資源簡介

中小學教育資源及組卷應用平臺
高考生物二輪復習專題突破
考點三 基因工程及生物技術的安全性與倫理問題
1．基因工程的理論基礎
2．基因工程的3種基本工具
3．熟記基因工程的四個操作步驟
4．圖解記憶蛋白質工程
5．PCR技術原理與條件
6．PCR技術的過程
7．DNA的粗提取與鑒定
8．DNA片段的電泳鑒定
9．治療性克隆與生殖性克隆的關系
類型 項目 治療性克隆 生殖性克隆
區別 目的 利用克隆技術產生特定的細胞、組織和器官，用于醫學研究和治療 利用克隆技術產生獨立生存的新個體，獲得人的復制品
水平 細胞水平 個體水平
聯系 都屬于無性生殖；產生的新細胞、組織、器官或新個體，遺傳信息相同
10.區分試管嬰兒和設計試管嬰兒
(1)設計試管嬰兒比試管嬰兒多出的是過程④(遺傳學診斷)。
(2)試管嬰兒主要解決不孕夫婦的生育問題，設計試管嬰兒用于白血病、貧血癥等疾病的治療。
(3)兩者都是體外受精，并進行體外早期胚胎培養，都要經過胚胎移植，都是有性生殖。
1．(2022·山東，13)關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法錯誤的是(　　)
A．過濾液沉淀過程在4 ℃冰箱中進行是為了防止DNA降解
B．離心研磨液是為了加速DNA的沉淀
C．在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現藍色
D．粗提取的DNA中可能含有蛋白質
2．(2020·江蘇，33)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側的序列，具體流程如下圖(以EcoRⅠ酶切為例)：
請據圖回答問題：
(1)步驟Ⅰ用的EcoRⅠ是一種_____________________酶，它通過識別特定的______________切割特定位點。
(2)步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′－羥基與5′－磷酸間形成________________；PCR循環中，升溫到95 ℃是為了獲得________________；Taq DNA聚合酶的作用是催化______________________________________________________________。
(3)若下表所列為已知的DNA序列和設計的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是______(從引物①②③④中選擇，填編號)。
DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物 ①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′ ②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′ ③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′ ④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
(4)對PCR產物測序，經分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列)，結果正確的是______。
A．5′－AACTATGCG－－－－－－AGCCCTT－3′
B．5′－AATTCCATG－－－－－－CTGAATT－3′
C．5′－GCAATGCGT－－－－－－TCGGGAA－3′
D．5′－TTGATACGC－－－－－－CGAGTAC－3′
3．(2021·江蘇，23)某小組為研究真菌基因m的功能，構建了融合表達蛋白M和tag標簽的質粒，請結合實驗流程回答下列問題：
(1)目的基因的擴增
①提取真菌細胞__________，經逆轉錄獲得cDNA，進一步獲得基因m片段。
②為了獲得融合tag標簽的蛋白M，設計引物P2時，不能包含基因m終止密碼子的編碼序列，否則將導致______________________________________________。
③熱啟動PCR可提高擴增效率，方法之一是：先將除Taq DNA聚合酶(Taq酶)以外的各成分混合后，加熱到80 ℃以上再混入酶，然后直接從94 ℃開始PCR擴增，下列敘述正確的有________。
A．Taq酶最適催化溫度范圍為50～60 ℃
B．與常規PCR相比，熱啟動PCR可減少反應起始時引物錯配形成的產物
C．兩條子鏈的合成一定都是從5′端向3′端延伸
D．PCR產物DNA堿基序列的特異性體現了Taq酶的特異性
(2)重組質粒的構建
①將SmaⅠ切開的載體A與添加同源序列的m混合，用特定DNA酶處理形成黏性末端，然后降溫以促進____________________，形成A－m結合體。將A－m結合體導入大腸桿菌，利用大腸桿菌中的DNA聚合酶及__________酶等，完成質粒的環化。
②若正確構建的重組質粒A－m仍能被SmaⅠ切開，則SmaⅠ的酶切位點可能在________
______________________。
(3)融合蛋白的表達
①用含有尿嘧啶的培養基培養URA3基因缺失型酵母，將其作為受體菌，導入質粒A－m，然后涂布于無尿嘧啶的培養基上，篩選獲得目的菌株，其機理是_______________________
______________________________________________________________________________。
②若通過抗原—抗體雜交實驗檢測到酵母蛋白中含tag標簽，說明_____________________
______________________________________________________________________________，
后續實驗可借助tag標簽進行蛋白M的分離純化。
思維延伸——判斷與填充
(1)某實驗利用PCR技術獲取目的基因，實驗結果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對)外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。為了減少反應非特異條帶的產生，可以提高復性的溫度(2021·湖北，16)(　　)
(2)(2018·江蘇，32節選)為了便于擴增的DNA片段與表達載體連接，需在引物的____端加上限制性酶切位點，且常在兩條引物上設計加入不同的限制性酶切位點，主要目的是____________________________________。
(3)(2022·山東，25節選)為構建重組載體，需先設計引物，通過PCR特異性擴增P基因。用于擴增P基因的引物需滿足的條件是______________________________________________。為使PCR產物能被限制酶切割，需在引物上添加相應的限制酶識別序列，該限制酶識別序列應添加在引物的_________________________________________________________________
(填“3′端”或“5′端”)。
(4)(2019·江蘇，33節選)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質粒，擬設計引物進行PCR鑒定。如圖所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質粒中的相應位置，PCR鑒定時應選擇的一對引物是____________。某學生嘗試用圖中另外一對引物從某一菌落的質粒中擴增出了400 bp片段，原因是________________________。
(5)(2019·全國Ⅰ，38節選)在體外利用PCR技術擴增目的基因時，使反應體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是____________________。在PCR反應中使用Taq DNA聚合酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是________________________________________________
____________________________________________________________________________。
題組一　基因工程
1．(2022·江蘇南通高三一模)如圖1中的三個DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制性內切核酸酶的識別序列與切割位點，圖2為某種基因表達載體的示意圖(載體上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切點是唯一的)。請回答下列問題：
(1)經BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以與上述表達載體被____________酶切后的產物連接，理由是______________________________________________________________。
(2)圖2中啟動子的作用是___________________________________________，終止子的作用是______________________，抗生素抗性基因的作用是________________________。
(3)構建基因表達載體時，還需要用到DNA連接酶。常見的DNA連接酶有__________DNA連接酶和________DNA連接酶，其中能連接平末端的是__________DNA連接酶。
(4)若某人利用圖2所示的表達載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組DNA分子(如圖3所示)。這三種重組DNA分子中，不能在宿主細胞中表達目的基因產物的有________，原因是________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________。
2．抗體分子含有兩條短肽鏈和兩條長肽鏈，科研人員將小鼠編碼抗體(抗禽流感病毒HA抗原)可變區的基因片段與人編碼抗體恒定區的基因片段整合，構建圖1所示表達載體(Hind Ⅲ等表示不同限制酶的切割位點，EcoR V的識別序列和切割位點是)，導入中國倉鼠卵巢細胞后，篩選能夠穩定表達的細胞株，成功獲得大量嵌合抗體(圖2)。請根據資料回答下列問題：
(1)為構建人鼠嵌合抗體基因表達載體，需要對編碼抗體不同片段的基因進行重組，為此需從分泌鼠源單克隆抗體的雜交瘤細胞中提取______________，經逆轉錄得到________________用于PCR擴增，并分別與人抗體的恒定區DNA序列拼接。
(2)在PCR反應體系中需加入模板、________________、Taq DNA聚合酶、引物、緩沖液等，擴增過程中高溫處理的目的是______________________。若利用PCR技術擴增某基因片段時消耗了126個引物分子，則該過程擴增了__________次。
(3)圖1所示表達載體中除標注出的結構外還必須有_____________，圖中①是_____________識別和結合的部位。構建該基因表達載體時，先將人抗體的長鏈、短鏈基因部分序列分別與相應鼠抗體的可變區序列整合后插入到兩個啟動子的下游，這一過程需要用到多種限制酶，如獲得鼠抗體長鏈可變區基因用________________酶切；圖中⑤和⑥用______________(填“T4 DNA”或“E·coliDNA”)連接酶連接。
(4)通過基因工程技術成功表達并組裝出有生物學活性的嵌合抗體，該嵌合抗體的優點是______________________。
題組二　DNA片段的擴增及電泳鑒定
3．(2022·江蘇高三模擬)染色質是由一定長度的核小體為基本單位構成的。將大鼠肝細胞中分離出的染色質用非特異性核酸酶水解后去除染色質蛋白，對得到的DNA片段進行凝膠電泳，結果如圖所示。若先將染色質中的蛋白質去掉后用同樣的非特異性核酸酶處理，則得到隨機長度的DNA片段。據此分析，下列有關敘述錯誤的是(　　)
A．凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300 nm的紫外燈下被檢測出來
B．染色質中的蛋白質可能對DNA具有保護作用
C．構成核小體的基本單位是脫氧核糖核苷酸
D．在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠濃度、DNA分子的大小和構象等有關
4．如圖是將目的基因導入大腸桿菌內制備“工程菌”的示意圖，其中引物1～4在含有目的基因的DNA上的結合位置如圖甲所示，限制酶BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ 在質粒上的識別位點如圖乙所示。下列說法中錯誤的是(　　)
A．PCR過程完成4輪循環，理論上至少需加入引物30個
B．若已經合成了圖甲所示4種引物，應選擇引物2和3擴增目的基因
C．過程①中應使用限制酶BamH Ⅰ切割質粒
D．對于轉化失敗的大腸桿菌及其培養基應進行滅菌處理，以防其污染環境
題組三　蛋白質工程
5．(2022·海南海口高三模擬)利用木聚糖酶進行紙漿漂白，可以大幅度減少氯化物的用量，減輕造紙工業對環境的污染。紙漿漂白需要在高溫堿性條件下進行，因此需要耐熱耐堿的木聚糖酶。根據生產需要，科學家對已知氨基酸序列的木聚糖酶進行改造，獲得了耐高溫耐堿的新木聚糖酶，減少了紙漿漂白時木聚糖酶的用量，提高了生產效率。請回答下列問題：
(1)蛋白質工程的目標是根據人們對____________的特定需求，對蛋白質的結構進行設計改造。與蛋白質工程相比，基因工程原則上只能生產________________________。
(2)在蛋白質工程和基因工程中常用大腸桿菌作為受體細胞，原因是大腸桿菌______________
________________________________________________________________________________
(答出兩點)。分離純化大腸桿菌時，可使用接種環采用____________法將聚集的菌種逐步分離并培養成單菌落；實驗室中利用選擇培養基篩選微生物的原理是______________________
______________________________________________________________________________。
(3)人工合成的新木聚糖酶的基因在導入受體細胞前要先構建________________________，以使目的基因能夠表達和發揮作用。若要將重組大腸桿菌分泌的耐熱耐堿木聚糖酶應用于造紙工業生產，除了需要研究木聚糖酶的產量外，還需要檢測木聚糖酶的______________________
________________________________________________________________________。
(4)有研究表明，在木聚糖酶中特定部位引入精氨酸可以增加木聚糖酶中的離子鍵數目，從而增加該酶在堿性環境中的穩定性。利用蛋白質工程技術改造木聚糖酶，其基本思路是________
________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________。
根據新木聚糖酶的氨基酸序列設計新木聚糖酶的基因，會設計出多種脫氧核苷酸序列，原因是____________________________________________________________________________。
題組四　生物技術的安全性和倫理問題
6．(2022·江蘇高三模擬)根據下列2份材料回答有關生物技術的問題：
材料一　2012年諾貝爾醫學獎獲獎者分別是來自日本的科學家山中伸彌和來自英國的科學家約翰·格登。約翰·格登去除一只爪蟾卵細胞的細胞核，代之以取自蝌蚪的一個特殊細胞的細胞核。經處理的卵細胞發育成一只正常的蝌蚪。數十年后其他學者后續進行的核移植實驗成功克隆出哺乳動物，因而約翰·格登被尊為“克隆教父”。
2001年11月25日，美國先進細胞技術公司利用成人細胞首次克隆出人類早期胚胎，消息公布后，引起全世界的軒然大波；11月29日，中國衛生部明確表示：中國不贊成、不支持、不接受任何克隆人實驗，贊成以治療和預防疾病為目的的人類胚胎干細胞研究，但研究必須是有序的，并要在有效監控條件下進行。
(1)動物的克隆方法一般是供體(被克隆個體)的體細胞的核＋去核卵細胞重組細胞早期胚胎個體。“多莉”的誕生采用了上述技術路線，一般認為這種生殖(繁殖)方式是__________生殖。b過程在離體條件下進行，除了營養和適宜電脈沖刺激之外，至少還需要___________________________ (答出2點即可)等條件；c過程中應用了____________ 技術。
(2)克隆技術的突破說明了________________________________________________________
______________________________________________________________________________。
(3)克隆人在全世界引起軒然大波，中國衛生部反對克隆人，原因是________。
A．克隆立法相對滯后
B．如果克隆人早期胚胎的試驗不加控制地進行下去，克隆人終將誕生
C．克隆人一旦出現，人類的許多倫理觀念都會被推翻，同時會帶來人種優化、宗教混亂等社會政治問題
D．克隆技術并不絕對成熟，不能保證克隆出無缺陷的人
E．大力推廣克隆技術對保持生物多樣性具有重要意義
材料二　2006 年，山中伸彌首次利用逆轉錄病毒將四種轉錄因子“Oct4，Sox2，c－Myc，Klf4”導入已分化完全的小鼠成纖維細胞中，將其重新編排變成全能性的類胚胎細胞，這些重編排的細胞被命名為“誘導多能干細胞”，即iPS細胞。
(4)近些年的研究顯示，iPS細胞可以產生出機體內所有種類的細胞，由iPS細胞產生其他種類細胞的過程稱為____________ 。
(5)目前iPS細胞在實際應用中還存在許多問題。例如，有研究發現iPS細胞的增殖難以控制，即iPS細胞具有______細胞的特征。結合山中伸彌的研究過程分析，產生這種變化的最可能的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
考點三　真題研究
1．B　[低溫時DNA酶的活性較低，過濾液沉淀過程在4 ℃冰箱中進行是為了防止DNA降解，A正確；離心研磨液是為了使細胞碎片沉淀，B錯誤；在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑呈現藍色，C正確；細胞中的某些蛋白質可以溶解于酒精，可能有蛋白質不溶于酒精，在體積分數為95%的冷酒精中與DNA一塊析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白質，D正確。]
2．(1)限制性內切核酸(或限制)　核苷酸序列　(2)磷酸二酯鍵　DNA單鏈　以DNA為模板的DNA鏈的延伸
(3)②④　(4)B
解析　(3)PCR過程中，根據已知的DNA序列合成兩個引物，要注意模板鏈和引物的方向是相反的，引物的核苷酸序列要能夠和相應模板的核苷酸序列發生堿基互補配對，環狀DNA圖中顯示PCR過程是從已知DNA序列的兩端分別向相反方向形成子鏈，一個引物是與已知DNA序列的第一條鏈的左端互補結合，該引物是④，另一個引物是與已知DNA序列的第二條鏈的右端互補結合，該引物是②。(4)圖中由片段F形成的環狀DNA的未知序列中有一個EcoRⅠ限制酶的切割位點，而EcoRⅠ識別的位點是，因此片段F的單鏈中的一端應含有“AATTC－”序列，另一端應含有“TTAAG－”序列，B符合題意。
3．(1)①RNA　②蛋白M上不含tag標簽　③BC　(2)①黏性末端堿基配對　DNA連接　基因m的連接處、基因m的內部　(3)①受體菌在無尿嘧啶的培養基上無法生長，導入重組質粒的受體菌含有URA3基因可以長成菌落　②融合基因表達(或融合基因正確解碼)
解析　(1)①逆轉錄獲得cDNA的方式，要先從真菌細胞中提取基因m轉錄出來的mRNA。②從構建好的重組質粒上看，tag序列位于目的基因下游，若m基因的轉錄產物mRNA上有終止密碼子，核糖體移動到終止密碼子多肽鏈就斷開，則不會對tag序列的轉錄產物繼續進行翻譯，蛋白M上就不含tag標簽。③由題干信息“80 ℃以上再混入酶，然后直接從94 ℃開始PCR擴增”可知，Taq酶最適催化溫度范圍為94 ℃左右，A錯誤；PCR 反應的最初加熱過程中，樣品溫度上升到70 ℃之前，在較低的溫度下引物可能與部分單鏈模板形成非特異性結合，并在Taq DNA 聚合酶的作用下延伸，結果會導致引物錯配形成的產物的擴增，影響反應的特異性，熱啟動可減少引物錯配形成的產物的擴增，提高反應的特異性，B正確；DNA分子復制具有方向性，都是從5′端向3′端延伸，C正確；TaqDNA聚合酶沒有特異性，與普通的DNA聚合酶相比，TaqDNA聚合酶更耐高溫，D錯誤。故選BC。(2)①從圖上看，載體A只有一個Sma Ⅰ的酶切位點，故被Sma Ⅰ切開后，載體由環狀變為鏈狀DNA，將Sma Ⅰ切開的載體A與添加同源序列的m混合，用特定DNA酶處理形成黏性末端，然后降溫以促進載體A與添加同源序列的m的黏性末端堿基互補配對。將A－m結合體導入大腸桿菌，利用大腸桿菌中的DNA聚合酶及DNA連接酶等，完成質粒的環化。②重組質粒中，載體A被SmaⅠ切開的位置已經與基因m相連，原來的酶切位點已不存在，若正確構建的重組質粒A—m仍能被SmaⅠ切開，則SmaⅠ的酶切位點可能在基因m的連接處或基因m內部。(3)①篩選目的菌株的機理：導入了質粒A－m的目的菌株由于含有URA3基因，能在無尿嘧啶的培養基上存活，而URA3基因缺失型酵母則不能存活。②若通過抗原—抗體雜交實驗檢測到酵母蛋白中含tag標簽，位于tag標簽上游的基因m應該正常表達，說明融合基因表達(或融合基因正確解碼)。
思維延伸
(1)√　(2)5′　使DNA片段能定向插入表達載體，減少自連　(3)能與P基因母鏈的一段堿基序列互補配對、單鏈核酸　5′端　(4)乙、丙　目的基因反向連接　(5)加熱至90 ℃以上　Taq DNA聚合酶熱穩定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活
題組集訓
1．(1)Sau3A Ⅰ　兩種酶切割后產生的片段具有相同的黏性末端　(2)RNA聚合酶的識別和結合部位　使轉錄過程停止　便于重組DNA分子的篩選　(3)E.coli　T4　T4　(4)甲和丙 　甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉錄
解析　(1)經BamHⅠ酶切后得到的黏性末端是－GATC－，與Sau3AⅠ酶切后獲得的黏性末端相同，所以經BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以與上述表達載體被Sau3AⅠ酶切后的產物連接。(2)啟動子是RNA聚合酶的識別和結合部位，與RNA聚合酶結合后，開始進行轉錄過程；終止子使轉錄過程停止；抗生素抗性基因表達后，則生物具有抗生素抗性，便于重組DNA分子的篩選。(4)在基因表達載體中，目的基因應位于啟動子和終止子之間才能表達。甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉錄。
2．(1)鼠抗體mRNA(或mRNA或鼠抗體可變區mRNA)　鼠抗體cDNA(或cDNA或鼠抗體可變區cDNA)　(2)4種脫氧核苷酸(4種dNTP)　使DNA變性(使DNA兩條鏈分開、獲得DNA單鏈)　6　(3)復制原點　RNA聚合酶　Hind Ⅲ和KpnⅠ　T4 DNA　(4)減少發生免疫排斥反應
解析　(1)基因工程的第一步是目的基因的篩選與獲取，可以通過mRNA逆轉錄得到相應的DNA；從分泌鼠源單克隆抗體的雜交瘤細胞中提取鼠抗體mRNA(或mRNA或鼠抗體可變區mRNA)，經逆轉錄得到鼠抗體cDNA(或cDNA或鼠抗體可變區cDNA)用于PCR擴增。(2)PCR是體外進行DNA復制的過程，在PCR反應體系中需加入模板、4種脫氧核苷酸(4種dNTP)、TaqDNA聚合酶(耐高溫的DNA聚合酶)、引物及緩沖液等；高溫處理使DNA 變性，雙鏈DNA解聚為單鏈，有利于DNA復制的正常進行，溫度降低后DNA復性。擴增片段消耗126個引物，即合成了126條子鏈，設擴增n次，則2n×2－2＝126，n＝6，即進行了6次擴增。(3)構建表達載體時，質粒除了圖示結構外還需有復制原點；由圖可知，①啟動子是RNA聚合酶識別和結合位點，可以驅動相關基因轉錄。由圖可知，③為鼠抗體長鏈可變區基因，因此將③經Hind Ⅲ和KpnⅠ雙酶切，以獲得相應的黏性末端。⑤和⑥經EcoR Ⅴ切開，為平末端，用T4 DNA連接酶進行連接。(4)鼠抗體注射到人體會引起免疫應答，通過基因工程技術成功表達并組裝出有生物學活性的嵌合抗體，能夠減少免疫排斥反應的發生。
3．C
4．B　[PCR 技術大量擴增目的基因時，緩沖液中需要加入的引物個數計算公式為2n＋1－2(n為循環次數)，因此PCR過程完成4輪循環，理論上至少需加入引物24＋1－2＝30(個)，A正確；由于DNA聚合酶只能從5′端→3′端延伸子鏈，因此擴增目的基因時應選擇引物1和4，B錯誤；①是基因表達載體的構建過程；若使用限制酶EcoRⅠ切割質粒會將目的基因插入啟動子上游，目的基因不能正確表達；使用限制酶HindⅢ切割質粒將破壞標記基因，不利于目的基因的鑒定和篩選，因此該過程中應使用限制酶BamHⅠ切割質粒，C正確；為了防止污染環境，對于轉化失敗的大腸桿菌及其培養基應進行滅菌處理，D正確。]
5．(1)蛋白質功能　自然界中已存在的蛋白質　(2)為單細胞、繁殖快、遺傳物質相對較少　平板劃線　人為提供有利于目的菌生長的條件，同時抑制或阻止其他微生物的生長
(3)基因表達載體　生物活性(催化效率)　(4)根據需要對耐堿的木聚糖酶的功能特點，設計新木聚糖酶中特定部位引入精氨酸以后的氨基酸序列，推測出其基因中的脫氧核苷酸序列，然后利用DNA合成儀合成新木聚糖酶基因　密碼子具有簡并現象(或存在多種密碼子決定同一種氨基酸的現象)
6．(1)無性　適宜的溫度、pH、滲透壓，無菌無毒的環境　胚胎移植　(2)高度分化的動物細胞核具有全能性　(3)ABCD　(4)細胞分化　(5)癌　逆轉錄病毒含有病毒癌基因以及致癌有關的核酸序列，可通過感染小鼠的成纖維細胞，將其基因組整合進入小鼠的成纖維細胞中，誘發細胞癌變

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