資源簡介

[實驗基礎·自主學習]
1．實驗原理
20%馬鈴薯蔗糖培養基的配方：去皮馬鈴薯絲(或小塊)20 g，蔗糖2 g，瓊脂1.5～2 g，水100 mL(自然pH)。
2．方法步驟
(1)計算：根據配方計算出配制培養基所需的馬鈴薯、蔗糖和瓊脂的用量。
(2)配制20%馬鈴薯浸汁：取馬鈴薯去皮，稱取所需量，切成絲或小塊，加水至所需量。用酒精燈加熱煮沸10 min后，用紗布過濾到500 mL三角瓶中，按所需量加入蔗糖，待其溶化后補足水至所需體積，搖勻。
(3)制備斜面、固體和液體培養基
液體培養基：將部分上述馬鈴薯浸汁分裝到2個50 mL三角瓶中，每瓶約20 mL，封口。
斜面培養基：按需要量稱取瓊脂，將其加入上述500 mL的三角瓶中，加熱溶化后，用玻璃漏斗將培養基分裝到2支18 mm×180 mm的試管中，每支5～8 mL。
固體培養基：將用于制備斜面培養基后剩余的培養基分裝到250 mL三角瓶中，封口。
將上述固體、液體和斜面培養基放入高壓滅菌鍋，在1 kg/cm2、121 ℃條件下滅菌20 min，滅菌后將斜面培養基擺成斜面。
(4)制作棉塞
用棉花制作試管棉塞時，要先確定棉塞的長度和粗細。棉塞長度要保證既塞住瓶口(進入瓶口約3～4 cm)，在瓶口外又要留有一定的長度(約2 cm)，方便在接種時用無名指、小拇指取下來；棉塞粗細也要適當，以不易脫落為度。
[實驗關鍵·探究學習]
1．制備斜面培養基操作提示：①注意控制好溫度，防止培養基提前凝固。②不要讓培養基粘在試管口。③試管中的液體量約為試管長度的1/4。試管加棉塞后，用牛皮紙包好。
2．制作棉塞時值得注意的是，由于脫脂棉吸水后容易引起污染，所以制作棉塞應該使用普通棉花，而不能使用醫用的脫脂棉。
[實驗應用·對點練習]
將馬鈴薯去皮切塊，加水煮沸至馬鈴薯軟爛，過濾得到馬鈴薯浸出液。在馬鈴薯浸出液中加入一定量葡萄糖和瓊脂，用蒸餾水定容后滅菌，得到馬鈴薯瓊脂培養基。回答下列問題。
(1)馬鈴薯瓊脂培養基中的馬鈴薯浸出液為微生物生長提供了多種營養物質，營養物質類型除氮源外還有________________(答出兩點即可)。氮源進入細胞后，可參與合成的生物大分子有________________ (答出兩點即可)。
(2)分離培養酵母菌通常使用馬鈴薯瓊脂培養基，該培養基在進行接種前要進行________。將酵母菌菌種劃線接種在平板上，培養一段時間后可觀察到菌落，菌落的含義是____________________________________________________
____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
(3)該培養基按物理性質劃分屬于________培養基，若要對酵母菌進行擴大培養，此培養基中不應加入的物質是________。
[解析]　(1)馬鈴薯浸出液中含有淀粉、蛋白質、脂質、無機鹽、水等多種物質，因此，除氮源外其中還有微生物生長所需要的碳源、無機鹽等營養要素。進入細胞的氮源可參與合成蛋白質、核酸(DNA、RNA)等含氮的生物大分子。(2)培養基在使用前常用高壓蒸汽滅菌；菌落概念見答案。(3)該培養基中有凝固劑，屬于固體培養基，若要對酵母菌進行擴大培養，此培養基中不應加入凝固劑。
[答案]　(1)碳源、無機鹽　蛋白質、核酸
(2)(高壓蒸汽)滅菌　分散的微生物在適宜的固體培養基表面或內部可以繁殖形成的肉眼可見的、有一定形態結構的子細胞群體
(3)固體　凝固劑第一節　微生物的培養需要適宜條件
課標內容要求 核心素養對接
1.闡明在發酵工程中滅菌是獲得純凈的微生物培養物的前提。2.闡明無菌技術是在操作過程中，保持無菌物品與無菌區域不被微生物污染的技術。 1.科學思維——根據微生物的代謝類型分析培養基的組成；認識無菌技術是獲得純凈微生物培養物的重要方法。2.科學探究——討論并掌握無菌技術的實驗操作方法；嘗試配制培養基培養酵母菌。
一、培養基為目標微生物提供適宜的生長環境
1．微生物和無菌技術
(1)微生物是人們對所有形體微小、肉眼不可見的生物的統稱。
(2)無菌技術：在培養某種微生物時，防止其他微生物混入，保持無菌物品及無菌區域不被污染的操作技術稱為無菌技術。
2．培養基
人們為滿足微生物生長繁殖或積累代謝產物的需求而配制的混合養料。
3．培養基的成分與細胞的化學組成及其在細胞代謝中的作用有關。
(1)水：培養基中含量最高。
(2)無機鹽
①影響微生物細胞的吸水能力。
②影響微生物的代謝及生長。
(3)碳源：為微生物生長提供碳元素的物質。
(4)氮源：為微生物生長提供氮元素的物質。
(5)生長因子：由于自身的缺陷，有些微生物對培養基成分有特殊的需求，需要在培養基中有針對性地添加某些特定的維生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶等有機化合物才能生長，這些化合物統稱為生長因子。
(6)微生物生活所需要的能量來源
①異養型微生物：培養基中的有機物。
②自養型微生物：光能或化學反應釋放的能量。
4．培養基的理化特性影響微生物的生長。
(1)“細菌喜葷，霉菌喜素”
①細菌培養基中要含有較高的有機氮，因此常用蛋白胨和酵母提取物等來配制。
②霉菌培養基一般用可溶性淀粉加無機物配制，或用添加蔗糖的豆芽汁等配制。
(2)制備培養基時要注意調節培養基的pH
①細菌通常要求在中性偏堿的環境中生長。
②霉菌要求在中性偏酸的環境中生長。
5．根據培養基的物理特征可以把培養基分成液體培養基和固體培養基等。
(1)液體培養基是沒有添加凝固劑的培養基，常用于大規模快速繁殖某種微生物。
(2)固體培養基(solid medium)通常是在液體培養基中添加一定量的凝固劑制成的。
①“平板”：將滅菌后未凝固的固體培養基注入培養皿中，冷凝后制成的固體培養基簡稱為“平板”。常用于微生物的分離、鑒定、活菌計數等。
②“斜面”：將滅菌后未凝固的固體培養基注入試管，將試管斜放在臺面上，培養基冷卻后在試管中形成了一個斜面，這樣的固體培養基簡稱為“斜面”，常用于菌種保存。
6．根據培養基的化學成分可以把培養基分成合成培養基和天然培養基等。
二、滅菌和無菌操作技術可以排除非目標微生物的干擾
1．保證器具與培養基無菌是獲得微生物“純”培養物的基礎。
(1)芽孢：某些種類的細菌會在營養缺乏或代謝產物積累的環境中形成沒有繁殖功能的休眠構造，稱為芽孢。
對于加熱、紫外線照射和化學藥物都具有極強的抵抗能力。
(2)消滅器具和培養基中可能存留的各種類型微生物的方式：高壓滅菌。
2．使用高壓滅菌鍋滅菌時所需的溫度、壓力和時間是根據要消滅的微生物芽孢等結構的耐熱性來確定的。
(1)實例
①肉毒梭菌的芽孢：在pH 7.0的100 ℃沸水中要煮5.0～9.5 h才能被殺滅，當溫度提高到115 ℃加壓滅菌時，時間就能縮短到10～40 min，將溫度提高到121 ℃時只需要10 min就能完成。
②保證外科手術器械無菌、安全：要在115 ℃下滅菌30 min或在121 ℃下滅菌10 min，這樣才能殺死致病菌破傷風梭菌(Tetani)和產氣莢膜梭菌(Perfringens)的芽孢。
(2)在微生物實驗中用121 ℃(1 kg/cm2壓力)對實驗器具和培養基進行15～20 min的滅菌處理是比較安全的。
3．滅菌后，要將高壓滅菌鍋中的實驗用具及培養基及時取出。
(1)培養基
①取出后，放入超凈工作臺。
②分裝最好在超凈工作臺內的酒精燈火焰旁完成。
③分裝時注意事項：不要讓培養基黏附在三角瓶口、試管口、培養皿內壁上，以免在培養過程中非目標微生物從瓶口沿器皿內壁上的培養基向內生長而發生污染。
(2)實驗器具
①取出后，放入60～80 ℃的烘箱中烘干，除去滅菌時高壓蒸汽產生的水分以免金屬器械銹蝕。
②在進行分裝或接種操作前，將需要使用的、已滅菌的用具從烘箱中取出，放到超凈工作臺中，然后打開紫外燈和過濾風開關，滅菌30 min。
4．接種過程中，防止其他微生物進入培養基是獲得純培養物的關鍵環節。
(1)接種：將目標微生物轉移到培養基中的過程稱為接種。
(2)接種工具：涂布器、接種環等。
①接種環：用接種環接種前，要先將接種環的環部、金屬絲、金屬絲與柄的連接部、連接部的上端在明火上灼燒，使黏附在其表面的微生物在高溫中炭化，待接種環冷卻后再接種。
②涂布器：在使用涂布器接種時，應將涂布器浸泡在75%的酒精中。接種前將表面殘留著少量酒精的涂布器在酒精燈火焰上灼燒，冷卻后用于涂布。
(3)瓶口或試管口：在接種過程中，打開塞子后和塞上塞子前都要將瓶口或試管口在酒精燈火焰上灼燒滅菌。
(4)接種時要靠近酒精燈的火焰，利用燃燒產生的上升氣流減少空氣中微生物落入培養基的可能性。
判斷對錯(正確的打“√”，錯誤的打“×”)
1．液體培養基含有水，而固體培養基不含水。 (×)
提示：液體培養基和固體培養基都含有水，它們的區別為是否含有凝固劑。
2．獲得純凈微生物培養物的基礎是保證器具與培養基無菌。 (√)
3．用于微生物培養的器皿、接種用具和培養基都要進行消毒。 (×)
提示：用于微生物培養的器皿、接種用具和培養基都要進行滅菌。
4．培養基分裝到培養皿后進行滅菌。 (×)
提示：培養基分裝到培養皿之前要進行滅菌。
5．“平板”“斜面”都常用于微生物的分離、鑒定、活菌計數等。 (×)
提示：“平板”常用于微生物的分離、鑒定、活菌計數等，而“斜面”則常用于菌種保存。
6．將目標微生物轉移到培養基中的過程稱為接種。 (√)
　培養基為目標微生物提供適宜的生長環境
1．培養基的成分及功能
營養要素 來源 功能
水 ①細胞中含量最高，培養基中含量最高的也是水②細胞的重要組成成分
無機鹽 ①影響微生物細胞的吸水能力②影響微生物的代謝及生長
碳源 ①無機碳，如CO2②有機物 ①用于微生物構建自身有機物②對異養型微生物而言，有機物既是碳源又能滿足它們對能量的需求
氮源 含氮化合物 用于微生物合成自身的蛋白質等有機物
生長因子 特定的維生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶等有機化合物 滿足微生物生長對培養基成分的特殊需求
2.培養基的種類
分類標準 培養基種類 培養基特點 作用
物理特征 固體培養基 “平板” 添加凝固劑，如瓊脂 常用于微生物的分離、鑒定、活菌計數等
“斜面” 常用于菌種保存
物理特征 半固體培養基 容器放倒不致流出，劇烈震動則破散 觀察微生物的運動、分類鑒定
液體培養基 不添加凝固劑 常用于大規模快速繁殖某種微生物
化學成分 合成培養基 化學成分完全清楚 一般用于在實驗室進行的、要求可重復性強的各種研究工作
天然培養基 用化學成分還不十分清楚或成分不恒定的天然有機物制成 除了在實驗室常用外，更多地被用于大規模的生物發酵工業
1．能夠利用無機碳源的微生物的同化作用類型是什么？
提示：能利用無機碳源的微生物的同化作用類型是自養型微生物。
2．牛肉膏蛋白胨培養基是一種常見的細菌培養基，其中牛肉膏、蛋白胨能夠提供哪些營養成分？
提示：牛肉膏、蛋白胨能夠提供碳源、氮源、維生素(生長因子)和無機鹽。
1．(2020·北京西城區高二下期中)下列有關培養基配制的描述，正確的是(　　)
A．液體培養基常用于菌種的分離、計數、鑒定
B．任何培養基都必須含有碳源、氮源、水、無機鹽等成分
C．是依據人們的需求，配制出的供微生物生長繁殖的營養基質
D．微生物的生長除受營養因素影響外，還受pH、滲透壓等影響
D　[固體培養基常用于菌種的分離、計數、鑒定，A錯誤；培養基不一定含有碳源、氮源，如培養自養型微生物的培養基不需加碳源，分離自生固氮菌的培養基不需加氮源，B錯誤；人們按照微生物對營養物質的不同需求，配制出的供其生長繁殖的營養基質叫培養基，C錯誤；微生物的生長除受營養因素影響外，還受pH、氧氣、滲透壓等的影響，D正確。]
2．如表所示為某培養基的配方，下列敘述錯誤的是(　　)
成分 NaNO3 K2HPO4 MgSO4·7H2O (CH2O) 蒸餾水 青霉素
含量 3 g 1 g 0.5 g 30 g 定容至1 000 mL 0.1萬單位
A．根據物理性質劃分，該培養基屬于液體培養基
B．根據用途劃分，該培養基屬于選擇培養基
C．根據培養基的配方可知，該培養基培養的微生物的同化作用類型是異養型
D．固體培養基中加入少量水即可形成液體培養基
D　[固體培養基和液體培養基的區別在于是否加入凝固劑(如瓊脂)，題表所示的培養基配方中沒有瓊脂，因此屬于液體培養基，A正確、D錯誤；加入青霉素可分離得到酵母菌和霉菌等，因此該培養基屬于選擇培養基，B正確；該培養基中的(CH2O)可作為有機碳源，因此其培養的微生物的同化作用類型是異養型，C正確。]
　滅菌和無菌操作技術可以排除非目標微生物的干擾
1．滅菌和無菌操作技術
(1)目的：保證得到的培養物就是所需要的微生物。
(2)獲得微生物“純”培養物的基礎：保證器具與培養基無菌。
(3)方法
①除掉各種微生物簡便易行的辦法：加熱。
②消滅器具和培養基中可能存留的各種類型微生物的方法：高壓滅菌。
(4)使用高壓滅菌鍋滅菌
①滅菌時
a．所需的溫度、壓力和時間是根據要消滅的微生物芽孢等結構的耐熱性來確定的。
b．在微生物實驗中用121 ℃(1 kg/cm2壓力)對實驗器具和培養基進行15～20 min的滅菌處理是比較安全的。
②滅菌后：要將實驗用具及培養基及時取出。
③對含葡萄糖的培養基：采用適當降低溫度、壓力(112 ℃，500 g/cm2)以及延長時間(30 min)的高壓滅菌方法滅菌。
④在全部培養工作結束后，所有使用過的器皿、廢棄物等都必須先經過高壓滅菌后再洗滌或傾倒。
(5)接種過程中，防止其他微生物進入培養基是獲得純培養物的關鍵環節。
①接種所使用的涂布器或接種環等工具均需滅菌后再使用。
②在接種過程中，打開塞子后和塞上塞子前都要將瓶口或試管口在酒精燈火焰上灼燒滅菌。
③接種時要靠近酒精燈的火焰。
④盡量減少各種器皿敞口向上的時間和機會。
2．滅菌、消毒與防腐
處理方法 結果 應用實例
滅菌 強烈的物理、化學方法 殺滅物體表面以及內部的一切微生物 對器具和培養基進行高壓蒸汽滅菌
消毒 較溫和的物理、化學方法 僅殺死物體表面或內部一部分不需要的微生物 消毒劑對皮膚、水果或飲用水進行消毒
防腐 根據微生物生長繁殖的特點，控制理化因素 抑制微生物生長繁殖 用除氧劑抑制需氧型微生物的繁殖；采用低溫、鹽腌、糖漬、干燥等防腐措施保存食物
3．微生物的實驗室培養獲得純凈培養物的關鍵是防止外來雜菌入侵。下列無菌操作中，錯誤的是(　　)
A．對實驗用的培養基，采用高壓蒸汽滅菌鍋進行滅菌
B．接種所使用的涂布器或接種環等工具均需滅菌后再使用
C．對操作者的雙手、衣著以及操作空間等，采用紫外線進行消毒
D．對試管口、錐形瓶口等部位，通過火焰灼燒進行滅菌
C　[對實驗用的培養基，采用高壓蒸汽滅菌鍋進行滅菌，A項正確；接種所使用的涂布器或接種環等工具均需滅菌后再使用，B項正確；對操作者的雙手采用酒精進行消毒，C項錯誤；對試管口、錐形瓶口等部位，通過火焰灼燒進行滅菌，D項正確。]
4．為保證得到的培養物就是所需要的微生物，消滅器具和培養基中可能存留的各種類型微生物需要使用高壓滅菌的方式，下列相關敘述錯誤的是(　　)
A．使用高壓滅菌鍋滅菌時所需的溫度、壓力和時間是根據要消滅的微生物芽孢等結構的耐熱性來確定的
B．在微生物實驗中用121 ℃(1 kg/cm2壓力)對實驗器具和培養基進行15～20 min的滅菌處理是比較安全的
C．考慮到高壓滅菌鍋的使用效率，往往將培養基集中在一個較大的容器中放入高壓滅菌鍋滅菌
D．對含葡萄糖的培養基，采用適當升高溫度、壓力以及延長時間(30 min)的高壓滅菌方法滅菌
D　[由于葡萄糖在115 ℃以上會焦化，故對含葡萄糖的培養基可采用適當降低溫度、壓力(112 ℃、500 g/cm2壓力)以及延長時間(30 min)的高壓滅菌方法滅菌。]
問題探究1通過對某種微生物培養基成分的分析培養學生的物質與能量觀、適應觀等生命觀念，認識生物的多樣性、獨特性；問題探究2通過無菌操作培養學生實驗操作、實施實驗的科學探究能力。
1．(1)材料1中，該培養基含有微生物生長所需要的營養成分有哪幾類？(生命觀念)
提示：該培養基含有的營養成分有三類：水、無機鹽和氮源。
(2)該培養基可培養什么樣的微生物？說明理由。(生命觀念)
提示：該培養基培養的是自養型微生物，因為該培養基中不含含碳有機物。
(3)若除去成分①，加入(CH2O)，該培養基可用于培養什么樣的微生物？(科學探究)
提示：若除去成分①，加入含碳有機物可用于培養固氮菌。
2．在培養基配制和微生物接種的過程中，確保無雜菌污染被稱為無菌操作。材料2的圖中符合無菌操作要求的有哪些？(科學探究)
提示：①②③⑤。
[課堂小結]
知 識 網 絡 構 建 核 心 語 句 背 誦
1.發酵工程是采用現代工程技術手段，利用微生物的某些特定功能，為人類生產有用的產品，或直接利用微生物的工作過程。2.培養基的成分中應包含微生物生長所需的水、無機鹽、碳源、氮源、生長因子等。3.培養基的理化特性影響微生物的生長。不同的微生物代謝需求不同，只有滿足目標微生物的代謝需求，才能使其快速生長。4.根據培養基的物理特征可以把培養基分成液體培養基和固體培養基等。根據培養基的化學成分可以把培養基分成合成培養基和天然培養基等。5.保證器具與培養基無菌是獲得微生物“純”培養物的基礎。接種過程中，防止其他微生物進入培養基是獲得純培養物的關鍵環節。6.配制可用于培養酵母菌的馬鈴薯蔗糖斜面培養基操作提示：(1)注意控制好溫度，防止培養基提前凝固。(2)不要讓培養基粘在試管口。(3)試管中的液體量約為試管長度的1/4。試管加棉塞后，用牛皮紙包好。
1．不同培養基的具體配方不同，但一般都含(　　)
A．碳源、磷酸鹽和維生素
B．氮源和維生素
C．水、碳源、氮源和無機鹽
D．碳元素、氧元素、氫元素、氮元素
C　[培養基中一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽，此外還應考慮pH、特殊營養物質及O2等條件。]
2．下列有關培養基的說法，正確的是(　　)
A．液體培養基是指只加了水的培養基
B．固體培養基是指加熱凝固了的培養基
C．分離某一特定的微生物時，應選用選擇培養基
D．為了保證培養基成分不變，滅菌溫度不能超過100 ℃
C　[配制成的液體狀態的基質稱為液體培養基，不含凝固劑成分，一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽，A錯誤；固體培養基是指在液體培養基中加入了凝固劑的培養基，B錯誤；分離某一特定的微生物時，應選用選擇培養基，C正確；對培養基滅菌常用高壓蒸汽滅菌，為達到良好的滅菌效果，一般在壓力為100 kPa，溫度為121 ℃的條件下，維持15～30 min，D錯誤。]
3．采用干熱滅菌、灼燒滅菌、高壓蒸汽滅菌、紫外線照射等幾種方法，可分別殺死哪些部位的雜菌(　　)
A．接種環、吸管、培養基、接種室
B．吸管、接種環、培養基、接種箱
C．培養基、吸管、接種環、接種箱
D．培養皿、吸管、培養基、雙手
B　[干熱滅菌是將滅菌物品放入干熱滅菌箱內，在160～170 ℃下加熱2～3 h，適用于耐高溫且需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培養皿)和金屬用具等；灼燒滅菌是利用酒精燈火焰的充分燃燒層滅菌，如接種針、接種環等；高壓蒸汽滅菌用高壓蒸汽滅菌鍋，一般在壓力為100 kPa、溫度為121 ℃的條件下，維持15～30 min，主要用于培養基滅菌；紫外線照射適用于物體表面滅菌和空氣滅菌，如接種室、接種箱、超凈工作臺等，使用前用紫外線照射約30 min。]
4．防止雜菌入侵并獲得純凈的培養物是研究和應用微生物的前提。下列敘述錯誤的是(　　)
A．實驗室里可以用紫外線或化學藥物進行消毒
B．接種環、接種針等金屬用具，直接在酒精燈火焰的內焰部位灼燒滅菌
C．在實驗室中，切不可吃東西、喝水，離開實驗室時一定要洗手，防止被微生物感染
D．使用后的培養基丟棄前一定要進行滅菌處理，以免污染環境
B　[接種環、接種針等金屬用具，直接在酒精燈火焰的充分燃燒層即外焰部位灼燒滅菌，B錯誤。]
5．下表是某微生物培養基成分，請據此回答下列問題。
編號 成分 含量
① 粉狀硫 10 g
② (NH4)2SO4 0.4 g
③ K2HPO4 4.0 g
④ MgSO4 9.25 g
⑤ FeSO4 0.5 g
⑥ CaCl2 0.5 g
⑦ H2O 100 mL
(1)上表培養基可培養的微生物類型是________。
(2)若除去成分②，加入(CH2O)，該培養基可用于培養______。
(3)表中營養成分共有________類。
(4)不論何種培養基，在各種成分都溶化后分裝前，要進行的是________________。
(5)若上表培養基用于菌種鑒定，應該增加的成分是____________。
[解析]　(1)由題表可知，該培養基中沒有碳源，說明培養的微生物是從外界環境中獲取碳源的，因此培養的微生物是自養型微生物。
(2)該培養基若加入(CH2O)，培養基中就有了碳源，但除去成分②，培養基中就沒有了氮源，該培養基就只能用于培養固氮微生物。
(3)題表中的營養物質有水、無機鹽、無機氮源三類，缺乏碳源和特殊營養物質。
(4)微生物生長需要一定的pH，所以培養基裝瓶前需要調節pH。
(5)該培養基中無凝固劑，為液體培養基。菌種的純化和鑒定通常利用固體平板培養基以獲得單細胞菌落，因此需要加入凝固劑，如瓊脂，將液體培養基轉變成固體培養基。
[答案]　(1)自養型微生物　(2)固氮微生物　(3)三　(4)調節pH　(5)凝固劑第二節　純凈的目標微生物可通過分離和純化獲得
課標內容要求 核心素養對接
1.舉例說明通過調整培養基的配方可有目的地培養某種微生物。2.概述稀釋涂布平板法和顯微鏡計數法是測定微生物數量的常用方法。 1.生命觀念——通過實例理解各類微生物都能適應其生活環境。2.科學思維——根據微生物的代謝類型配制選擇培養基；總結分離微生物的過程和測定微生物數量的常用方法。3.科學探究——討論土壤中分解尿素的細菌的分離與計數的實驗方法并對實驗結果進行評價。
一、采用劃線或涂布的接種方法能夠實現對目標微生物的分離和純化
1．接種
(1)定義：接種是指微生物進入培養基質的過程。
(2)類型：自然接種和人為接種。
2．單菌落
在固體培養基上采用劃線或稀釋涂布的方法接種，通過培養能獲得由一個細胞分裂形成的、肉眼可見的、有一定形態構造的子細胞集團，這樣的細胞集團稱為單菌落。
3．平板劃線法
(1)連續平行劃線是從培養基上的一點出發，向左右連續劃平行線至覆蓋整個培養基表面。(如圖A)
(2)扇形劃線是從培養基上的一點出發，向多方向多次劃線，每劃一條線都要將接種環在酒精燈的火焰上滅菌，然后再次從同一起點變換方向劃線。(如圖B)
A．連續平行劃線　B．扇形劃線
(3)多次連續平行劃線接種時，劃線可分3～4次進行。將培養皿旋轉一定角度后，不需再次蘸取菌種，只需在上一次劃線的末端區域直接開始劃線即可。(如圖C)
(1)　　　　(2)　　　(3)　　　　(4)
C．多次連續平行劃線
4．稀釋涂布平板法
稀釋涂布平板法(pour spread method)接種時，通常需要先將菌液進行梯度稀釋，并在培養皿側面或底面做好標記后，將稀釋度不同的菌液各取0.1 mL，加在固體培養基表面，然后用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基表面上進行培養。
二、稀釋涂布平板法和顯微鏡計數法可測定微生物的數量
1．測定微生物數量的目的：了解目標微生物的繁殖速度_。
2．稀釋涂布平板法
(1)問題：平板上的菌落即使是分開的，也可能難以數清其數量。如果菌落太多，準確數出菌落數并不容易，這會導致最終的計算結果出現較大誤差。而菌液稀釋度過大，菌落數少，雖然容易準確計數菌落數，但可能存在較大的隨機誤差。
(2)解決方法：一是在保證能準確計數的前提下減小稀釋度；二是將相同稀釋度下的多組數值取平均值后再進行計算。即：每毫升菌液中微生物細胞的數量＝某一稀釋倍數下至少3個培養皿的平均菌落數÷菌液稀釋液體積×稀釋倍數。
3．顯微鏡計數法
(1)血細胞計數板
①側面觀
1．血細胞計數板　2.蓋玻片　3.中央平臺　4.凹槽
②中央平臺上、下兩個部分各刻有一個計數區。
③計數區由長、寬各1 mm的9個大方格組成。
④大方格
a．每個大方格內的液體體積：0.1_mm3。
b．分類：紅細胞計數區和白細胞計數區。
c．紅細胞計數區又用雙線分成25(或16)個中方格，每個中方格再用單線劃分為16(或25)個小方格。
(2)用顯微鏡進行酵母細胞計數
①步驟：先將專用的蓋玻片蓋在計數板上，再用吸管在中央平臺蓋玻片邊緣滴加搖勻的酵母菌懸液，讓菌液滲入蓋玻片下直至充滿計數區。
②注意事項：滴加菌液時，一方面要避免菌液滴到蓋玻片上，另一方面要注意防止產生氣泡，以免影響計數結果。
③計數區域：紅細胞計數區。
④取樣原則：隨機取樣。
⑤對有25個中方格的紅細胞計數區取樣方法：“五點取樣”。
⑥在計數每一小方格中的細胞數時，應只計數每一小方格上方和左側線條上的細胞數(即“數上不數下”“數左不數右”)。
⑦每毫升菌液中的酵母細胞數：酵母細胞個數/mL＝80個小方格細胞總數/80×400×10_000×稀釋倍數。
三、調整培養基的配方和培養方式可有目的地培養某種微生物
1．不同自然環境中生活著的微生物代謝類型不盡相同。
2．許多微生物的代謝方式并不唯一。
(1)某些異養型微生物在有有機物存在的情況下可同時將CO2轉變為自身的物質。
(2)自養型微生物也并非不能利用有機物生長。
(3)營養方式的可變性提高了微生物在環境中的生存能力。
3．培養基中營養物質的濃度及比例都會影響微生物的生長。
4．選擇培養基
(1)概念：在培養基中添加(或減去)某種化學成分，使得只有某些特定的微生物能夠生長，其他微生物均不能生長，這樣的培養基稱為選擇培養基。
(2)用途
①從混雜的微生物群體中快速篩選出所需種類的目標微生物。
②從已知種類的混雜的細胞群體中篩選出特定的細胞。
判斷對錯(正確的打“√”，錯誤的打“×”)
1．轉換劃線角度后需要灼燒接種環再進行劃線。 (√)
2．在用涂布器涂布平板時，為了操作方便可完全打開培養皿蓋。
(×)
提示：為了防止雜菌污染，不能完全打開皿蓋。
3．統計菌落數目時，統計的菌落數就是活菌的實際數目。 (×)
提示：由于當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落，所以統計的菌落數往往比活菌的實際數目少。
4．借助于顯微鏡、血細胞計數板也能在顯微鏡下直接對菌液中的酵母細胞進行計數。 (√)
5．異養微生物只能以有機物為碳源，自養微生物也可以利用有機物生長。 (×)
提示：某些異養微生物在有有機物存在的情況下可同時將CO2轉變為自身的物質，它們只是不以CO2為唯一碳源。
6．分解尿素的細菌在分解尿素時，可以將尿素轉化為氨，使得培養基的pH降低。 (×)
提示：尿素分解菌將尿素轉化為氨，使培養基的pH升高。
　采用劃線或涂布的接種方法能夠實現對目標微生物的分離和純化
1．兩種純化方法的比較
主要方法 平板劃線法 稀釋涂布平板法
主要步驟 接種環在固體培養基表面劃線 系列梯度稀釋操作和涂布平板操作
接種工具 接種環 涂布器
菌體獲取 在具有顯著的菌落特征的區域挑取菌體 從適宜稀釋度的平板上的菌落中挑取菌體
能否用于計數 不能計數 可以計數，但是操作復雜，需涂布多個平板
共同點 都能將微生物分散到固體培養基表面，以獲得單細胞菌落，達到分離純化微生物的目的，也可用于觀察菌落特征
2.接種、培養并分離酵母菌
(1)目的要求
①用平板劃線法或稀釋涂布平板法接種酵母菌。
②用液體培養基大量擴增酵母菌。
(2)方法步驟
制作平板→接種(用平板劃線法接種、用稀釋涂布平板法接種，將菌種接種到液體培養基中)→培養→觀察培養結果→挑取菌落利用劃線法接種至試管斜面培養基中。
(3)注意事項
①在用接種環蘸取菌液進行接種前，應在酒精燈火焰上從接種環的圓環處依次向上灼燒滅菌。
②為避免滅菌后接種環的高溫燙死菌種，應在挑取菌種前將接種環貼在培養容器內壁上降溫。
③初次劃線時可參照培養皿底面的標記點進行劃線，以保證有最好的劃線分離效果。
④在使用蘸有酒精的涂布器對平板中的菌液進行涂布時，應先在火焰上使酒精燃燒盡。此時手持涂布器的部位應高于火焰上的部位，以免酒精沿器具流下，燒傷手指。
⑤涂布和劃線均應在酒精燈旁進行。
⑥用接種環在無菌條件下將菌液接種到液體培養基中，同時以不接種菌液的液體培養基作為對照。
1．在分離、純化酵母菌實驗中，劃線接種(甲)、培養結果(乙)如圖所示，且甲、乙的對應位置不變。有關敘述錯誤的是(　　)
甲　　　　乙
A．配制培養基時需進行高壓蒸汽滅菌
B．甲中a區域為劃線的起始位置
C．連續劃線的目的是獲得單個細菌形成的菌落
D．圖示接種過程中接種環灼燒了5次
B　[為了能徹底滅菌，配制的培養基需進行高壓蒸汽滅菌，A正確；起始劃線的區域長出的菌落多且密，甲中d區域為劃線的起始位置，a區域為劃線的結束位置，B錯誤；連續劃線的目的是獲得單個細菌形成的菌落，C正確；由于每次使用接種環前后都要灼燒滅菌，圖示甲中共有4次劃線接種，接種過程中接種環灼燒了5次，D正確。]
2．下列關于統計菌落數目的方法的敘述，不正確的是(　　)
A．采用稀釋涂布平板法獲得的菌落數往往少于實際的活菌數
B．當樣品的稀釋度足夠高時，一個活菌往往會形成一個菌落
C．為了保證結果準確，一般采用菌落密度較大的平板進行計數
D．在某一濃度下涂布三個平板，若三個平板統計的菌落數差別不大，則應以它們的平均值作為統計結果
C　[稀釋涂布平板法常用來統計樣品中活菌的數目，當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌，值得注意的是，該方法統計的菌落數往往比活菌的實際數目低，這是因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落，A、B正確。為了保證結果準確，一般選擇菌落數在30～300的平板進行計數；設計實驗時，一定要至少用三個平板做重復實驗，才能增強實驗的說服力和準確性。分析結果時，一定要考慮所設置的重復實驗的結果是否一致，差別不大時，取平均值作為統計結果，C錯誤，D正確。]
　微生物的數量測定和選擇培養
1．微生物的計數
常用的微生物的計數方法有直接計數法和間接計數法。二者比較如下：
內容 直接計數法 間接計數法
主要用具 顯微鏡、血細胞計數板 涂布器
計數依據 細菌個數 培養基上菌落數
優點 計數方便、操作簡單 計數的是活菌
缺點 不能區分死菌與活菌 操作較復雜，且有一定誤差
計算公式 每毫升原液含菌株數＝400×10 000×每小格平均菌株數×稀釋倍數 每毫升原液含菌株數＝×稀釋倍數
2.特定培養基的設計原理與應用實例
特定培養基的設計原理 應用實例
具體處理 分離菌種
依據營養需求 不添加碳源 自養微生物(硝化細菌等)
不添加氮源 固氮微生物(圓褐固氮菌等)
以尿素為唯一氮源 能分解尿素的微生物
以石油為唯一碳源 能分解石油的微生物
加入某種化學物質，其不作為營養物質，對目標微生物無害，但會抑制或殺死其他微生物 加入青霉素、四環素或鏈霉素 抑制細菌和放線菌生長→分離酵母菌、霉菌等
加入10%的酚 抑制細菌和霉菌生長→分離放線菌
利用特殊環境 置于無氧條件下 厭氧型和兼性厭氧型微生物→分離乳酸菌、酵母菌等
置于高鹽環境中 其他菌在高鹽環境中易失水而不能生存→分離金黃色葡萄球菌
置于高溫環境中 其他微生物因酶失活而無法生存→分離耐高溫微生物
1．在用稀釋涂布平板法對微生物進行計數時，統計菌落數目的理論依據是什么？
提示：當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。
2．稀釋涂布平板法和顯微鏡計數法對微生物計數產生的實驗誤差如何？試分析原因。
提示：稀釋涂布平板法計數的值比實際值小，原因是當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落；顯微鏡計數法計數的結果比實際值大，原因是顯微鏡下無法區分細胞的死活，計數時包括了死細胞。
3．(2021·四川綿陽期末)某同學將1 mL土壤樣液稀釋100倍，在3個平板上用稀釋涂布平板法分別接入0.1 mL稀釋液，經適當培養后，3個平板上的菌落數分別為56、57和58。下列敘述錯誤的是(　　)
A．可得出土壤樣液中活菌大約為5.7×107個/L
B．此方法統計的菌落數往往比實際的活菌數目低
C．一般選擇菌落數為30～300的平板進行計數
D．顯微鏡直接計數法統計的是稀釋液中的活菌數
D　[將1 mL樣品稀釋100倍，在3個平板上分別接入0.1 mL稀釋液；經適當培養后，3個平板上的菌落數分別為56、57和58，據此可得出每升樣品中的活菌數為(56＋57＋58)÷3÷0.1×1 000×100＝5.7×107個/L，A正確；由于兩個或多個細胞連在一起時，在平板上觀察到的只是一個菌落，所以統計的菌落數往往比實際的活菌數目低，B正確；為保證結果準確，一般選擇菌落數為30～300的平板進行計數，C正確；顯微鏡計數法統計的是稀釋液中所有菌體的數目，包括活菌和死菌，D錯誤。]
4．(2020·濟南外國語學校高二月考)某種菌在30 ℃的環境下，經過6周后會產生2種不同的酶，幾乎可將PET塑料完全分解。下圖是分離、純化和保存菌株的過程，相關敘述正確的是(　　)
A．塑料垃圾中含有大量微生物，是分離該菌株的首選樣品
B．篩選培養基中需要加入PET塑料粉末，通過菌落特征挑出分解PET塑料的菌落
C．通過涂布平板法可以獲得單菌落
D．斜面培養基中含有大量營養物質，可在常溫下長期保存菌株
B　[塑料垃圾中含有大量微生物，但不一定含有分解PET塑料的菌株，A項錯誤；篩選培養基中需要加入PET塑料粉末，通過菌落特征挑出分解PET塑料的菌落，從而獲得分解PET塑料的菌株，B項正確；在涂布平板上長出的菌落，可以通過劃線或稀釋涂布平板法進一步純化得到單個菌落，C項錯誤；斜面培養基中含有大量營養物質，可在低溫下臨時保存菌株，如果長期保存菌株應選擇甘油管藏法，D項錯誤。]
　能分解尿素的微生物的分離與計數
1．實驗原理
(1)分離原理
當培養基中只有尿素作為氮源時，只有能分泌脲酶(urease)的微生物才能在該培養基中生長。因為它們可以通過脲酶將尿素降解為氨，作為其生長的氮源。利用這種培養基就分離出土壤中能產生脲酶的微生物。
(2)鑒定原理
因為微生物分解尿素產生的氨會使培養基的堿性增強，若在培養基中加入在酸性情況下呈黃色、堿性情況下呈紅色的酚紅指示劑，就可根據菌落周圍是否出現紅色區域，進一步鑒定尿素分解菌。在相同培養條件下，圓形紅色區域愈大，表明這種菌利用尿素的能力愈強。
2．目的要求
(1)利用選擇培養基分離能產生脲酶的微生物。
(2)觀察微生物代謝改變環境pH的現象。
(3)利用稀釋涂布平板法對微生物進行計數。
3．方法步驟
制備培養基
↓　
滅菌：在121 ℃下滅菌15 min后待用
↓　
倒平板
↓　
制備土壤細菌懸液：梯度稀釋
5．下列關于“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數”實驗操作的敘述，錯誤的是(　　)
A．利用稀釋涂布平板法準確估計菌落數目的關鍵是有恰當的稀釋度
B．若要判斷選擇培養基是否起到了選擇作用，需要設置未接種的LB培養基作為對照
C．該實驗應采用稀釋涂布平板法
D．用以尿素為唯一氮源且添加了酸堿緩沖劑的培養基來培養該細菌后不會使酚紅指示劑變紅
B　[利用稀釋涂布平板法估算菌落數目的關鍵是有恰當的稀釋度，若稀釋倍數太低，菌落太多，會長在一起，稀釋倍數太高，平板上菌落數目過少，都不宜進行計數，A正確；若要判斷選擇培養基是否起到了選擇作用，需設置接種在沒有選擇作用的LB培養基上培養作為對照，B錯誤；該實驗應采用稀釋涂布平板法，C正確；分解尿素的細菌能合成脲酶，將尿素分解產生氨，使培養基的堿性增強，用以尿素為唯一氮源且添加了酸堿緩沖劑的培養基來培養該細菌，則能維持pH穩定，不會使酚紅指示劑變紅，D正確。]
6．自然界中的微生物往往是混雜生長的。人們在研究微生物時一般要將它們分離提純，然后進行數量的測定。下面是有關土壤中分解尿素的細菌分離和計數的實驗過程，請回答有關問題。
(1)若取土樣6 g，應加入________mL的無菌水配制成稀釋10的倍土壤溶液。因土壤中細菌密度很大，需要不斷加以稀釋，配制成101～107不同濃度的土壤溶液。將103～107倍的稀釋液分別吸取0.2 mL加入固體培養基上，用涂布器將菌液鋪平，每個稀釋度下至少涂布3個平板，這種接種方法稱為_______________。將接種的培養皿放置在37 ℃恒溫培養箱中培養24～48 h，觀察并統計菌落數，結果如下表，其中________倍的稀釋比較合適，由此計算出每克土壤中的菌落數為________個。這種方法測定的菌落數往往比活菌的實際數目________(填“低”或“高”)。
稀釋倍數 103 104 105 106 107
菌落數/個 1號平板 478 367 277 26 5
2號平板 496 354 261 20 8
3號平板 509 332 254 29 3
(2)若研究尿素分解菌的群體生長規律，可采用平板劃線法分離土壤中的尿素分解菌。操作時，接種環通過灼燒滅菌，在第二次及以后劃線時，總是從上一次劃線的末端開始劃線。這樣做的目的是_______________________________
________________________________________________________________。
將分離純化后的單個菌落進行液體培養，可采用定期取樣的方法進行計數。若以一個大方格(體積為0.1 mm3)有25個中方格的計數板為例進行計算，設5個中方格中總菌數為45，菌液稀釋倍數為102，那么原菌液的菌群密度為________個/mL。
[解析]　(1)根據題意分析，需要稀釋10倍的土壤溶液，因此應該將6 g土樣加入54 mL的無菌水進行配制；將103～107倍的稀釋液分別吸取0.2 mL加入固體培養基上，用稀釋涂布平板法將菌液用涂布器涂布到固體培養基上；估算樣品中的活菌數時，往往選取菌落數在30到300之間的平板，分析表格中數據可知，稀釋倍數為105的平板菌落數在這一范圍；每克土壤中的菌落數為(277＋261＋254)÷3×105÷0.2÷6＝2.2×107個。稀釋涂布平板法進行微生物計數時，由于菌落之間會相互重疊，因此測定的菌落數往往比活菌的實際數目低。(2)用平板劃線法分離土壤中的尿素分解菌時，為了將聚集的菌體逐步稀釋以便獲得(不連續)單個菌落，在第二次及以后劃線時，總是從上一次的末端開始劃線。若以一個大方格(體積為0.1 mm3)有25個中方格的計數板為例進行計算，設5個中方格中總菌數為45，菌液稀釋倍數為102，那么原菌液的菌群密度＝45×5÷0.1÷10－3×102＝2.25×108個/mL。
[答案]　(1)54　稀釋涂布平板法　105　2.2×107　低　(2)將聚集的菌體逐步稀釋以便獲得(不連續)單個菌落　2.25×108
微生物合成的油脂是制備生物柴油的新型原料。如圖為產油脂芽孢桿菌篩選的流程，其中B平板上的5個菌落是初篩得到的芽孢桿菌，C為B平板上菌落的原位影印，利用蘇丹黑B可使脂類物質呈黑色的特性，對C進行染色，得到結果D。
通過本案例培養學生的演繹與推理和對實驗結果的交流與討論能力。
(1)圖中對土壤菌液進行系列梯度稀釋的目的是什么？(科學思維)
提示：將微生物分散成單個細胞，進而獲得單個菌落。
(2)根據D的染色結果，判斷B平板中產油脂芽孢桿菌的菌落是哪一個？(科學思維)
提示：3。
(3)采用什么方法將B平板中的產油脂芽孢桿菌的單菌落進一步純化培養得到E？(科學思維)
提示：平板劃線法或稀釋涂布平板法。
[課堂小結]
知 識 網 絡 構 建 核 心 語 句 背 誦
1.在固體培養基上采用劃線或稀釋涂布的方法接種，通過培養能獲得由一個細胞分裂形成的、肉眼可見的、有一定形態構造的子細胞集團，這樣的細胞集團稱為單菌落。2.平板劃線法接種時，通常用接種環蘸取液體培養物或挑取固體表面的微生物后，在固體培養基表面進行連續平行劃線、扇形劃線或其他形式的劃線，以實現接種的目的。3.稀釋涂布平板法接種時，通常需要先將菌液進行梯度稀釋，并在培養皿側面或底面做好標記后，將稀釋度不同的菌液各取0.1 mL，加在固體培養基表面，然后用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基表面上進行培養。4.利用稀釋涂布平板法計數微生物數量：每毫升菌液中微生物細胞的數量＝某一稀釋倍數下至少3個培養皿的平均菌落數÷菌液稀釋液體積×稀釋倍數。5.利用顯微鏡進行酵母細胞計數：每毫升菌液中的酵母細胞數＝80個小方格細胞總數/80×400×10 000×稀釋倍數。6.在培養基中添加(或減去)某種化學成分，使得只有某些特定的微生物能夠生長，其他微生物均不能生長，這樣的培養基稱為選擇培養基。
1．下列能選擇出分解尿素的細菌的培養基是(　　)
A．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、瓊脂、蒸餾水
B．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、瓊脂、蒸餾水
C．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、瓊脂、蒸餾水
D．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、蒸餾水
A　[在A項的培養基中既有尿素作為唯一氮源，又有其他各種成分，可以選擇出分解尿素的細菌，而B項中無尿素作氮源，C項中缺少碳源，D項中有牛肉膏可提供氮源。]
2．(2020·山東淄博月考)下列關于土壤中分解尿素的細菌的分離與計數的敘述，正確的是(　　)
A．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素
B．統計樣品中的活菌數目一般用平板劃線法
C．篩選分解尿素的細菌時，應以尿素作為培養基中唯一的營養物質
D．在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑，若指示劑變藍，則表明篩選到了分解尿素的細菌
A　[統計樣品中的活菌數目時一般用稀釋涂布平板法，B錯誤；篩選分解尿素的細菌時應以尿素作為培養基中的唯一氮源，培養基中還應含有水、無機鹽、碳源等營養物質，C錯誤；在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑，若指示劑變紅，則表明篩選到了分解尿素的細菌，D錯誤。]
3．(2020·太原實驗中學高二月考)判斷選擇培養基是否起到了選擇作用時，需要設置的對照是(　　)
A．未接種的選擇培養基
B．接種了的LB培養基
C．未接種的LB培養基
D．接種了的選擇培養基
B　[選擇培養基的作用是只允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類的微生物生長，若設置對照組，需要用接種了的LB培養基，若該培養基上微生物能生長且并非只有特定種類，則可證明選擇培養基起到選擇作用，B項符合題意。]
4．(2020·陜西延安吳起高中高二期末)下圖表示培養和分離酵母菌的部分操作步驟，下列相關敘述正確的是(　　)
①　　　　　　②　　　　　③
A．對實驗操作的空間、操作者的衣著和手進行滅菌處理
B．步驟①倒平板操作時，倒好后應立即將其倒過來放置
C．步驟②應多個方向劃線，使接種物逐漸稀釋，培養后出現單個菌落
D．步驟③劃線結束后在培養皿蓋上做好標注
C　[圖中①是倒平板，②是進行平板劃線，③是培養。對實驗操作的空間、操作者的衣著和手需要進行消毒處理，A項錯誤；倒完平板后立即蓋上培養皿蓋，冷卻后將平板倒過來放置，B項錯誤；步驟②應多個方向劃線，使接種物逐漸稀釋，培養后出現單個菌落，C項正確；圖中操作結束后需在培養皿底標注菌種及接種日期等信息，而不是在培養皿蓋上做標注，D項錯誤。]
5．尿素是一種重要的氮肥，農作物不能將其直接吸收利用，而是通過土壤中的細菌將其分解為氨和CO2后才能被農作物利用。請回答下列問題：
(1)土壤中的某些細菌能分解尿素是因為該種細菌能合成________。
(2)為篩選尿素分解菌而制備的培養基中含有的營養物質除尿素外，還包括水、碳源、________等，該培養基能篩選出目的菌株的原因是__________________
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
(3)一般依據尿素分解菌菌落的________、隆起程度和顏色等特征來統計菌落數目。現將10 mL尿素分解菌懸液進行梯度稀釋，分別取0.1 mL稀釋倍數為106的樣液接種到3個培養基上，培養一段時間后，統計菌落數分別為39、42、45，則1 mL懸液中活細菌數量為________個。上述過程采用的接種方法是______________。
(4)為檢驗培養基及培養皿滅菌是否合格，可采取的措施是_______________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
[解析]　(1)分解尿素的細菌能合成脲酶，將尿素分解。(2)微生物的培養基中需含有水、無機鹽、碳源和氮源，尿素作為氮源。因為只有能合成脲酶的細菌才能利用尿素作為氮源生長，因此該培養基能篩選出分解尿素的細菌。(3)一個菌落為一個細菌繁殖的后代，不同的微生物的菌落特征不同，菌落的特征包括形狀、大小、隆起程度，據此來統計菌落的數目。微生物計數的方法采用稀釋涂布平板法接種，1 mL懸液中活細菌的數目為(39＋42＋45)÷3÷0.1×106＝4.2×108(個)。(4)可單獨設置一個滅菌后不接種樣液的(含培養基的)培養皿進行培養，觀察該培養基上是否出現菌落，從而判斷滅菌是否合格。
[答案]　(1)脲酶　(2)無機鹽　只有以尿素為唯一氮源的細菌才能在該培養基上生長　(3)形狀、大小　4.2×108　稀釋涂布平板法　(4)單獨設置一個滅菌后不接種樣液的(含培養基的)培養皿進行培養第三節　發酵工程為人類提供多樣的生物產品
第1課時　傳統發酵技術的應用
課標內容要求 核心素養對接
舉例說明日常生活中的某些食品是運用傳統發酵技術生產的。 1.生命觀念——運用結構功能觀認識乳酸菌、酵母菌和醋酸菌的結構特點和代謝特點。2.科學探究——運用發酵原理，設計并完成利用天然菌種制作泡菜、果酒和果醋的實驗探究并對實驗結果進行分析和評價。3.社會責任——關注食品安全和健康的生活方式。
一、某些食品、飲料及調味品是運用傳統發酵技術生產的
1．最早制成的發酵飲料大概要算在游牧社會出現的奶酒。我國是醬油生產最早的國家。
釀制常見的發酵食品、飲料和調味品的原料及菌種
發酵產品 菌種 原料
面包 釀酒酵母 小麥面粉
糯米酒 酵母菌、霉菌、乳酸菌 糯米
酸奶 乳酸菌 牛奶、羊奶
葡萄酒 酵母菌、纖細桿菌 葡萄
黃酒 青霉、毛霉、根霉、酵母菌 糯米、黍米、粳米
啤酒 釀酒酵母 大麥、酒花
醬油 曲霉、酵母菌、乳酸菌 小麥、蠶豆、薯、米
食醋 醋酸菌、曲霉、酵母菌 米、麥、薯等
豆腐乳 曲霉、毛霉、根霉 大豆、冷榨豆粕
泡菜 乳酸菌、明串珠菌 蔬菜、瓜果
奶酪 乳桿菌、乳球菌 鮮牛奶
味精 谷氨酸棒桿菌 糖蜜、淀粉、葡萄糖和玉米漿
β 胡蘿卜素 三孢布拉氏霉 淀粉、豆粉、無機鹽
(1)許多傳統發酵食品使用的菌種中都包含酵母菌和乳酸菌。
(2)酵母菌或乳酸菌只是習慣上的歸類，并不完全代表當今微生物分類學上的名稱。
①酵母菌只是對進行出芽生殖或裂殖的真核、單細胞微生物的統稱，已知的酵母菌至少有56屬，約500多種。
②乳酸菌則是對能夠發酵糖類產生乳酸的一類革蘭氏陽性細菌的統稱，已知的乳酸菌約有430多種。
2．發酵食品的不同風味由多種因素造成
(1)不同的微生物、不同的菌株能夠分泌的酶種類不同，分解大分子有機物后形成的產物也就不同。
(2)菌株遺傳上的差異會造成發酵產品的風味不同。
(3)混菌發酵也影響發酵食品的風味。
傳統發酵菌種中微生物的種類、代謝特點、種間關系等都是造成不同發酵制品的風味和營養物質有差異的原因。
二、體驗傳統發酵
1．利用酵母菌、醋酸菌制作果酒和果醋
(1)實驗原理
一些果實的表面附有許多微生物，如葡萄果實的表面就常常附有肉眼看不見的酵母菌。放置過久的葡萄有時會自然散發出酒味，就是酵母菌發酵的結果。酵母菌在無氧條件下，通過厭氧呼吸，將葡萄糖氧化為乙醇和二氧化碳。有時放置過久的葡萄也會發出酸味或其他味道，這是其他微生物活動的結果。例如，醋酸菌在有氧條件下可將乙醇氧化為醋酸。
(2)方法步驟
選取酒味較重的一瓶，用小刀在發酵液面以上的瓶壁戳一小洞，放置在溫暖的環境中。24 h后打開瓶蓋就會聞到果酒在有氧條件下發酵產生的果醋的氣味
2．利用乳酸菌發酵制作泡菜
(1)實驗原理
泡菜是利用附生在蔬菜表面的植物乳桿菌、短乳桿菌和明串珠菌等發酵制成的。這些微生物一般為厭氧、兼性厭氧或微好氧菌。它們的發酵產物不僅有乳酸，還會有醇、酯等，因而使泡菜具有特殊的風味。
(2)方法步驟
處理材料
↓
腌制泡菜
判斷對錯(正確的打“√”，錯誤的打“×”)
1．菌株是指來自一種微生物的每一個來源不同的純培養物。 (√)
2．菌種中不同的微生物之間只存在互利的關系。 (×)
提示：菌種中不同的微生物可能互利，可能競爭，也可能存在一種排斥其他若干種微生物生長的現象。
3．同種微生物在不同環境條件下進行的代謝活動，所形成的代謝產物都是相同的。 (×)
提示：不同微生物或同種微生物在不同環境條件下進行的代謝活動，所形成的代謝產物不同，制成的發酵食品的風味也就不同。
4．將葡萄用清水洗凈、晾干后，擠碎并連皮一同放入礦泉水瓶中，放入的葡萄體積不能超過礦泉水瓶體積的2/3。 (×)
提示：所放入的葡萄體積不要超過礦泉水瓶體積的1/2。
5．對于新配制的泡菜原料，如果加入一些老泡菜汁，可以縮短腌制時間，這是因為老泡菜汁中有較多的發酵菌。 (√)
　某些食品、飲料及調味品是運用傳統發酵技術生產的
1．發酵食品中的微生物種類多樣。發酵釀制糯米酒和醬油的菌種都是霉菌、酵母菌和乳酸菌，但糯米酒和醬油的風味差別很大。要解釋產生這一現象的原因，需要了解一些微生物分類、代謝的知識。
2．許多傳統發酵食品使用的菌種中都包含酵母菌和乳酸菌。其實酵母菌或乳酸菌只是習慣上的歸類，并不完全代表當今微生物分類學上的名稱。
3．傳統發酵菌種中的微生物在分類上具有多樣性，如：兩種國產食醋發酵菌種中的微生物種類。
產品名稱 發酵微生物
鎮江香醋 乳酸菌(Lactobacillus)
醋酸菌(Acetobacter)
葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter)
葡萄球菌(Staphylococcus)
腸桿菌(Enterobacter)
酵母菌屬(Saccharomyces)
德克酵母屬(Dekkera sp.)
山西老陳醋 酒香酵母屬(Brettanomyces sp.)
卵孢酵母屬(Oosporium sp.)
克魯弗氏酵母屬(Kluveromyces sp.)
畢赤酵母屬(Pichia sp.)
植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)
巴氏醋酸菌(Acetobacter pasteurianus)
4.不同微生物或同種微生物在不同環境條件下進行的代謝活動，所形成的代謝產物不同，制成的發酵食品的風味也就不同，如圖表示醬油發酵的大致過程及菌種發酵的風味產物。
5．傳統發酵所使用的菌種是人們在世世代代的生產生活中不斷篩選保留下來的、在自然界中自然存在的“雜居混生”的微生物群落。群落中的不同微生物相互作用可導致發酵制品風味的不同。菌種中不同的微生物可能互利，可能競爭，也可能存在一種排斥其他若干種微生物生長的現象。
1．生活中的一些食品、飲料及調味品是經過微生物發酵后制成的。下列相關敘述錯誤的是(　　)
A．在游牧社會出現的奶酒是最早制成的發酵飲料
B．傳統發酵食品使用的酵母菌只是對進行出芽生殖或裂殖的真核、單細胞微生物的統稱
C．大多數微生物以現成的有機物為食，通過胞內酶將其分解成小分子物質后，再合成自身物質
D．在糯米酒發酵中乳酸菌產生的乳酸與酵母菌發酵產生的酒精發生反應生成酯類
C　[大多數微生物需要以現成的有機物為食，不過由于它們的結構簡單，因此多以分泌胞外酶的方式消化、分解大分子有機物后，再吸收所需的小分子物質。]
2．傳統發酵所使用的菌種是人們在世世代代的生產生活中不斷篩選保留下來的、在自然界中自然存在的“雜居混生”的微生物群落。下列說法錯誤的是(　　)
A．傳統釀造醬油所使用的菌種有曲霉、酵母菌、乳酸菌等
B．酸奶發酵過程中，保加利亞乳桿菌代謝產生的甲酸和二氧化碳可促進嗜熱鏈球菌的生長
C．在醬油發酵菌種中的嗜鹽片球菌在鹽水發酵前期產生的乳酸，在形成特殊風味的同時也抑制其他存在競爭關系的雜菌的生長
D．乳酸菌代謝產生的乙醛和雙乙酰，與糯米酒特殊的風味有關
B　[酸奶發酵過程中的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的特定菌株之間就存在互利的關系。保加利亞乳桿菌代謝產生的小肽和氨基酸可促進嗜熱鏈球菌的生長，而嗜熱鏈球菌代謝產生的甲酸和二氧化碳可刺激保加利亞乳桿菌的生長。]
　體驗傳統發酵
1．利用酵母菌、醋酸菌制作果酒和果醋
(1)果酒與果醋制作的比較
果酒制作 果醋制作
發酵菌種 來源 附著在葡萄皮上的野生型酵母菌 空氣中的醋酸菌
分類地位 單細胞真核生物 單細胞原核生物
繁殖方式 出芽生殖、孢子生殖 二分裂生殖
代謝類型 異養兼性厭氧型 異養需氧型
聯系 醋酸發酵可以在酒精發酵的基礎上進行，酒精發酵為醋酸發酵提供原料
(2)發酵過程中酵母菌數量、酒精含量及pH變化分析
①果酒發酵過程中酵母菌數量和酒精含量的變化
a．菌體數量的變化：發酵初期，酵母菌進行需氧呼吸，大量繁殖。發酵中期形成無氧環境，酵母菌數量增加緩慢，最后達到穩定。發酵后期由于酒精含量較高，可能會導致酵母菌大量死亡。
b．酒精含量的變化：發酵初期，酵母菌進行需氧呼吸，酒精含量很低。發酵中期，酵母菌進行厭氧呼吸產生大量酒精，酒精含量增加。發酵后期，由于酒精含量升高，大量酵母菌死亡，酒精含量不再增加。
②果酒、果醋制作過程中pH的變化
a．果酒發酵時產生的部分CO2會溶于發酵液，使發酵液pH下降，最后趨于穩定。
b．果醋發酵時產生的醋酸溶于發酵液，使發酵液pH下降，最后趨于穩定。
(3)注意事項
①所放入的葡萄體積不要超過礦泉水瓶體積的1/2。為提高酒精產量，可在兩個礦泉水瓶中適當添加白糖。
②礦泉水瓶中不可加水；不可用不能自動排氣的玻璃瓶作為發酵的容器，以免發酵產生的大量氣體使瓶子炸裂，造成危險。
2．利用乳酸菌發酵制作泡菜
(1)與泡菜制作有關的菌類——乳酸菌
生物學分類 原核生物
常見類型 明串珠菌、乳酸菌
分布 廣泛分布于空氣、土壤、植物體表、人或動物的腸道內
代謝類型 異養厭氧型
生產應用 制作酸菜、酸奶等
發酵原理 C6H12O6―→2C3H6O3
(1)乳酸菌是對能夠發酵糖類產生乳酸的一類革蘭氏陽性細菌的總稱。
(2)乳酸菌是厭氧型微生物，在有氧氣存在時，厭氧呼吸受抑制。
(3)抗生素能殺死乳酸菌或抑制乳酸菌的生長，所以含抗生素的牛奶不能發酵成酸奶。
(2)制作泡菜的注意事項
①用于制作泡菜的蔬菜應新鮮，若放置時間過長，蔬菜中的亞硝酸鹽含量相對較高。
②按照清水與鹽的質量比為4∶1的比例配制鹽水。鹽的用量過高，乳酸發酵受抑制，泡菜風味差；用量過低，雜菌易繁殖，導致泡菜變質。鹽水要煮沸后冷卻。煮沸的作用：一是除去水中的氧氣，二是殺滅鹽水中的其他細菌。
③控制嚴格的厭氧條件
a．選擇合理的發酵容器，如泡菜壇，這是一種既科學又簡單的厭氧容器。
b．鹽水煮沸后冷卻待用。
c．裝壇時壓實，鹽水沒過全部菜料。
d．泡菜壇用水封口，不讓空氣進入，創造一個封閉無氧的環境，發酵期間不宜開蓋，并注意在發酵過程中經常向水槽中補充水。
④控制適宜的發酵溫度
溫度過高易致雜菌滋生；溫度過低不利于乳酸發酵，會使發酵時間延長。
⑤控制發酵時間
一般在腌制7天后，亞硝酸鹽含量開始下降。但泡菜發酵時間并不是越長越好，一方面發酵時間過長，可能會產生其他有害物質，另一方面，發酵時間過長，乳酸含量過高，口味不佳。
1．在果酒和果醋制作中，你認為哪些方法可防止發酵液被污染？
提示：(1)沖洗葡萄時應先沖洗再除去枝梗。(2)榨汁機要沖洗干凈并晾干。(3)發酵瓶要清洗干凈，并用70%的酒精消毒。(4)給礦泉水瓶安裝可折彎吸管。
2．果酒制作過程中，在不滅菌的情況下，酵母菌是如何成為優勢菌種的？
提示：發酵后期在缺氧和酸性發酵液中，絕大多數微生物的生命活動受到抑制，而酵母菌可以適應這一環境成為優勢菌種。
3．制作泡菜時，營造“無氧環境”的措施有哪些？
提示：(1)選擇的泡菜壇要密封性好；(2)加入蔬菜后要注入煮沸冷卻的鹽水，使鹽水沒過全部菜料；(3)蓋上壇蓋后要在壇蓋邊沿的水槽中注滿清水。
3．(2021·濰坊模擬)“每天喝一點，健康多一點”是某品牌枸杞果酒提出的消費理念。下列為生產該枸杞果酒的傳統工藝流程，有關分析錯誤的是(　　)
選料→？→粉碎→滅菌→接種→發酵→？→果酒
A．流程中兩處“？”依次表示沖洗和過濾
B．制作枸杞果酒時，溫度應該控制在18～30 ℃
C．在酒精發酵旺盛時，若因前期滅菌不合格導致容器中存有醋酸菌，則醋酸菌可將果汁中的糖分解為醋酸
D．可在酸性條件下用重鉻酸鉀溶液來檢驗是否有酒精產生
C　[流程中兩處“？”依次表示清水沖洗和過濾，過濾的目的是除去果皮等雜質，A正確；由果酒制作的原理可知，制作枸杞果酒時，溫度應該控制在18～30 ℃，B正確；在酒精發酵旺盛時，若因前期滅菌不合格導致容器中存有醋酸菌，由于此時為缺氧環境，而醋酸菌為需氧型微生物，在無氧條件下無法生存，因此，醋酸菌不能將果汁中的糖分解為醋酸，C錯誤；酒精在酸性條件下與重鉻酸鉀溶液發生顏色反應，由橙色變為灰綠色，以此原理可以來檢驗是否有酒精產生，D正確。]
4．回答下列有關泡菜制作的問題。
(1)制作泡菜時，所用鹽水要煮沸，其目的是_______________________。為了縮短制作時間，有人還會在冷卻后的鹽水中加入少量陳泡菜液，加入陳泡菜液的目的是______________。
(2)泡菜制作過程中，乳酸發酵過程即乳酸菌進行________________的過程。該過程發生在乳酸菌的________________中。
(3)泡菜制作過程中影響亞硝酸鹽含量的因素有__________、________和________等。
(4)從開始制作到泡菜質量最佳這段時間內，泡菜液逐漸變酸，這段時間內泡菜壇中乳酸菌和其他雜菌的消長規律是_________________________________
_____________，原因是____________________________________________
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
[解析]　(1)制作泡菜時需要先形成無菌環境，所用鹽水需煮沸，以殺滅鹽水中的微生物并除去水中氧氣。想要縮短制作時間，應該縮短菌株的生長時間，陳泡菜液中含有一定量的乳酸菌，加入陳泡菜液可以使菌體數量擴增速度加快。(2)乳酸菌為厭氧菌，進行厭氧呼吸產生乳酸，該過程只能在細胞質基質中進行。(3)溫度過高、腌制時間過短、食鹽用量不足等，容易造成雜菌大量繁殖，亞硝酸鹽含量增加。(4)從開始制作到泡菜質量最佳這段時間內，氧氣濃度逐漸降低，泡菜液逐漸變酸，不適宜雜菌生長，而適宜乳酸菌生長，因此乳酸菌數量增多，其他雜菌數量減少。
[答案]　(1)殺滅鹽水中的微生物并除去水中氧氣　增加乳酸菌的數量　(2) 厭氧呼吸　細胞質基質　(3)溫度　腌制時間　食鹽用量　(4)乳酸菌數量增多，其他雜菌數量減少　乳酸菌比雜菌更耐酸
發酵過程中控制雜菌的方法
(1)泡菜壇的密閉性及滅菌。
(2)蔬菜的清洗可以防止雜菌繁殖。
(3)食鹽的用量合適可以控制雜菌的繁殖。
(4)調味料也具有抑菌的作用。
(5)泡菜鹽水的浸泡提供的無氧環境為乳酸菌的繁殖提供條件，同時又能抑制好氧菌繁殖。
為獲得優良的發酵食品，某實驗室在三支試管中培養了酵母菌、醋酸菌、乳酸菌，實驗結果如圖。
甲　 　乙　　　丙
通過本探究案例能夠提高學生對生物學問題進行觀察、思考、分析的能力及對實驗現象和結果進行交流和討論的能力。在探究過程中，可增強學生的好奇心和求知欲。
試問甲、乙、丙三支試管中分別培養的是什么菌種？并說明判斷的理由。(科學思維)
提示：甲試管中培養的是醋酸菌，乙試管中培養的是乳酸菌，丙試管中培養的是酵母菌。因為醋酸菌是需氧型的，因此生長在試管的上層；乳酸菌是厭氧型的，因此生長在試管的下層；酵母菌是兼性厭氧型的，因此在試管的上下層都有生長。
[課堂小結]
知 識 網 絡 構 建 核 心 語 句 背 誦
1.傳統發酵食品使用的菌種中酵母菌只是對進行出芽生殖或裂殖的真核、單細胞微生物的統稱，已知的酵母菌至少有56屬，約500多種。乳酸菌則是對能夠發酵糖類產生乳酸的一類革蘭氏陽性細菌的統稱，已知的乳酸菌約有430多種。2.不同微生物或同種微生物在不同環境條件下進行的代謝活動，所形成的代謝產物不同，制成的發酵食品的風味也就不同。3.菌株是指來自一種微生物的每一個來源不同的純培養物。菌株遺傳上的差異會造成發酵產品的風味不同。4.群落中的不同微生物相互作用可導致發酵制品風味的不同。菌種中不同的微生物可能互利，可能競爭，也可能存在一種排斥其他若干種微生物生長的現象。
1．人們還在各自的生產生活實踐中，逐步摸索總結出了在自然接種和混菌培養條件下，利用有益微生物來釀造自己喜愛的風味食品、飲料和調味品的技術。下列相關敘述錯誤的是(　　)
A．發酵釀制糯米酒和醬油的菌種都是霉菌、酵母菌和乳酸菌，它們都是真核生物
B．大多數微生物結構簡單，需要以現成的有機物為食
C．菌株遺傳上的差異會造成發酵產品的風味不同
D．傳統發酵所使用的菌種是人們在世世代代的生產生活中不斷篩選保留下來的、在自然界中自然存在的“雜居混生”的微生物群落。
A　[乳酸菌是對能夠發酵糖類產生乳酸的一類革蘭氏陽性細菌的統稱。]
2．下列關于用塑料瓶制作果酒和果醋的敘述，正確的是(　　)
A．為了提高果酒的產出量，果汁應盡量裝滿發酵瓶
B．醋酸發酵階段應封閉瓶口，防止雜菌污染
C．制作果酒裝置時，需安裝可折彎吸管
D．果酒制成后，可將裝置轉移至溫度較高的環境中制作果醋
D　[葡萄汁裝入發酵瓶時，要留出大約1/2的空間，這樣既有利于酵母菌有氧呼吸，大量繁殖，又可防止果酒發酵時產生大量二氧化碳使果汁溢出。醋酸發酵是需氧發酵，應通入氧氣，發酵時應敞開瓶口并在瓶口蓋上紗布以防雜菌污染。制作果酒裝置時安裝可折彎吸管，既可排出氣體又可避免雜菌污染。醋酸菌發酵的適宜溫度比酵母菌高。]
3．(2021·浙江名校聯盟月考)下列關于泡菜發酵過程的敘述，正確的是(　　)
A．發酵時間越長，亞硝酸鹽的含量越高
B．發酵過程中只有乳酸菌一種微生物發揮作用
C．發酵過程中乳酸菌可以分解蛋白質和果膠
D．發酵過程中要經常補充水槽中的水
D　[隨著發酵的進行，亞硝酸鹽含量先逐漸增加，后又逐漸降低，A項錯誤；泡菜發酵過程中，發揮主要作用的是乳酸菌，此外酵母菌也發揮了作用，B項錯誤；發酵過程中乳酸菌不分解蛋白質和果膠，因而能使蔬菜脆嫩而不軟化，C項錯誤；經常補充水槽中的水，目的是保持壇內的無氧狀態，D項正確。]
4．某研究性學習小組以櫻桃、番茄為材料進行果酒、果醋的發酵實驗。下列相關敘述正確的是(　　)
A．酵母菌是好氧細菌，所以果酒發酵所需的最適溫度較高
B．先供氧進行果醋發酵，然后隔絕空氣進行果酒發酵
C．與人工接種的發酵相比，自然發酵獲得的產品品質更好
D．適當加大接種量可以提高發酵速率、抑制雜菌生長繁殖
D　[醋酸菌是好氧細菌，果醋發酵所需的最適溫度較高，果酒發酵所需的溫度是18～30 ℃，而醋酸菌的最適生長溫度為30～35 ℃，A項錯誤；進行果酒、果醋發酵實驗，要先隔絕空氣進行果酒發酵，然后接種醋酸菌，通入空氣，進行果醋發酵，因為醋酸菌可以將酒精轉變為醋酸，B項錯誤；與人工接種的發酵相比，自然發酵過程中菌種量比較少，且菌種本身品質不好，因此，自然發酵獲得的產品品質較差，而人工接種菌種的品質更好，且不容易存在雜菌污染，C項錯誤；適當加大接種量，讓菌體快速形成優勢菌群，可以抑制雜菌生長，提高發酵速率，D項正確。]
5．從古至今人們廣泛利用微生物發酵進行食品加工，如釀酒、制醋等。請回答下列相關問題。
(1)傳統發酵技術經常采用野生菌種，在家庭中以葡萄為原料制作葡萄酒時，可以不添加菌種，原因是________________________
_________________，但現代發酵工業常采用純化的優良菌種，這樣可以____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(2)釀酒時，溫度應該控制在________。某同學在通過發酵制作果酒時，發現在制作原料中添加一定量的糖，可以提高酒精度，原因是___________________________________________________________________
__________________________________________________________________。
在制作葡萄酒的過程中，如果密封不嚴混入空氣，發酵液會變酸，可能的原因是_________________________________________________________________
____________________________________________________________________，
反應簡式是__________________________________________。
(3)在果酒制作中，加入的新鮮葡萄汁沒有經過滅菌處理，但是在制出的果酒中基本檢測不出酵母菌以外的雜菌，從生態學角度分析：一是酵母菌與雜菌之間存在________________關系；二是由于果酒中的________不利于雜菌的生長。
[解析]　(1)在家庭中以葡萄為原料制作葡萄酒時，不添加酵母菌，原因是在葡萄皮表面附著有大量的野生酵母菌；現代工業發酵用純化的優良菌種進行發酵，可以避免雜菌污染，保證產品的質量。(2)酒精發酵時一般將溫度控制在18～30 ℃。制作果酒時，在原料中添加一定量的糖，可以提高酒精度，原因是酵母菌可以利用糖進行厭氧呼吸產生酒精；在制作葡萄酒的過程中，如果密封不嚴混入空氣，發酵液會變酸，可能的原因是醋酸菌發酵產生醋酸。在書寫反應式時，反應物是C2H5OH和O2，生成物是CH3COOH和水，還有能量，箭頭上注明酶。(3)加入的新鮮葡萄汁沒有進行滅菌處理，但是在制出的果酒中基本檢測不出酵母菌以外的雜菌，從生態學角度分析：一是酵母菌在與雜菌之間的競爭中取得優勢，二是果酒中的酒精不利于雜菌生長，從而淘汰掉雜菌。
[答案]　(1)葡萄皮表面附著有大量的野生酵母菌　避免雜菌污染，保證產品的質量　(2)18～30 ℃　酵母菌可以利用糖進行厭氧呼吸產生酒精　醋酸菌發酵產生醋酸　C2H5OH＋O2CH3COOH＋H2O＋能量　(3)競爭　酒精第2課時　發酵工程及其應用
課標內容要求 核心素養對接
1.闡明發酵工程利用現代工程技術及微生物的特定功能，工業化生產人類所需產品。2.舉例說明發酵工程在醫藥、食品及其他工農業生產上有重要的應用價值。 1.科學思維——基于發酵工程的基本環節和應用實例，闡明發酵工程的概念。2.科學探究——根據發酵產品和利用微生物的不同討論發酵工程中的發酵條件及控制方法。3.社會責任——認可發酵工程在生產上重要的應用價值。
一、發酵工程利用現代工程技術及微生物的特定功能，工業化生產人類所需產品
1．微生物發酵是一個復雜的過程。鑒于菌種特性、原料和產物的特點、技術設備的可行性以及成本核算等諸多因素，現代發酵工業大多是采用好氧、液體、深層、分批及單一純種發酵的方式組合進行的。其中好氧以及用單一純種微生物生產單一產品是現代發酵工業的主流。
2．微生物工業發酵的基本過程
(1)選育高產、優質的菌種是發酵工業的前提條件。
(2)將菌種擴大培養才能滿足大規模生產的需要。
(3)對發酵過程進行控制才能獲得所需要的產品。
(4)控制發酵過程是保證發酵生產高效順利進行的重要措施。
(5)菌種在不同的發酵階段要求的環境條件是不同的。
(6)分離或提純發酵產品是工業發酵制取產品必經的步驟。
(7)分離后的生物產品還需要進一步提純，經過質檢合格后才能成為產品。
二、發酵工程在醫藥、食品及其他工農業生產上有重要的應用價值
1．發酵工程特點：生產條件溫和、原料豐富且價格低廉、廢棄物對環境影響小且容易處理。
2．微生物發酵的食品和飲料在生活中比比皆是，高居微生物工業的榜首。
3．絕大多數抗生素也是微生物發酵的產物，或由微生物發酵產物加工而成。
4．近年來，在醫藥領域開發的酶抑制劑、免疫調節劑、類激素、抗氧化劑、生物表面活性劑和抗輻射藥物等許多新藥也是微生物發酵的產物或衍生物。
5．酶制劑是發酵工程對工業化生產的又一貢獻
(1)采用發酵工程生產的酶制劑除了應用于食品工業生產中，還廣泛應用于洗滌劑生產、紡織、皮革、造紙工業中。
(2)許多在極端條件下仍具有功能的酶來自極端環境中的微生物，這些酶通過發酵工程生產，已經在許多高溫、高鹽、強酸、強堿條件下的工業生產過程中發揮作用。
判斷對錯(正確的打“√”，錯誤的打“×”)
1．發酵工程利用的菌種都是從自然界中篩選出來的。 (×)
提示：發酵工程的菌種也可以通過誘變育種和基因工程育種獲得。
2．好氧、用單一純種微生物生產單一產品是現代發酵工業的主流。 (√)
3．發酵工程中要對培養基進行滅菌，發酵設備不用滅菌。 (×)
提示：培養基和發酵設備都必須經過嚴格的滅菌。
4．對菌種擴大培養是發酵工業的前提條件。 (×)
提示：選育高產、優質的菌種是發酵工業的前提條件。將菌種擴大培養可滿足大規模生產的需要。
5．發酵工程具有生產條件溫和、原料豐富且價格低廉、廢棄物對環境影響小且容易處理的特點。 (√)
　發酵工程利用現代工程技術及微生物的特定功能，工業化生產人類所需產品
1．選育高產、優質的菌種
(1)需滿足的條件
①應選擇高產的菌種，使菌種的發酵產物中，需要的產物多，不需要的產物少。
②培養基來源充足且廉價，被轉化的效率高。
③菌種發酵產物易于分離。
④菌種對環境沒有明顯或潛在的危害。
⑤菌種的遺傳特性和生產能力穩定。
(2)得到符合要求的菌種措施
①篩選并不斷地選育或改良菌種，以保持菌種健壯旺盛的生命力。
②減少菌種的傳代次數能減小菌種發生自發突變的概率。
③對于已出現衰退跡象的菌種要進行分離篩選，保留高產的菌株，用于大規模的發酵工業生產。
2．擴大培養
(1)在大規模的發酵生產中，需要將選育出的優良菌種經過多次擴大培養。
(2)目的：增加菌種數量，縮短菌種在發酵罐中發酵的時間。
3．控制發酵過程
(1)發酵罐的大小取決于生產需要。
(2)在密封的罐體上安裝各種閥門、管道、傳感器、儀表等，以監控發酵過程的營養供給、氧氣、溫度、pH等變化。
(3)發酵控制
發酵原料
↓　
預處理
↓　
發酵培養基的配制(添加水、無機鹽、其他營養物，調碳氮比、pH等)
↓　
滅菌
↓接種
大型發酵(測量和控制發酵溫度、pH、溶解氧等)
4．分離或提純發酵產品
(1)發酵產品是菌體本身：采用過濾、沉淀等方法將菌體從培養液中分離出來。
(2)發酵產品是微生物的代謝產物：采用真空發酵、吸附發酵、萃取發酵等方法進行提取。
(3)分離后的生物產品還需要進一步提純，經過質檢合格后才能成為產品。
1．現代發酵工程和傳統發酵技術所用菌種的來源有什么差異？
提示：傳統發酵技術用的菌種一般是原材料中天然存在的多種菌種，而現代發酵工程用的菌種是通過微生物培養技術獲得的單一菌種。
2．與化工生產相比，為什么發酵工程的生產條件比較溫和？
提示：發酵是利用微生物的代謝將原料進行轉化，而微生物細胞代謝是在常溫常壓條件下進行的，因此發酵工程的生產條件比較溫和。
1．發酵工程的內容包括菌種的選育、培養基的配制、滅菌、擴大培養和接種、發酵過程和產品的分離提純等方面。下列關于發酵工程的認識錯誤的是(　　)
A．發酵工程具有條件溫和、產物單一、污染小的特點
B．發酵工程的產品包括微生物的代謝產物和菌體本身
C．通常所指的發酵條件包括溫度、溶解氧和pH等
D．發酵工程與傳統發酵技術最大的區別是前者可以用微生物進行發酵
D　[傳統發酵技術和發酵工程都是利用各種微生物的代謝來實現相關產品的生產的，D錯誤。]
2．下列關于發酵工程的說法，錯誤的是(　　)
A．在菌種選育過程中，可以利用人工誘變或基因工程等手段
B．雖然青霉素是抗生素，但在青霉素生產過程中仍然需要嚴格滅菌
C．發酵時，發酵條件變化會影響微生物生長，不影響微生物的代謝途徑
D．發酵工程的產品可以采用過濾、沉淀、蒸餾、萃取等方法提取
C　[環境不同，同種微生物的代謝產物可能不同。發酵時，pH、氧氣、溫度等發酵條件變化不僅會影響微生物生長，也會影響微生物的發酵產物。]
　發酵工程在醫藥、食品及其他工農業生產上有重要的應用價值
1．發酵工程的特點：生產條件溫和、原料豐富且價格低廉、廢棄物對環境影響小且容易處理。
2．發酵工程的應用：在食品工業、醫藥工業、冶金工業、農業、環境保護等許多領域得到了廣泛的應用，為社會提供了眾多的微生物發酵產品。
3．發酵工程與傳統發酵技術的比較
發酵工程 傳統發酵技術
不同點 菌種 通過微生物純培養技術篩選或其他技術生產的優良菌種，大多是單一菌種 原材料中天然存在的混合菌種
發酵方式 以液體發酵為主 以固體發酵或半固體發酵為主
對發酵條件的控制 嚴格無菌操作，防止雜菌污染。通過現代工程技術對發酵條件精確地控制，使發酵條件處于最佳狀態 不是無菌操作，容易受到雜菌污染。對發酵條件不能嚴格控制，易受外界條件影響
生產規模和產品 生產規模大，實現了工業化生產。原料來源豐富，成本低，產物多樣，產量高 通常是家庭式或作坊式的，產量低，生產往往受季節和原料限制，產品風味品種比較單一，質量不穩定
相同點 ①都是利用了微生物的作用②發酵工程是在傳統發酵技術的基礎上發展起來的
3．近年來，在醫藥領域開發的許多新藥也是微生物發酵的產物或衍生物，下列有關敘述錯誤的是(　　)
A．近年來，發酵工程在醫藥領域開發的新藥有酶抑制劑、免疫調節劑、類激素、抗氧化劑、生物表面活性劑和抗輻射藥物等
B．普伐他丁是一種類激素，臨床上能顯著降低患者血液中膽固醇的濃度
C．環孢菌素A能夠阻斷抗器官移植的T細胞的活力
D．2013年初，通過合成生物學手段構建的人工酵母菌菌株，開始大規模工業化生產青蒿酸
B　[藥物普伐他丁是膽固醇合成過程中一種酶的抑制劑，臨床上能顯著降低患者血液中膽固醇的濃度，且副作用小。]
4．酶制劑是發酵工程對工業化生產的又一貢獻。下列敘述錯誤的是(　　)
A．在輕工微生物工業領域，微生物發酵生產了許多酶制劑，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纖維素酶等
B．二肽甜味素(阿斯巴甜)可由嗜熱脂肪芽孢桿菌所產的蛋白酶催化生產，與化學工業生產相比，產品價格大幅度下降
C．利用耐高溫的水生棲熱菌生產的Taq酶制劑具有高耐熱性
D．酶制劑可廣泛應用于食品工業生產、洗滌劑生產、紡織、皮革、造紙工業等領域，但在醫藥、臨床診斷和食品毒素鑒定中還未涉及
D　[許多酶制劑在醫藥、臨床診斷和食品毒素鑒定中也被廣泛應用。]
蘋果可用于制作蘋果酒、蘋果醋飲料和提取具有抗過敏、抗癌細胞增生、調節脂質代謝等多種生理功能的蘋果多酚。如圖所示為工業化制作蘋果酒和蘋果醋的裝置。
通過本案例培養學生的演繹推理的科學思維能力和實踐應用的社會責任感。
(1)甲罐中預留近1/3的空間，目的是什么？(科學思維)
提示：有利于酵母菌的早期繁殖。
(2)甲罐連接的雙U型管中一側注滿水的作用是什么？(科學思維)
提示：密閉裝置，利于自動化排氣；防止發酵液從排氣管溢出。
(3)若圖中A代表無菌空氣，則乙罐排出的氣體中氧氣的含量有什么變化？(科學思維)
提示：氧氣含量降低。
[課堂小結]
知 識 網 絡 構 建 核 心 語 句 背 誦
1.現代發酵工業大多是采用好氧、液體、深層、分批及單一純種發酵的方式組合進行的。其中，好氧以及用單一純種微生物生產單一產品是現代發酵工業的主流。2.選育高產、優質的菌種是發酵工業的前提條件。將菌種擴大培養才能滿足大規模生產的需要。控制發酵過程是保證發酵生產高效順利進行的重要措施。分離或提純發酵產品是工業發酵制取產品必經的步驟。3.發酵工程具有生產條件溫和、原料豐富且價格低廉、廢棄物對環境影響小且容易處理的特點。
1．隨著微生物生理學、生物化學研究的深入，以及高產發酵菌株的不斷選育，整個微生物工業獲得了迅猛發展，下列相關敘述錯誤的是(　　)
A．好氧、用單一純種微生物生產單一產品是現代發酵工業的主流
B．選育的高產、優質菌種遺傳特性和生產能力穩定
C．發酵工業中發酵罐的大小取決于菌種特性和產物特點
D．菌種在不同的發酵階段要求的環境條件是不同的
C　[發酵工業中發酵罐的大小取決于生產需要。]
2．分離或提純發酵產品是工業發酵制取產品必經的步驟，下列相關敘述不正確的是(　　)
A．如果發酵產品是菌體本身，可采用過濾、沉淀等方法將菌體從培養液中分離出來
B．真空發酵是對發酵罐減壓，使易揮發的發酵產物從發酵液中分離出來的技術
C．吸附發酵是在發酵過程中加入對發酵產物具有特異性吸附作用的吸附劑，從而使產物從發酵液中分離出來的技術
D．分離后的生物產品還需進一步提純，經過質檢合格后才能成為產品
C　[吸附發酵是在發酵過程中加入對發酵產物具有特異性或非特異性吸附作用的吸附劑，從而使產物從發酵液中分離出來的技術。]
3．發酵工程在醫藥、食品及其他工農業生產上有重要的應用價值。下列不屬于發酵工程應用的是(　　)
A．利用工程菌生產人生長激素
B．利用啤酒酵母釀造啤酒
C．用培養的人細胞構建人造皮膚
D．用酵母菌生產作為食品添加劑的單細胞蛋白
C　[利用工程菌生產人生長激素利用了發酵工程和基因工程技術，A不符合題意；利用啤酒酵母釀造啤酒屬于發酵工程的應用，B不符合題意；用培養的人細胞構建人造皮膚利用了動物細胞工程技術，不屬于發酵工程，C符合題意；用酵母菌生產作為食品添加劑的單細胞蛋白屬于發酵工程在食品工業上的應用，D不符合題意。]
4．發酵工程廣泛應用于多個行業，下列有關敘述錯誤的是(　　)
A．黑曲霉可作為釀制醬油、生產檸檬酸的菌種
B．啤酒釀制終止后，可得到啤酒、單細胞蛋白等產品
C．用纖維廢料發酵得到酒精，可減少環境污染、減緩能源短缺問題
D．用液體培養基可大規模生產新冠病毒減毒疫苗
D　[黑曲霉產生的蛋白酶可將大豆中的蛋白質分解為小分子的肽和氨基酸，進一步加工為醬油，檸檬酸可通過黑曲霉發酵獲得，A正確；啤酒釀制終止后，可通過過濾、沉淀等手段獲得酵母細胞(單細胞蛋白)，將濾液加工后得到啤酒，B正確；纖維廢料分解得到葡萄糖，其經過發酵得到酒精，既減少了環境污染，又減緩了能源短缺問題，C正確；新冠病毒減毒疫苗是新冠病毒經過減毒處理得到的，需用特定的動物細胞進行培養，病毒不能獨立地在液體培養基中生長繁殖，D錯誤。]　傳統發酵技術與其他模塊知識的交匯點
[核心精要]
交匯點1　酵母菌、醋酸菌和乳酸菌的細胞結構，聯系必修課程模塊1中原核細胞與真核細胞的主要區別
(1)相同點：都有細胞膜、細胞質和DNA分子。
(2)不同點：醋酸菌和乳酸菌屬于原核生物，其細胞無核膜、染色體以及線粒體等眾多的細胞器，只有核糖體一種細胞器，而酵母菌屬于真核生物。
交匯點2　發酵條件的控制，聯系必修課程模塊1中需氧呼吸和厭氧呼吸的影響因素
(1)果酒的制作前期需要氧，有利于酵母菌進行需氧呼吸而大量繁殖，然后控制為無氧條件，進行酒精發酵。控制發酵溫度約為28 ℃。
(2)果醋的制作一直需要充足的氧氣，醋酸菌是需氧型細菌，控制發酵溫度為30～35 ℃。但泡菜的制作一直需要密封，因為乳酸菌是厭氧型細菌。
[對點訓練]
1．下列有關傳統發酵技術的應用，敘述正確的是(　　)
A．制作果酒、果醋的菌種屬于真核生物，制作腐乳、泡菜的菌種屬于原核生物
B．制作果酒、果醋在無氧條件下進行，制作腐乳、泡菜需在有氧條件下進行
C．制作果酒、果醋、泡菜主要利用的是胞內酶，制作腐乳主要利用的是胞外酶
D．制作果酒、果醋的過程需保持菌種活性，制作腐乳、泡菜的過程不需要
C　[制作果酒利用的酵母菌屬于真核生物，制作果醋利用的醋酸菌屬于原核生物，制作腐乳利用的毛霉屬于真核生物，A項錯誤；制作果酒先在有氧條件下進行，后在無氧條件下進行，制作泡菜需在無氧條件下進行，制作果醋、腐乳需在有氧條件下進行，B項錯誤；制作果酒、果醋、泡菜主要利用的是胞內酶，制作腐乳主要利用的是胞外酶，C項正確；制作果酒、果醋、腐乳和泡菜的過程中均需保持菌種活性，D項錯誤。]
2．下圖表示果酒和果醋制作過程中的物質變化過程，下列敘述正確的是(　　)
A．過程①和②都只能發生在缺氧條件下
B．過程①和③都發生在酵母菌的線粒體中
C．過程③和④都需要氧氣的參與
D．過程①～④所需的最適溫度基本相同
C　[據圖分析可知，過程①表示細胞呼吸的第一階段，其在有氧或無氧的條件下都可以進行，且是在細胞溶膠中進行的，而非線粒體中，A、B錯誤；過程③表示需氧呼吸的第二、三階段，過程④表示乙醇氧化為醋酸的階段，過程③和④都必須在有氧的條件下才可以進行，C正確；過程①②③是果酒制作階段的化學反應，其適宜溫度約為28 ℃，過程④是果醋制作階段的化學反應，其適宜溫度為30～35 ℃，D錯誤。]
3．蘋果醋是以蘋果汁為原料經發酵而成的。請回答下列問題。
(1)酵母菌的呼吸代謝途徑如圖所示。圖中過程①和②是蘋果醋生產的第一階段，在酵母菌細胞的______________中進行，其產物乙醇與____________試劑反應呈現灰綠色，這一反應可用于乙醇的檢驗；過程③在酵母菌細胞的________________中進行。與無氧條件相比，在有氧條件下，酵母菌的增殖速度____________。
(2)第二階段是在醋酸菌的作用下將第一階段產生的乙醇轉變為醋酸的過程，根據醋酸菌的呼吸作用類型，該過程需要在__________________條件下才能完成。
(3)在生產過程中，第一階段和第二階段的發酵溫度不同，第一階段的溫度________(填“低于”或“高于”)第二階段的。
(4)醋酸菌屬于____________核生物，其細胞結構中__________(填“含有”或“不含有”)線粒體。
[解析]　(1)圖中過程①和②是酵母菌進行厭氧呼吸產生乙醇的過程，厭氧呼吸的場所是細胞溶膠。乙醇可用酸性重鉻酸鉀試劑檢測，顏色由橙色變為灰綠色。過程③為需氧呼吸的第二和第三階段，場所為線粒體。在有氧條件下酵母菌進行需氧呼吸，產生更多的能量供酵母菌繁殖利用，故有氧條件下酵母菌的繁殖速度更快。(2)醋酸菌是好氧細菌，因此，在醋酸菌作用下，將乙醇轉變為醋酸的過程需要在有氧條件下才能完成。(3)在生產過程中，第一階段酵母菌產生乙醇的適宜溫度約為28 ℃，第二階段醋酸菌產生醋酸的適宜溫度為30～35 ℃，第一階段的溫度低于第二階段的。(4)醋酸菌屬于原核生物，原核細胞中的細胞器只有核糖體一種，不含有線粒體。
[答案]　(1)細胞溶膠　酸性重鉻酸鉀　線粒體　快　(2)有氧　(3)低于　(4)原　不含有
　微生物培養技術與其他模塊知識的交匯點
[核心精要]
交匯點1　酶的分解作用，聯系必修課程模塊1中酶的特性
(1)酶具有專一性：一種酶只能催化一種或一類化學反應，如脲酶只能催化分解尿素。
(2)需要溫和條件：酶起催化作用需要適宜的溫度和pH，因此培養微生物需要控制溫度，調節培養基的pH。
交匯點2　培養基中葡萄糖的作用，聯系選擇性必修課程模塊1中血糖的來源和去路
(1)葡萄糖的氧化分解：葡萄糖通過氧化分解釋放能量，一部分以熱能形式散失，另一部分儲存在ATP中，為生命活動提供能量。
(2)三大類物質的相互轉化：糖類、脂質和蛋白質三大類物質之間可以相互轉化。
交匯點3　培養基中無機鹽的作用，聯系必修課程模塊1、選擇性必修課程模塊1有關細胞和內環境中無機鹽的作用
(1)無機鹽的作用：①無機鹽是某些化合物的組成成分；②調節生物體的生命活動；③維持滲透壓和酸堿平衡。
(2)調節pH的緩沖對：H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。
[對點訓練]
4．某些土壤細菌可將尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列問題。
(1)有些細菌能分解尿素，有些細菌則不能，原因是前者能產生________。能分解尿素的細菌不能以尿素的分解產物CO2作為碳源，原因是_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
但可用葡萄糖作為碳源，進入細菌體內的葡萄糖的主要作用是____________
_________________________________________________________________
__________________________________________________(答出兩點即可)。
(2)為了篩選可分解尿素的細菌，在配制培養基時，應選擇________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作為氮源，不選擇其他兩組的原因是____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
(3)用來篩選分解尿素細菌的培養基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有____________________________________________________________________
____________________________________________________(答出兩點即可)。
[解析]　(1)有些細菌能分解尿素是因為這些細菌能產生脲酶，將尿素分解成CO2和NH3。能分解尿素的細菌是異養生物，不能利用CO2作為碳源合成有機物，但這些細菌可用葡萄糖作為碳源，進入細菌體內的葡萄糖的主要作用：作為能源物質氧化分解為細胞生命活動提供能量，為其他有機物的合成提供原料。(2)為了篩選可分解尿素的細菌，在配制培養基時，應選擇尿素作為唯一氮源，這樣只有能分解尿素的細菌才能在培養基上生存。若選擇“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”作為氮源，能分解尿素的細菌和不能分解尿素的細菌都能利用NH4NO3，不能起到篩選作用。(3)用來篩選分解尿素細菌的培養基含有KH2PO4和Na2HPO4，它們可以為細菌生長提供無機營養；同時，KH2PO4和Na2HPO4還可以作為緩沖劑保持細胞生長過程中pH穩定。
[答案]　(1)脲酶　分解尿素的細菌是異養生物，不能利用CO2來合成有機物　為細胞生命活動提供能量，為其他有機物的合成提供原料　(2)尿素　其他兩組都含有NH4NO3，能分解尿素的細菌和不能分解尿素的細菌都能利用NH4NO3，不能起到篩選作用　(3)為細菌生長提供無機營養；作為緩沖劑保持細胞生長過程中pH穩定
5．(2021·廣東適應性測試)幾丁質廣泛存在于甲殼類動物的外殼、昆蟲的外骨骼和真菌的細胞壁中。某些微生物能合成幾丁質酶(胞外酶)，使幾丁質降解為N 乙酰氨基葡萄糖，然后進一步轉化利用。科研人員試圖從土壤中篩選出能高效降解幾丁質的菌株，通過微生物培養獲得幾丁質酶，用于生物防治。回答下列問題。
　 　 　　 　
(1)在篩選過程中，應將土壤樣品稀釋液接種于以__________為唯一碳源的固體選擇性培養基上篩選目標菌株。
(2)培養所篩選出的目標菌株，計算各單菌落周圍的“水解圈直徑/菌落直徑”的比值，比值大小反映了__________________。
(3)科研人員篩選出了產幾丁質酶的菌株A。將菌株A發酵產生的幾丁質酶粗提液加入盛有馬鈴薯培養基的培養皿中，涂布均勻后分別接種4種病原真菌，以____________代替幾丁質酶粗提液作為對照，結果見圖，幾丁質酶粗提液對________(填入病原菌編號)的抑菌效果最強。推測幾丁質酶的抑菌機理是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
[解析]　(1)篩選過程中，將土壤樣品稀釋液接種以幾丁質為唯一碳源的選擇培養基上，在該培養基上只有可以利用幾丁質的真菌可以生存，其他不能利用幾丁質的微生物被淘汰而達到篩選的作用。(2)水解圈直徑/菌落直徑可以反映水解能力的大小，水解圈直徑/菌落直徑越大，說明該菌降解幾丁質能力越強，反之越弱。(3)對照組實驗應滿足單一變量原則，實驗組添加幾丁質酶，對照組加入不含幾丁質酶粗提液的等量的無菌水，對4組實驗進行觀察比較，d組水解圈直徑/菌落直徑最大，即抑制效果最強，幾丁質是真菌細胞壁的組成成分，幾丁質酶水解了幾丁質導致真菌細胞壁不能合成，抑制了真菌的繁殖。
[答案]　(1)幾丁質　(2)微生物的降解能力　(3)等量的無菌水　 d　幾丁質是真菌細胞壁的組成成分，幾丁質酶水解了幾丁質導致真菌細胞壁不能合成，抑制了真菌的繁殖

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