資源簡介

第1節　傳統發酵技術的應用
課標內容要求 核心素養對接
舉例說明日常生活中的某些食品是運用傳統發酵技術生產的。 1．生命觀念：運用結構功能觀認識乳酸菌、酵母菌和醋酸菌的結構特點和代謝特點。2．科學探究：運用發酵原理，設計并完成利用天然菌種制作泡菜、果酒和果醋的實驗探究并對實驗結果進行分析和評價。3．社會責任：關注食品安全和健康的生活方式。
一、發酵與傳統發酵技術
1．發酵
(1)發酵的歷史：約9 000年前，我們的祖先就會利用微生物將谷物、水果等發酵成含酒精的飲料。1857年，法國微生物學家巴斯德通過實驗證明，酒精發酵是由活的酵母菌引起的。
(2)發酵的概念：人們利用微生物，在適宜的條件下，將原料通過微生物的代謝轉化為人類所需要的產物的過程。
2．傳統發酵食品——腐乳
(1)原料：豆腐。
(2)參與發酵的微生物：酵母、曲霉和毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。
(3)發酵原理：經過微生物的發酵，豆腐中的蛋白質被分解成小分子的肽和氨基酸。
3．傳統發酵技術
(1)概念：直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次發酵保存下來的面團、鹵汁等發酵物中的微生物進行發酵、制作食品的技術。
(2)特點：以混合菌種的固體發酵及半固體發酵為主，通常是家庭式或作坊式的。
4．下列食品是傳統發酵食品的是②③④⑥⑦⑧⑨ 。
①豆腐　②腐乳　③醬油　④香醋　⑤豆油　⑥泡菜　⑦豆豉　⑧饅頭　⑨米酒　⑩豆漿　 酸奶　 米飯
二、嘗試制作傳統發酵食品
1．傳統發酵食品制作所利用的微生物
(1)乳酸菌
①代謝特點：厭氧細菌，在無氧的情況下能將葡萄糖分解成乳酸，反應簡式：C6H12O62C3H6O3(乳酸)＋能量。
②生產應用：用于乳制品的發酵、泡菜的腌制等。
(2)酵母菌
①代謝特點：單細胞真菌，兼性厭氧微生物，在無氧條件下能進行酒精發酵，反應簡式為C6H12O62C2H5OH(酒精)＋2CO2＋能量。釀酒酵母最適生長溫度約為28_℃。
②生產應用：用于釀酒、制作饅頭和面包等。
(3)醋酸菌
①代謝特點：好氧細菌，當O2、糖源都充足時能將糖分解成乙酸，反應簡式為C6H12O6＋2O22CH3COOH(乙酸)＋2H2O＋2CO2＋能量；當缺少糖源時則將乙醇轉化為乙醛，再將乙醛變為乙酸，反應簡式為C2H5OH＋O2CH3COOH(乙酸)＋H2O＋能量。最適生長溫度為30～35_℃。
②生產應用：用于制作各種風味的醋。
2．制作泡菜
(1)菌種的來源
利用植物體表面天然的乳酸菌。
(2)方法步驟
配制鹽水：用清水和食鹽配制質量分數為5%～20%的鹽水，并將鹽水煮沸，冷卻待用。
　↓
蔬菜裝壇：將新鮮蔬菜洗凈，切成塊狀或條狀，混合均勻，晾干后裝壇，裝至半壇時，加入蒜瓣、生姜及其他香辛料，繼續裝至八成滿。
　↓
加鹽水：將冷卻好的鹽水緩緩倒入壇中，使鹽水沒過全部菜料。
　↓
封壇發酵：蓋好壇蓋，向壇蓋邊沿的水槽中注滿水，發酵過程中注意補充水，室溫發酵。
3．制作果酒和果醋
(1)菌種來源
新鮮水果的果皮表面附著有大量的不同種類的野生酵母菌。
(2)方法步驟
器具消毒：將發酵瓶、榨汁機等器具用洗潔精清洗干凈，并用體積分數為70%的酒精消毒，晾干備用。
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沖洗：新鮮葡萄用清水沖洗1～2次，再去除枝梗和腐爛的籽粒，瀝干。
　↓
榨汁：用榨汁機榨取葡萄汁，裝入發酵瓶中，留大約1/3的空間，蓋好瓶蓋。
　↓
酒精發酵：溫度控制在18～30 ℃，每隔12 h左右將瓶蓋擰松一次(注意：不是打開瓶蓋)此后再擰緊瓶蓋。發酵時間為10～12 d。
　↓
醋酸發酵：葡萄酒制作完成后，打開瓶蓋，蓋上一層紗布，進行葡萄醋發酵，溫度為30～35 ℃，時間為7～8 d。
判斷對錯(正確的打“√”，錯誤的打“×”)
1．多種微生物參與了腐乳的發酵。 (√)
2．醋酸菌是好氧細菌，乳酸菌和酵母菌是厭氧細菌。 (×)
提示：酵母菌是兼性厭氧真菌。
3．制作葡萄酒的過程中，要定時打開瓶蓋放出CO2。 (×)
提示：應擰松瓶蓋，不應打開瓶蓋。
4．制作泡菜的過程中只有乳酸菌起作用。 (×)
提示：不只是乳酸菌起作用，酵母菌、大腸桿菌等也起作用。
5．傳統發酵食品的制作過程中，不同的食品接種不同的菌種。 (×)
提示：傳統發酵技術沒有接種菌種，而是利用了天然存在的菌種。
　泡菜的制作
1．泡菜發酵過程中乳酸菌、乳酸和亞硝酸鹽含量變化的分析
項目 乳酸菌 乳酸 亞硝酸鹽
初期 少(有氧氣，乳酸菌活動受抑制) 少 增加(硝酸鹽還原菌的作用)
中期 最多(乳酸抑制其他菌活動) 增多，pH下降 下降(硝酸鹽還原菌受抑制，部分亞硝酸鹽被分解)
后期 減少(乳酸繼續積累，pH繼續下降，抑制自身活動) 繼續增多，pH繼續下降 下降至相對穩定(硝酸鹽還原菌被完全抑制)
變化曲線
2．泡菜制作的注意事項
(1)泡菜壇的選擇：應選用火候好、無裂紋、無砂眼、壇沿深、蓋子吻合好的泡菜壇。檢查時，可將壇口向上壓入水中，看壇內有無滲水現象。
(2)腌制的條件：要注意控制時間、溫度和食鹽的用量。溫度過高、食鹽用量過低、腌制時間過短，容易造成細菌大量繁殖，亞硝酸鹽含量增加。
(3)腌制方法：配制質量分數為5%～20%的鹽水，鹽水要煮沸冷卻后備用。蔬菜和配料裝至八成滿時，加鹽水沒過全部菜料，蓋好壇蓋后向壇蓋邊沿的水槽中注滿水，以保證壇內形成無氧環境，以便乳酸菌發酵。
1．制作泡菜時，營造“無氧環境”的措施有哪些？
提示：(1)選擇的泡菜壇要密封性好；(2)加入蔬菜后要注入煮沸冷卻的鹽水，使鹽水沒過全部菜料；(3)蓋上壇蓋后要在壇蓋邊沿的水槽中注滿清水。
2．為什么泡菜壇只能裝八成滿？
提示：蔬菜剛入壇時，其表面帶入的微生物，主要以不抗酸的大腸桿菌和酵母菌較為活躍，這些微生物是需氧型的，要消耗氧氣，因此壇內要留有一定量的氧氣。
1．在制作泡菜的過程中，下列敘述不正確的是(　　)
A．按照清水與鹽的質量比為1∶2的比例配制鹽水
B．配制好的鹽水需煮沸冷卻
C．腌制過程中，要注意控制腌制的時間、溫度和食鹽用量
D．在壇蓋邊沿的水槽中要注滿水，以保證壇內的無氧環境
A　[在制作泡菜的過程中，用清水和食鹽配制質量百分比為5%～20%的鹽水，A錯誤；鹽水入壇前要煮沸冷卻，煮沸是為了去除氧氣并殺滅微生物，冷卻是為了避免殺死蔬菜上微生物，保證乳酸菌正常的生命活動，B正確；腌制過程中，要注意控制時間、溫度和食鹽的用量，以防止雜菌的大量繁殖和亞硝酸鹽含量過高，C正確；乳酸菌是異養厭氧型生物，在壇蓋邊沿的水槽中要注滿水，以保證壇內的無氧環境，D正確。]
2．回答下列有關泡菜制作的問題：
(1)制作泡菜時，所用鹽水要煮沸，其目的是___________。為了縮短制作時間，有人還會在冷卻后的鹽水中加入少量陳泡菜液，加入陳泡菜液的目的是________________。
(2)泡菜制作過程中，乳酸發酵過程即乳酸菌進行___________的過程。該過程發生在乳酸菌的_____________中。
(3)泡菜制作過程中影響亞硝酸鹽含量的因素有__________、________和________等。
(4)從開始制作到泡菜質量最佳這段時間內，泡菜液逐漸變酸，這段時間內泡菜壇中乳酸菌和其他雜菌的消長規律是__________，原因是______________。
[解析]　(1)制作泡菜時需要先形成無菌環境，所用鹽水需煮沸，以殺滅鹽水中的微生物并除去水中氧氣。想要縮短制作時間，應該縮短菌株的生長時間，陳泡菜液中含有一定量的乳酸菌，加入陳泡菜液可以使菌體數量擴增速度加快。(2)乳酸菌為厭氧菌，進行無氧呼吸產生乳酸，該過程只能在細胞質基質中進行。(3)溫度過高、腌制時間過短、食鹽用量不足等，容易造成雜菌大量繁殖，亞硝酸鹽含量增加。(4)從開始制作到泡菜質量最佳這段時間內，氧氣濃度逐漸降低，泡菜液逐漸變酸，不適宜雜菌生長，而適宜乳酸菌生長，因此乳酸菌數量增加，其他雜菌數量減少。
[答案]　(1)殺滅鹽水中的微生物并除去水中氧氣　增加乳酸菌的數量　(2)無氧呼吸　細胞質基質　(3)溫度　腌制時間　食鹽用量　(4)乳酸菌數量增多，雜菌數量減少　乳酸菌比雜菌更耐酸
發酵過程中控制雜菌的方法
(1)泡菜壇的密閉性及滅菌。
(2)蔬菜的清洗可以防止雜菌繁殖。
(3)食鹽的用量合適可以控制雜菌的繁殖。
(4)調味料也具有抑菌的作用。
(5)泡菜鹽水的浸泡提供的無氧環境為乳酸菌的繁殖提供條件，同時又能抑制好氧菌繁殖。
　果酒和果醋的制作
1．果酒與果醋制作的比較
果酒制作 果醋制作
發酵菌種 來源 附著在葡萄皮上的野生型酵母菌 空氣中的醋酸菌
分類地位 單細胞真核生物 單細胞原核生物
繁殖方式 出芽生殖、孢子生殖 二分裂生殖
代謝類型 異養兼性厭氧型 異養需氧型
發酵條件 溫度 18～30 ℃ 30～35 ℃
時間 10～12 d 7～8 d
氧氣 前期需氧，后期無氧 一直需要充足氧氣
pH 酸性 酸性
結果檢測 酒精與酸性的重鉻酸鉀溶液反應呈現灰綠色 反應液pH下降
聯系 醋酸發酵可以在酒精發酵的基礎上進行，酒精發酵為醋酸發酵提供原料
2．發酵過程中酵母菌數量、酒精含量及pH變化分析
(1)果酒發酵過程中酵母菌數量和酒精含量的變化：
①菌體數量的變化：發酵初期，酵母菌進行有氧呼吸，大量繁殖。發酵中期形成無氧環境，酵母菌數量增加緩慢，最后達到穩定。發酵后期由于酒精含量較高，可能會導致酵母菌大量死亡。
②酒精含量的變化：發酵初期，酵母菌進行有氧呼吸，酒精含量很低。發酵中期，酵母菌進行無氧呼吸產生大量酒精，酒精含量增加。發酵后期，由于酒精含量升高，大量酵母菌死亡，酒精含量不再增加。
(2)果酒、果醋制作過程中pH的變化：
①果酒發酵時產生的部分CO2會溶于發酵液，使發酵液pH下降，最后趨于穩定。
②果醋發酵時產生的醋酸溶于發酵液，使發酵液pH下降，最后趨于穩定。
1．在果酒和果醋制作中，你認為哪些方法可防止發酵液被污染？
提示：(1)沖洗葡萄時應先沖洗再除去枝梗。(2)榨汁機要沖洗干凈并晾干。(3)發酵瓶要清洗干凈，并用70%的酒精消毒。(4)排氣時只需擰松瓶蓋，不要完全揭開瓶蓋，防止雜菌污染。
2．果酒制作過程中，在不滅菌的情況下，酵母菌是如何成為優勢菌種的？
提示：發酵后期在缺氧和酸性發酵液中，絕大多數微生物的生命活動受到抑制，而酵母菌可以適應這一環境成為優勢菌種。
1．(2020·江蘇高考)某同學在線提交了在家用帶蓋玻璃瓶制作果酒和果醋的實驗報告，他的做法錯誤的是(　　)
A. 選擇新鮮的葡萄略加沖洗，除去枝梗后榨汁
B. 將玻璃瓶用酒精消毒后，裝滿葡萄汁
C. 酒精發酵期間，根據發酵進程適時擰松瓶蓋放氣
D. 酒精發酵后去除瓶蓋，蓋一層紗布，再進行醋酸發酵
B　[選擇新鮮的葡萄洗1到2次，除去枝梗后榨汁，A正確；葡萄汁不能裝滿，需裝至玻璃瓶的2/3空間，B錯誤；酒精發酵期間會產生二氧化碳，故需適時擰松瓶蓋，防止發酵瓶爆裂，C正確；醋酸菌是好氧菌，故醋酸發酵時應去除瓶蓋，加一層紗布，D正確。]
2．(2021·濰坊模擬)“每天喝一點，健康多一點”是某品牌枸杞果酒提出的消費理念。下列為生產該枸杞果酒的傳統工藝流程，以下有關分析錯誤的是(　　)
選料→？→粉碎→滅菌→接種→發酵→？→果酒
A．流程中兩處“？”依次表示沖洗和過濾
B．制作枸杞果酒時，溫度應該控制在18～30 ℃
C．在酒精發酵旺盛時，若因前期滅菌不合格導致容器中存有醋酸菌，則醋酸菌可將果汁中的糖分解為醋酸
D．可在酸性條件下用重鉻酸鉀溶液來檢驗是否有酒精產生
C　[流程中兩處“？”依次表示清水沖洗和過濾，過濾的目的是除去果皮等雜質，A正確；由果酒制作的原理可知，制作枸杞果酒時，溫度應該控制在18～30 ℃，B正確；在酒精發酵旺盛時，若因前期滅菌不合格導致容器中存有醋酸菌，由于此時為缺氧環境，而醋酸菌為需氧型微生物，在無氧條件下無法生存，因此，醋酸菌不能將果汁中的糖分解為乙酸，C錯誤；酒精在酸性條件下與重鉻酸鉀溶液發生顏色反應，由橙色變為灰綠色，以此原理可以來檢驗是否有酒精產生，D正確。]
葡萄酒是葡萄汁經酵母菌發酵而成的，釀制葡萄酒的兩個簡易裝置如圖所示。
甲　　　乙
通過本探究案例能夠提高學生對生物學問題進行觀察、思考、分析的能力及對實驗現象和結果進行交流和討論的能力。在探究過程中，增強學生的好奇心和求知欲。
(1)試管中的X溶液有助于維持甲裝置的瓶中氣壓相對穩定，與乙裝置相比，用甲裝置釀制葡萄酒有哪些優點？(科學思維)
(2)葡萄汁裝入甲裝置時，要留有約1/3的空間，這種做法的目的是什么？(科學思維)
提示：(1)不需要開蓋放氣；避免了因開蓋引起的雜菌污染。
(2)為酵母菌大量繁殖提供適量的氧氣；防止發酵旺盛時汁液溢出。
[課堂小結]
知 識 網 絡 構 建 核 心 語 句 背 誦
1.發酵是指人們利用微生物，在適宜的條件下，將原料通過微生物的代謝轉化為人類所需要的產物的過程。2.乳酸菌是厭氧細菌。醋酸菌是好氧細菌。酵母菌是兼性厭氧型真菌。3.直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次發酵保存下來的面團、鹵汁等發酵物中的微生物進行發酵，制作食品的技術一般稱為傳統發酵技術。4.傳統發酵食品的制作過程中，沒有接種菌種，而是利用了天然存在的菌種。
1．下列不屬于傳統發酵技術的是(　　)
A．通過微生物的培養生產胰島素
B．果酒和果醋的制作
C．利用乳酸菌發酵制作泡菜
D．利用微生物發酵制作腐乳
A　[傳統發酵技術是指直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次發酵保存下來的面團、鹵汁等發酵物中的微生物進行發酵、制作食品的技術。通過微生物的培養生產胰島素是現代生物技術——基因工程的應用。]
2．在果酒、果醋、腐乳、泡菜的制作過程中，用到的微生物分別是(　　)
A．酵母菌、酵母菌、毛霉、乳酸菌
B．酵母菌、醋酸菌、毛霉、乳酸菌
C．毛霉、醋酸菌、乳酸菌、酵母菌
D．酵母菌、乳酸菌、毛霉、醋酸菌
B　[參與果酒制作的微生物是酵母菌；參與果醋制作的微生物是醋酸菌，醋酸菌能將糖源或酒精轉變成乙酸；參與腐乳制作的微生物有多種，如酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉；參與泡菜制作的微生物是乳酸菌。]
3．(2020·福建廈門外國語學校期中)制作泡菜、酸菜時，所用菜壇子必須密封，其原因是(　　)
A．防止水分蒸發
B．防止菜葉萎蔫
C．防止產生的乳酸揮發
D．乳酸菌在有氧條件下發酵被抑制
D　[乳酸菌是厭氧菌，所用菜壇子密封的原因不是防止水分蒸發、防止菜葉萎蔫或防止產生的乳酸揮發，而是為乳酸菌提供無氧環境，防止乳酸菌在有氧條件下發酵被抑制，D項符合題意。]
4．下列關于用塑料瓶制作果酒和果醋的敘述，正確的是(　　)
A．為了提高果酒的產出量，果汁應盡量裝滿發酵瓶
B．乙酸發酵階段應封閉瓶口，防止雜菌污染
C．制作果酒過程中每天需適時打開瓶蓋
D．果酒制成后，可將裝置轉移至溫度較高的環境中制作果醋
D　[葡萄汁裝入發酵瓶時，要留出大約1/3的空間，這樣既有利于酵母菌有氧呼吸，大量繁殖，又可防止果酒發酵時產生大量二氧化碳使果汁溢出。乙酸發酵是需氧發酵，應通入氧氣，發酵時應敞開瓶口并在瓶口蓋上紗布以防雜菌污染。制作果酒過程中定時擰松瓶蓋既可排出氣體又可避免雜菌污染。醋酸菌發酵的適宜溫度比酵母菌高。]
5．下面是果酒和果醋制作的實驗流程以及某同學設計的果酒和果醋的發酵裝置。請據圖回答下列問題：
圖1　　　　　　　圖2
(1)圖1中方框內的實驗流程是_________________________。
(2)沖洗的主要目的是____________________________，
沖洗時應特別注意不能______________，以防菌種的流失。
(3)圖2所示裝置中的充氣口在________時關閉，在________時連接充氣泵，并連續不斷地向內________。
(4)排氣口在果酒制作時排出的氣體是由________(填生物名稱)產生的________。
[解析]　本題主要考查了果酒、果醋制作的基本過程和原理，同時還考查了兩種微生物的代謝類型和生存環境。酵母菌是兼性厭氧微生物，有氧時進行有氧呼吸，無氧時進行酒精發酵，反應式分別為C6H12O6＋6O2＋6H2O6CO2＋12H2O＋能量，C6H12O62C2H5OH＋2CO2＋能量。因此制作果酒時，應在缺氧的環境中進行。醋酸菌是好氧細菌，在氧氣、糖源都充足時，其可將葡萄汁中的糖分解成乙酸；在糖源不足時，其可將乙醇變成乙醛，再將乙醛變為乙酸，酒精發酵時的缺氧環境會抑制醋酸菌的生長。在果酒制作過程中排氣口排出的氣體是由酵母菌產生的CO2。
[答案]　(1)乙酸發酵　(2)除去污物　反復沖洗
(3)酒精發酵　乙酸發酵　泵入空氣(或氧氣)　(4)酵母菌　CO2第2節　微生物的培養技術及應用
第1課時　微生物的基本培養技術
課標內容要求 核心素養對接
1．闡明在發酵工程中滅菌是獲得純凈的微生物培養物的前提。2．闡明無菌技術是在操作過程中，保持無菌物品與無菌區域不被微生物污染的技術。3．概述平板劃線法和稀釋涂布平板法是實驗室進行微生物分離和純化的常用方法。 1．科學思維：根據微生物的代謝類型分析培養基的組成；比較消毒和滅菌方法的不同。2．科學探究：討論并掌握無菌技術的實驗操作方法；討論并掌握微生物的純培養的方法。
一、培養基的配制
1．培養基
人們按照微生物對營養物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養基質——培養基，用以培養、分離、鑒定、保存微生物或積累其代謝物。
2．培養基的種類
3．培養基的營養組成
各種培養基一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽等營養物質，此外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養物質以及O2的需求。
4．培養基特殊需求
(1)培養乳酸桿菌時，在培養基中添加維生素。
(2)培養霉菌時，將培養基調至酸性。
(3)培養細菌時，將培養基調至中性或弱堿性。
(4)培養厭氧微生物時，需要提供無氧的條件。
二、無菌技術
1．無菌技術關鍵：防止雜菌污染。
2．消毒與滅菌
(1)概念
①消毒：使用較為溫和的物理、化學或生物等方法殺死物體表面或內部一部分微生物。
②滅菌：使用強烈的理化方法殺死物體內外所有的微生物(包括芽孢和孢子)。
(2)類型與方法
連一連：將無菌技術類型、常用方法和適用對象用線連起來。
提示：
3．具體操作
(1)對操作的空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒。
(2)將用于微生物培養的器皿、接種用具和培養基等進行滅菌。
(3)為避免周圍環境中微生物的污染，實驗操作應在超凈工作臺并在酒精燈火焰附近進行。
(4)實驗操作時應避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品接觸。
三、微生物的純培養
1．微生物純培養的概念：由單一個體繁殖所獲得的微生物群體稱為純培養物，獲得純培養物的過程就是純培養。
2．微生物純培養的步驟：微生物的純培養包括配制培養基、滅菌、接種、分離和培養等步驟。
3．酵母菌的純培養
(1)菌落：分散的微生物在適宜的固體培養基表面或內部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態結構的子細胞群體。
(2)純培養的原理：設法在培養基上得到由單個微生物繁殖形成的純培養物(單菌落)。
(3)純培養方法：平板劃線法和稀釋涂布平板法。
(4)酵母菌的純培養步驟
判斷對錯(正確的打“√”，錯誤的打“×”)
1．液體培養基含有水，而固體培養基不含水。 (×)
提示：液體培養基和固體培養基都含有水，它們的區別為是否含有凝固劑。
2．獲得純凈微生物培養物的關鍵是防止雜菌污染。 (√)
3．用于微生物培養的器皿、接種用具和培養基都要進行消毒。 (×)
提示：用于微生物培養的器皿、接種用具和培養基都要進行滅菌。
4．培養基分裝到培養皿后進行滅菌。 (×)
提示：培養基分裝到培養皿之前要進行滅菌。
5．平板冷凝后應將平板倒置，防止皿蓋上的冷凝水落入培養基，造成污染。 (√)
6．轉換劃線角度后需要灼燒接種環再進行劃線。 (√)
　制備培養基
1．培養基的配制原則
(1)目的要明確：不同的微生物需求不同，根據培養目的進行配制。
(2)營養要協調：營養物質的濃度和比例要適宜。
(3)pH要適宜：為維持pH的相對恒定，可在培養基中加入緩沖劑，常用K2HPO4－KH2PO4。
2．培養基的成分及功能
營養物質 作用 功能 主要來源
碳源 能為微生物代謝提供碳元素 構成生物體的細胞物質和一些代謝產物，有些是異養生物的能源物質 無機碳源：CO2、NaHCO3等；有機碳源：糖類、脂質、蛋白質、有機酸等
氮源 能為微生物的代謝提供氮元素 合成蛋白質、核酸以及含氮的代謝產物 無機化合物：N2、NH3、銨鹽、硝酸鹽等；有機氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等
生長因子 微生物生長不可缺少的微量有機物 酶和核酸的組成成分；參與代謝過程中的酶促反應 維生素、氨基酸、堿基等
水 是生命活動所必需的 不僅是優良的溶劑，而且可維持生物大分子結構的穩定 外界攝入
無機鹽 為微生物提供除碳、氮以外的各種重要元素，包括大量元素 細胞內的組成成分，生理調節物質，某些化能自養菌的能源，酶的激活劑 無機化合物
1．能夠利用無機碳源的微生物的同化作用類型是什么？
提示：能利用無機碳源的微生物的同化作用類型是自養型微生物。
2．牛肉膏蛋白胨培養基是一種常見的細菌培養基，其中牛肉膏、蛋白胨能夠提供哪些營養成分？
提示：牛肉膏、蛋白胨能夠提供碳源、氮源、維生素(生長因子)和無機鹽。
1．(2020·吉林三中高二月考)下列有關培養基配制原則的表述，正確的是(　　)
A．任何培養基都必須含有碳源、氮源、無機鹽、水
B．碳源和氮源必須具有一定比例，碳元素的含量最多，其次為氮元素
C．微生物的生長除受營養因素影響外，還受溫度、pH、氧氣、滲透壓等的影響
D．營養物質的濃度越高越好
C　[培養基一般都含有碳源、氮源、無機鹽和水等營養物質，但不是必須全部含有，如自養型微生物培養基中可不含碳源，A項錯誤；碳源和氮源必須具有一定比例，但碳元素的含量不一定最多，B項錯誤；微生物的生長除受營養因素影響外，還受溫度、pH、氧氣、滲透壓等的影響，C項正確；營養物質的濃度過高可能會造成微生物滲透失水而死亡，D項錯誤。]
2．下列關于制備牛肉膏蛋白胨固體培養基的敘述，錯誤的是(　　)
A．操作順序為計算、稱量、溶化、倒平板、滅菌
B．將稱好的牛肉膏連同稱量紙一同放入燒杯
C．待培養基冷卻至50 ℃左右時倒平板
D．待培養基冷卻凝固后將平板倒過來放置
A　[制備牛肉膏蛋白胨固體培養基的步驟是計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板，其順序不能顛倒，A錯誤；牛肉膏比較黏稠，所以稱好后需將稱量紙一同放入燒杯中加熱，當牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻璃棒取出稱量紙，B正確；待培養基冷卻至50 ℃左右，開始倒平板，C正確；培養基冷卻凝固后需將平板倒置，D正確。]
　無菌技術
1．無菌技術的概念：防止外來雜菌的入侵，并保持已滅菌物品及無菌區域不再被污染的方法，稱為無菌技術。
2．無菌技術的目的：
(1)可防止實驗室的培養物被其他微生物污染。
(2)有效避免操作者自身被微生物感染。
3．無菌技術的選擇原則
(1)考慮效果：滅菌的效果比消毒要好。
(2)考慮操作對象的承受能力：活體生物材料、操作者的手等只能采用消毒的方法，而不能采用滅菌的方法。
4．無菌技術的方法——滅菌和消毒
滅菌和消毒的種類 主要方法 應用范圍
滅菌 濕熱滅菌(高壓蒸汽滅菌法) 100 kPa、121 ℃維持15～30 min 培養基及多種器材、物品
干熱滅菌 干熱滅菌箱160～170 ℃加熱2～3 h 玻璃器皿(如吸管、培養皿等)、金屬用具等凡不適宜用其他方法滅菌而又能耐高溫的物品
灼燒滅菌 酒精燈火焰灼燒 微生物接種工具，如接種環、接種針或其他金屬用具等，接種過程中的試管口或瓶口等
消毒 煮沸消毒法 100 ℃煮沸5～6 min 家庭餐具等生活用品
巴氏消毒法 62～65 ℃煮30 min或80～90 ℃煮30 s～1 min 牛奶、啤酒、果酒和醬油等不宜進行高溫滅菌的液體
紫外線消毒 30 W紫外燈照射30 min 接種室空氣
化學藥物消毒 用體積分數為75%的乙醇、碘酒涂抹，來蘇水噴灑等 皮膚、傷口、動植物組織表面和空氣、手術器械、塑料或玻璃器皿等
1．滅菌和消毒的作用原理是什么？
提示：作用原理是借助理化因素，通過使蛋白質變性來抑制微生物生命活動或殺死微生物。
2．滅菌和消毒的根本區別是什么？
提示：根本區別是芽孢和孢子是否滅活，滅菌能殺死芽孢和孢子，因而滅菌更徹底。
3．對培養基、培養皿、接種環、實驗者的雙手、空氣和牛奶常采用的滅菌或消毒方法分別是什么？
提示：分別為高壓蒸汽滅菌、干熱滅菌、灼燒滅菌、化學藥物消毒、紫外線消毒、巴氏消毒。
4．在用酒精消毒時為什么用75%的酒精，而不用100%的酒精？
提示：75%的酒精殺菌效果最好。原因是濃度過高，菌體表面蛋白質變性過快而凝固成一層保護膜，酒精不能滲入其中。
1．(2020·山東萊州一中高二檢測)微生物的實驗室培養，獲得純凈培養物的關鍵是防止外來雜菌入侵。下列無菌操作中，錯誤的是(　　)
A．對實驗用的培養基，采用高壓蒸汽滅菌鍋進行滅菌
B．對錐形瓶、塞上棉塞的試管、吸管等，用干熱滅菌箱進行滅菌
C．對操作者的雙手、衣著以及操作空間等，采用紫外線進行消毒
D．對試管口、錐形瓶口等部位，通過火焰灼燒進行滅菌
C　[對實驗用的培養基，采用高壓蒸汽滅菌鍋進行滅菌，A項正確；對錐形瓶、塞上棉塞的試管、吸管等，用干熱滅菌箱進行滅菌，B項正確；對操作者的雙手采用酒精進行消毒，C項錯誤；對試管口、錐形瓶口等部位，通過火焰灼燒進行滅菌，D項正確。]
2．在生產、生活和科研實踐中，經常通過消毒和滅菌來避免雜菌的污染。請回答下列問題：
(1)在實驗室中，玻璃和金屬材質的實驗器具________(填“可以”或“不可以”)放入干熱滅菌箱中進行干熱滅菌。
(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高溫瞬時消毒法，與煮沸消毒法相比，這兩種方法的優點是___________________________。
(3)密閉空間內的空氣可采用紫外線照射消毒，其原因是紫外線能_____________。在照射前，適量噴灑________，可強化消毒效果。
(4)水廠供應的自來水通常是經過________(填“氯氣”“乙醇”或“高錳酸鉀”)消毒的。
(5)某同學在使用高壓蒸汽滅菌鍋時，若壓力達到設定要求，而鍋內并沒有達到相應溫度，最可能的原因是___________________。
[解析]　(1)在實驗室中，能耐高溫的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金屬材質的實驗器具等可以放入干熱滅菌箱中進行干熱滅菌。(2)巴氏消毒法或高溫瞬時消毒法與煮沸消毒法相比，其優點表現為在達到消毒目的的同時，營養物質損失較少。(3)紫外線照射能消毒的原因是其能夠破壞微生物細胞中的DNA分子。在利用紫外線照射前，適量噴灑石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可強化消毒效果。(4)自來水通常是采用氯氣進行消毒的。(5)采用高壓蒸汽滅菌時，若壓力達到設定要求，而溫度未達到相應要求，最可能的原因是沒有排盡高壓蒸汽滅菌鍋內的冷空氣。
[答案]　(1)可以　(2)在達到消毒目的的同時，營養物質損失較少　(3)破壞DNA結構　消毒液　(4)氯氣　(5)未將鍋內冷空氣排盡
　無菌技術的主要內容
(1)對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和消毒。
(2)將用于微生物培養的器皿、接種用具和培養基等進行滅菌。
(3)為避免周圍環境中微生物的污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近進行。
(4)實驗操作時應避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。
　酵母菌的純培養
1．平板劃線法接種和分離酵母菌
(1)平板劃線法：通過接種環在固體培養基表面連續劃線操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面。
(2)平板劃線法的注意事項
①灼燒接種環后，要冷卻后才能進行操作，以免溫度太高殺死菌種。
②第二次及其以后的劃線操作總是從上一次劃線末端開始，能使微生物的數目隨著劃線次數的增加而逐漸減少，最終得到由單個細胞繁殖而來的菌落。
③劃線用力大小要適當，防止用力過大將培養基劃破。
④最后一次的劃線不要與第一次的劃線相連。
⑤幾次灼燒接種環的目的
灼燒時期 目的
第一次操作(取菌種前) 殺死接種環上原有的微生物，避免污染培養物
每次劃線之前 殺死上次劃線后接種環上殘留的菌種，使下次劃線的菌種直接來源于上次劃線的末端，使每次劃線菌種數目減少
劃線結束 殺死接種環上殘存的菌種，避免微生物污染環境和感染操作者
2．培養酵母菌：接種和未接種的平板在溫度適宜的恒溫箱中培養。
3．結果分析與評價
(1)平板劃線法結果
平板劃線示意圖(A)及培養后菌落分布示意圖(B)如下圖所示。
(2)在接種酵母菌的培養基上可觀察到獨立的菌落，這些菌落在顏色、形狀和大小上相似，酵母菌菌落一般表面光滑，多呈乳白色。
(3)若在培養基中觀察到不同形態的菌落，原因可能是菌液不純，混入其他雜菌，或在實驗操作過程中被雜菌污染。
1．倒平板時，培養基冷凝后，為什么要將平板倒置？
提示：培養基冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，將平板倒置既可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，又可以避免培養基中的水分過快地揮發。
2．接種結束后，為什么要將一個未接種的培養基和一個接種的培養基放在一起培養，未接種的培養基表面是否有菌落生長很關鍵。如果有菌落生長，說明了什么？
提示：培養未接種培養基的作用是作對照，未接種的培養基在恒溫箱中保溫1～2 d后無菌落生長，說明培養基的制備是成功的。若有菌落形成，說明培養基滅菌不徹底，或培養基被污染了，需要重新制備。
1．下圖為實驗室培養和純化酵母菌過程中的部分操作步驟，下列說法錯誤的是(　　)
A．①②③步驟操作時需要在酒精燈火焰旁進行
B．步驟①中待倒入的培養基冷卻后蓋上培養皿的皿蓋
C．步驟③中，每次劃線前后都需對接種環進行滅菌處理
D．劃線接種結束后，將圖④平板倒置后放入培養箱中培養
B　[由題干圖可知，①是倒平板，②是用接種環蘸取菌液，③是進行平板劃線，④是培養。①②③步驟操作時需要在酒精燈火焰旁進行，防止被雜菌污染，A正確；倒完平板后應立即蓋上培養皿，冷卻后將平板倒過來放置，B錯誤；每次劃線前灼燒接種環是為了殺死上次劃線結束后，接種環上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數的增加，使每次劃線時菌種的數目逐漸減少，以便得到單菌落，C正確；劃線接種結束后，將平板倒置后放入培養箱中培養，可以避免培養基中的水分過快地揮發和防止皿蓋上的水珠落入培養基造成污染，D正確。]
2．(2020·遼寧沈陽鐵路實驗中學期中)在分離、純化大腸桿菌實驗中，劃線接種(甲)、培養結果(乙)如圖所示，且甲、乙的對應位置不變。有關敘述錯誤的是(　　)
甲　　　乙
A．配制培養基時需進行高壓蒸汽滅菌
B．甲中a區域為劃線的起始位置
C．連續劃線的目的是獲得單個細菌形成的菌落
D．圖示接種過程中接種環灼燒了5次
B　[為了能徹底滅菌，配制的培養基需進行高壓蒸汽滅菌，A正確；起始劃線的區域長出的菌落多且密，甲中d區域為劃線的起始位置，a區域為劃線的結束位置，B錯誤；連續劃線的目的是獲得單個細菌形成的菌落，C正確；由于每次使用接種環前后都要灼燒滅菌，圖示甲中共有4次劃線接種，接種過程中接種環灼燒了5次，D正確。]
下表是某種微生物培養基的成分。請思考回答下列問題：
編號 ① ② ③ ④ ⑤
成分 (NH4)2SO4 KH2PO4 FeSO4 CaCl2 H2O
含量 0.4 g 4.0 g 0.5 g 0.5 g 100 mL
通過對某種微生物培養基成分的分析培養學生的物質與能量觀、適應觀等生命觀念，認識生物的多樣性、獨特性。
(1)該培養基含有微生物生長所需要的營養成分有哪幾類？(生命觀念)
(2)該培養基可培養什么樣的微生物？說明理由。(生命觀念)
(3)若除去成分①，加入(CH2O)，該培養基可用于培養什么樣的微生物？(科學思維)
提示：(1)該培養基含有的營養成分有三類：水、無機鹽和氮源。
(2)該培養基培養的是自養型微生物，因為該培養基中不含含碳有機物。
(3)若除去成分①，加入含碳有機物可用于培養固氮菌。
[課堂小結]
知 識 網 絡 構 建 核 心 語 句 背 誦
1.各種培養基都含有水、碳源、氮源和無機鹽等營養物質。2.獲得純凈微生物培養物的關鍵是防止雜菌污染。3.消毒是指使用較為溫和的物理、化學或生物等方法殺死物體表面或內部一部分微生物。4.滅菌是指使用強烈的理化方法殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子。5.由單一個體繁殖所獲得的微生物群體稱為純培養物，獲得純培養物的過程就是純培養。6.菌落是分散的微生物在適宜的固體培養基表面或內部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態結構的子細胞群體。
1．不同培養基的具體配方不同，但一般都含(　　)
A．碳源、磷酸鹽和維生素
B．氮源和維生素
C．水、碳源、氮源和無機鹽
D．碳元素、氧元素、氫元素、氮元素
C　[培養基中一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽，此外還應考慮pH、特殊營養物質及O2等條件。]
2．采用干熱滅菌、灼燒滅菌、高壓蒸汽滅菌、紫外線照射等幾種方法，可分別殺死哪些部位的雜菌(　　)
A．接種環、吸管、培養基、接種室
B．吸管、接種環、培養基、接種箱
C．培養基、吸管、接種環、接種箱
D．培養皿、吸管、培養基、雙手
B　[干熱滅菌是將滅菌物品放入干熱滅菌箱內，在160～170 ℃下加熱2～3 h，適用于耐高溫且需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培養皿)和金屬用具等；灼燒滅菌是利用酒精燈火焰的充分燃燒層滅菌，如接種針、接種環等；高壓蒸汽滅菌用高壓蒸汽滅菌鍋，一般在壓力為100 kPa、溫度為121 ℃的條件下，維持15～30 min，主要用于培養基滅菌；紫外線照射適用于物體表面滅菌和空氣滅菌，如接種室、接種箱、超凈工作臺等，使用前用紫外線照射約30 min。]
3．(2020·河北邢臺期末)下列有關微生物的分離與培養的敘述，錯誤的是(　　)
A．獲得純培養物的關鍵是防止雜菌污染
B．倒置平板可防止培養皿蓋上的冷凝水滴落造成污染
C．倒平板時將培養皿的蓋拿開，以便于將錐形瓶中的培養基倒入培養皿
D．檢驗培養基是否被雜菌污染的最有效方法是將未接種的培養基放在恒溫箱中培養
C　[獲得純培養物的關鍵是防止雜菌污染，A正確；倒置平板可防止培養皿蓋上的冷凝水滴落造成污染，B正確；倒平板時用食指和拇指夾住皿蓋并開啟一縫，使其恰好能讓錐形瓶瓶口伸入，隨后倒入培養基，C錯誤；檢驗培養基是否被雜菌污染的最有效方法是將未接種的培養基放在恒溫箱中培養，D正確。]
4．下列有關平板劃線操作的描述，錯誤的是(　　)
A．將接種環放在酒精燈火焰上灼燒，直到接種環燒紅
B．接種環在平板上劃線的位置是隨機的
C．在挑取菌種前和接種完畢后均要將試管口通過酒精燈火焰
D．最后一區的劃線不能與第一區相連
B　[接種環在平板上劃線的位置并不是隨機的：將蘸有菌種的接種環伸入平板內，劃三至五條平行線后應蓋上皿蓋，并灼燒接種環，待其冷卻后，從第一區域劃線的末端開始往第二區域內劃線，重復以上操作，在三、四、五區域內劃線。]
5．下表是培養某微生物的培養基的配方，請回答下列問題：
組分 牛肉膏 蛋白胨 NaCl 瓊脂 水
用量 5 g 10 g 5 g 20 g 1 000 mL
(1)培養基的類型很多，但培養基中一般都含有水、碳源、_____和無機鹽。上述培養基配方中能充當碳源的成分是_______。培養基配制完成以后，一般還要調節pH并對培養基進行______處理。
(2)在配制培養基時，除考慮營養條件外，還要考慮________、________和滲透壓等條件。
(3)在微生物培養操作過程中，為防止雜菌污染，需對培養基和培養器皿進行________(填“消毒”或“滅菌”)；操作者的雙手需進行清洗和________；空氣中的細菌可用紫外線殺滅，其原因是紫外線能使蛋白質________，還能損傷DNA的結構。
(4)分離純化微生物最常使用的接種方法是______________。
(5)在接種前需要檢測培養基是否被污染。對于固體培養基應采用的檢測方法是____________________。
[解析]　(1)培養基中都應含有水、無機鹽、碳源和氮源。培養基配制完成后要調pH和滅菌。牛肉膏、蛋白胨中含碳元素，可作為有機碳源。(2)配制培養基時，除考慮營養條件外，還要考慮溫度、酸堿度和滲透壓等條件。(3)滅菌是指使用強烈的理化方法殺死物體內外所有的微生物，所以要對培養基和培養皿進行滅菌。消毒是指使用較為溫和的物理、化學或生物等方法殺死物體表面或內部一部分微生物，故操作者的雙手需要進行清洗和消毒。紫外線能使蛋白質變性，還能損傷DNA的結構。(4)分離純化微生物常采用平板劃線法。(5)培養微生物時，在接種前需要檢測培養基是否被污染。對于固體培養基應采用的檢測方法是將未接種的培養基在適宜的溫度下放置適宜的時間，觀察培養基上是否有菌落產生。
[答案]　(1)氮源　牛肉膏和蛋白胨　滅菌　(2)溫度　酸堿度　(3)滅菌　消毒　變性　(4)平板劃線法　(5)將未接種的培養基放在恒溫箱中一段時間，觀察培養基上是否有菌落產生第2課時　微生物的選擇培養和計數
課標內容要求 核心素養對接
1.舉例說明通過調整培養基的配方可有目的地培養某種微生物。2．概述稀釋涂布平板法和顯微鏡計數法是測定微生物數量的常用方法。 1．生命觀念：通過實例理解各類微生物都能適應其生活環境。2．科學思維：根據微生物的代謝類型配制選擇培養基；總結分離微生物的過程和測定微生物數量的常用方法。3．科學探究：討論土壤中分解尿素的細菌的分離與計數的實驗方法并對實驗結果進行評價。
一、選擇培養基
1．實驗室中微生物篩選的原理：人為提供有利于目的菌生長的條件(包括營養、溫度和pH等)，同時抑制或阻止其他微生物的生長。
2．選擇培養基概念：在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基。
3．選擇培養基配方的設計
(1)原理：分解尿素的細菌合成的脲酶將尿素分解產生NH3。
(2)培養基配方設計：以尿素為唯一氮源的選擇培養基。
二、微生物的選擇培養
1．方法：對土樣進行充分稀釋，然后再將菌液涂布到制備好的選擇培養基上。
2．稀釋涂布平板法的操作過程
(1)系列梯度稀釋操作
(2)涂布平板操作
①取菌液：取0.1_mL菌液，滴加到培養基表面。
②涂布器滅菌：取出浸在酒精中的涂布器，放在火焰上灼燒，待酒精燃盡，涂布器冷卻后，再進行涂布。
③涂布過程：用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基表面，涂布時可轉動培養皿，使涂布均勻。
3．培養：待涂布的菌液被培養基吸收后，將平板倒置，放入30～37 ℃的恒溫培養箱中培養1～2 d，觀察。
三、微生物的數量測定
1．稀釋涂布平板法
(1)統計依據
當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。
(2)操作
①選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養，一般選擇菌落數為30～300的平板進行計數。
②在同一稀釋度下，應至少對3個平板進行重復計數，然后求出平均值。
2．顯微鏡直接計數：利用特定的細菌計數板或血細胞計數板，在顯微鏡下觀察、計數，然后再計算一定體積的樣品中微生物的數量。
四、探究·實踐——土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
1．提出問題：如何分離土壤中分解尿素的細菌？每克土壤樣品中含有多少分解尿素的細菌？
2．基礎知識
組分 含量 提供的主要營養
KH2PO4 1.4 g 無機鹽
Na2HPO4 2.1 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
葡萄糖 10.0 g 碳源
尿素 1.0 g 氮源
瓊脂 15.0 g 凝固劑
H2O 定容至1 000 mL 水
3．實驗設計
(1)土壤取樣：先鏟去表層土，取距地表3～8 cm的土壤層，將樣品裝入紙袋中。
(2)樣品的稀釋：一般選用1×104、1×105、1×106倍稀釋的稀釋液進行平板培養。
(3)微生物的培養與觀察：細菌一般在30～37_℃的溫度下培養1～2天，每隔24_h統計一次菌落數目，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果。
判斷對錯(正確的打“√”，錯誤的打“×”)
1．選擇分解尿素的細菌的培養基為液體培養基。 (×)
提示：選擇分解尿素的細菌的培養基為固體培養基，固體培養基具有分離、鑒定作用。
2．由于使用了選擇培養基，因此本實驗不需要設置對照組。 (×)
提示：應該設置未接種的平板和接種在牛肉膏蛋白胨培養基的平板作為對照。
3．在用涂布器涂布平板時，為了操作方便可完全打開培養皿蓋。 (×)
提示：為了防止雜菌污染，不能完全打開皿蓋。
4．在同一稀釋度下，至少要涂布3個平板。 (√)
5．當菌落數目穩定時，選取菌落數為30～300的平板進行計數。 (√)
6．統計菌落數目時，統計的菌落數就是活菌的實際數目。 (×)
提示：由于當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落，所以統計的菌落數往往比活菌的實際數目少。
　微生物的選擇培養與計數方法
1．選擇培養的目的：從眾多微生物中分離出需要的特定微生物。
2．篩選微生物常用培養基——選擇培養基和鑒別培養基
選擇培養基 鑒別培養基
特殊成分 控制某一條件(如唯一氮源)或加入某種物質(如青霉素) 加入某種指示劑或化學藥品
目的 抑制其他微生物生長，促進目的微生物的生長 與微生物的代謝產物或培養基中的成分發生特定反應
用途 培養、分離出特定微生物 鑒別不同的微生物
舉例 培養酵母菌和霉菌，可在培養基中加入青霉素，抑制細菌生長；用以尿素為唯一氮源的培養基來培養尿素分解菌 可用伊紅—美藍培養基鑒定飲用水或乳制品中是否有大腸桿菌(若有，菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤)
3．稀釋涂布平板法
(1)主要操作環節：系列梯度稀釋和涂布平板。
(2)系列梯度稀釋和涂布平板后培養結果如圖所示：
(3)計算公式：
每克樣品中的菌株數＝
×稀釋倍數
(4)計數結果：由于當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落，計算結果比實際值偏小。
4．稀釋涂布平板法操作注意問題
(1)稀釋操作時：每支試管及其中的9 mL水、移液管等均需滅菌；操作時，試管口和移液管應在離火焰1～2 cm處。
(2)涂布平板時：
①涂布器浸在體積分數為70%的酒精中，取出時，讓多余酒精在燒杯中滴盡，然后將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。
②不要將過熱的涂布器放在盛放酒精的燒杯中，以免引燃其中的酒精。
③酒精燈與培養皿距離要合適，移液管管頭不接觸任何物體。
(3)同一稀釋度的樣液加到三個或三個以上的平板上，經涂布、培養，計算出菌落平均數。
5．顯微鏡直接計數
(1)原理：此法利用特定的細菌計數板或血細胞計數板，在顯微鏡下計算一定體積的樣品中微生物的數量。
(2)方法：顯微鏡下觀察，細菌計數板或血細胞計數板計數。
(3)計算公式：
每毫升原液所含細菌數＝每小格平均細菌數×400×10 000×稀釋倍數。
(4)缺點：統計的結果一般是活細菌和死細菌的總和，計算結果比實際值偏大。
1．如何從大豆田土壤中分離出固氮微生物？
提示：從大豆田土壤取土樣，利用缺乏氮源的培養基可分離出固氮微生物。
2．要分離出分解纖維素的微生物，應在什么樣的環境中取土樣？應配制什么樣的培養基？
提示：應從富含纖維素的土壤中取土樣，如樹林中多年落葉形成的腐殖土。應配制以纖維素為唯一碳源的培養基。
3．在用稀釋涂布平板法對微生物進行計數時，統計菌落數目的理論依據是什么？
提示：當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。
4．稀釋涂布平板法和顯微計數法對微生物計數產生的實驗誤差如何？試分析原因。
提示：稀釋涂布平板法計數的值比實際值小，原因是當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落；顯微計數法計數的結果比實際值大，原因是顯微鏡下無法區分細胞的死活，計數時包括了死細胞。
1．(2021·河北衡水中學檢測)秸稈還田可增加土壤肥力，緩解環境污染。為分離分解纖維素的微生物菌種，實現廢物的資源化利用，研究人員設計了“土壤取樣→選擇培養→梯度稀釋→涂布平板→挑選菌株”的實驗流程。下列敘述錯誤的是(　　)
A．配制培養基時，應在高壓蒸汽滅菌之后調節pH
B．選擇培養時，應使用纖維素為唯一碳源的培養基
C．進行梯度稀釋時，應在酒精燈火焰旁完成各種操作
D．挑選菌株后，應將使用過的培養基進行滅菌后再丟棄
A　[配制培養基時，應在高壓蒸汽滅菌之前調節pH，避免滅菌之后調節pH造成雜菌污染，A錯誤；選擇培養時，為分離分解纖維素的微生物菌種，應使用纖維素為唯一碳源的培養基，B正確；進行梯度稀釋時，為了無菌操作，應在酒精燈火焰旁完成各種操作，C正確；挑選菌株后，為了防止造成污染，應將使用過的培養基進行滅菌后再丟棄，D正確。]
2．(2020·全國卷Ⅰ)某種物質S(一種含有C、H、N的有機物)難以降解，會對環境造成污染，只有某些細菌能降解S。研究人員按照下圖所示流程從淤泥中分離得到能高效降解S的細菌菌株。實驗過程中需要甲、乙兩種培養基，甲的組分為無機鹽、水和S，乙的組分為無機鹽、水、S和Y。
無菌水　　甲　　乙　　 　　甲
回答下列問題：
(1)實驗時，盛有水或培養基的搖瓶通常采用______________的方法進行滅菌。乙培養基中的Y物質是____________。甲、乙培養基均屬于________培養基。
(2)實驗中初步估測搖瓶M中細菌細胞數為2×107個/mL，若要在每個平板上涂布100 μL稀釋后的菌液，且保證每個平板上長出的菌落數不超過200個，則至少應將搖瓶M中的菌液稀釋________倍。
(3)在步驟⑤的篩選過程中，發現當培養基中的S超過某一濃度時，某菌株對S的降解量反而下降，其原因可能是____________(答出1點即可)。
(4)若要測定淤泥中能降解S的細菌細胞數，請寫出主要實驗步驟：_________________。
(5)上述實驗中，甲、乙兩種培養基所含有的組分雖然不同，但都能為細菌的生長提供4類營養物質，即_____________。
[解析]　(1)實驗過程中，對盛有水或培養基的搖瓶進行滅菌時，常采用高壓蒸汽滅菌法。據題圖分析可知，乙培養基為固體培養基，與甲培養基相比，其特有的組分Y物質應是凝固劑瓊脂。甲、乙培養基均只允許能利用物質S作為氮源和碳源的微生物生長，因此均為選擇培養基。(2)據題意，假設至少將搖瓶M中的菌液稀釋X倍，才能保證稀釋后的100 μL菌液中細菌細胞數不超過200個，初步估測搖瓶M中細菌細胞數為2×107個/mL，則稀釋之前100 μL菌液中有2×106個細菌，可得2×106×(1/X)＝200，則X＝104，因此至少應將搖瓶M中的菌液稀釋104倍。(3)在篩選過程中，若培養基中S濃度過高，可能會導致細胞失水，進而抑制菌株的生長。(4)將含有能降解S的細菌的淤泥加入無菌水中，進行適當稀釋后，利用稀釋涂布平板法，取適量的菌液涂布到乙培養基上，在適宜條件下進行培養，一段時間后，統計菌落數，即可估算出淤泥中能降解S的細菌細胞數。(5)本實驗中，甲、乙兩種培養基所含有的組分雖然不同，但都能為細菌的生長提供的營養物質是水、碳源、氮源和無機鹽。
[答案]　(1)高壓蒸汽滅菌　瓊脂　選擇　(2)104
(3)S的濃度超過某一值時會抑制菌株的生長　(4)取淤泥加入無菌水中，涂布(或稀釋涂布)到乙培養基上，培養后計數　(5)水、碳源、氮源和無機鹽
　兩種純化方法的比較
主要方法 平板劃線法 稀釋涂布平板法
主要步驟 接種環在固體培養基表面連續劃線 系列梯度稀釋操作和涂布平板操作
接種工具 接種環 涂布器
菌體獲取 在具有顯著的菌落特征的區域挑取菌體 從適宜稀釋度的平板上的菌落中挑取菌體
能否用于計數 不能計數 可以計數，但是操作復雜，需涂布多個平板
共同點 都能將微生物分散到固體培養基表面，以獲得單細胞菌落，達到分離純化微生物的目的，也可用于觀察菌落特征
　土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
1．分離菌種的原理
在以尿素為唯一氮源的選擇培養基上，只有能產生脲酶的微生物才能分解尿素，而缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，會因缺乏氮源而無法生長繁殖。
2．實驗流程示意圖
3．實驗操作過程
流程 具體操作 操作提示
土壤取樣 先鏟去表層土，取距地表3～8 cm的土壤層，將樣品裝入紙袋中 ①適宜在富含有機質，酸堿度接近中性的潮濕土壤中取樣②取樣用的鐵鏟和取樣的紙袋使用前都需要滅菌
制備培養基 分別配制牛肉膏蛋白胨培養基和以尿素為唯一氮源的選擇培養基 牛肉膏蛋白胨培養基作為對照組，用來判斷選擇培養基是否具有選擇的作用
樣品的稀釋和涂布 ①火焰旁稱取土壤樣本②將稀釋倍數為103～107倍稀釋的稀釋液涂布平板。每個稀釋度至少涂布三個平板作為重復組 ①注意無菌操作②對所用的平板、試管做好標記③初次實驗對于稀釋的范圍沒有把握，可選擇一個較為寬泛范圍103～107倍稀釋的稀釋液
培養、觀察和計數 ①將涂布好的平板和空白平板放在適宜溫度下的培養箱中倒置培養②每隔24 h統計一次菌落數目，比較牛肉膏蛋白胨培養基和選擇培養基中菌落的數量、形態等，并做好記錄③當菌落數目穩定時，選取菌落數在30～300的平板進行計數 ①空白平板作為對照，檢測培養基制備是否合格②觀察時還要記錄不同菌落的形狀、大小、顏色等③在同一稀釋度下，至少對3個平板進行計數，然后求出平均值，并根據平板所對應的稀釋度計算出樣品中活菌的數目
4．實驗結果分析
內容 現象 結論
有無雜菌污染的判斷 對照的培養皿中無菌落生長 未被雜菌污染
培養基中菌落數偏高 被雜菌污染
菌落形態多樣，菌落數偏高 培養基中混入其他雜菌
選擇培養基的篩選作用 牛肉膏蛋白胨培養基上的菌落數目大于選擇培養基上的數目 選擇培養基具有篩選作用
樣品的稀釋操作 得到3個或3個以上菌落數目在30～300的平板 操作成功
重復組的結果 若選取同一種土樣，統計結果應接近
5．鑒定原理：分解尿素的細菌合成的脲酶將尿素分解為NH3，使培養基的堿性增強，pH升高。在選擇培養基中加入酚紅指示劑，培養某種細菌，若指示劑變紅，可初步鑒定該種細菌能夠分解尿素。
1．在稀釋涂布平板法中，為何需要涂布3個平板？
提示：作為重復實驗，統計時取平均值，以減少偶然因素對實驗結果的影響，增強實驗結果的說服力。
2．為什么一般選擇菌落數為30～300的平板進行計數？
提示：若平板上菌落數過多，說明稀釋度過低，菌體的密度大，就會出現更多的兩個或兩個以上的菌體形成的菌落，結果不準確，且計數較困難。若平板上菌落數過少，菌落形成的偶然性大，結果也不準確。
3．為什么要選取菌落數目穩定時的記錄作為結果？
提示：盡量縮小統計的菌落數與實際活菌數的差值，因為繁殖慢的菌體開始看不出明顯的菌落。
1．下列關于“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數”實驗操作的敘述，錯誤的是(　　)
A.利用稀釋涂布平板法準確估計菌落數目的關鍵是有恰當的稀釋度
B.若要判斷選擇培養基是否起到了選擇作用需要設置未接種的牛肉膏蛋白胨培養基作為對照
C.該實驗應采用稀釋涂布平板法
D.用以尿素為唯一氮源且添加了酸堿緩沖劑的培養基來培養該細菌后不會使酚紅指示劑變紅
B　[利用稀釋涂布平板法估算菌落數目的關鍵是有恰當的稀釋度，若稀釋倍數太低，菌落太多，會長在一起，稀釋倍數太高，平板上菌落數目過少，都不宜進行計數，A正確；若要判斷選擇培養基是否起到了選擇作用，需設置接種在沒有選擇作用的牛肉膏蛋白胨培養基上培養作為對照，B錯誤；該實驗應采用稀釋涂布平板法，C正確；分解尿素的細菌能合成脲酶，將尿素分解產生氨，使培養基的堿性增強，用以尿素為唯一氮源且添加了酸堿緩沖劑的培養基來培養該細菌，則能維持pH穩定，不會使酚紅指示劑變紅，D正確。]
2．下圖為“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數”實驗中樣品稀釋示意圖。據圖分析，下列敘述正確的是(　　)
A.3號試管的稀釋倍數為103倍
B.4號試管中稀釋液進行平板培養得到的菌落平均數恰好為5號試管的10倍
C.5號試管的結果表明每克土壤中的菌株數為1.7×109個
D.該實驗方法統計得到的結果往往會比實際活菌數目要多
C　[3號試管的稀釋倍數為104倍，A項錯誤；4號試管中稀釋液進行平板培養得到的菌落平均數不一定恰好為5號試管的10倍，B項錯誤；5號試管的結果表明每克土壤中的菌株數為(168＋175＋167)÷3÷0.1×106＝1.7×109(個)，C項正確；在固體培養基上可能存在兩個或多個菌體形成一個菌落的情況，得到的結果往往會比實際活菌數目少，D項錯誤。]
　實驗中的兩種“對照組”與“重復組”
(1)兩種對照組作用比較。
①判斷培養基中“是否有雜菌污染”，需將未接種的培養基(空白對照組)同時進行培養。
②判斷選擇培養基“是否具有篩選作用”，需設置完全培養基(牛肉膏蛋白胨培養基)進行接種培養，觀察兩種培養基上菌落數目，進行對比得出結論。
(2)重復組的設置及作用：為排除偶然因素對實驗結果的干擾，在每一稀釋度下宜設置3個平板作為重復組，選擇菌落數均在30～300且數目相差不大的三個平板，用“平均值”代入計數公式計算活菌數。
微生物合成的油脂是制備生物柴油的新型原料。如圖為產油脂芽孢桿菌篩選的流程，其中B平板上的5個菌落是初篩得到的芽孢桿菌，C為B平板上菌落的原位影印，利用蘇丹黑B可使脂類物質呈黑色的特性，對C進行染色，得到結果D。回答下列問題：
通過本案例培養學生的演繹與推理和對實驗結果的交流和討論能力。
(1)圖中對土壤菌液進行系列梯度稀釋的目的是什么？(科學思維)
(2)根據D的染色結果，判斷B平板中產油脂芽孢桿菌的菌落是哪一個？(科學思維)
(3)采用什么方法將B平板中的產油脂芽孢桿菌的單菌落進一步純化培養得到E？(科學思維)
提示：(1)將微生物分散成單個細胞，進而獲得單個細胞。
(2)3。
(3)平板劃線法或稀釋涂布平板法。
[課堂小結]
知 識 網 絡 構 建 核 心 語 句 背 誦
1.選擇培養基是指允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基。2．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素為唯一氮源的選擇培養基分離能分解尿素的細菌。3．為確保結果準確，一般選擇菌落數在30～300的平板進行計數。4．當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。5．統計的菌落數往往比活菌的實際數目少，這是因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。
1．下列能選擇出分解尿素的細菌的培養基是(　　)
A.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、瓊脂、蒸餾水
B.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、瓊脂、蒸餾水
C.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、瓊脂、蒸餾水
D.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、蒸餾水
A　[在A項的培養基中既有尿素作為唯一氮源，又有其他各種成分，可以選擇出分解尿素的細菌，而B項中無尿素作氮源，C項中缺少碳源，D項中有牛肉膏可提供氮源。]
2．(2020·山東淄博月考)下列關于土壤中分解尿素的細菌的分離與計數的敘述，正確的是(　　)
A.只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素
B.統計樣品中的活菌數目一般用平板劃線法
C.篩選分解尿素的細菌時，應以尿素作為培養基中唯一的營養物質
D.在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑，若指示劑變藍，則表明篩選到了分解尿素的細菌
A　[統計樣品中的活菌數目時一般用稀釋涂布平板法，B錯誤；篩選分解尿素的細菌時應以尿素作為培養基中的唯一氮源，培養基中還應含有水、無機鹽、碳源等營養物質，C錯誤；在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑，若指示劑變紅，則表明篩選到了分解尿素的細菌，D錯誤。]
3．(2020·太原實驗中學高二月考)判斷選擇培養基是否起到了選擇作用時，需要設置的對照是(　　)
A.未接種的選擇培養基
B.接種了的牛肉膏蛋白胨培養基
C.未接種的牛肉膏蛋白胨培養基
D.接種了的選擇培養基
B　[選擇培養基的作用是只允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類的微生物生長，若設置對照組，需要用接種了的牛肉膏蛋白胨培養基，若該培養基上微生物能生長且并非只有特定種類，則可證明選擇培養基起到選擇作用，B項符合題意。]
4．用稀釋涂布平板法測定某一土壤樣品中的細菌數，在對應稀釋倍數為106的培養基中，得到以下幾種統計結果，正確的是(　　)
A.涂布了1個平板，統計的菌落數是230
B.涂布了2個平板，統計的菌落數是215和260，取平均值238
C.涂布了3個平板，統計的菌落數分別是21、212和256，取平均值163
D.涂布了3個平板，統計的菌落數分別是212、240和250，取平均值234
D　[在設計實驗時，一定要涂布至少3個平板作為重復組，才能增強實驗的說服力與準確性，A、B錯誤。C項雖然涂布了3個平板，但是，其中1個平板的計數結果與其他的相差太遠，說明在操作過程中可能出現了錯誤，此時，不能簡單地用3個平板的計數值來求平均值，C錯誤。]
5．尿素是一種重要的氮肥，農作物不能將其直接吸收利用，而是通過土壤中的細菌將其分解為氨和CO2后才能被農作物利用。請回答下列問題：
(1)土壤中的某些細菌能分解尿素是因為該種細菌能合成________。
(2)為篩選尿素分解菌而制備的培養基中含有的營養物質除尿素外，還包括水、碳源、________等，該培養基能篩選出目的菌株的原因是________________________________。
(3)一般依據尿素分解菌菌落的________、隆起程度和顏色等特征來統計菌落數目。現將10 mL尿素分解菌懸液進行梯度稀釋，分別取0.1 mL稀釋倍數為106的樣液接種到3個培養基上，培養一段時間后，統計菌落數分別為39、42、45，則1 mL懸液中活細菌數量為________個。上述過程采用的接種方法是______________。
(4)為檢驗培養基及培養皿滅菌是否合格，可采取的措施是
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
______________________________________________________________。
[解析]　(1)分解尿素的細菌能合成脲酶，將尿素分解。(2)微生物的培養基中需含有水、無機鹽、碳源和氮源，尿素作為氮源。因為只有能合成脲酶的細菌才能利用尿素作為氮源生長，因此該培養基能篩選出分解尿素的細菌。(3)一個菌落為一個細菌繁殖的后代，不同的微生物的菌落特征不同，菌落的特征包括形狀、大小、隆起程度，據此來統計菌落的數目。微生物計數的方法采用稀釋涂布平板法接種，1 mL懸液中活細菌的數目為(39＋42＋45)÷3÷0.1×106＝4.2×108(個)。(4)可單獨設置一個滅菌后不接種樣液的含培養基的培養皿進行培養，觀察該培養基上是否出現菌落，從而判斷滅菌是否合格。
[答案]　(1)脲酶　(2)無機鹽　只有以尿素為唯一氮源的細菌才能在該培養基上生長 　(3)形狀、大小　4.2×108　稀釋涂布平板法 　(4)單獨設置一個滅菌后不接種樣液的培養皿(含培養基)進行培養第3節　發酵工程及其應用
課標內容要求 核心素養對接
1.闡明發酵工程利用現代工程技術及微生物的特定功能，工業化生產人類所需產品。2．舉例說明發酵工程在醫藥、食品及其他工農業生產上有重要的應用價值。 1．科學思維：基于發酵工程的基本環節和應用實例，闡明發酵工程的概念。2．科學探究：根據發酵產品和利用微生物的不同討論發酵工程中的發酵條件及控制方法。3．社會責任：認可發酵工程在生產上重要的應用價值。
一、發酵工程的概念和基本環節
1．發酵工程的概念
(1)概念：利用微生物的特定功能，通過現代工程技術，規模化生產對人類有用的產品的一項技術。
(2)范圍：一般包括菌種的選育，擴大培養，培養基的配制、滅菌、接種、發酵、產品的分離、提純等方面。
2．發酵工程的基本環節
(1)基本環節：
(2)選一選：下列關于發酵工程基本環節的描述正確的是②④⑤。
①用于發酵工程的菌種應該具備優良性狀，并且只能從自然界中篩選。
②在進行發酵前，需要對選育的菌種進行擴大培養。
③發酵工程所用的菌種大多是單一菌種，所以沒有必要進行嚴格的滅菌。
④發酵工程所用的培養基是液體培養基。
⑤在發酵過程中要隨時進行檢測，還需要對發酵條件進行嚴格的控制。
⑥發酵結束后即可得到發酵產品。
3．發酵裝置
二、發酵工程的應用
1．特點
(1)生產條件溫和。
(2)原料來源豐富且價格低廉。
(3)產物專一。
(4)廢棄物對環境的污染小和容易處理。
2．在食品工業上的應用
(1)生產傳統的發酵產品。
①優點：能明顯提高產品的產量和質量。
②實例：
a．大豆中的蛋白質肽和氨基酸醬油
b．啤酒的工業化生產流程：
(2)生產各種各樣的食品添加劑：酸度調節劑、增味劑、著色劑、增稠劑、防腐劑等。
(3)生產酶制劑：在食品工業中，經常用到一些酶制劑，如α 淀粉酶、β 淀粉酶、果膠酶、氨基肽酶和脂肪酶等。
3．在醫藥工業上的應用
(1)發酵工程可以生產抗生素、多種氨基酸、激素和免疫調節劑等。
(2)基因工程與發酵技術相結合生產所需要的產品。
4．在農牧業上的應用：主要表現在生產微生物肥料、微生物農藥、微生物飼料等方面。
5．在其他方面的應用
(1)對解決資源與環境污染問題具有重要意義。
(2)極端微生物的應用。
(3)發酵工程滲透到幾乎所有的工農業領域。
判斷對錯(正確的打“√”，錯誤的打“×”)
1．發酵工程利用的菌種都是從自然界中篩選出來的。 (×)
提示：發酵工程的菌種也可以通過誘變育種和基因工程育種獲得。
2．發酵工程的中心環節是選育菌種。 (×)
提示：發酵工程的中心環節是發酵罐內發酵的過程。
3．發酵工程中要對培養基進行滅菌，發酵設備不用滅菌。 (×)
提示：培養基和發酵設備都必須經過嚴格的滅菌。
4．利用微生物農藥防治農林蟲害屬于化學防治。 (×)
提示：利用微生物農藥防治農林蟲害屬于生物防治。
5．微生物飼料主要是利用發酵工程生產的微生物的菌體。 (√)
　發酵工程的基本環節
1．選育菌種
(1)常用菌種：主要是細菌、放線菌、酵母菌和霉菌等。
(2)選育方法：
①從自然界中篩選出優良菌種。
②利用誘變育種篩選出符合生產要求的優良菌種。
③利用基因工程、細胞工程的方法對菌種的遺傳特性進行定向改造，構建出能生產相應產品的菌種。
2．擴大培養：在進行接種前，要進行擴大培養。
(1)目的：增加菌種的數量，縮短生產周期。
(2)方法：將培養到生長速度最快時期的菌體分開，再進行培養。
3．配制培養基
(1)類型：發酵工程一般使用液體培養基。
(2)要求：
①根據不同的菌種，選擇不同的材料配制培養基。
②培養基應滿足微生物在碳源、氮源、生長因子、水、無機鹽等方面的營養要求，并為微生物提供適宜的pH，以利于產物的合成。
③應盡量降低生產成本，以得到更高的經濟效益。
4．滅菌和接種：在發酵前對培養基和發酵設備進行嚴格的滅菌處理，接種過程中要注意防止雜菌污染。
5．發酵罐內發酵條件的控制
(1)溫度：通過發酵罐上的溫度傳感器和控制裝置進行監測和調整。
(2)溶解氧：通過通氣量和攪拌速度加以調節。
(3)pH：通過加料裝置添加酸或堿進行調節，也可以在培養基中添加pH緩沖液。
6．分離、提純產物，獲得發酵產品
發酵產品 分離提純方法
微生物細胞 過濾、沉淀將菌體分離和干燥
代謝物 蒸餾、萃取、離子交換等方法
1．現代發酵工程和傳統發酵技術所用菌種的來源有什么差異？
提示：傳統發酵技術用的菌種一般是原材料中天然存在的多種菌種，而現代發酵工程用的菌種是通過微生物培養技術獲得的單一菌種。
2．與化工生產相比，為什么發酵工程的生產條件比較溫和？
提示：發酵是利用微生物的代謝將原料進行轉化，而微生物細胞代謝是在常溫常壓條件下進行的，因此發酵工程的生產條件比較溫和。
1．某高校采用如圖所示的發酵罐進行葡萄酒主發酵過程的研究，下列敘述錯誤的是(　　)
A．夏季生產果酒時，常需對罐體進行降溫處理
B．乙醇為揮發性物質，故發酵過程中空氣的進氣量不宜太大
C．正常發酵過程中罐內的壓力不會低于大氣壓
D．可以通過監測發酵過程中殘余糖的濃度來決定何時終止發酵
B　[果酒發酵的適宜溫度為18～30 ℃，因此夏季生產果酒時，常需對罐體進行降溫處理，A正確；乙醇是酵母菌無氧呼吸的產物，因此分解過程中不需要通入空氣，B錯誤；無氧呼吸產生了二氧化碳，但是沒有消耗氧氣，因此發酵罐中的氣壓不會低于大氣壓，C正確；葡萄酒發酵的原料是糖類，因此可以通過監測發酵過程中殘余糖的濃度來決定何時終止發酵，D正確。]
2．發酵工程在工業生產上得到廣泛應用，其生產流程如下圖所示。結合賴氨酸或谷氨酸的生產實際，回答相關問題。
(1)圖中①表示的育種方法是________________。
(2)人工控制微生物代謝的措施包括____________和_____________。
(3)在賴氨酸或谷氨酸發酵過程中，產物源源不斷地產生，這說明該生產采用了________的發酵方式。在生產過程中，常需增加通氧量，因此判斷賴氨酸或谷氨酸發酵菌種為________菌。
(4)當發酵生產的產品是代謝產物時，還要采用________等分離提純的方法進行提取。
[解析]　基因工程、細胞工程和誘變育種是發酵工程菌種的來源。控制微生物代謝的措施包括兩個方面：一方面是改變微生物的遺傳特性，另一方面是控制微生物的生長繁殖條件。在發酵生產中，產物源源不斷地產生，因此發酵過程是連續的。發酵生產的產品是代謝產物，分離提取產物的方法有萃取、蒸餾和離子交換等。
[答案]　(1)誘變育種　(2)改變微生物遺傳特性　控制生產過程中的各種條件　(3)連續培養　好氧　(4)萃取(或蒸餾或離子交換等)
　發酵罐使用的三點提醒
(1)發酵罐在使用前要進行滅菌，培養基和發酵設備一般用蒸汽滅菌，空氣采用過濾的方法除菌。
(2)對于需氧發酵，為了防止雜菌污染，應該從空氣入口通入無菌空氣。
(3)攪拌的作用：
①使空氣和發酵液充分混合，增加培養液中的溶解氧。
②使菌種與培養液充分接觸，提高原料利用率。
　發酵工程的應用
1．發酵工程的應用：發酵工程滲透到幾乎所有的工農業領域。
(1)在食品工業上的應用：生產傳統的發酵產品、食品添加劑和酶制劑。
(2)在醫藥工業上的應用：生產抗生素、多種氨基酸、激素和免疫調節劑等。
(3)在農牧業上的應用：生產微生物肥料、微生物農藥、微生物飼料等。
2．發酵工程與傳統發酵技術的比較
發酵工程 傳統發酵技術
不同點 菌種 通過微生物純培養技術篩選或其他技術生產的優良菌種，大多是單一菌種 原材料中天然存在的混合菌種
發酵方式 液體發酵為主 固體發酵或半固體發酵為主
對發酵條件的控制 嚴格無菌操作，防止雜菌污染。通過現代工程技術對發酵條件精確地控制，使發酵條件處于最佳狀態 不是無菌操作，容易受到雜菌污染。對發酵條件不能嚴格控制，易受外界條件影響
生產規模和產品 生產規模大，實現了工業化生產。原料來源豐富，成本低，產物多樣，產量高 通常是家庭式或作坊式的，產量低，生產往往受季節和原料限制，產品風味品種比較單一，質量不穩定
相同點 ①都是利用了微生物的作用②發酵工程是在傳統發酵技術的基礎上發展起來的
1．微生物肥料使作物增產的原理是什么？
提示：微生物在代謝過程中產生的有機酸、生物活性物質能增進土壤肥力、改良土壤結構，促進植物生長。
2．微生物農藥防治農林害蟲的原理是什么？
提示：微生物農藥是利用微生物或其代謝產物來防治病蟲害的。
1．下列有關發酵工程應用的敘述，正確的是(　　)
A．發酵完成后分離出的菌體均可作為動物飼料
B．發酵工程不能用于傳統發酵食品的生產
C．利用基因工程選育的菌種可用于酶制劑、疫苗、激素等的生產
D．將發酵液中的微生物分離出來就是微生物肥料，可大大增進土壤肥力
C　[有些微生物的菌體含有激素、抗生素等，不適合作為動物飼料，A錯誤；利用發酵工程能生產傳統發酵食品，B錯誤；微生物肥料是指微生物代謝產生的有機酸、生物活性物質等，D錯誤。]
2．發酵工程廣泛應用于多個行業，下列有關敘述錯誤的是(　　)
A．黑曲霉可作為釀制醬油、生產檸檬酸的菌種
B．啤酒釀制終止后，可得到啤酒、單細胞蛋白等產品
C．用纖維廢料發酵得到酒精，可減少環境污染、減緩能源短缺問題
D．用液體培養基可大規模生產新冠病毒減毒疫苗
D　[黑曲霉產生的蛋白酶可將大豆中的蛋白質分解為小分子的肽和氨基酸，進一步加工為醬油，檸檬酸可通過黑曲霉發酵獲得，A正確；啤酒釀制終止后，可通過過濾、沉淀等手段獲得酵母細胞(單細胞蛋白)，將濾液加工后得到啤酒，B正確；纖維廢料分解得到葡萄糖，其經過發酵得到酒精，既減少了環境污染，又減緩了能源短缺問題，C正確；新冠病毒減毒疫苗是新冠病毒經過減毒處理得到的，需用特定的動物細胞進行培養，病毒不能獨立地在液體培養基中生長繁殖，D錯誤。]
蘋果可用于制作蘋果酒、蘋果醋飲料和提取具有抗過敏、抗癌細胞增生、調節脂質代謝等多種生理功能的蘋果多酚。如圖所示為工業化制作蘋果酒和蘋果醋的裝置。
通過本案例培養學生的演繹推理的科學思維能力和實踐應用的社會責任感。
(1)甲罐中預留近1/3的空間，目的是什么？(科學思維)
(2)甲罐連接的雙U型管中一側注滿水的作用是什么？(科學思維)
(3)若圖中A代表無菌空氣，則乙罐排出的氣體中氧氣的含量有什么變化？(科學思維)
提示：(1)有利于酵母菌的早期繁殖。
(2)密閉裝置，利于自動化排氣；防止發酵液從排氣管溢出。
(3)氧氣含量降低。
[課堂小結]
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1.性狀優良的菌種可以從自然界中篩選出來，也可以通過誘變育種或基因工程育種獲得。2.發酵工程所用的菌種大多是單一菌種。3.發酵工程的中心環節是發酵罐內發酵。4.如果發酵產品是微生物菌體可采用過濾、沉淀等方法將菌體分離和干燥得到產品；如果發酵產品是微生物的代謝物可根據產物的性質采取適當的提取、分離和純化措施來獲得產品。5.發酵工程的產品主要包括微生物的代謝產物、酶及微生物的菌體。
1．發酵工程的正確操作過程是(　　)
①發酵　②培養基的配制　③滅菌　④產品的分離與提純　⑤菌種的選育　⑥擴大培養和接種
A．①③④⑤②⑥ B．⑤②③⑥①④
C．②⑤③①⑥④ D．⑥⑤②④③①
B　[發酵工程的基本環節中，第一個環節是菌種的選育，最后一個環節是產品的分離與提純，B項正確。]
2．關于發酵工程的菌種說法錯誤的是(　　)
A．發酵工程的菌種可以從自然界中篩選出來
B．發酵工程可以利用原材料中含有的菌種
C．發酵工程的菌種可以來自基因工程
D．發酵工程的菌種可以來自誘變育種
B　[傳統發酵技術利用的是原材料中含有的菌種，發酵工程利用的是經過篩選或培育的菌種。]
3．嚴格控制發酵條件是保證發酵正常進行的關鍵，直接關系到是否能得到質量高、產量多的理想產物，通常所指的發酵條件不包括(　　)
A．溫度控制　　 B．溶氧控制
C．pH控制 D．酶的控制
D　[通常所指的發酵條件包括溫度、pH、溶氧、通氣與轉速等。酶是自身調節物質，不屬于發酵條件。]
4．關于啤酒生產的流程說法錯誤的是(　　)
A．讓大麥種子發芽的目的是釋放淀粉酶
B．焙烤發芽的大麥種子時，淀粉酶喪失活性
C．糖化的目的是讓淀粉分解
D．蒸煮時終止了酶的作用，并對糖漿進行滅菌
B　[焙烤發芽的大麥種子時殺死大麥種子，但不能使淀粉酶喪失活性。]
5．如圖所示是發酵工程生產產品的流程圖，據圖回答下列問題：
(1)發酵工程中，選育優良性狀的菌種，至關重要。高產青霉素菌種是通過________育種獲得的，啤酒酵母菌是通過________改造的。
(2)圖中①表示________，這樣做的目的是______________。
(3)③表示___________，是整個過程的中心環節，在此階段需隨時取樣、檢測_______、________等，以了解發酵進程，還要及時添加___________，同時嚴格控制____________等發酵條件。
(4)④表示______，發酵結束后可采用______等方法獲得產品。
[解析]　(1)高產青霉素菌種是通過誘變育種獲得的，啤酒酵母菌是通過基因工程改造的。(2)圖中①表示擴大培養，目的是增加菌種的數量，縮短生產周期。(3)③是整個過程的中心環節——發酵罐內發酵，在此階段需隨時取樣、檢測微生物數量、產物濃度等，以了解發酵進程。隨著發酵進行，培養基中的營養物質減少，還要及時添加必需的營養組分，同時嚴格控制溫度、pH和溶解氧等發酵條件。(4)④是發酵工程產品微生物細胞(菌體)，發酵結束后可采用過濾、沉淀等方法將菌體分離和干燥。
[答案]　(1)誘變　基因工程　(2)擴大培養　增加菌種的數量，可以縮短生產周期　(3)發酵罐內發酵　微生物數量　產物濃度　必需的營養組分　溫度、pH和溶解氧　(4)微生物細胞(菌體)　過濾、沉淀　傳統發酵技術與其他模塊知識的交匯點
[素能建構]
交匯點1　酵母菌、醋酸菌和乳酸菌的細胞結構，聯系必修課程模塊1中原核細胞與真核細胞的主要區別
(1)相同點：都有細胞膜、細胞質和DNA分子。
(2)不同點：醋酸菌和乳酸菌屬于原核生物，其細胞無核膜、染色體以及線粒體等眾多的細胞器，只有核糖體一種細胞器，而酵母菌屬于真核生物。
交匯點2　發酵條件的控制，聯系必修課程模塊1中有氧呼吸和無氧呼吸的影響因素
(1)果酒的制作前期需要氧，有利于酵母菌進行有氧呼吸而大量繁殖，然后控制為無氧條件，進行酒精發酵。控制發酵溫度約為28 ℃。
(2)果醋的制作一直需要充足的氧氣，醋酸菌是需氧型細菌，控制發酵溫度為30～35 ℃。但泡菜的制作一直需要密封，因為乳酸菌是厭氧型細菌。
[對應練習]
1．下列有關傳統發酵技術的應用，敘述正確的是(　　)
A．制作果酒、果醋的菌種屬于真核生物，制作腐乳、泡菜的菌種屬于原核生物
B．制作果酒、果醋在無氧條件下進行，制作腐乳、泡菜需在有氧條件下進行
C．制作果酒、果醋、泡菜主要利用的是胞內酶，制作腐乳主要利用的是胞外酶
D．制作果酒、果醋的過程需保持菌種活性，制作腐乳、泡菜的過程不需要
C　[制作果酒利用的酵母菌屬于真核生物，制作果醋利用的醋酸菌屬于原核生物，制作腐乳利用的毛霉屬于真核生物，A項錯誤；制作果酒先在有氧條件下進行，后在無氧條件下進行，制作泡菜需在無氧條件下進行，制作果醋、腐乳需在有氧條件下進行，B項錯誤；制作果酒、果醋、泡菜主要利用的是胞內酶，制作腐乳主要利用的是胞外酶，C項正確；制作果酒、果醋、腐乳和泡菜的過程中均需保持菌種活性，D項錯誤。]
2．下圖表示果酒和果醋制作過程中的物質變化過程，下列敘述正確的是(　　)
A．過程①和②都只能發生在缺氧條件下
B．過程①和③都發生在酵母菌的線粒體中
C．過程③和④都需要氧氣的參與
D．過程①～④所需的最適溫度基本相同
C　[據圖分析可知，過程①表示細胞呼吸的第一階段，其在有氧或無氧的條件下都可以進行，且是在細胞質基質中進行的，而非線粒體中，A、B錯誤；過程③表示有氧呼吸的第二、三階段，過程④表示乙醇氧化為醋酸的階段，過程③和④都必須在有氧的條件下才可以進行，C正確；過程①②③是果酒制作階段的化學反應，其適宜溫度約為28 ℃，過程④是果醋制作階段的化學反應，其適宜溫度為30～35 ℃，D錯誤。]
3．蘋果醋是以蘋果汁為原料經發酵而成的。請回答下列問題：
(1)酵母菌的呼吸代謝途徑如圖所示。圖中過程①和②是蘋果醋生產的第一階段，在酵母菌細胞的______________中進行，其產物乙醇與____________試劑反應呈現灰綠色，這一反應可用于乙醇的檢驗；過程③在酵母菌細胞的________________中進行。與無氧條件相比，在有氧條件下，酵母菌的增殖速度____________。
(2)第二階段是在醋酸菌的作用下將第一階段產生的乙醇轉變為醋酸的過程，根據醋酸菌的呼吸作用類型，該過程需要在______________條件下才能完成。
(3)在生產過程中，第一階段和第二階段的發酵溫度不同，第一階段的溫度________(填“低于”或“高于”)第二階段的。
(4)醋酸菌屬于_______核生物，其細胞結構中_______(填“含有”或“不含有”)線粒體。
[解析]　(1)圖中過程①和②是酵母菌進行無氧呼吸產生乙醇的過程，無氧呼吸的場所是細胞質基質。乙醇可用酸性重鉻酸鉀試劑檢測，顏色由橙色變為灰綠色。過程③為有氧呼吸的第二和第三階段，場所為線粒體。在有氧條件下酵母菌進行有氧呼吸，產生更多的能量供酵母菌繁殖利用，故有氧條件下酵母菌的繁殖速度更快。(2)醋酸菌是好氧細菌，因此，在醋酸菌作用下，將乙醇轉變為醋酸的過程需要在有氧條件下才能完成。(3)在生產過程中，第一階段酵母菌產生乙醇的適宜溫度約為28 ℃，第二階段醋酸菌產生醋酸的適宜溫度為30～35 ℃，第一階段的溫度低于第二階段的。(4)醋酸菌屬于原核生物，原核細胞中的細胞器只有核糖體一種，不含有線粒體。
[答案]　(1)細胞質基質　酸性重鉻酸鉀　線粒體　快
(2)有氧　(3)低于　(4)原　不含有
　微生物培養技術與其他模塊知識的交匯點
[素能建構]
交匯點1　酶的分解作用，聯系必修課程模塊1中酶的特性
(1)酶具有專一性：一種酶只能催化一種或一類化學反應，如脲酶只能催化分解尿素。
(2)需要溫和條件：酶起催化作用需要適宜的溫度和pH，因此培養微生物需要控制溫度，調節培養基的pH。
交匯點2　培養基中葡萄糖的作用，聯系選擇性必修模塊1中血糖的來源和去路
(1)葡萄糖的氧化分解：葡萄糖通過氧化分解釋放能量，一部分以熱能形式散失，另一部分儲存在ATP中，為生命活動提供能量。
(2)三大類物質的相互轉化：糖類、脂質和蛋白質三大類物質之間可以相互轉化。
交匯點3　培養基中無機鹽的作用，聯系必修課程模塊1、選擇性必修模塊1有關細胞和內環境中無機鹽的作用
(1)無機鹽的作用：①無機鹽是某些化合物的組成成分；②調節生物體的生命活動；③維持滲透壓和酸堿平衡。
(2)調節pH的緩沖對：H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。
[對應練習]
1．某些土壤細菌可將尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列問題：
(1)有些細菌能分解尿素，有些細菌則不能，原因是前者能產生________。能分解尿素的細菌不能以尿素的分解產物CO2作為碳源，原因是___________________________________。
但可用葡萄糖作為碳源，進入細菌體內的葡萄糖的主要作用是________________(答出兩點即可)。
(2)為了篩選可分解尿素的細菌，在配制培養基時，應選擇________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作為氮源，不選擇其他兩組的原因是_________________________。
(3)用來篩選分解尿素細菌的培養基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________________(答出兩點即可)。
[解析]　(1)有些細菌能分解尿素是因為這些細菌能產生脲酶，將尿素分解成CO2和NH3。能分解尿素的細菌是異養生物，不能利用CO2作為碳源合成有機物，但這些細菌可用葡萄糖作為碳源，進入細菌體內的葡萄糖的主要作用：作為能源物質氧化分解為細胞生命活動提供能量，為其他有機物的合成提供原料。(2)為了篩選可分解尿素的細菌，在配制培養基時，應選擇尿素作為唯一氮源，這樣只有能分解尿素的細菌才能在培養基上生存。若選擇“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”作為氮源，能分解尿素的細菌和不能分解尿素的細菌都能利用NH4NO3，不能起到篩選作用。(3)用來篩選分解尿素細菌的培養基含有KH2PO4和Na2HPO4，它們可以為細菌生長提供無機營養；同時，KH2PO4和Na2HPO4還可以作為緩沖劑保持細胞生長過程中pH穩定。
[答案]　(1)脲酶　分解尿素的細菌是異養生物，不能利用CO2來合成有機物　為細胞生命活動提供能量，為其他有機物的合成提供原料　(2)尿素　其他兩組都含有NH4NO3，能分解尿素的細菌和不能分解尿素的細菌都能利用NH4NO3，不能起到篩選作用　(3)為細菌生長提供無機營養；作為緩沖劑保持細胞生長過程中pH穩定
2．(2021·廣東適應性測試)幾丁質廣泛存在于甲殼類動物的外殼、昆蟲的外骨骼和真菌的細胞壁中。某些微生物能合成幾丁質酶(胞外酶)，使幾丁質降解為N 乙酰氨基葡萄糖，然后進一步轉化利用。科研人員試圖從土壤中篩選出能高效降解幾丁質的菌株，通過微生物培養獲得幾丁質酶，用于生物防治。回答下列問題：
　　　
(1)在篩選過程中，應將土壤樣品稀釋液接種于以__________為唯一碳源的固體選擇性培養基上篩選目標菌株。
(2)培養所篩選出的目標菌株，計算各單菌落周圍的“水解圈直徑/菌落直徑”的比值，比值大小反映了__________________。
(3)科研人員篩選出了產幾丁質酶的菌株A。將菌株A發酵產生的幾丁質酶粗提液加入到盛有馬鈴薯培養基的培養皿中，涂布均勻后分別接種4種病原真菌，以_________代替幾丁質酶粗提液作為對照，結果見圖，幾丁質酶粗提液對________的抑菌效果最強(填入病原菌編號)。推測幾丁質酶的抑菌機理是______________________。
[解析]　(1)篩選過程中，將土壤樣品稀釋液接種以幾丁質為唯一碳源的選擇培養基上，在該培養基上只有可以利用幾丁質的真菌可以生存，其他不能利用幾丁質的微生物被淘汰而達到篩選的作用。(2)水解圈直徑/菌落直徑可以反映水解能力的大小，水解圈直徑/菌落直徑越大，說明該菌降解幾丁質能力越強，反之越弱。(3)對照組實驗應滿足單一變量原則，實驗組添加幾丁質酶，對照組加入不含幾丁質酶粗提液的等量的無菌水，對4組實驗進行觀察比較，d組水解圈直徑/菌落直徑最大，即抑制效果最強，幾丁質是真菌細胞壁的組成成分，幾丁質酶水解了幾丁質導致真菌細胞壁不能合成，抑制了真菌的繁殖。
[答案]　 (1)幾丁質　(2)微生物的降解能力　(3)等量的無菌水　 d　幾丁質是真菌細胞壁的組成成分，幾丁質酶水解了幾丁質導致真菌細胞壁不能合成，抑制了真菌的繁殖

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