資源簡介

中小學教育資源及組卷應用平臺
高考生物二輪復習專題突破
專題十　生物工程
[課標內容]　1.植物細胞工程包括組織培養和體細胞雜交等技術。2.動物細胞工程包括細胞培養、核移植、細胞融合和干細胞的應用等技術。3.對動物早期胚胎或配子進行顯微操作和處理以獲得目標個體。4.基因工程是一種DNA重組技術。5.蛋白質工程是基因工程的延伸。6.生物技術在造福人類社會的同時也可能會帶來安全與倫理問題。7.依據生態學原理保護環境是人類生存和可持續發展的必要條件。
梳理核心知識
提示　深思1：第三步將目的基因導入受體細胞沒有堿基互補配對現象。
深思2：脫分化和再分化。
1.初生代謝是生物生長和生存所必需的代謝活動，因此在整個生命過程中它一直進行著。初生代謝物有糖類、脂質、蛋白質和核酸等。次生代謝不是生物生長所必需的，一般在特定的組織或器官中，并在一定的環境和時間條件下才進行。
2.動物細胞培養過程中，常用幼齡的動物細胞，因為幼齡動物的細胞、分化程度低的細胞更易于培養。細胞的分化程度越低，其分裂能力就越強。
3.動物細胞培養時不能用胃蛋白酶分散細胞的原因：胃蛋白酶適于在較強的酸性條件下發揮作用，而較強的酸性條件會對貼壁細胞造成傷害。
4.滅活是指用物理或化學手段使病毒或細菌失去感染能力，但是并不破壞這些病原體的抗原結構。
5.在選擇性培養基上，未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長。
6.抗體—藥物偶聯物（ADC）通過將細胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結合，實現了對腫瘤細胞的選擇性殺傷。ADC的抗體具有特異性識別腫瘤細胞的作用，藥物有殺傷腫瘤細胞的作用。
7.艾弗里等人通過不同類型肺炎鏈球菌的轉化實驗，不僅證明了生物的遺傳物質是DNA，還證明了DNA可以在同種生物的不同個體之間轉移。
8.限制酶不能切割自身DNA的原因：原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾。
9.真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應緩沖溶液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。用于PCR的引物長度通常為20～30個核苷酸。
10.農桿菌細胞內含有Ti質粒，當它侵染植物細胞后，能將Ti質粒上的T－DNA（可轉移的DNA）轉移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色體DNA上。
1.判斷有關動植物細胞工程和胚胎工程說法的正誤
（1）在誘導離體菊花莖段形成幼苗的過程中，不會發生細胞的增殖和分化。（×）
（2）愈傷組織是外植體通過脫分化和再分化后形成的。（×）
（3）用纖維素酶和果膠酶水解法獲得的植物原生質體失去了全能性。（×）
（4）植物體細胞雜交所獲得的雜種植株的變異類型屬于染色體變異。（√）
（5）肝細胞培養過程中通常在培養液中通入5%的CO2刺激細胞呼吸。（×）
（6）雜交瘤細胞的特點是既能迅速大量繁殖，又能產生專一抗體。（√）
（7）卵裂期胚胎中細胞數目和有機物總量在不斷增加。（×）
（8）在胚胎發育過程中，細胞的分化出現在桑葚胚期。（×）
（9）胚胎分割移植時應選取發育良好、形態正常的囊胚或原腸胚。（×）
2.判斷有關基因工程和蛋白質工程說法的正誤
（1）DNA連接酶能將兩堿基通過氫鍵連接起來。（×）
（2）E·coli DNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端。（×）
（3）載體質粒通常采用抗生素合成基因作為篩選的標記基因。（×）
（4）用PCR技術擴增目的基因時不必知道基因的全部序列。（√）
（5）應用DNA探針技術，可以檢測轉基因抗凍番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表達。（×）
（6）蛋白質工程是在分子水平上對蛋白質分子直接進行操作，定向改變分子的結構。（×）
（7）基因工程只能產生自然界已存在的蛋白質。（√）
1.[2017·全國卷Ⅰ，38（5）]艾弗里等人的肺炎鏈球菌轉化實驗為證明DNA是遺傳物質做出了重要貢獻，也可以說是基因工程的先導，如果說他們的工作為基因工程理論的建立提供了啟示，那么，這一啟示是　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
提示　DNA可以從一種生物個體轉移到另一種生物個體
2.[2017·全國卷Ⅱ，38（2）]以mRNA為材料可以獲得cDNA，其原理是　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
提示　在逆轉錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補配對的原則可以合成cDNA
3.[2019·全國卷Ⅰ，38（3）]目前在PCR反應中使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
提示　Taq酶熱穩定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活
4.[2017·全國卷Ⅱ，38（3）]若要使目的基因在受體細胞中表達，需要通過質粒載體而不能直接將目的基因導入受體細胞，原因是　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（答出兩點即可）。
提示　目的基因無復制原點；目的基因無表達所需的啟動子
5.[2018·全國卷Ⅲ，38（1）]“中中”和“華華”的獲得涉及核移植過程，核移植是指　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
提示　將動物的一個細胞的細胞核，移入一個已去掉細胞核的卵母細胞中
6.在動物細胞核移植獲得克隆動物時用卵母細胞作受體細胞原因是　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
提示　卵母細胞大利于操作，細胞質中有使細胞核基因得以表達的物質和條件
7.胚胎移植時對同種哺乳動物供受體進行同期發情處理的原因是　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
提示　使供受體處于相同的生理狀態
1.（2020·山東等級考，14）經遺傳改造的小鼠胚胎干細胞注入囊胚，通過胚胎工程的相關技術可以獲得具有不同遺傳特性的實驗小鼠。下列說法錯誤的是（　　）
A.用促性腺激素處理雌鼠可以獲得更多的卵子
B.體外受精前要對小鼠的精子進行獲能處理
C.胚胎移植前要檢查胚胎質量并在囊胚或原腸胚階段移植
D.遺傳改造的小鼠胚胎干細胞可以通過轉基因等技術獲得
答案　C
解析　為獲得更多卵子，需要用促性腺激素對雌性個體進行超數排卵處理，A正確；剛排出的精子不能與卵子受精，必須進行獲能處理后才具備受精能力，B正確；胚胎移植前要檢查胚胎質量，牛、羊等一般要培養到桑葚胚或囊胚階段才進行移植，小鼠等可在更早的階段移植，C錯誤；可通過轉基因等技術獲得遺傳改造的小鼠胚胎干細胞，D正確。
2.（2021·全國乙卷，38）[生物——選修3：現代生物科技專題]
用DNA重組技術可以賦予生物以新的遺傳特性，創造出更符合人類需要的生物產品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性內切酶核酸的切割位點如圖所示。
回答下列問題：
（1）常用的DNA連接酶有E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。上圖中　　　　酶切割后的DNA片段可以用E·coli DNA連接酶連接。上圖中　　　　　　　　酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA連接酶連接。
（2）DNA連接酶催化目的基因片段與質粒載體片段之間形成的化學鍵是　　　　。
（3）DNA重組技術中所用的質粒載體具有一些特征。如質粒DNA分子上有復制原點，可以保證質粒在受體細胞中能　　　　；質粒DNA分子上有　　　　　　　　，便于外源DNA插入；質粒DNA分子上有標記基因（如某種抗生素抗性基因），利用抗生素可篩選出含質粒載體的宿主細胞，方法是　　　　　　　　　　　　。
（4）表達載體含有啟動子，啟動子是指___________________________________。
答案　（1）EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ　EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ　（2）磷酸二酯鍵　（3）自我復制　限制酶切割位點　用含有該抗生素的培養基培養宿主細胞，能夠存活的即為含有質粒載體的宿主細胞　（4）RNA聚合酶識別、結合和驅動轉錄的一段DNA序列
解析　（1）由題圖可以看出，EcoRⅠ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ切割后分別形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端，E·coliDNA連接酶可用于連接黏性末端，T4DNA連接酶可用于連接黏性末端和平末端。（2）DNA連接酶催化DNA鏈的5′端與另一DNA鏈的3′端生成磷酸二酯鍵。（3）復制原點是在基因組上復制起始的一段序列，可以保證質粒在宿主細胞中進行自我復制。質粒上有限制酶切割位點，該位點可被限制酶切開并使外源目的基因插入其中。若質粒DNA分子上有某種抗生素抗性基因，則可以用含有該抗生素的培養基培養宿主細胞，能夠存活的即為含有質粒載體的宿主細胞。（4）啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得所需要的蛋白質。
3.（2020·全國卷Ⅲ，38）[生物——選修3：現代生物科技專題]W是一種具有特定功能的人體蛋白質。某研究小組擬仿照制備乳腺生物反應器的研究思路，制備一種膀胱生物反應器來獲得W，基本過程如圖所示。
回答下列問題：
（1）步驟①中需要使用的工具酶有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。步驟②和③所代表的操作分別是　　　　和　　　　。步驟④稱為　　　　。
（2）與乳腺生物反應器相比，用膀胱生物反應器生產W的優勢在于不受轉基因動物的　　　　　　（答出2點即可）的限制。
（3）一般來說，在同一動物個體中，乳腺上皮細胞與膀胱上皮細胞的細胞核中染色體DNA所含的遺傳信息　　　　（填“相同”或“不同”），原因是______________________________________________________________________。
（4）從上述流程可知，制備生物反應器涉及胚胎工程，胚胎工程中所用到的主要技術有　　　　　（答出2點即可）。
答案　（1）限制性內切核酸酶、DNA連接酶　顯微注射　體外培養　胚胎移植　（2）性別、年齡　（3）相同　兩種上皮細胞都是體細胞，且來源于同一個受精卵
（4）體外受精、胚胎移植
解析　（1）步驟①是基因表達載體的構建過程，該過程需要使用的工具酶有限制性內切核酸酶（限制酶）和DNA連接酶，用限制酶分別切割載體和目的基因，用DNA連接酶將目的基因和載體連接起來。步驟②和③所代表的操作分別是顯微注射和體外培養。步驟④是將早期胚胎植入到代孕母體內，稱為胚胎移植。
（2）與乳腺生物反應器相比，用膀胱生物反應器生產W的優勢在于不受轉基因動物的性別和年齡的限制。（3）乳腺上皮細胞和膀胱上皮細胞都是體細胞。一般來說，在同一動物個體中，其體細胞都是由同一個受精卵分裂、分化而來的，細胞在分裂、分化過程中，其細胞核中染色體DNA所含的遺傳信息一般是不變的，因此兩種上皮細胞的染色體DNA所含的遺傳信息相同。（4）據題述流程可知，胚胎工程中所用到的主要技術有體外受精、早期胚胎培養、胚胎移植等。
微專題1　動植物細胞工程與胚胎工程
1.植物組織培養的過程　原理：植物細胞的全能性
提醒：①植物組織培養中添加蔗糖的目的是提供營養和調節滲透壓。
②脫分化階段不需光，再分化階段需光。
③生長素/細胞分裂素的比值高時，促進根的分化、抑制芽的形成；比值低時，促進芽的分化、抑制根的形成。
④體內細胞未表現全能性的原因：基因的表達具有選擇性。
2.植物體細胞雜交技術
原理：植物細胞的全能性、細胞膜的流動性
3.動物細胞培養　原理：細胞增殖
提醒：①動物細胞培養中兩次使用胰蛋白酶的作用不同：
第一次：處理剪碎的組織，使其分散成單個細胞。
第二次：使貼壁生長的細胞從瓶壁上脫落下來。
②避免雜菌污染的措施：培養液及培養用具滅菌處理，加入一定量的抗生素，定期更換培養液。
③區分原代培養和傳代培養的關鍵是是否分瓶培養。
4.動物體細胞克隆技術（核移植技術）
原理：動物細胞核的全能性
提醒：核移植獲得的克隆動物與提供細胞核的親本性狀可能不同的三個原因：
①克隆動物遺傳物質來自兩個親本。
②發育過程中可能發生基因突變或染色體變異。
③外界環境可能引起不可遺傳的變異。
5.單克隆抗體的制備　原理：細胞膜的流動性、細胞的增殖
6.胚胎移植的操作流程及生理基礎
（1）操作流程
提醒：①精子獲能的方法有培養法和化學誘導法。
②卵母細胞須培養到MⅡ中期才能參與受精。
③細胞分化開始于囊胚，桑葚胚的形成沒有經過細胞分化。
④囊胚的內細胞團具有全能性，將來發育成胎兒的各種組織。
（2）生理基礎
7.胚胎分割　無性繁殖或克隆
1.(2021·河南南陽市一中調研)隨著對植物組織培養技術的深入研究，其操作流程不斷改進和完善，該技術在我們的生產和生活中的應用越來越普遍。如圖是將胡蘿卜的某組織通過植物組織培養技術培養成植株的簡化流程。請回答下列有關問題：
(1)在切取胡蘿卜塊時，往往強調要切取含有容易誘導形成愈傷組織的________________部分。圖中①②過程分別是________________、________________，兩過程所用的培養基存在不同之處，主要是____________________________。
(2)從細胞水平看，圖中③過程主要是通過________________________________兩個步驟來完成的。圖中全過程表明，分化的植物細胞內仍具有________________________________。
(3)植物組織培養技術的應用越來越廣泛，例如利用該技術培育無病毒草莓苗，一般選取莖尖或根尖作為外植體，其原因是__________________________________
______________________________________________________________________。
請列舉該技術的其他應用：______________________________________________
_________________________________________________________(列舉兩類)。
答案　(1)形成層　脫分化　再分化　培養基中植物激素比例不同　(2)細胞分裂和細胞分化　形成完整植株所需要的全部基因　(3)植物分生區附近(如莖尖、根尖)的病毒極少，甚至無病毒　快速繁殖植物(微型繁殖)、制造人工種子、單倍體育種、體細胞誘變育種、細胞產物的工廠化生產等(任選兩個，合理即可)
解析　(1)在切取胡蘿卜組織塊時強調要含有形成層部分，因為該部分容易誘導形成愈傷組織。圖中①為脫分化，②為再分化，③表示胚狀體生長發育為植株的過程；①②過程所用的培養基中都應含有營養物質和植物激素，①過程是脫分化，其培養基中生長素含量高于細胞分裂素，②過程為再分化，其培養基中生長素含量低于細胞分裂素，所以兩過程所用的培養基主要不同之處是培養基中植物激素比例不同。(2)圖中③表示胚狀體生長發育為植株的過程，生物的生長發育是通過細胞分裂和細胞分化兩個步驟完成的。圖中全過程反映的是將離體的植物器官、組織、細胞，培養在人工配制的培養基上，給予適宜的培養條件，誘導其產生愈傷組織、叢芽，最終形成了完整的植株，該過程說明分化的植物細胞內仍具有形成完整植株所需要的全部基因。(3)科學家們發現植物分生區附近(如莖尖、根尖)的病毒極少，甚至無病毒，因此，切取一定大小的莖尖或根尖進行組織培養，再生的植株就有可能不帶病毒，從而獲得脫毒苗。現在植物組織培養技術得到了廣泛應用，如快速繁殖植物(微型繁殖)、制造人工種子、單倍體育種、體細胞誘變育種以及細胞產物的工廠化生產等。
2.(2021·合肥市調研)新冠病毒，即2019 nCoV，是一種RNA病毒，其結構模式圖如下。其中S蛋白是2019 nCoV表面主要抗原，利用S蛋白可以制作相應的抗體，據此回答下列問題：
(1)采用基因工程的方法，可以獲取大量S蛋白。獲取方法是提取2019 nCoV的RNA，通過____________過程獲取相應的cDNA。
(2)通過基因工程技術獲取S蛋白，最關鍵的一步是__________________________
_____________________________________________________________________。
(3)將S蛋白注入小鼠等動物體內，通過單克隆抗體技術，即可獲得抗S蛋白的單克隆抗體。與新冠肺炎康復者捐獻的血漿中的抗體相比，抗S蛋白的單克隆抗體的優點是___________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)在對新冠肺炎疑似患者的檢測中，利用核酸檢測法，有時會出現假陰性現象，在分子水平上還可以利用________________________技術進行檢測。
答案　(1)逆轉錄(反轉錄)　(2)基因表達載體的構建　(3)能準確識別抗原的細微差異，與特定抗原發生特異性結合，并且可大量別備　(4)抗原和抗體雜交
解析　(1)以病毒的RNA為模板，通過逆轉錄過程可獲取相應的cDNA。(2)基因工程中最關鍵的步驟是基因表達載體的構建。(3)通過單克隆抗體技術獲得的抗S蛋白的單克隆抗體具有特異性強、靈敏度高、并可能大量制備等優點。(4)在分子水平上檢測新冠肺炎疑似患者除了可以利用核酸檢測法外，還可以利用抗體能夠和抗原特異性結合的特點，即抗原和抗體雜交技術進行檢測。
3.(2021·河南百校聯盟)據圖回答下列問題。
(1)圖中雌鼠進行激素注射的目的是_____________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)胚胎的收集可以通過人工方法從雌鼠輸卵管內獲得，該過程稱為________________。將胚胎在相關培養液中進行早期培養，目的是____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
培養液中除含有有機鹽、無機鹽、血清外，還需加入的四種主要物質是____________________。
(3)圖中目的基因表達載體通過________________法進入胚胎細胞，胚胎發育的早期稱為卵裂期，其特點是_______________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)圖中將結扎雄鼠與雌鼠交配，可獲得假孕鼠，其目的是
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________。
圖中①是指____________。
答案　(1)促使雌鼠超數排卵　(2)沖卵　便于檢查受精狀況和受精卵的發育能力　維生素、激素、氨基酸、核苷酸　(3)顯微注射　細胞分裂方式為有絲分裂，細胞的數量不斷增加，但胚胎的總體積并不增加，或略有縮小　(4)使假孕鼠生殖器官的生理變化與供體相同，從而為供體胚胎移入假孕鼠提供相同的生理環境(合理即可)　胚胎移植
解析　(1)圖中雌鼠注射的激素是促性腺激素，目的是促使雌鼠超數排卵。(2)胚胎的收集可以通過人工方法從雌鼠輸卵管內獲得，該過程稱為沖卵。沖出的胚胎移入發育培養液中繼續培養，以檢查受精狀況和受精卵的發育能力。胚胎的培養液成分除一些無機鹽和有機鹽類外，還需添加維生素、激素、氨基酸、核苷酸等營養成分，以及血清等物質。(3)圖中目的基因表達載體通過顯微注射法進入胚胎細胞，胚胎發育的早期稱為卵裂期，其特點是細胞分裂方式為有絲分裂，細胞的數量不斷增加，但胚胎的總體積并不增加，或略有縮小。(4)圖中將結扎雄鼠與雌鼠交配，可獲得假孕鼠，其目的是使假孕鼠生殖器官的生理變化與供體相同，從而為供體胚胎移入假孕鼠提供相同的生理環境。圖中①是指胚胎移植。
4.(2021·河南開封模擬)科學家通過導入外源分子使動物的某特定基因失活。進而培養出有基因缺陷的動物來研究相應基因的功能。如圖是流程示意圖。請據圖回答相關問題。
(1)①過程通常用到____________(儀器)，②過程所采取避免雜菌污染措施，除培養液及培養用具滅菌處理外，一般需加入____________，還要定期更換培養液。定期更換培養液的理由是_______________________________________________。
(2)圖示體外受精過程，一般需要在________中完成。
(3)為更多地獲得基因剔除小鼠，可對囊胚階段的胚胎進行分割移植，在分割時要注意________________。請說明理由______________________________________。
(4)胚胎移植能否成功，主要與供體和受體的________________有關。
(5)經研究得知，某基因與乳腺癌細胞的增殖密切相關。請簡述基因剔除技術在乳腺癌治療方面的基本思路：_______________________________________________
_____________________________________________________________________。
答案　(1)顯微注射儀　一定量的抗生素　清除代謝產物，防止細胞代謝產物積累對細胞自身造成危害　(2)專用的受精溶液(或獲能溶液)　(3)對內細胞團進行均等分割　若不均等分割，會影響分割后胚胎的恢復和進一步發育　(4)生理狀況
　(5)通過基因剔除技術使該基因失活，從而阻止乳腺細胞的癌變
解析　(1)圖中①過程將體外轉錄后mRNA導入受精卵常用顯微注射技術。②是早期胚胎培養過程，除培養液及培養用具滅菌處理外，一般需加入一定量的抗生素(防止染菌)，還要定期更換培養液。定期更換培養液的目的是清除代謝產物，防止細胞代謝產物積累對細胞自身造成危害。(2)體外受精過程，一般需要在獲能溶液或專用的受精溶液中完成。(3)對囊胚階段的胚胎進行分割時，要對內細胞團進行均等分割，因為內細胞團將來發育成胎兒的組織器官，若不均等分割，會影響分割后胚胎的恢復和進一步發育。(4)胚胎移植能否成功，主要與供體和受體的生理狀況有關，應將早期胚胎移植到同期發情的代孕母體內。(5)某基因與乳腺癌細胞的增殖密切相關，則可通過基因剔除技術使該基因失活，從而阻止乳腺細胞癌變。
微專題2　基因工程
1.基因工程的3種基本工具
2.基因工程的操作流程
(1)目的基因的獲取
提醒：①從cDNA文庫獲取的目的基因不含啟動子和終止子。
②PCR過程中需要耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶)。
(2)基因表達載體的構建——重組質粒的構建
提醒：①基因工程中的載體與細胞膜上的載體不同。
②啟動子、終止子
a.啟動子(DNA片段)≠起始密碼子(位于mRNA上)。
b.終止子(DNA片段)≠終止密碼子(位于mRNA上)。
③目的基因插入位置：啟動子與終止子之間。
④利用乳腺生物反應器生產藥物時，應將目的基因與乳腺蛋白基因的啟動子連接到一起。
(3)將目的基因導入受體細胞
提醒：農桿菌轉化法中的“兩個兩次”
(4)目的基因的檢測與鑒定
3.蛋白質工程
1.(2021·中原名校聯盟)糖尿病是一種常見病，且發病率有逐年增加的趨勢，以致西方發達國家把它列為第三號“殺手”。治療該病的胰島素過去主要從動物(如豬、牛)中獲得。自20世紀70年代遺傳工程(又稱基因工程)發展起來以后，人們開始采用這種高新技術生產胰島素，其操作的基本過程如下圖所示：
(1)圖中基因工程的基本過程可概括為“四步曲”，即______________________________________________________________________
______________________________________________________________________。
(2)圖中的質粒存在于細菌細胞內，在基因工程中通常被用作________，從其分子結構可確定它是一種________。
(3)根據堿基互補配對的規律，在DNA連接酶的作用下，把圖中甲與乙拼接起來(即重組)，若a段與d段的堿基序列分別是AATTC和CTTAA，則b段與c段分別是______________________________________________________________________
______________________________________________________________________。
(4)細菌進行分裂后，其中被拼接起來的質粒也由一個變成兩個，兩個變成四個……質粒的這種增加方式在遺傳學上稱為________。目的基因通過活動(即表達)后，能使細菌產生治療糖尿病的激素。這是因為基因具有控制________合成的功能，它的過程包括____________________。
答案　(1)目的基因的獲取；基因表達載體的構建；將目的基因導入受體細胞；目的基因的檢測與鑒定
(2)載體　環狀DNA　(3)TTAAG、GAATT　(4)DNA分子的擴增(復制)　蛋白質　轉錄和翻譯
2.(2021·襄陽五中調研)農作物的增產常常需要使用除草劑，但強力除草劑往往對農作物有毒害作用。近年來，科學家利用基因工程技術獲得了多種轉基因農作物新品種，包括抗除草劑的轉基因煙草，下圖表示其技術路線，其中含有內含子的報告基因只能在真核生物中正確表達，其產物能使無色物質K呈現藍色。回答下列問題：
(1)基因工程是在________水平對生物的遺傳性狀加以改造的，相較于傳統的育種方式，它的優點是____________________________________________。圖示技術路線中，為了成功構建載體，需使用限制酶分別對___________________________進行酶切。
(2)為了提高基因工程的成功率，需要利用標記基因對轉化后的農桿菌進行篩選，圖中屬于標記基因的是____________________________。若篩選1的目的是淘汰未導入目的基因的農桿菌，應在培養基中添加____________________。
(3)若農桿菌未成功轉化愈傷組織，僅殘留在愈傷組織表面，會導致未轉化的愈傷組織也能在含除草劑的培養基中生長，為避免這種情況發生，篩選2應進行的具體操作是_____________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)利用獲得的轉基因煙草進行擴大生產，常采用微型繁殖的方法，該方法利用的原理是____________________。
答案　(1)分子　能夠定向改造生物性狀，克服遠緣雜交不親和的障礙　含除草劑抗性基因G的DNA片段和Ti質粒上的T DNA
(2)氨芐青霉素抗性基因和報告基因　氨芐青霉素
(3)在培養基中加入除草劑和物質K，從存活的愈傷組織中挑選呈藍色的愈傷組織進行植物組織培養(答案合理即可)
(4)植物細胞的全能性
解析　(1)基因工程是在分子水平上對生物的遺傳性狀加以改造的，相較于傳統的育種方式，它的優點是能夠定向改造生物性狀，克服遠緣雜交不親和的障礙，為了成功構建表達載體，需使用限制酶分別對含除草劑抗性基因G的DNA片段和Ti質粒上的T DNA進行酶切。(2)題圖中屬于標記基因的是氨芐青霉素抗性基因和報告基因，可以用來進行篩選。未導入目的基因的農桿菌不含氨芐青霉素抗性基因，不能在含氨芐青霉素的培養基中生長。(3)進行篩選2操作時，首先需要加入除草劑進行篩選，但這種情況不能避免農桿菌未成功轉化愈傷組織，僅殘留在愈傷組織表面造成干擾，因而還需要利用報告基因。報告基因只能在真核細胞中表達，在培養基中加入物質K，農桿菌成功轉化的愈傷組織會呈現藍色。故篩選2應進行的具體操作為在培養基中加入除草劑和物質K，從存活的愈傷組織中挑選呈藍色的愈傷組織進行植物組織培養。(4)微型繁殖利用的是植物組織培養技術，其原理是植物細胞的全能性。
3.(2021·陜西省部分學校摸底調研)穿梭載體是一類具有兩種不同復制原點、能在兩種不同的生物體(物種不同)中復制的載體，一般在原核生物和真核生物中都能復制和表達，如Ti質粒和哺乳動物表達質粒pMT2。回答下列問題。
(1)構建基因表達載體前，需先獲取目的基因。PCR技術可用于目的基因的擴增，其原理是_____________________________________________________________。
用PCR技術從基因文庫中獲取并擴增目的基因時，需要加入人工合成的________作為引物；PCR反應體系中需加入的原料是_______________________________。
(2)若要構建一個穿梭質粒，使其能夠在大腸桿菌中大量復制，且能在哺乳動物細胞中表達，質粒上除含啟動子、終止子、多個限制酶酶切位點和標記基因外，還需要有________________________________的復制原點。
(3)如圖為某種哺乳動物穿梭質粒示意圖，現欲使用該質粒表達人生長激素，但人生長激素基因所在的DNA片段上不含圖中限制酶識別序列。為使PCR擴增的人生長激素基因定向插入該質粒，擴增的人生長激素基因兩端設計的序列應含有________(填圖中的限制酶名稱)的切割位點。
(4)將該穿梭質粒、目的基因混合后形成的重組質粒與感受態的大腸桿菌細胞混合，完成轉化過程，再從培養的大腸桿菌細胞中提取質粒，可獲得大量該質粒。在含卡那霉素的培養基中能夠生長的大腸桿菌細胞中________(填“一定”或“不一定”)含有目的基因，原因是______________________________________________
_____________________________________________________________________。
答案　(1)DNA半保留復制　一小段單鏈DNA　4種脫氧核苷酸　(2)大腸桿菌和哺乳動物細胞　(3)Nde Ⅰ和BamH Ⅰ　(4)不一定　若大腸桿菌細胞中導入的是未攜帶目的基因的(穿梭)質粒，大腸桿菌細胞也能在含卡那霉素的培養基中生長(合理即可)
解析　(1)PCR是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術，其原理是DNA半保留復制。在PCR反應體系中，需加入一小段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據這一序列合成引物；需加入四種脫氧核苷酸作為合成DNA的原料。(2)基因表達載體的組成成分包括目的基因、啟動子、終止子、復制原點和標記基因等。穿梭載體具有兩種不同復制原點，要構建一個能夠在大腸桿菌中大量復制，且能在哺乳動物細胞中表達的穿梭質粒，需要加入大腸桿菌和哺乳動物細胞的復制原點。(3)如果在哺乳動物的穿梭質粒中插入人生長激素基因，基因表達載體中目的基因的上游為啟動子，下游為終止子。題圖中啟動子和終止子之間有限制酶Nde Ⅰ、Xba Ⅰ、BamH Ⅰ的識別序列，但是，終止子下游，還有一段限制酶Xba Ⅰ的識別序列，所以，為使PCR擴增的人生長激素基因定向插入該質粒，擴增的人生長激素基因兩端設計的序列應含有Nde Ⅰ和BamH Ⅰ的切割位點。(4)導入大腸桿菌細胞的有可能是沒有攜帶目的基因的穿梭質粒，該穿梭質粒上含有卡那霉素抗性基因，導入未攜帶目的基因的穿梭質粒的大腸桿菌也可在含有卡那霉素的培養基中生長，所以在含卡那霉素的培養基中能夠生長的大腸桿菌細胞中不一定含有目的基因。
微專題3　PCR技術及應用
1.PCR技術原理與條件
2.PCR技術的過程
1.(2021·全國甲卷，38)[生物——選修3：現代生物科技專題]PCR技術可用于臨床的病原菌檢測。為檢測病人是否感染了某種病原菌，醫生進行了相關操作：①分析PCR擴增結果；②從病人組織樣本中提取DNA；③利用PCR擴增DNA片段；④采集病人組織樣本。回答下列問題：
(1)若要得到正確的檢測結果，正確的操作順序應該是________(用數字序號表示)。
(2)操作③中使用的酶是________。PCR反應中的每次循環可分為變性、復性、________三步，其中復性的結果是________________________________________。
(3)為了做出正確的診斷，PCR反應所用的引物應該能與________特異性結合。
(4)PCR(多聚酶鏈式反應)技術是指________________________________。該技術目前被廣泛地應用于疾病診斷等方面。
答案　(1)④②③①　(2)熱穩定DNA聚合酶(Taq酶)　延伸　兩種引物通過堿基互補配對分別與兩條單鏈DNA模板結合　(3)病原菌DNA　(4)一種在生物體外快速擴增特定DNA片段的技術
解析　(1)為了檢測病人是否感染了某種病原菌，首先應采集病人組織樣本，然后從病人組織樣本中提取DNA，利用PCR擴增DNA片段后，再分析PCR擴增結果，所以正確的操作順序是④②③①。(2)PCR技術中用到的DNA聚合酶是Taq酶，又稱熱穩定DNA聚合酶，PCR反應中的每次循環可分為變性、復性和延伸三步。復性是溫度下降到50 ℃左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。(3)PCR反應所用引物要根據需要擴增的目標DNA的堿基序列來設計，要檢測是否感染病原菌，應根據該病原菌的DNA堿基序列合成引物，這樣PCR反應所用的引物會與某種病原菌的DNA特異性結合。(4)PCR技術是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術，通過這一技術，可以在短時間內大量擴增目的基因。
2.(2021·1月八省聯考湖北卷，24)某實驗室需構建含增強型綠色熒光蛋白(eGFP)基因的表達載體用于科學研究。相關資料如下：
Ⅰ.雙鏈DNA的每一條鏈有兩個末端，分別是5′端和3′端，從左到右的5′—3′DNA鏈是編碼鏈，從左到右的3′—5′DNA鏈是模板鏈。
Ⅱ.增強型綠色熒光蛋白(eGFP)在自然光下顯示綠色，已知該基因的DNA編碼序列如下：5′ATGGTGAGC……AAGTAA3′。
Ⅲ.質粒載體中含有EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、XbaⅠ和NotⅠ等酶的酶切位點(這些酶各自的識別序列不同)，如下圖所示。
回答下列問題：
(1)增強型綠色熒光蛋白基因轉錄的mRNA堿基序列為
______________________________________________________________________。
(2)通過PCR方法獲得eGFP目的片段，首先需要設計________(填“一對”或“一個”)引物，在體外選擇性擴增eGFP目的片段，PCR反應一般由95 ℃熱變性、55～60 ℃引物和模板配對、72 ℃延伸三個步驟，經過多次循環完成。延伸階段選用72 ℃是綜合考慮了兩個因素，這兩個因素是____________________________和________________________________。
(3)eGFP的PCR產物兩端分別含有BamHⅠ和NotⅠ的酶切位點，構建重組表達載體時，用這兩種酶酶切PCR產物和質粒載體。與單一酶酶切相比，該實驗采用的雙酶切方法的優點是_________________________________________________
_________________________________________________________(答一點即可)。
(4)將所構建的表達載體轉入大腸桿菌，涂布含有卡那霉素的平板，若表達載體構建成功，可觀察到多個________單菌落。
答案　(1)5′AUGGUGAGC……AAGUAA3′
(2)一對　防止新合成的DNA變性　保證Taq酶所需溫度條件
(3)防止目的基因自身環化
(4)發出綠色熒光
解析　(1)基因轉錄時，以DNA的模板鏈為模板，按照堿基互補配對原則合成一條mRNA鏈。由題可知，基因的編碼鏈與模板鏈配對，又根據mRNA鏈與模板鏈配對，可得到增強型綠色熒光蛋白基因轉錄的mRNA堿基序列為5′AUGGUGAGC……AAGUAA3′。(2)由于DNA復制的模板鏈為兩條且DNA聚合酶只能沿5′→3′合成子鏈，因此利用PCR獲得目的基因時，應依據目的基因兩端序列設計一對引物。(3)只用一種限制酶切割目的基因和質粒時，由于切出的黏性末端相同，可能會導致目的基因發生自身環化，而雙酶切可防止目的基因自身環化。(4)卡那霉素抗性基因為標記基因，用于重組DNA的篩選與鑒定，若表達載體構建成功，則卡那霉素抗性基因會表達，使大腸桿菌具有抗卡那霉素的特性，且目的基因在大腸桿菌中表達，因此可觀察到多個發出綠色熒光的單菌落。
3.(2021·南京市學情調研)X基因存在于水稻基因組中，其可在體細胞(2n)和精子中正常表達，但在卵細胞中不轉錄。為研究X基因表達對卵細胞的影響，設計了如圖1所示實驗。回答下列問題：
(1)科研工作者從水稻體細胞或精子中提取RNA，構建________文庫，進而獲得X基因編碼蛋白的序列。
(2)為使X基因能在卵細胞中成功表達，需在基因表達載體中插入______________________________________________________________________。
將重組質粒導入水稻愈傷組織細胞，最常用的方法是________________________。
(3)為篩選出含有重組質粒的菌落，需采用含有不同抗生素的平板進行篩選。符合要求的菌落在只含潮霉素、只含卡那霉素、含潮霉素和卡那霉素三種培養基中的生長情況分別為____________(填“生長”或“不生長”)。
(4)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質粒，擬設計引物進行PCR鑒定。PCR反應體系中除含緩沖液、模板DNA、dNTP(包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、引物以外，還應含有____________________________；圖2所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質粒片段中的相應位置，PCR鑒定時應選擇的一對引物是________。某學生從某一菌落的質粒中擴增出了400 bp片段，則該菌落中含有的質粒________(填“是”或“不是”)正確插入目的基因的重組質粒。
(5)從轉基因植株未成熟種子中分離出胚，觀察到細胞內僅含一個染色體組，判定該胚是由未受精的卵細胞發育形成的，而非轉基因水稻卵細胞在未受精時不能發育，由此表明________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
答案　(1)cDNA　(2)可在水稻卵細胞中啟動X基因轉錄的啟動子(和終止子)　農桿菌轉化法　(3)不生長、生長、不生長　(4)Taq酶(或耐高溫的DNA聚合酶)　甲、乙　不是　(5)X基因在卵細胞中成功表達能使卵細胞不經受精直接發育成胚
解析　(1)從水稻體細胞或精子中提取DNA，構建cDNA文庫，進而獲得X基因編碼蛋白的序列。(2)要使X基因能在卵細胞中成功表達，需要在基因表達載體中插入可在水稻卵細胞中啟動X基因轉錄的啟動子(和終止子)，以啟動X基因在卵細胞中的轉錄。將重組質粒導入植物細胞通常使用農桿菌轉化法。(3)在構建重組質粒時，X基因插入了潮霉素抗性基因中，潮霉素抗性基因被破壞，其不能正常表達。因此，符合要求的菌落在只含潮霉素的培養基中不能生長，在只含卡那霉素的培養基中能夠生長，在含潮霉素和卡那霉素的培養基中也不能生長。(4)PCR反應體系中除了含緩沖液、模板DNA、dNTP、引物外，還應含有Taq酶(即耐高溫的DNA聚合酶)。據圖分析，根據目的基因插入的位置和PCR技術的原理分析，PCR鑒定時應選擇的一對引物是甲和乙。某同學從某一菌落的質粒中擴增出了400 bp片段，則該菌落中含有的質粒不是正確插入目的基因的重組質粒。(5)轉基因水稻的卵細胞可以不經受精直接發育成胚，而非轉基因水稻的卵細胞在未受精時不能發育成胚，說明X基因在卵細胞中成功表達能使卵細胞不經受精直接發育成胚。
專題強化練
(時間：40分鐘　滿分：100分)
一、微專題強化練
微專題1　細胞工程和胚胎工程
1.(2021·廣東湛江期末)科學家利用白菜和紫甘藍通過植物體細胞雜交技術得到了白菜—甘藍新品種，下列敘述錯誤的是(　　)
A.該過程的原理是細胞的全能性和細胞膜的流動性
B.該技術以植物組織培養技術為基礎，培養過程需添加一定的植物激素
C.融合的原生質體再生出細胞壁與線粒體、高爾基體、細胞核等細胞器有關
D.獲得的白菜—甘藍是同時具有白菜和紫甘藍兩種植物的遺傳物質的新品種
答案　C
解析　植物體細胞雜交過程的原理是細胞的全能性和細胞膜的流動性，其中原生質體融合體現細胞膜的流動性，而雜種細胞培養成植株體現細胞的全能性，A正確；植物體細胞雜交過程以植物組織培養技術為基礎，培養過程需添加一定的植物激素，如生長素和細胞分裂素等，B正確；融合的原生質體再生出細胞壁與線粒體、高爾基體等細胞器有關，而細胞核不屬于細胞器，C錯誤；植株由白菜和紫甘藍兩種細胞融合后的雜種細胞發育形成，所以含有兩種植物的遺傳物質，使得雜種植株可以同時表現白菜和紫甘藍兩種植物的遺傳特性，D正確。
2.(2021·河北衡水金卷)如圖為動物細胞培養的基本過程，以下敘述錯誤的是(　　)
A.a中放置的一般是幼齡動物的器官或組織，原因是其細胞分裂能力強
B.將組織用胰蛋白酶或胃蛋白酶處理，制成b瓶中的細胞懸液
C.c、d瓶中的培養液為無菌、無毒的環境
D.培養過程中還需要提供O2和CO2等氣體環境，CO2的主要作用是維持培養液的pH
答案　B
解析　a中放置的一般是幼齡動物的器官或組織，原因是其細胞分裂能力強，A正確；將組織用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理，制成b瓶中的細胞懸液，不能用胃蛋白酶處理，B錯誤；c、d瓶中的培養液為無菌、無毒的環境，C正確；培養過程中還需要提供O2和CO2等氣體環境，CO2的主要作用是維持培養液的pH，D正確。
3.(2021·長春市聯考)利用正常大鼠制備遺傳性高血壓轉基因模型大鼠的流程如圖所示：
(1)將重組質粒導入受精卵的常用方法是____________，重組質粒的本質是______________________________________________________________________。
(2)過程①后在分子水平上檢測目的基因是否導入到受精卵的方法是_____________________________________________________________________。
(3)過程②所用的精子需要達到________狀態。過程③胚胎的早期培養中，培養液中除一些無機鹽和有機鹽類外，還需添加“兩素、兩酸”以及血清等，其中的“兩酸”是指_____________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)早期胚胎發育到適宜的階段時，若暫時不移植給受體，可使用________法保存。
(5)在胚胎移植過程中，需要對受體動物進行____________處理，以保證胚胎能夠在受體的子宮著床、繼續生長發育。受體對外來的胚胎基本不發生____________，這使外來胚胎在其體內存活成為了可能。
答案　(1)顯微注射法　雙鏈環狀DNA分子　(2)DNA分子雜交技術　(3)獲能　氨基酸、核苷酸　(4)冷凍　(5)同期發情　免疫排斥
解析　(1)將重組質粒導入受精卵的常用方法是顯微注射法。重組質粒的本質是雙鏈環狀DNA分子。(2)在分子水平上檢測目的基因是否導入到受精卵的方法是DNA分子雜交技術。(3)獲能的精子和成熟后的卵細胞在適宜的環境中才可完成受精。受精后形成的受精卵需經早期胚胎培養，才能進行移植，胚胎的早期培養中，培養液中除一些無機鹽和有機鹽類外，還需添加維生素、激素、氨基酸、核苷酸等營養成分，以及血清等物質，其中“兩酸”是指氨基酸、核苷酸。(4)早期胚胎發育到適宜的階段時，可將其向受體移植或冷凍保存。(5)胚胎移植時要對接受胚胎的受體動物進行同期發情處理，以保證胚胎能夠在受體的子宮著床、繼續生長發育。胚胎在受體內存活的生理學基礎是受體對外來胚胎基本不發生免疫排斥反應。
4.(2021·四川成都七中診斷)已知某RNA病毒包膜表面的S蛋白負責病毒的吸附、融合和侵入宿主細胞，也是誘導宿主產生體液免疫的抗原。針對該病毒的S蛋白研制疫苗和抗體的部分流程如圖所示。回答下列問題：
(1)提取該抗原的RNA并將RNA通過________形成DNA。
(2)過程③中，常利用改造后的腺病毒充當載體，改造后的腺病毒能作為載體需具備的條件有___________________________________________________________
_______________________________________________________(答出兩點即可)，
構建S蛋白基因重組載體所需的工具酶有____________________。
(3)提取的S蛋白可作為疫苗使用，以病毒包膜表面的S蛋白作為疫苗比開發減毒病毒作為疫苗更為安全，主要原因是______________________________________
______________________________________________________________________。
(4)通過過程⑦獲得的X稱為________。
答案　(1)逆轉錄　(2)能自主復制、有多個限制酶切割位點、有標記基因、對宿主細胞無害　限制酶和DNA連接酶　(3)蛋白質不具侵染性，不會破壞細胞結構(合理即可)　(4)雜交瘤細胞
解析　(1)RNA在逆轉錄酶的作用下可形成DNA。(2)改造后的腺病毒能作為載體需要具備的條件有能自主復制、有多個限制酶切割位點、有標記基因、對宿主細胞無害等。構建重組載體所需要的工具酶有限制酶和DNA連接酶。(3)以病毒包膜表面的S蛋白作為疫苗比開發減毒病毒作為疫苗更安全，主要是因為蛋白質不具侵染性，不會破壞細胞結構。(4)據圖分析可知，通過過程⑦獲得的X稱為雜交瘤細胞。
微專題2　基因工程
5.(2021·山東菏澤期末改編)轉基因抗蟲棉是我國商業化種植的轉基因作物。將Bt抗蟲蛋白基因導入棉花細胞可采用農桿菌轉化法，下列對相關操作及結果的敘述，錯誤的是(　　)
A.用相同的限制酶切割Bt抗蟲蛋白基因和農桿菌Ti質粒
B.限制酶和DNA連接酶分別催化磷酸二酯鍵的水解和形成
C.可用PCR技術檢測Bt抗蟲蛋白基因是否導入成功
D.將Bt抗蟲蛋白基因轉移至受體細胞的染色體DNA上獲得抗蟲棉的過程屬于染色體變異
答案　D
解析　構建基因表達載體時，用相同的限制酶切割Bt抗蟲蛋白基因和農桿菌Ti質粒，以產生相同的末端，便于二者進行連接，A正確；限制酶和DNA連接酶分別催化磷酸二酯鍵的水解和形成，B正確；可用PCR技術檢測目的基因是否導入成功，C正確；將Bt抗蟲蛋白基因轉移至受體細胞的染色體DNA上獲得抗蟲棉的過程屬于基因重組，D錯誤。
6.(2021·山東聊城調研)2018年第一例基因編輯的嬰兒的誕生，引起中國醫學與科研界的普遍震驚與強烈譴責。這一嬰兒的基因編輯利用CRISPR/Cas9系統基因編輯技術，該系統主要包含引導RNA和Cas9內切酶兩個部分，引導RNA能識別并結合特定的DNA序列，從而引導Cas9內切酶結合到相應位置并剪切DNA，最終實現對靶基因序列的編輯。CRISPR/Cas9系統基因修飾技術流程如圖示，請回答下列問題：
(1)Cas9內切酶在自然界原核生物體中的作用是____________________________
_____________________________________________________________________。
(2)圖中進行基因修飾過程中，除圖中所示工具酶外，還用到____________________，該工具酶________(填“能”或“不能”)特異性識別DNA堿基序列。
(3)將經過修飾的基因組導入斑馬魚、細菌細胞的技術方法分別是________法、Ca2＋處理法等。細菌細胞作為受體的原因是___________________________________。
(4)將經過修飾的基因組成功導入人體細胞后，還需經過_____________________技術，才能獲得基因編輯嬰兒，但基因編輯嬰兒的誕生被世界眾多科學家所譴責。若你是一名持譴責態度的科學家，請說明你譴責的理由是____________________
___________________________________________________________(至少兩點)。
答案　(1)識別外源性入侵的核酸序列，并對其進行特異性切割
(2)DNA連接酶　不能
(3)顯微注射　細菌繁殖快，多為單細胞生物，遺傳物質較少
(4)動物細胞培養、早期胚胎培養、胚胎移植　違背人類倫理道德；基因編輯具有一定的不確定性，這給被改編基因的人埋下難以預計的潛在后果；基因編輯后，不能完全達到目的；將基因修飾技術施于人，會導致人類基因的改變(答案合理即可)
解析　(1)Cas9內切酶作為一種限制酶，在自然界原核生物中的作用是切割外源基因，保護自身。(2)基因組靶向修復過程中需要用到DNA連接酶，進行重組DNA分子構建，由于基因工程中用到的DNA連接酶只有兩種，而幾乎能連接所有的黏性末端或平末端，所以不能特異性識別DNA堿基序列。(3)將經過靶向修飾的基因組導入斑馬魚、細菌細胞的技術方法分別是顯微注射技術、Ca2＋處理法，由于微生物細胞作為受體細胞具有細菌繁殖快，多為單細胞生物，遺傳物質較少等優點，所以更容易成功。(4)基因導入動物細胞后，還需要經過動物細胞培養、早期胚胎培養、胚胎移植等過程，才能獲得轉基因動物。如果將基因工程操作應用于人類，可能會違背人類倫理道德；基因編輯具有一定的不確定性，這給被改編基因的人埋下難以預計的潛在后果；基因編輯后，不能完全達到目的；將基因修飾技術施于人，會導致人類基因的改變。
7.(2021·湖南長郡中學聯考)采用現代生物技術將乙肝病毒表達表面抗原(HBsAg)的基因進行質粒構建，將其導入CHO細胞(中國倉鼠卵巢細胞)中，通過培養這種CHO細胞來表達乙肝表面抗原亞單位，從而獲得疫苗，基本流程如圖所示。請回答下列問題。
(1)要獲取HBsAg基因，除采用圖中方法外，還可以根據表面抗原蛋白質的結構推測____________________，進而推測目的基因的脫氧核苷酸序列，再進行人工合成。
(2)圖中①過程選用的限制酶是________________，理由是_____________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(3)利用PCR技術擴增HBsAg基因片段的前提條件是_______________________，以便合成引物。
以下是某同學設計的一組引物(只標注了部分堿基序列)：
該組引物是否合理？________，理由是____________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________。
(4)若一個HBsAg基因通過PCR擴增了4次，在子代基因中同時含有兩個引物的基因占________。
(5)HBsAg基因在CHO細胞中表達需要有特異性的____________________，控制基因表達的起始時間和表達程度。HBsAg基因能否在CHO細胞中穩定遺傳的關鍵是_________________________________________________________________
______________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
答案　(1)氨基酸序列　(2)Hind Ⅲ和Xho Ⅰ　HBsAg基因含有限制酶Hind Ⅲ、Sma Ⅰ和Xho Ⅰ的切割位點，但限制酶Sma Ⅰ的切割位點位于目的基因上，若選用限制酶Sma Ⅰ則會破壞目的基因
(3)要有一段已知目的基因的核苷酸序列　否(不合理)　引物Ⅱ自身折疊后會出現局部堿基互補配對，這影響了與模板的堿基互補配對　(4)7/8　(5)啟動子　CHO細胞的染色體DNA上是否插入了HBsAg基因
解析　(1)要獲取目的基因，除了采用圖中方法外，還可以根據表面抗原蛋白質的結構推測氨基酸序列，進而推測目的基因的脫氧核苷酸序列，再進行人工合成。(2)分析題圖可知，含有目的基因(HBsAg基因)的DNA分子中含有限制酶Hind Ⅲ、Sma Ⅰ和Xho Ⅰ的切割位點，但其中限制酶Sma Ⅰ的切割位點位于目的基因上，若選用限制酶Sma Ⅰ則會破壞目的基因，為了保證目的基因的完整性，①過程選用的限制酶是Hind Ⅲ和Xho Ⅰ。(3)利用PCR技術擴增HBsAg基因片段的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據這一序列合成引物。題圖中的引物Ⅱ自身折疊后會出現局部堿基互補配對，這影響了與模板的堿基互補配對，所以該組引物不合理。(4)一個目的基因擴增4次后共得到16個子代基因，除了含有模板DNA鏈的2個基因外，其余的子代基因中都同時含有兩個引物，因此在子代基因中同時含有兩個引物的基因占7/8。(5)啟動子可控制基因表達(轉錄)的起始時間和表達程度。HBsAg基因能否在CHO細胞中穩定遺傳的關鍵是CHO細胞的染色體DNA上是否插入了HBsAg基因。
微專題3　PCR技術及應用
8.(2021·山東濟南調研)PCR是以模擬體內DNA復制的方式在體外選擇性地將DNA某個特殊區域進行擴增的技術。DNA擴增過程的產物有長產物片段和短產物片段兩種，其形成過程如圖1所示。請回答下列問題：
圖1
(1)DNA復制時子鏈延伸的方向是________(填“5′→3′”或“3′→5′”)。由于DNA聚合酶不能直接催化兩個單核苷酸之間的反應，因此DNA復制需要一段單鏈DNA或RNA作為________。
(2)如果擴增序列為圖2所示的兩段序列之間的DNA片段，請從表中列出的引物中選出一對合適的引物________。
5′－GACCTGTGGAAGC……CATACGGGATTG－3′
3′－CTGGACACCTTCG……GTATGCCCTAAC－5′
圖2
引物Ⅰ 引物Ⅱ
甲 5′－GACCTGTGGAAGC A 5′－CATACGGGATTG
乙 5′－CTGGACACCTTCG B 5′－GTATGCCCTAAC
丙 5′－CGAAGGTGTCCAG C 5′－GTTAGGGCTTAC
丁 5′－GCTTCCACAGGTC D 5′－CAATCCCGTATG
(3)下面為某同學利用PCR儀進行PCR的操作步驟，請完善相關步驟內容。
a.按配方準備好各組分。
b.用微量移液器向微量離心管中依次加入各組分：模板DNA、4種脫氧核糖核苷三磷酸、________、引物、緩沖液等。
c.________使反應液聚集在微量離心管底部。
d.將微量離心管放人PCR儀，設定好PCR儀的循環程序。
e.進行PCR反應。
(4)PCR的產物片段中，只有________才是符合要求的目標產物。
答案　(1)5′→3′　引物　(2)甲和D　(3)耐高溫的DNA聚合酶　離心　(4)雙鏈短產物片段
解析　(1)DNA復制時子鏈延伸的方向是5′→3′。由于DNA聚合酶不能直接催化兩個單核苷酸之間的反應，因此DNA復制需要一段單鏈DNA或RNA作為引物，當引物與模板鏈結合后，單個的脫氧核苷酸才能結合上來。(2)引物與DNA的模板鏈的3′端能夠配對，如果擴增序列為圖2所示的兩段序列之間的DNA片段，則根據堿基互補配對原則，最合適的引物為甲和D。(3)PCR是在體外進行DNA復制的技術。該過程需要模板、原料、引物、耐高溫的DNA聚合酶等。離心使反應液聚集在微量離心管底部。(4)DNA是雙鏈，PCR的產物片段中，只有雙鏈短產物片段才是符合要求的目標產物。
9.(2021·山東煙臺調研)通過RT PCR技術檢測咽拭子標本是目前臨床上診斷人體是否感染新型冠狀病毒的常用方法，用于核酸檢測的RT PCR試劑盒的部分工作原理簡圖如圖。回答下列問題：
(1)RT PCR是指以RNA為模板通過________過程合成cDNA，并對cDNA進行PCR擴增的過程。進行RT PCR時，需要加入的酶有_________________________
(2)利用PT PCR試劑盒對新型冠狀病毒進行檢測時，除借助上述RT PCR技術外，還需要有特異性探針。制作該探針的依據是____________________________，利用該探針對新型冠狀病毒進行檢測的原理是_______________________________。
(3)除核酸檢測外，研究人員還研發了基于病毒蛋白的檢測技術，該項技術的關鍵是生產出能與新型冠狀病毒結合的特異性抗體。生產該種抗體的大致方案如下：
①向小鼠體內注射新型冠狀病毒的抗原蛋白；
②分離免疫小鼠的B淋巴細胞，并與小鼠的骨髓瘤細胞融合，多次篩選、檢測，最終獲得所需的雜交瘤細胞；
③將獲得的雜交瘤細胞在體外條件下大規模培養，獲得大量的特異性抗體。
上述生產抗體的方案中使用的技術手段有____________________，其中步驟②中獲得的雜交瘤細胞具有____________________等特點；步驟③中為防止細胞代謝產物積累對細胞自身造成危害，應采取的措施是_____________________________。
答案　(1)逆轉錄　逆轉錄酶和耐高溫的DNA聚合酶　(2)新型冠狀病毒的(核糖)核苷酸序列　分子雜交
(3)動物細胞培養、動物細胞融合　既能迅速大量增殖，又能產生專一的抗體　定期更換培養液
解析　(1)以RNA為模板合成cDNA的過程為逆轉錄過程，該過程需要逆轉錄酶的參與，利用PCR技術對cDNA進行擴增時需要耐高溫的DNA聚合酶的參與。(2)探針是指被放射性同位素等標記的已知核苷酸序列的核酸片段，其與目標核苷酸序列間的分子雜交遵循堿基互補配對原則，制作題中探針的依據是新型冠狀病毒的(核糖)核苷酸序列。利用該探針對新型冠狀病毒進行檢測的原理是分子雜交。(3)題中方案制備的是單克隆抗體，采用的技術手段有動物細胞培養、動物細胞融合；雜交瘤細胞的特點是既能迅速大量增殖，又能產生專一的抗體；步驟③中為防止細胞代謝產物積累對細胞自身造成危害，應定期更換培養液。

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