粉酶分泌型菌種，一般從________(A.果園樹下　B.肉類加工廠周圍　C.米酒廠周圍　D.枯樹周圍)獲得土樣，用無菌水稀釋，涂布到含有淀粉的選擇培養基上培養，一段時間后在培養基表面滴加碘液，可在菌落周圍觀察到透明的水解圈。若要篩選酶活性較高的菌種，需挑選若干個________________比值大的菌落，分別利用液體培養基振蕩培養進行擴增。然后將培養液離心，取________用于檢測酶活性。
答案　(2)將淀粉分解成單糖　作為碳源
(3)C　水解圈直徑與菌落直徑　上清液
解析　(2)相比果醋制作中先利用葡萄糖進行酒精發酵，再進行醋酸發酵，以淀粉為原料制醋，需增加淀粉分解成單糖的過程。醋化醋桿菌培養基由蛋白胨、酵母提取物和甘露醇組成，其中甘露醇的主要作用是作為碳源。(3)結合生物具有適應性的規律，米酒廠周圍的淀粉量相對較多，因此存在可分泌α－淀粉酶的分泌型菌種。分泌的α－淀粉酶活性越高，數量越多，菌落周圍的透明水解圈越大。由于水解圈越大，表明淀粉分解量越多，因此水解圈直徑與菌落直徑比值大的菌落，分泌的酶活性較高。經液體培養基振蕩培養進行擴增后，再將培養液離心，菌種會分布于沉淀，而分泌的胞外酶分布于上清液，可取上清液測定酶活性。
考向3　考查果酒、果醋及泡菜的制作
3.[2017·浙江11月選考，32(一)節選]回答與釀酒和制醋有關的問題：
(1)為了獲得優良的釀酒紅曲霉菌株，將原菌株的孢子誘變處理后制成較稀濃度的單孢子懸液，這樣做的目的是在培養時有利于獲得________。
(2)大米經蒸煮、紅曲霉菌糖化后，用某釀酒酵母進行酒精發酵，發酵完畢后得到新鮮紅曲酒，酒中乙醇濃度不超過15%。其主要原因是當發酵液中的乙醇濃度接近15%時，________(A.乙醇氧化逐漸增強直至平衡　B.葡萄糖分解逐漸增強直至平衡　C.乙醇氧化逐漸減弱直至停止　D.葡萄糖分解逐漸減弱直至停止)。
(3)影響紅曲酒風味的主要因素，除了溫度、pH、氧氣等環境因素外，還有_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________(答出2點即可)。
(4)在紅曲醋生產工藝中，將適量的紅曲酒、水和醋化醋桿菌等混合，再添加一定量谷殼糠等制成松散的發酵料，其主要目的是________，以利于醋酸發酵。
答案　(1)單菌落
(2)D
(3)不同的菌株、不同的原料
(4)增加通氣性
解析　(1)在適當的稀釋度下，可培養得到相互分開的菌落，即單菌落。(2)乙醇濃度接近15%時，抑制了酵母菌的存活，可推知葡萄糖的分解會逐漸減弱直至停止。(3)釀酒過程中，除了溫度、pH、氧氣等環境因素外，還有釀酒原料、菌種活性、糖含量、雜菌污染、次級代謝產物等都會影響酒的風味。
(4)釀醋過程中，添加一定量谷殼糠等制成松散的發酵料，可在發酵過程中為醋酸發酵積存氧氣，松散有利于空氣流通。
4.(真題重組)回答與泡菜制作有關的問題：
(1)用蘿卜等根菜類蔬菜制作泡菜，用熱水短時處理，可抑制某些微生物產生________，從而使成品泡菜口感較脆。同時，該處理也會使泡菜發酵時間縮短，其原因是____________________。(2020·浙江1月選考，29節選)
(2)用白蘿卜制作泡菜的過程中，采用適當方法可縮短腌制時間。下列方法中錯誤的是________(2021·浙江1月選考，10)
A.將白蘿卜切成小塊
B.向容器中通入無菌空氣
C.添加經腌制過的泡菜汁
D.用沸水短時處理白蘿卜塊
(3)泡菜發酵初期，由于泡菜罐加蓋并水封，會使________菌被逐漸抑制。發酵中期，乳酸菌大量繁殖，會使________菌受到抑制。發酵后期，乳酸生產過多，會使乳酸菌受到抑制。(2020·浙江1月選考，29節選)
(4)從泡菜汁中可分離制作酸奶的乳酸菌，首先對經多次發酵的泡菜汁進行過濾，然后取濾液進行________，再用________的方法在某種含牛乳的專用的培養基中進行初步篩選。該培養基必須含有________，以便于觀察是否產酸。(2020·浙江1月選考，29節選)
(5)自然界中醋桿菌常與乳酸菌共同生長。若要篩選出醋桿菌，則其專用的培養基中應添加________。(2020·浙江1月選考，29節選)
答案　(1)果膠酶　細胞破裂，細胞內營養物質外流使乳酸菌快速地獲得營養物質
(2)B　(3)喜好氧的　不耐酸的
(4)稀釋　涂布分離　酸堿指示劑　(5)乙醇
解析　(1)用蘿卜等根菜類蔬菜制作泡菜時，為抑制某些微生物產生果膠酶，從而使成品泡菜口感較脆，可用熱水短時處理。同時，該處理也會使細胞破裂，細胞內營養物質外流使乳酸菌快速地獲得營養物質，從而使泡菜發酵時間縮短。(2)泡菜腌制過程中起作用的主要是假絲酵母和乳酸菌，在無氧條件下乳酸菌厭氧呼吸產生乳酸，乳酸菌是異養厭氧型菌，因此向容器中通入無菌空氣會對發酵產生抑制作用；將白蘿卜切成小塊可以增大發酵菌和蘿卜的接觸面積，有利于發酵；已經腌制過的泡菜汁中含有已經擴增的發酵菌，可以減少腌制時間；用沸水短時處理白蘿卜塊可以破壞蘿卜的細胞膜，有利于發酵，故應選B。(3)泡菜發酵初期，由于泡菜罐加蓋并水封，形成無氧環境，會使喜好氧的菌被逐漸抑制。發酵中期，乳酸菌大量繁殖，產生乳酸，會使不耐酸的菌受到抑制。發酵后期，乳酸生產過多，又會抑制乳酸菌。(4)從泡菜汁中可分離制作酸奶的乳酸菌，首先對經多次發酵的泡菜汁進行過濾，然后取濾液進行稀釋，再用涂布分離的方法在某種含牛乳的專用的培養基中進行初步篩選。為了便于觀察是否產酸，該培養基必須含有酸堿指示劑。(5)自然界中醋桿菌常與乳酸菌共同生長。由于醋桿菌可以利用乙醇產生醋酸，若要篩選出醋桿菌，則其專用的培養基中應添加乙醇。
考向1　全面考查微生物培養利用中的無菌技術及分離計數
1.(2021·衢州高三質檢)測定水樣是否符合飲用水衛生標準，常用濾膜法測定大腸桿菌的數目。濾膜法的大致流程：用濾膜過濾待測水樣→水樣中的細菌留在濾膜上→將濾膜轉移到伊紅美藍的培養基(EMB培養基)上培養→統計菌落數目。流程示意圖如下圖所示。其中，指示劑伊紅美藍可使大腸桿菌菌落呈現紫黑色。請據圖回答問題：
(1)過濾待測水樣需要用到濾杯、濾膜和濾瓶，均需要進行滅菌處理，與過濾有關的操作都要在超凈臺上酒精燈火焰旁進行。待測水樣過濾完之后，還有部分細菌吸附在濾杯杯壁上，將這部分細菌也盡可能集中到濾膜上的操作為：在無菌條件下用________沖洗濾杯，并再次________。
(2)將完成過濾之后的濾膜緊貼在EMB培養基上，這屬于微生物培養中的________操作。從物理狀態角度分析，EMB培養基屬于________培養基，為檢
測培養基滅菌是否徹底，對于固體培養基應采用的檢測方法是_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(3)某生物興趣小組的某同學嘗試按照上述方法進行測定，無菌操作下將10 mL待測水樣加入到90 mL無菌水中，稀釋后的菌液通過濾膜法測得EMB培養基上的菌落數平均為84，紫黑色菌落數平均為21，則推測1 L待測水樣中的大腸桿菌數目為________。
(4)在配制尿素培養基的過程中，由于尿素具有________的特性，導致其無法使用高壓蒸汽滅菌法滅菌，通常通過選用合適________的濾膜代替G6玻璃砂漏斗，也可達到去除尿素溶液中雜菌的目的。
答案　(1)無菌水　過濾　(2)接種　固體　將未接種的培養基在恒溫箱中培養一段時間，觀察培養基上是否有菌落產生
(3)2 100　(4)受熱會分解　孔徑
解析　(1)有部分細菌吸附在濾杯杯壁上，為了將這部分細菌也盡可能集中到濾膜上，可以在無菌條件下用無菌水沖洗濾杯，并再次過濾。(2)完成過濾之后的濾膜上含有所需的菌種，濾膜緊貼在EMB培養基上，這屬于接種。從物理狀態角度分析，EMB培養基屬于固體培養基。將未接種的培養基在恒溫箱中培養一段時間，觀察培養基上是否有菌落產生，可檢測培養基滅菌是否徹底。(3)將10 mL待測水樣加入到90 mL無菌水中，紫黑色菌落數為大腸桿菌的菌落，平均為21，因此，原來10 mL大腸桿菌的數目為21個。推測1 L(1 000 mL)待測水樣中的大腸桿菌數目為2 100個。(4)尿素受熱會分解，因此不宜使用高壓蒸汽滅菌。通常通過選用合適孔徑的濾膜代替G6玻璃砂漏斗，對尿素進行過濾除菌。
考向2　借助目標菌種的選育，考查社會責任
2.(2022·稽陽聯誼)草莓是春節市場上非常受歡迎的一種水果，但卻存在易腐爛、難保存的問題。某科研團隊為了確定腐爛草莓上的菌種類型和探究草莓的新產業開發模式，進行了以下一系列的研究。請回答：
(1)科研團隊用棉簽刮取腐爛的草莓表面，然后用________沖洗棉簽獲得菌懸液，然后利用________法將其接種至LB固體培養基中，培養基中出現了均勻分布的單菌落。
(2)腐爛的草莓非常軟爛，原因是微生物產生的________作用后使草莓組織更加松散。為了獲得使草莓變軟的微生物，用接種環分別刮取LB培養基上菌落的菌種，接種到________培養基上，發現了以下兩種情況：
①LB培養基中的菌落數量和種類更多，原因是____________________________
____________________________________________________________________。
②后者培養基上的菌落與在LB培養基上培養時相比，生長狀況不盡相同，可能原因是_____________________________________________________________。
(3)科研團隊為了制成草莓果酒，將草莓放入榨汁機制成黏稠的果醬，然后接種釀酒酵母進行發酵，結果發現酒精含量低，且極易造成污染。可以將果醬進行________處理后再用于發酵。
答案　(1)無菌水　稀釋涂布平板
(2)果膠酶　以果膠為唯一碳源的　草莓腐爛處的微生物并非都能產生果膠酶(其他合理答案也可)　菌種對營養物質的需求不同，導致生長狀況不同
(3)稀釋和滅菌
解析　(1)需要用無菌水沖洗刮取過腐爛草莓表面的棉簽，制成菌懸液，避免其他雜菌的干擾。(2)果膠酶的作用使果膠含量減少會導致組織變軟；草莓腐爛表面的微生物不一定都能產生果膠酶，需要將LB培養基上的菌落分別接種到以果膠為唯一碳源的培養基上進行篩選；能產生果膠酶的微生物常見的有細菌和真菌，真菌對培養基的偏好是“素”，也就是要求C/N較高，因此在以果膠為唯一碳源的培養基上的生長狀況比LB培養基上更好。(3)黏稠的果醬有機物含量高，易被微生物污染，且黏稠的環境不易使酵母菌對營養成分的利用，導致酒精含量低，因此可以進行稀釋和滅菌處理。
考向3　關注傳統發酵技術，考查果酒、果醋及泡菜的制作
3.(2022·湖麗衢質檢)蘋果醋是一種酸性發酵健身飲料，含有豐富的維生素、無機鹽、氨基酸和有機酸類，風味獨特，深受廣大消費者歡迎。在蘋果醋生產中，醋酸菌的性能對產品質量、發酵效率有很大影響。研究者為了從醋酸菌中選出優勢高產的菌種，做了相關實驗，部分實驗結果如下表所示。醋酸菌因產生醋酸溶解了培養基中的碳酸鈣，而使菌落周圍產生透明圈。回答下列問題。
菌株編號 透明圈直徑/mm 菌落直徑/mm
A1 3.5 1.5
A2 1.5 0.9
A3 7.0 1.8
A4 6.5 3.2
(1)菌株培養過程中需要對各種用具進行滅菌，置于超凈工作臺上的用具可利用________滅菌30分鐘。
(2)依據菌落的________(答出2點)等特征篩選出四株可能是優勢高產的菌株(A1、A2、A3和A4)，并采用________法來進一步純化這些菌株。篩選的菌株接種于斜面培養基后，置于________中臨時保存。根據表中實驗結果，可以選取________菌株用于生產。
(3)用篩選出的高產醋酸菌制作蘋果醋，當蘋果酸和醋酸等總酸濃度不再增加時，其原因可能是________(答出2點)。
(4)在蘋果醋工業生產過程中，除考慮上述條件外，還需考慮溫度、pH和________等外界因素。
答案　(1)紫外燈(和過濾風)
(2)大小、形狀、顏色和邊緣與表面光滑與否
　平板劃線法或稀釋涂布平板　4 ℃的冰箱　A3
(3)乙醇消耗完畢；酸度過高抑制醋酸菌的代謝活動
(4)溶解氧
解析　(1)菌株培養過程中需要對各種用具進行滅菌，置于超凈工作臺上的用具可打開紫外燈滅菌30分鐘，并開啟過濾風。(2)每一種細菌在一定條件下都會形成固定的菌落特征，可依據菌落的大小、形狀、顏色和邊緣與表面光滑與否等特征篩選出四株可能是優勢高產的菌株(A1、A2、A3和A4)，并采用平板劃線法或稀釋涂布平板法來進一步純化這些菌株。篩選的菌株接種于斜面培養基后，置于4 ℃的冰箱中臨時保存。根據表中實驗結果，表格中透明圈直徑與菌落直徑比值最大的菌株是A3，故可以選取A3菌株用于生產。
(3)用篩選出的高產醋酸菌制作蘋果醋，當蘋果酸和醋酸等總酸濃度不再增加時，其原因可能是乙醇消耗完畢或酸度過高抑制醋酸菌的代謝活動。(4)醋酸菌是好氧菌，在蘋果醋工業生產過程中，除考慮上述條件外，還需考慮溫度、pH和溶解氧等外界因素。
4.(2022·紹興適應性考試)研究表明，成品泡菜中含有豐富的乳酸菌資源，包括明串珠菌屬、乳桿菌屬等多個屬。從泡菜中篩選出產酸耐酸能力較強的乳酸菌，可用于其他生產行業。回答下列問題：
(1)泡菜在發酵過程中表現出明顯的菌群更替現象。發酵早期，隨著發酵瓶中氧氣耗盡，明串珠菌屬由于具有復活迅速、________快等特點，迅速成了優勢菌群；隨著發酵持續進行，乳桿菌屬由于________能力更強，逐漸在后期取代明串珠菌，成為優勢菌群。
(2)選取發酵后期且風味良好的農家泡菜，用無菌移液器吸取適量泡菜汁液轉移至經________的采樣瓶中，零上低溫保存并運回實驗室。將樣品進行梯度稀釋后用移液器和________接種到含有溴甲酚紫的BCP培養基中進行選擇培養，部分菌落周圍出現黃色包圍圈，溴甲酚紫的作用是作為________。選取上述菌落中的菌種，分別接種到MRS液體培養基中37 ℃培養24 h，測定并選取________較低的多組菌液，分別在人工胃液中培養，統計各組培養前后樣本中的________，選出目標菌種。
(3)產酸耐酸性能優異的乳酸菌株應用廣泛，適合用于制作益生菌飼料，其理由是一方面這些菌株更耐受胃的酸性環境，另一方面________________________。
答案　(1)增殖(繁殖)　耐酸　(2)滅菌　涂布器　(酸堿)指示劑　pH　活菌數
(3)產酸能力強，能更好抑制(胃)腸道內病原菌
解析　(1)氧氣耗盡，好氧菌不能存活，明串珠菌可以在無氧或有氧條件下生長，具有復活迅速、繁殖快等特點；乳酸菌是厭氧菌，厭氧呼吸產生乳酸，后期酸性增強，乳酸菌耐酸能力強，因此逐漸成為優勢菌群。
(2)要分析泡菜中的菌種，需排除其他菌的干擾，因此對采樣瓶需進行高壓蒸汽滅菌，即選取發酵后期且風味良好的農家泡菜，用無菌移液器吸取適量泡菜汁液轉移至經滅菌的采樣瓶中，稀釋涂布平板法是分離鑒定菌種的一種方法，其特點是常需進行稀釋，而后將稀釋液用涂布器接種到固體培養基上；溴甲酚紫作為酸堿指示劑，如產生酸性，可使菌落周圍呈現黃色包圍圈；要進一步分離菌種，需選取pH較低(含有產酸多，耐酸強的菌種)的MRS培養液進行進一步培養；轉移至人工胃液，比較各組樣本中的活菌數，選出目標菌種(活菌數多的)。
(3)產酸耐酸性能優異的乳酸菌株不僅耐酸能力強，而且產酸能力強，能更好抑制(胃)腸道內病原菌，是制作益生菌飼料的良好菌種。
微專題2　細胞工程
1.細胞工程中的三大培養基
2.動物細胞培養與植物組織培養的比較
3.動物細胞融合與植物體細胞雜交的區別
　滅活病毒誘導法是誘導動物細胞融合的特有方法，不適合用于誘導植物原生質體融合。
4.單克隆抗體的制備
　①單克隆抗體具有四大優點——純度高、可大量制備、特異性強、靈敏度高；②單克隆抗體的三大用途——診斷試劑、運載藥物和治療疾病。
5.理解受精作用和早期胚胎發育過程
6.熟練掌握胚胎工程的主要技術手段
考向1　圍繞植物細胞工程，考查科學思維
1.(真題重組)回答下列與植物克隆有關的問題：
(1)利用帶側芽的莖段獲得叢狀苗的過程與利用莖段誘導產生愈傷組織再獲得叢狀苗的過程相比，前者總培養時間________，且不經歷________過程，因而其遺傳性狀穩定，是大多數植物快速繁殖的常用方法。(2020·浙江7月選考，29節選)
(2)與發芽培養基相比，配制轉基因叢狀苗生根培養基時，可根據實際情況適當添加________，促進叢狀苗基部細胞分裂形成愈傷組織并進一步分化形成________，最終形成根。還可通過改變MS培養基促進生根，如________(A.提高蔗糖濃度　B.降低培養基濃度　C.提高大量元素濃度　D.不添加瓊脂)。(2020·浙江7月選考，29節選)
(3)植物細胞在培養過程中往往會發生________，可利用這一特性篩選抗致病真菌能力強的細胞。篩選時在培養基中加入______________，并將存活的細胞進一步培養至再生植株。若利用________培養建立的細胞系用于篩選，則可快速獲得穩定遺傳的抗病植株。(2019·浙江4月選考，32節選)
答案　(1)短　脫分化　(2)生長素　根的分生組織　B　(3)變異　高濃度致病真菌　花粉離體
解析　(1)利用帶側芽的莖段獲得叢狀苗的過程，比利用莖段誘導產生愈傷組織獲得叢狀苗的過程所需時間更短，因為不需要經歷脫分化的過程，而且遺傳性狀穩定。(2)植物器官的分化需要一定的營養物質及適宜的植物激素配比，配制叢狀苗生根培養基需根據實際情況添加生長素，促進基部細胞形成愈傷組織，并進一步分化形成根的分生組織，最終形成根，比較發芽培養基和生根培養基可知降低培養基的濃度可促進生根。故選B。(3)抗致病真菌基因是原本植物細胞不含的基因，則需要利用植物細胞在培養過程中的變異來篩選抗致病真菌能力強的細胞；由于需要篩選抗致病真菌能力強的細胞，故需要在培養基中加入高濃度致病真菌；快速穩定遺傳的抗病植株需要通過單倍體培養獲得，故需要利用花粉離體培養建立細胞系用于篩選。
考向2　圍繞動物細胞工程，考查生命觀念
2.(真題重組)為了獲取大量斑馬魚胚胎細胞用于藥物篩選，下圖為相關細胞培養過程示意圖。
(1)步驟①的操作________(填“需要”或“不需要”)在無菌環境中進行(2021·6月浙江選考，18A)
(2)步驟②中需要________溶解細胞間物質使細胞分離，以制備細胞懸浮液。(2021·6月浙江選考，18B)(2021·1月浙江選考，29節選)
(3)步驟③的培養稱為________，步驟④的培養稱為________，從步驟③到④的分瓶操作前常用________處理(2021·6月浙江選考，18C)(2021·1月浙江選考，29節選)
(4)單克隆抗體有望用于治療新冠肺炎。單克隆抗體的制備原理是：取免疫陽性小鼠的________細胞與骨髓瘤細胞混合培養，使其融合，最后篩選出能產生特定抗體的雜交瘤細胞。單克隆抗體制備的過程________(填“需要”或“不需要”)用到上述動物細胞培養技術。
答案　(1)需要　(2)胰蛋白酶或膠原蛋白酶
(3)原代培養　傳代培養　胰蛋白酶
(4)B淋巴　需要
解析　(1)步驟①的操作需要在無菌環境中進行。
(2)步驟②中需用胰蛋白酶或膠原蛋白酶溶解細胞間物質使細胞分離，以制備細胞懸浮液。
(3)步驟③的培養稱為原代培養，步驟④的培養稱為傳代培養，從步驟③到④的分瓶操作前常用胰蛋白酶處理。
(4)單克隆抗體有望用于治療新冠肺炎。單克隆抗體的制備原理是：取免疫陽性小鼠的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞混合培養，使其融合，最后篩選出能產生特定抗體的雜交瘤細胞。單克隆抗體制備的過程需要用到上述動物細胞培養技術。
考向3　圍繞胚胎工程，考查生命觀念
3.(2020·浙江1月選考，17)下列關于利用胚胎工程培育優質奶牛的敘述，正確的是(　　)
A.從雄性奶牛中采集到的成熟精子遇到卵子即可進入卵子內
B.在體外完成受精后的受精卵，將其植入子宮即可完成著床
C.隨著卵裂的進行，卵裂球細胞的體積變小，卵裂球的體積和有機物總量顯著增加
D.在含有經輻射處理的胚胎成纖維細胞的培養體系中，胚胎干細胞不易發生分化
答案　D
解析　成熟的精子獲能后方可受精，A錯誤；在體外完成受精后的受精卵，若要植入子宮，需要先培養至桑葚胚或囊胚，受精卵無著床能力，B錯誤；在卵裂期，卵裂球的體積基本不變，細胞的體積由于細胞數的增多而減小，有機物總量減少，C錯誤；經射線照射喪失增殖力的胚胎成纖維細胞可抑制胚胎干細胞的分化，D正確。
考向1　結合基因工程，考查植物細胞工程的應用
1.(2022·湖麗衢質檢)紅花草莓兼有觀賞性和食用性。研究人員對紅花草莓的離體繁殖及再生植株體系開展了研究。請回答下列問題。
(1)紅花草莓的匍匐莖尖具有頂端分生組織，可以不經________階段，直接萌生出叢狀苗，因此實驗時常作為外植體使用。為避免外植體組織內的雜菌污染，可在培養基中添加一定量的________。
(2)試管苗在初代培養基上培養一段時間后需要進行繼代培養，原因是________________________。當叢狀苗繁殖到一定數量時，需要將其移入________培養基。對比上述各種培養基的成分，最關鍵的區別在于________的濃度和配比不同。取上述草莓無菌苗的葉片為外植體，在葉片傷口處形成愈傷組織，再經愈傷組織生芽生根，這種再生植株途徑稱為________途徑。
(3)為提高紅花草莓的耐低溫能力，研究人員擬將青稞抗寒基因(dhn4)導入紅花草莓，常用的方法有2種：①將含有重組DNA分子的________與無菌草莓葉塊共同培養完成侵染；②用________法直接將重組DNA分子導入草莓原生質體。
答案　(1)愈傷組織/脫分化　抗生素
(2)培養基中營養物質枯竭、代謝產物積累　生根　植物生長調節劑(或植物激素)　器官發生
(3)農桿菌　顯微注射
解析　(1)紅花草莓的匍匐莖尖具有頂端分生組織，可直接誘導出幼芽，然后通過幼芽的快速繁殖出幼苗，因此不需要經過愈傷組織這個階段。為避免外植體組織內的雜菌污染，可在培養基中添加一定量的抗生素抑制雜菌生長。
(2)試管苗在初代培養基上培養一段時間后營養物質消耗殆盡，代謝廢物積累，因此需要進行繼代培養。當叢狀苗繁殖到一定數量時需要進行生根培養，需要生根培養基。誘導生根或者出芽就是植物生長調節劑濃度和配比不同。草莓無菌苗的葉片為外植體，在葉片傷口處形成愈傷組織，再經愈傷組織生芽生根，這種再生植株途徑稱為器官發生。
(3)①將目的基因導入植物體內選擇農桿菌作為載體，②直接將重組DNA分子導入原生質體使用顯微注射法。
考向2　結合動物細胞工程技術，考查單克隆抗體的制備
2.(2022·諸暨診斷)單克隆抗體因其靶向性強、特異性好等顯著優點，在實踐中應用廣泛。
(1)早期單克隆抗體是利用已免疫小鼠的脾臟細胞和骨髓瘤細胞________獲得雜交瘤細胞來制備的，這些鼠源單克隆抗體進入人體，可能使人體產生與該抗體特異性結合的________，導致該抗體失效。
(2)多種技術可以解決抗體失效問題。如從雜交瘤細胞中提取編碼鼠源單克隆抗體________(填“5區”或“6區”，抗體的結構如圖所示)序列的基因，與從人體中獲得的編碼抗體________(填“5區”或“6區”)的基因進行拼接，然后導入骨髓瘤細胞中，進行培養獲得新的抗體。
(3)采用相關技術破壞小鼠內源免疫球蛋白(Ig)基因，然后將含人免疫球蛋白(Ig)基因的重組DNA經顯微注射技術導入小鼠________，然后將篩選后的受體細胞進行胚胎體外培養，再將其移植到同種、________的代孕母鼠體內，經分娩后培育、篩選獲得能產生________的轉基因小鼠，然后利用該小鼠進行單克隆抗體制備。
答案　(1)雜交　抗體
(2)5區　6區
(3)受精卵　同期發情　人免疫球蛋白
解析　(1)早期單克隆抗體的制備：利用已免疫小鼠的脾臟細胞和骨髓瘤細胞進行雜交，獲得雜交瘤細胞，這些鼠源單克隆抗體進入人體，對于人體來說，這些抗體就是抗原，可能使人體產生與該抗體特異性結合的抗體，導致該抗體失效。
(2)抗體和抗原特異性結合的區域是5區。引起人體免疫反應的主要是6區。據蛋白質工程流程，可以從人體中獲取編碼抗體6區序列的基因，然后從雜交瘤細胞中提取編碼鼠源單克隆抗體5區序列的基因，對兩種基因進行修飾、拼接，利用運載體將重組基因導入骨髓瘤細胞進行培養，獲取人鼠嵌合抗體。
(3)構建人免疫蛋白轉基因小鼠時，為避免小鼠細胞自身Ig基因表達而產生的免疫排斥，要選擇自身Ig基因缺陷的小鼠受精卵細胞作為受體細胞，并通過顯微注射操作導入重組DNA將經篩選后的受體細胞進行胚胎體外培養，再將胚胎移植到同期發情處理的代孕母鼠子宮內，經代孕母鼠分娩后培育、篩選獲得人免疫球蛋白(Ig)轉基因小鼠，利用該小鼠進行單克隆抗體制備，產生大量人免疫球蛋白。
考向3　結合胚胎工程技術流程，考查生命觀念
3.(2020·全國卷Ⅲ，38)W是一種具有特定功能的人體蛋白質。某研究小組擬仿照制備乳腺生物反應器的研究思路，制備一種膀胱生物反應器來獲得W，基本過程如圖所示。
回答下列問題：
(1)步驟①中需要使用的工具酶有_______________________________________。
步驟②和③所代表的操作分別是________和________。步驟④稱為________。
(2)與乳腺生物反應器相比，用膀胱生物反應器生產W的優勢在于不受轉基因動物的____________(答出2點即可)的限制。
(3)一般來說，在同一動物個體中，乳腺上皮細胞與膀胱上皮細胞的細胞核中染色體DNA所含的遺傳信息________(填“相同”或“不同”)，原因是____________________________________________________________________。
(4)從上述流程可知，制備生物反應器涉及胚胎工程，胚胎工程中所用到的主要技術有____________(答出2點即可)。
答案　(1)限制性內切核酸酶、DNA連接酶　顯微注射　體外培養　胚胎移植　(2)性別、年齡　(3)相同　兩種上皮細胞都是體細胞，且來源于同一個受精卵
(4)體外受精、胚胎移植
解析　(1)步驟①是基因表達載體的構建過程，該過程需要使用的工具酶有限制性內切核酸酶(限制酶)和DNA連接酶，用限制酶分別切割載體和目的基因，用DNA連接酶將目的基因和載體連接起來。步驟②和③所代表的操作分別是顯微注射和體外培養。步驟④是將早期胚胎植入到代孕母體內，稱為胚胎移植。(2)與乳腺生物反應器相比，用膀胱生物反應器生產W的優勢在于不受轉基因動物的性別和年齡的限制。(3)乳腺上皮細胞和膀胱上皮細胞都是體細胞。一般來說，在同一動物個體中，其體細胞都是由同一個受精卵分裂、分化而來的，細胞在分裂、分化過程中，其細胞核中染色體DNA所含的遺傳信息一般是不變的，因此兩種上皮細胞的染色體DNA所含的遺傳信息相同。(4)據題述流程可知，胚胎工程中所用到的主要技術有體外受精、胚胎體外培養、胚胎移植等。
微專題3　基因工程
1.基因工程的三大工具
2.基因工程的四個操作步驟
(1)獲取目的基因
(2)利用表達載體構建重組DNA分子
　表達載體應包含適當的轉錄和翻譯信號，如啟動子、終止子。
(3)將目的基因導入受體細胞
(4)檢測目的基因及其表達產物
3.PCR技術
　①1個模板DNA分子經n輪擴增，共產生2n個DNA片段，共需引物2n＋1－2個；②經過第3輪擴增后，擴增出的含目的基因的DNA片段才不帶黏性末端(占1/4)；③經過n輪擴增，擴增出的不帶黏性末端的DNA片段所占比例為1－n·2(1－n)。
4.基因診斷與基因治療的比較
5.基因工程與蛋白質工程的比較
考向1　考查獲得目的基因的方法和重組DNA分子的形成
1.(真題重組)回答下列關于基因工程中目的基因獲取與重組DNA分子形成的相關問題：
(1)為了研究某基因在斑馬魚血管發育過程中的分子調控機制，用DNA連接酶將該基因連接到質粒載體形成________，導入到大腸桿菌菌株DH5α中。為了能夠連接上該目的基因，并有利于獲得含該目的基因的DH5α陽性細胞克隆，質粒載體應含有__________________________________________________________
_____________________________________________________________________
(答出2點即可)。
提取質粒后，采用________法，將該基因導入到斑馬魚受精卵細胞中，培養并觀察轉基因斑馬魚胚胎血管的發育情況。(2021·浙江6月選考，29節選)
(2)若要獲得已知序列的抗病基因，可采用________或PCR的方法。為了提高目的基因和質粒重組的成功率，選擇使用________，對含目的基因的DNA片段進行處理，使其兩端形成不同的黏性末端，對質粒也進行相同的處理，然后用DNA連接酶連接形成重組質粒。通過在大腸桿菌中________，以獲得大量的重組質粒，最終將其導入原生質體中。(2020·浙江1月選考，29)
(3)通過抗病性強的植株獲取抗病目的基因有多種方法。現已獲得純度高的抗病蛋白(可作為抗原)，可通過________技術獲得特異性探針，并將________中所有基因進行表達，然后利用該探針，找出能與探針特異性結合的表達產物，進而獲得與之對應的目的基因。(2019·浙江4月選考，32節選)
(4)將含某抗蟲基因的載體和含卡那霉素抗性基因的載體pBⅠ121均用限制性內切核酸酶EcoRⅠ酶切，在切口處形成________。選取含抗蟲基因的DNA片段與切割后的pBⅠ121用DNA連接酶連接。在兩個片段相鄰處形成________，獲得重組質粒。(2018·浙江4月選考，32節選)
(5)兔肝細胞中的基因E編碼代謝甲醛的酶，擬利用基因工程技術將基因E轉入矮牽牛中，以提高矮牽牛對甲醛的代謝能力。從兔肝細胞中提取mRNA，在________酶的作用下形成互補DNA，然后以此DNA為模板擴增得到基因E。在相關酶的作用下，將基因E與Ti質粒連接在一起，形成________，再導入用氯化鈣處理的________，侵染矮牽牛葉片。將被侵染的葉片除菌后進行培養，最終得到轉基因矮牽牛。(2016·浙江4月選考，32節選)
答案　(1)重組DNA分子　限制性內切核酸酶的識別序列、抗生素抗性基因　顯微注射　(2)化學合成　兩種限制性內切核酸酶　擴增　(3)單克隆抗體　基因組文庫　
(4)黏性末端　磷酸二酯鍵　(5)逆轉錄　重組DNA分子　農桿菌
解析　(1)為了研究某基因在斑馬魚血管發育過程中的分子調控機制，用DNA連接酶將該基因連接到質粒載體形成重組DNA分子，導入到大腸桿菌菌株DH5α中。為了能夠連接上該目的基因，并有利于獲得含該目的基因的DH5α陽性細胞克隆，質粒載體應含有限制性內切核酸酶的識別序列、抗生素抗性基因等。將目的基因導入動物細胞可采用顯微注射法。(2)可采用化學合成或PCR的方法獲得已知序列的抗病基因。對含目的基因的DNA片段進行處理，為使其兩端形成不同的黏性末端，需要選擇使用兩種限制性內切核酸酶，對質粒也進行相同的處理，然后用DNA連接酶連接形成重組質粒。通過在大腸桿菌中擴增，以獲得大量的重組質粒，最終將其導入原生質體中。(3)抗病蛋白可作抗原，則特異性探針應為抗體，則需要通過單克隆抗體技術獲得特異性探針；基因組文庫包含了某個DNA分子的所有基因，故是將基因組文庫中的所有基因進行表達，再利用探針獲得目的基因。(4)用限制性內切核酸酶EcoRⅠ切割含某抗蟲基因的載體和含卡那霉素抗性基因的載體pBⅠ121，可在切口處形成黏性末端。用DNA連接酶連接含抗蟲基因的DNA片段與切割后的pBⅠ121，可在兩個片段相鄰處形成磷酸二酯鍵，獲得重組質粒。(5)以mRNA為模板合成DNA的過程為逆轉錄過程，這一過程需要在逆轉錄酶的催化下進行。獲得目的基因后，需在限制性內切核酸酶和DNA連接酶的作用下，將目的基因與載體連接形成重組DNA分子，再將其導入受體細胞。將目的基因導入植物細胞常用農桿菌轉化法，先將重組DNA分子導入經氯化鈣處理的農桿菌，再用導入目的基因的農桿菌感染植物細胞，最終實現將目的基因導入植物細胞內。導入目的基因的植物細胞經組織培養過程形成轉基因植物。
考向2　考查將重組DNA分子導入受體細胞的方法和篩選含有目的基因的受體細胞
2.(真題重組)(1)天然農桿菌的Ti質粒上存在著一段DNA片段(T－DNA)，該片段可轉移并整合到植物細胞染色體上。為便于轉基因植物在組織培養階段的篩選，設計重組Ti質粒時，應考慮T－DNA中要有可表達的目的基因，還需要有可表達的________。(2020·浙江7月選考，29節選)
(2)結合植物克隆技術進行轉基因實驗，為獲得轉基因植株，農桿菌侵染的宿主一般要選用具有優良性狀、較高的遺傳穩定性、________及易被農桿菌侵染等特點的植物材料。(2020·浙江7月選考，29節選)
(3)已知用CaCl2處理細菌，會改變其某些生理狀態。取CaCl2處理過的農桿菌與重組質粒在離心管內進行混合等操作，使重組質粒進入農桿菌，完成________實驗。在離心管中加入液體培養基，置于搖床慢速培養一段時間，其目的是_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________，
從而表達卡那霉素抗性基因，并大量增殖。(2018，浙江4月選考，32節選)
(4)將某種抗病基因通過轉基因的方法導入植物的分生組織可獲得抗病性強的植株。若在試管苗期間用分子水平方法判斷抗病基因是否表達，應檢測________(A.質粒載體　B.轉錄產物　C.抗性基因　D.病原微生物)。(2019·浙江4月選考，32節選改編)
答案　(1)抗性基因　(2)全能性表達充分　(3)轉化　使CaCl2處理過的農桿菌恢復細胞的正常狀態
(4)B
解析　(1)設計重組質粒時，除了要含有可表達的目的基因，還需要有可表達的抗性基因(如抗生素抗性基因)，在添加抗生素的培養基上，含重組質粒的宿主細胞能夠生長，因而被篩選出來。(2)轉基因實驗要求宿主細胞性狀優良、遺傳穩定性較高、全能性(細胞發育成個體的潛能)較高及易被農桿菌侵染等特點。(3)取CaCl2處理過的農桿菌與重組質粒在離心管內進行混合等操作，使重組質粒進入農桿菌，完成轉化實驗。在離心管中加入液體培養基，置于搖床慢速培養一段時間，其目的是使CaCl2處理過的農桿菌恢復細胞的正常狀態。(4)質粒載體只能檢測目的基因是否轉入受體細胞，A錯誤；轉錄產物為RNA，可以通過DNA－RNA分子雜交檢測抗病基因是否表達，B正確；檢測抗性基因只能檢測抗性基因是否導入受體細胞，無法檢測該基因是否表達，C錯誤；檢測病原微生物是個體水平檢測目的基因是否表達的方式，D錯誤。
考向1　創設情景，考查基因工程的操作步驟
1.(2022·稽陽聯誼)某種植物的根會產生一種次生代謝產物，該次生代謝產物具有很高的藥用價值。在研究這種次生代謝產物合成的分子機制時發現，基因A表達沉默時才能產生，且有物質甲存在時會使基因A表達。物質甲在環境中非常常見，為了實現基因A的沉默，現設計將基因A反向連接到植物基因組中。基因A與Ti質粒結構如下圖所示，箭頭表示轉錄方向。
(1)為了使基因A反向連接到Ti質粒上，選用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶進行切割并分離獲得A基因，然后加入________________形成重組Ti質粒。為了保證重組Ti質粒在農桿菌中穩定存在，需將工程發根農桿菌進行________________處理。
(2)將含有重組Ti質粒的發根農桿菌與經過創傷處理的外植體共同培養一段時間，然后進行________后，在培養基中加入________以篩選出成功導入基因A片段的植物細胞。再轉移至含有____________的培養基上培養得到愈傷組織。結果發現未更換培養基的情況下，就長出了較多的根，可能原因是發根農桿菌的T－DNA中含有________基因。
(3)為了檢驗轉基因是否成功，應在________(填“含”或“不含”)物質甲的培養液中將獲得的根進行水培，發現只有部分能產生目標次生代謝產物。部分根無法產生次生代謝產物的可能原因是________________________。
答案　(1)DNA連接酶　除去EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶/限制酶/EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶基因/限制酶基因
(2)除菌(不能填滅菌)　潮霉素　適當配比的營養物質和植物生長調節劑　生長素合成酶/生長素合成相關
(3)含　反接的基因A未成功表達
解析　(1)由圖可知，經EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切割得到的目的基因不含啟動子，需要借用T－DNA上的啟動子才能順利表達，T－DNA上的氨芐青霉素抗性基因上剛好有EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶的酶切位點，能成功地將目的基因反向連接上，其轉錄后形成的mRNA與A基因正常轉錄形成的mRNA恰好互補，從而阻止A基因正常轉錄形成的mRNA的翻譯過程；為了避免重組Ti質粒在農桿菌中被限制酶破壞，需將工程發根農桿菌進行除去EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶處理。
(2)將含有重組Ti質粒的發根農桿菌與經過創傷處理的外植體共同培養一段時間后，需要除去農桿菌，防止表面農桿菌在培養基上大量滋生；該過程中部分植株細胞完成了轉化，獲得了T－DNA上的潮霉素抗性基因，因此需要利用含有潮霉素的培養基來篩選完成轉化了的植物細胞；轉化后的植物細胞形成的愈傷組織在正常的MS培養基上生根旺盛，說明自身產生了較多的生長素，促進了愈傷組織生根，說明發根農桿菌的T－DNA中含有生長素合成的相關基因。
(3)自然條件下，次生代謝產物只有在基因A表達沉默時才能產生，且有物質甲存在時會使基因A表達，轉基因后，由于反接的基因A轉錄出的mRNA與正常基因A轉錄的mRNA互補，因此即使含有物質甲，正常基因A的表達也會被沉默，因此可以作為目的基因是否成功起作用的標志；部分根無法產生次生代謝產物，說明目的基因未正常發揮作用，可能原因是反接的基因A未成功表達。
考向2　圍繞基因工程的應用，考查社會責任
2.(2022·臺州二模)鐮刀形細胞貧血癥是一種嚴重的遺傳病，患者的紅細胞在缺氧時變為鐮刀狀，容易堵塞血管，導致內臟及組織缺氧。科學家利用基因工程的原理設計了一套治療方案，如圖所示，回答下列問題：
(1)基因治療是指將外源正常基因導入靶細胞，為細胞補上________的基因或改變病變的基因，以達到治療________的目的。
(2)腺病毒載體是目前基因治療最為常用的病毒載體之一。從人體細胞中獲得正常基因后，可通過________技術進行擴增，再利用________把載體基因和正常基因連接起來，構建重組腺病毒載體，再讓該病毒載體感染靶細胞。
(3)靶細胞應該是在體內能保持相當長的壽命或者具有________能力的細胞，這樣才能使被轉入的基因能長期有效地發揮治療作用。因此病人的________是理想的轉基因治療靶細胞。
(4)經過基因工程改造的靶細胞可提取其DNA，根據________原則，通過核酸分子雜交技術進行檢測。再將成功導入正常基因的靶細胞進行________培養，使之繁衍成一個新的細胞群體，然后回輸到病人的骨髓中，以產生正常的血細胞。
答案　(1)丟失(缺陷)　遺傳性疾病
(2)PCR　限制性內切核酸酶和DNA連接酶
(3)分裂(增殖)　造血干細胞
(4)堿基互補配對　克隆
解析　(1)基因治療是指將外源正常基因導入靶細胞，為細胞補上丟失(缺陷)的基因或改變病變的基因，以達到治療遺傳性疾病的目的。
(2)腺病毒載體是目前基因治療最為常用的病毒載體之一。從人體細胞中獲得正常基因后，可通過PCR技術進行擴增，再利用限制性內切核酸酶和DNA連接酶把載體基因和正常基因連接起來，構建重組腺病毒載體，再讓該病毒載體感染靶細胞。
(3)靶細胞應該是在體內能保持相當長的壽命或者具有分裂(增殖)能力的細胞，這樣才能使被轉入的基因能長期有效地發揮治療作用。因此病人的造血干細胞是理想的轉基因治療靶細胞。
(4)經過基因工程改造的靶細胞可提取其DNA，根據堿基互補配對原則，通過核酸分子雜交技術進行檢測。再將成功導入正常基因的靶細胞進行克隆培養，使之繁衍成新的細胞群體，然后回輸到病人的骨髓中，以產生正常的血細胞。

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