資源簡介

中小學教育資源及組卷應用平臺
新人教生物一輪復習課堂互動探究案
12-2　微生物的培養技術及應用
考點一　微生物的基本培養技術
任務驅動·探究突破
任務1　歸納培養基的種類和作用
(1)按物理狀態分類
培養基種類 特點 用途
液體培養基 不加________ 工業生產
半固體培養基 加凝固劑(如瓊脂) 觀察微生物的________、分類鑒定
固體培養基 加凝固劑(如瓊脂) 微生物的分離、鑒定，活菌計數，________保藏
(2)按功能分類
種類 制備方法 原理 用途 舉例
選擇培養基 培養基中加入某些________ 依據某些微生物對某些物質的特殊需求或抗性而設計 從眾多微生物中分離所需的微生物 加入________分離得到酵母菌和霉菌
鑒別培養基 培養基中加入某種________或________ 產生特定的顏色或其他變化 鑒別不同種類的微生物 用伊紅美藍培養基鑒別________菌
[師說拓展]　(1)培養基的配制原則
①目的要明確：配制時應根據微生物的種類、培養目的等來確定配制的培養基種類。
②營養要協調：注意各種營養物質的濃度和比例。
③pH要適宜：真菌為5.0～6.0，細菌所需pH為6.5～7.5，放線菌為7.5～8.5，故培養不同微生物所需pH 不同。
(2)培養基的營養構成
①各種培養基的具體配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽。
②不同培養基還要滿足不同微生物對pH、特殊營養物質以及氧氣的要求。
(3)微生物對主要營養物質的需求特點
①自養型微生物所需的主要營養物質是無機鹽，碳源可來自大氣中的CO2；氮源可由含氮無機鹽提供，如硝酸鹽等。
②異養型微生物所需的營養物質主要是有機物，即碳源必須由含碳有機物提供，如糖類、脂肪酸等；氮源也主要由有機物提供，如尿素、牛肉膏等，部分異養型微生物也可以利用無機氮源。
任務2　比較消毒和滅菌
方法 條件 結果 常用方法 應用范圍
消毒 較為溫和 的物理或 化學方法 僅殺死物體表面或內部的________微生物 ____消毒法 日常用品
巴氏消毒法 不耐高溫的液體
________ 消毒法 用酒精擦拭雙手，用氯氣消毒水源
滅菌 強烈的理化因素 殺死物體內外所有的微生物，包括________ _______滅菌法 接種工具
_______滅菌法 玻璃器皿、金屬用具
_______滅菌法 培養基及容器
任務3　完善微生物的純化培養
(1)比較平板劃線法和稀釋涂布平板法的區別
比較項目 平板劃線法 稀釋涂布平板法
關鍵操作 接種環在________培養基表面連續劃線 ①一系列的梯度稀釋 ②________操作
注意事項 每次劃線前后均需灼燒接種環 稀釋度要足夠高，為確保實驗成功可以增加稀釋度的范圍
菌體獲取 在具有顯著的________特征的區域挑取菌體 從適宜稀釋度的平板上的菌落中挑取菌體
適用范圍 適用于好氧菌 適用于________菌和兼性厭氧菌
優點 可以根據菌落的特點獲得某種微生物的________菌落 既可以獲得單細胞菌落，又能對微生物計數
缺點 不能對微生物計數 操作復雜，需要涂布多個平板
(2)歸納概括平板劃線操作的注意事項
①灼燒接種環，待其冷卻后才能伸入菌液，以免溫度太高殺死菌種。
②第二次及其以后的劃線操作總是從上一次劃線末端開始，能使微生物的數目隨著劃線次數的增加而逐漸減少，最終得到由單個細菌繁殖而來的菌落。
③劃線時最后一區不要與第一區相連。
④劃線用力大小要適當，防止用力過大將培養基劃破。
⑤操作第一步即取菌種之前及每次劃線之前都需要進行火焰灼燒滅菌，劃線操作結束時，仍需灼燒接種環，每次灼燒的目的如下表：
項目 第一次操作 每次劃線之前 劃線結束
目的 殺死接種 環上原有 的微生物 殺死____次劃線后接種環上殘留的菌種，使____次劃線的菌種直接來源于____次劃線的末端，使每次劃線菌種數目減少 殺死接種環上殘存的菌種，避免微生物污染________和感染操作者
考向分類·對點落實
考向一 培養基及其制備方法分析
1.[經典模擬]下表為某培養基的配方，下列敘述正確的是(　　)
成分 蛋白胨 葡萄糖 K2HPO4 伊紅 美藍 蒸餾水
含量 10 g 10 g 2 g 0.4 g 0.065 g 1 000 mL
A.從物理性質看，該培養基屬于液體培養基；從用途看，該培養基屬于選擇培養基
B．該培養基中屬于碳源的物質主要是葡萄糖，屬于氮源的物質是蛋白胨
C．該培養基缺少提供生長因子的物質
D．該培養基調節合適的pH后就可以接種使用
2．[2022·安徽省黃山市高三 “八校聯考”]藍白斑篩選是基因工程中篩選重組目的基因常用的一種方法，表現為培養基上出現藍白顏色的菌落，可以通過顏色直接篩選重組菌。用于篩選的菌為β－半乳糖苷酶缺陷型菌株，這種宿主菌中編碼β－半乳糖苷酶的部分缺失，不具有生物活性。用于藍白斑篩選的質粒載體一般含有抗性基因和將宿主菌β－半乳糖苷酶缺失部分補全的序列，在這段序列中還含有多個限制性酶切位點，便于插入目的基因。β－半乳糖苷酶能夠作用于一種無色化合物X gal，使其變成藍色物質。回答下列問題：
(1)玻璃和金屬材質的實驗器材利用________方法滅菌。
(2)培養基滅菌后，需要冷卻到________℃左右時，才能倒平板。倒平板后，平板冷凝要將平板倒扣，其原因是______________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)為防止雜菌污染，培養基中要添加________。藍白斑篩選能成功，是因為培養基中添加了________。
(4)最終培養基出現的白色的菌落是(　　)
A．目的基因和載體結合
B．只含目的基因
C．只含載體
(5)若需要長期保存該菌種，可采用的方法是____________________。
考向二 無菌技術的操作
3.[經典模擬]微生物培養過程中，要十分重視無菌操作。現代生物學實驗中的許多方面也要進行無菌操作，以防止雜菌污染。請分析下列操作中錯誤的是(　　)
①煮沸消毒可以殺死微生物的營養細胞和部分芽孢
②接種操作要在酒精燈火焰附近進行　
③無菌繁殖脫毒苗時，植物的外植體要進行消毒
④家庭制作葡萄酒時要將容器和葡萄進行滅菌
⑤培養基要進行高壓蒸汽滅菌
⑥加入培養基中的指示劑和染料不需要滅菌
A．①③　　B．②④　　C．③⑤　　D．④⑥
4．(不定項選擇)下列關于滅菌和消毒的理解，正確的是(　　)
A．滅菌是指殺滅環境中一切微生物的細胞、芽孢和孢子
B．消毒和滅菌實質是相同的
C．接種環用灼燒法滅菌
D．常用的消毒方法有加熱法、過濾法、紫外線法、化學藥品法
考向三 大腸桿菌的純化方法及過程分析
5.[2022·甘肅蘭州一中高三試題]平板冷卻凝固后要將平板倒置，其目的是(　　)
A．利于大腸桿菌的生長
B．防止空氣進入
C．利于培養基的冷卻
D．防止皿蓋冷卻水滴入培養基造成污染
6．[2022·河南省安陽市高三第一次調研]一個由英國倫敦帝國學院和芬蘭圖爾庫大學的科學家組成的研究小組日前開發出一種通過大腸桿菌制造丙烷的新技術。科研人員欲對大腸桿菌進行研究和利用，首先要純化大腸桿菌，請結合所學知識，回答下列問題：
(1)純化大腸桿菌首先需要制備牛肉膏蛋白胨固體培養基，其步驟是計算、稱量、溶化、滅菌、________。對培養基進行滅菌的方法是____________________，檢驗培養基是否有雜菌污染的最有效的方法是________________________________________。
(2)可以估算出樣品中大腸桿菌數量的接種方法是________，用該方法得到的結果一般比實際值________(填“偏大”或“偏小”)。
(3)某實驗小組將得到的菌株接種到液體培養基中并混勻，一部分進行靜置培養，另一部分進行振蕩培養，結果發現：振蕩培養的細菌比靜置培養的細菌生長速度快。分析其原因是振蕩培養能提高培養液中________的含量和營養物質的利用率。使用過的培養基及培養物必須經過________后才能丟棄，以防止培養物擴散。
(4)如果要檢測食品中是否含有大腸桿菌，需要在培養基中加入________(填物質)，以觀察是否出現________(填顏色)的菌落。
考向四 微生物培養與分離的考查
7.(不定項選擇)漆酶屬于木質降解酶類，在環境修復、農業生產等領域有著廣泛用途。下圖是分離、純化和保存漆酶菌株的過程，相關敘述正確的是(　　)
A.生活污水中含有大量微生物，是分離產漆酶菌株的首選樣品
B．篩選培養基中需要加入漆酶的底物，通過菌落特征挑出產漆酶的菌落
C．在涂布平板上長出的菌落，再通過劃線進一步純化
D．斜面培養基中含有大量營養物，可在常溫下長期保存菌株
8．如圖是微生物平板劃線示意圖，劃線的順序為1→2→3→4→5，下列說法正確的是(　　)
A．操作前要將接種環用酒精消毒
B．劃線操作須在酒精燈火焰附近進行
C．只有在5區才可以得到所需菌落
D．在2、3、4、5區域中劃線前后都要對接種環滅菌
9．[2022·河北省保定市高三二模]冰箱并沒有滅菌的功能，如果生冷食物長期放在冰箱這個密封的空間里，就會滋生細菌，使冰箱產生難聞的異味。某學習小組利用冰箱內烤腸作樣本，在實驗室做了微生物培養。請回答下列問題：
(1)實驗用到的培養基用________法滅菌，滅菌后的培養基需要倒置，原因是____________________________。在接種前，隨機取若干滅菌后的空白平板先行培養了一段時間，這樣做的目的是________________________________________。
(2)為了觀察培養的微生物種類及數量，需要用________法進行接種，培養適宜時間后，培養基中出現多種形態和顏色不同的________，說明烤腸樣品中有多種微生物。
(3)一般情況下，一定濃度的抗生素會殺死細菌，用含抗生素的濾紙片處理培養基上分離出的大腸桿菌，觀察大腸桿菌生長狀況，看濾紙片附近是否出現了抑菌圈，再從抑菌圈邊緣的菌落上挑取細菌接種培養并重復以上抗生素處理，在連續培養幾代后，抑菌圈的平均直徑________(填“不變”、“變小”或“變大”)，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
考點二　微生物的選擇培養和計數
任務驅動·探究突破
任務1　歸納概括微生物的篩選與鑒別方法
(1)微生物的篩選方法
單菌落 挑取法 利用________法或稀釋涂布平板法接種到________培養基表面，直接根據微生物________的特征利用單菌落挑取的方法獲得目的微生物
選擇 培養法 利用________培養基對微生物進行選擇培養，直接獲得目的微生物
鑒定 培養法 利用________培養基使目的微生物菌落呈現特有的特征，然后篩選目的微生物
(2)微生物的鑒別方法
菌落特征 鑒別法 根據微生物在________培養基表面形成的菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等特征進行鑒別
指示劑 鑒別法 如培養基中加入____________，培養某種微生物后，培養基變紅說明該種微生物能夠分解尿素
染色 鑒別法 如利用________染色法，根據培養基中出現以纖維素分解菌為中心的透明圈來篩選分解纖維素的微生物
任務2　選擇培養基與鑒別培養基的比較
種類 制備方法 原理 用途 舉例
選擇培養基 培養基中 加入某些 化學物質 依據____________________________________而設計 從眾多微生物中分離所需的微生物 加入______________________________ 分離得到酵母菌和霉菌
鑒別培養基 培養基中 加入某種 指示劑或 化學藥品 依據微生物產生的某種代謝產物與培養基中的特定試劑或化學藥品反應，產生__________________而設計 鑒別不同種類的微生物 ______________可以鑒別大腸桿菌
任務3　選擇培養基的應用實例
(1)選擇培養基是在培養基中加入某種化學物質，以抑制不需要的微生物的生長，促進所需要的微生物的生長，其目的是培養、分離出特定微生物。
(2)選擇培養基的應用實例
①加入某些特定的物質(前提是培養基具備全部營養成分)
②改變培養基的營養成分
③利用培養基“特定化學成分”分離
④通過某些“特殊環境”分離
[歸納拓展]　自養型與異養型微生物培養基的區別
(1)自養型微生物所需的主要營養物質是無機鹽，碳源可來自大氣中的CO2，氮源也可由含氮無機鹽提供。
(2)異養型微生物所需的營養物質主要是有機物，即碳源必須由含碳有機物提供，氮源也主要是由有機物提供的，部分異養型微生物也可以利用無機氮源。
任務4　比較兩種微生物計數方法
比較 項目 間接計數法 (稀釋涂布平板法) 直接計數法 (顯微計數法)
原理 當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的____個活菌，通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌 利用特定細菌計數板或________計數板，在顯微鏡下計算一定容積的樣品中微生物的數量
公式 每克樣品中的菌落數＝C/V×M。C：某稀釋度下平板上生長的平均菌落數，V：涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)，M：稀釋倍數 每毫升原液所含細菌數：每小格內平均細菌數×400×104×稀釋倍數
缺點 當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是____個菌落 不能區分細胞________
結果 比實際值偏____ 比實際值偏____
[名師提醒]　(1)一般選用相差不大的平板計算平均值，選用保證菌落數在30～300的稀釋度下的平板進行計數。
(2)設置重復組，增強實驗的說服力與準確性。同時為了保證結果準確，設置三個以上。
(3)在同一稀釋度下，至少對3個平板進行重復計數，然后求出平均值，并根據平板所對應的稀釋度計算出樣品中細菌的數目，如果某個平板的菌落數與其他組差別甚遠，說明該平板操作過程中出現失誤，應舍棄。
(4)統計的菌落往往比活菌的實際數目低，這是由于當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落，因此，統計結果一般用菌落數而不是用活菌數來表示。
考向分類·對點落實
考向一 微生物分離與計數的考查
1.(不定項選擇)用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數，在對應稀釋倍數為106的培養基中，對該實驗有關敘述錯誤的是(　　)
A．涂布了三個平板，統計的菌落數分別是210、240和250，取平均值233
B．涂布了一個平板，統計的菌落數是230
C．設置對照實驗的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度
D．統計某一稀釋度的5個平板的菌落數依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數估計值
2．土壤中含有多種微生物，某研究小組欲分離能在Fe2＋污染的土壤環境下生存的希瓦氏菌，進行了相關研究。回答下列問題：
(1)配制培養基：加入牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、NaCl、H2O及________________等并滅菌；該培養基按功能劃分，屬于________培養基。
(2)分離希瓦氏菌：將10 g土樣溶于90 mL蒸餾水中，再稀釋成多個倍數，取多個稀釋倍數的土壤樣品液0.1 mL分別接種到多個平板上，這樣做的目的是________________________________________________________________________；
培養一段時間后，A、B研究員在105稀釋倍數下得到的結果：A涂布4個平板，統計的菌落數分別是150、178、259、310；B涂布4個平板，統計的菌落數分別是152、165、175、184，則每克土壤樣品中的希瓦氏菌數量最可能為________個。
(3)進一步純化希瓦氏菌：采用平板劃線法接種培養一段時間后，發現第一劃線區域上都不間斷地長滿了菌落，第二劃線區域上幾乎無菌落，分析出現此現象的原因可能是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________(答出兩點)。
(4)研究人員還欲采用測定ATP含量的方法估算希瓦氏菌數，該方法的依據是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________，
此方法與顯微鏡直接計數相比，得到的希瓦氏菌數目________(填“多”或“少”)，原因是
________________________________________________________________________。
3．[全國卷Ⅱ]為了調查某河流的水質狀況，某研究小組測定了該河流水樣中的細菌含量，并進行了細菌分離等工作。回答下列問題：
(1)該小組采用稀釋涂布平板法檢測水樣中細菌含量。在涂布接種前，隨機取若干滅菌后的空白平板先行培養了一段時間，這樣做的目的是____________________；然后，將1 mL水樣稀釋100倍，在3個平板上用涂布法分別接入0.1 mL稀釋液；經適當培養后，3個平板上的菌落數分別為39、38和37。據此可得出每升水樣中的活菌數為________________________________________________________________________。
(2)該小組采用平板劃線法分離水樣中的細菌，操作時，接種環通過__________滅菌。在第二次及以后的劃線時，總是從上一次劃線的末端開始劃線。這樣做的目的是________________________________________________________________________
________________________。
(3)示意圖A和B中，__________表示的是用稀釋涂布平板法接種培養后得到的結果。
(4)該小組將得到的菌株接種到液體培養基中并混勻，一部分進行靜置培養，另一部分進行振蕩培養。結果發現：振蕩培養的細菌比靜置培養的細菌生長速度快。分析其原因是：振蕩培養能提高培養液中__________的含量，同時可使菌體與培養液充分接觸，提高__________的利用率。
考向二 微生物篩選的拓展應用
4.營養缺陷型菌株是指缺乏合成某些營養物質(如氨基酸、維生素)的能力，必須在基本培養基中補充特殊營養物質才能正常生長的一類菌株，可自然產生或人工誘導獲得。用一定方法誘變大腸桿菌并將其接種到甲培養皿上，一段時間后將菌落影印接種(不改變菌落位置)到乙、丙兩培養皿中，進一步培養一段時間可篩選出營養缺陷型菌株，結果如圖所示。下列說法正確的是(　　)
A．將大腸桿菌接種到甲培養皿的方法為平板劃線法
B．甲、丙兩種培養基中均添加了特殊營養物質
C．乙培養皿中能生長的為所需的營養缺陷型菌株
D．甲中的部分大腸桿菌發生了基因突變或染色體變異
5.
[2022·德州檢測](不定項選擇)篩選淀粉分解菌需使用以淀粉為唯一碳源的培養基。接種培養后，得到如圖所示的兩個菌落，培養平板經稀碘液處理，出現了以菌落為中心的透明圈。相關敘述正確的是(　　)
A．培養基中的淀粉也可為微生物提供氮源
B．兩個菌落中的微生物為同一種微生物
C．兩個菌落中的微生物均能將淀粉酶分泌至細胞外
D．透明圈直徑與菌落直徑的比值越大，說明該微生物分解淀粉的能力越大
6．酸奶因營養豐富和口感美味而深受大眾喜愛，且含有活性乳酸菌，對身體大有益處。常見的乳酸菌主要為乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和嗜熱鏈球菌屬。現采用如下步驟對酸奶中的乳酸菌進行篩選、分離：
酸奶→選擇適宜稀釋度→涂布MRS瓊脂培養基→適宜溫度培養→挑取單個菌落→接種于MRS瓊脂平板或MC瓊脂平板→菌種鑒定→接種MRS液體培養基→菌種保藏
請回答下列有關問題：
(1)制備MRS瓊脂培養基時，采用________法滅菌15～20 min。倒平板操作時，應在________附近進行。
(2)制備稀釋液時，先將酸奶樣品充分搖勻，用無菌吸管吸取樣品________ mL放入裝有225 mL無菌水錐形瓶中，充分振蕩，制成1∶10的樣品液。
(3)培養一段時間后，從MRS固體培養基上挑選多個單菌落，使用____________法接種于MC瓊脂平板或MRS瓊脂平板上，于36±1 ℃________(填“厭氧”或“好氧”)條件下倒置培養48 h后，再挑取單個菌落進行菌種鑒定。
(4)菌種鑒定后將其接種至MRS液體培養基的目的是________________________________________________________________________。
將得到的純菌株進行長期保藏，可采用________的方法。
[網絡建構提升]
[長句應答必備]
1．無菌操作技術包括消毒和滅菌，消毒包括煮沸消毒、巴氏消毒、化學藥劑消毒和紫外線消毒等；滅菌包括灼燒滅菌、干熱滅菌和濕熱滅菌。
2．培養基的制備過程包括計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板等步驟，倒置平板的目的是防止培養皿蓋上的水滴落入培養基造成污染。
3．大腸桿菌的純化包括平板劃線法和稀釋涂布平板法。平板劃線法要求多次劃線，稀釋涂布平板法要求將菌液充分稀釋。
4．微生物的計數要求制作多個平板，且每個平板上能長出30～300個菌落。
5．尿素分解菌和纖維素分解菌的分離都運用了選擇培養基，前者所用的培養基中尿素是唯一的氮源，后者所用的培養基中纖維素是唯一的碳源。
[等級選考研考向]
1．[浙江卷]下列關于微生物培養及利用的敘述，錯誤的是(　　)
A．利用尿素固體培養基可迅速殺死其他微生物，而保留利用尿素的微生物
B．配制培養基時應根據微生物的種類調整培養基的pH
C．酵母菌不能直接利用糯米淀粉發酵得到糯米酒
D.適宜濃度的酒精可使醋化醋桿菌活化
2．[2021·湖南卷，節選]大熊貓是我國特有的珍稀野生動物，每只成年大熊貓每日進食竹子量可達12～38 kg。大熊貓可利用竹子中8%的纖維素和27%的半纖維素。研究人員從大熊貓糞便和土壤中篩選纖維素分解菌。回答下列問題：
(1)為篩選纖維素分解菌，將大熊貓新鮮糞便樣品稀釋液接種至以________為唯一碳源的固體培養基上進行培養，該培養基從功能上分類屬于________培養基。
(2)配制的培養基必須進行滅菌處理，目的是________________________。檢測固體培養基滅菌效果的常用方法是_________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)簡要寫出測定大熊貓新鮮糞便中纖維素分解菌活菌數的實驗思路________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)為高效降解農業秸稈廢棄物，研究人員利用從土壤中篩選獲得的3株纖維素分解菌，在37 ℃條件下進行玉米秸稈降解實驗，結果如表所示。在該條件下纖維素酶活力最高的是菌株________，理由是________________________________________________________
________________________________________________________________________。
菌株 秸稈總重(g) 秸稈殘重(g) 秸稈失重(%) 纖維素降解率(%)
A 2.00 1.51 24.50 16.14
B 2.00 1.53 23.50 14.92
C 2.00 1.42 29.00 23.32
3.[2020·江蘇卷]產脂肪酶酵母可用于含油廢水處理。為篩選產脂肪酶酵母菌株，科研人員開展了相關研究。請回答下列問題：
(1)常規微生物實驗中，下列物品及其滅菌方法錯誤的是________(填編號)。
編號 ① ② ③ ④
物品 培養基 接種環 培養皿 涂布器
滅菌方法 高壓蒸汽 火焰灼燒 干熱 臭氧
(2)稱取1.0 g某土壤樣品，轉入99 mL無菌水中，制備成菌懸液，經________后，獲得細胞密度不同的菌懸液。分別取0.1 mL菌懸液涂布在固體培養基上，其中10倍稀釋的菌懸液培養后平均長出了46個酵母菌落，則該樣本中每克土壤約含酵母菌________個。
(3)為了進一步提高酵母菌產酶能力，對分離所得的菌株，采用射線輻照進行________育種。將輻照處理后的酵母菌涂布在以________為唯一碳源的固體培養基上，培養一段時間后，按照菌落直徑大小進行初篩，選擇直徑________的菌落，純化后獲得A、B兩突變菌株。
(4)在處理含油廢水的同時，可獲得單細胞蛋白，實現污染物資源化。為評價A、B兩菌株的相關性能，進行了培養研究，結果如圖。據圖分析，應選擇菌株________進行后續相關研究，理由是_______________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
[國考真題研規律]
4．[2020·全國卷Ⅰ，37]某種物質S(一種含有C、H、N的有機物)難以降解，會對環境造成污染，只有某些細菌能降解S。研究人員按照下圖所示流程從淤泥中分離得到能高效降解S的細菌菌株。實驗過程中需要甲、乙兩種培養基，甲的組分為無機鹽、水和S，乙的組分為無機鹽、水、S和Y。
回答下列問題：
(1)實驗時，盛有水或培養基的搖瓶通常采用________________的方法進行滅菌。乙培養基中的Y物質是________。甲、乙培養基均屬于________培養基。
(2)實驗中初步估測搖瓶M中細菌細胞數為2×107個/mL，若要在每個平板上涂布100 μL稀釋后的菌液，且保證每個平板上長出的菌落數不超過200個，則至少應將搖瓶M中的菌液稀釋________倍。
(3)在步驟⑤的篩選過程中，發現當培養基中的S超過某一濃度時，某菌株對S的降解量反而下降，其原因可能是___________________________________(答出1點即可)。
(4)若要測定淤泥中能降解S的細菌細胞數，請寫出主要實驗步驟：________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(5)上述實驗中，甲、乙兩種培養基所含有的組分雖然不同，但都能為細菌的生長提供4類營養物質，即___________________________________________________。
5．[全國卷Ⅰ]已知一種有機物X(僅含有C、H兩種元素)不易降解，會造成環境污染。某小組用三種培養基篩選土壤中能高效降解X的細菌(目標菌)。
Ⅰ號培養基：在牛肉膏蛋白胨培養基中加入X(5 g/L)。
Ⅱ號培養基：氯化鈉(5 g/L)，硝酸銨(3 g/L)，其他無機鹽(適量)，X(15 g/L)。
Ⅲ號培養基：氯化鈉(5 g/L)，硝酸銨(3 g/L)，其他無機鹽(適量)，X(45 g/L)。
回答下列問題。
(1)在Ⅰ號培養基中，為微生物提供氮源的是__________________。Ⅱ、Ⅲ號培養基中為微生物提供碳源的有機物是________。
(2)若將土壤懸浮液接種在Ⅱ號液體培養基中，培養一段時間后，不能降解X的細菌比例會__________，其原因是______________________________________________。
(3)Ⅱ號培養基加入瓊脂后可以制成固體培養基，若要以該固體培養基培養目標菌并對菌落進行計數，接種時，應采用的方法是________________。
(4)假設從Ⅲ號培養基中得到了能高效降解X的細菌，且該菌能將X代謝為丙酮酸，則在有氧條件下，丙酮酸可為該菌的生長提供____________和________________________。
6．[全國卷Ⅱ]物質W是一種含氮有機物，會污染土壤。W在培養基中達到一定量時培養基表現為不透明。某研究小組欲從土壤中篩選出能降解W的細菌(目標菌)。回答下列問題。
(1)要從土壤中分離目標菌，所用選擇培養基中的氮源應該是____________。
(2)在從土壤中分離目標菌的過程中，發現培養基上甲、乙兩種細菌都能生長并形成菌落(如圖所示)。如果要得到目標菌，應該選擇____________菌落進一步純化，選擇的依據是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)土壤中的某些微生物可以利用空氣中的氮氣作為氮源。若要設計實驗進一步確定甲、乙菌能否利用空氣中的氮氣作為氮源，請簡要寫出實驗思路、預期結果和結論，即________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)該小組將人工合成的一段DNA轉入大腸桿菌，使大腸桿菌產生能降解W的酶(酶E)。為了比較酶E與天然酶降解W能力的差異，該小組擬進行如下實驗，請完善相關內容。
①在含有一定濃度W的固體培養基上，A處滴加含有酶E的緩沖液，B處滴加含有相同濃度天然酶的緩沖液，C處滴加____________，三處滴加量相同。
②一段時間后，測量透明圈的直徑。若C處沒有出現透明圈，說明________________________________________________________________________；
若A、B處形成的透明圈直徑大小相近，說明
________________________________________________________________________。
課堂互動探究案2
考點一
【任務驅動·探究突破】
任務1　(1)凝固劑　運動　菌種　(2)化學物質　青霉素　指示劑　化學藥品　大腸桿
任務2　部分　煮沸　化學藥劑　芽孢和孢子　灼燒　干熱　濕熱
任務3　固體　涂布平板　菌落　厭氧　單細胞　上　下　上　環境
【考向分類·對點落實】
1．解析：分析表中成分可知，該培養基中沒有凝固劑，為液體培養基，該培養基的營養成分齊全，但存在伊紅、美藍等鑒別物質，屬于鑒別培養基，A錯誤；該培養基中的蛋白胨既是唯一的氮源，也是碳源，而葡萄糖是絕大多數生物最常利用的碳源，B正確；該培養基中存在的無機鹽和蛋白胨中的某些物質可以看作是生長因子，C錯誤；對培養基調節完pH后還要進行滅菌處理等操作才能使用，D錯誤。
答案：B
2．解析：(1)玻璃和金屬材質的實驗器材可用干熱滅菌的方法進行滅菌。(2)培養基滅菌后，需要冷卻到50 ℃左右時才能倒平板。倒平板后，平板冷凝要將平板倒扣，這樣做可防止皿蓋上的冷凝水落入培養基而造成污染。(3)為防止雜菌污染，培養基中要添加抗生素。β－半乳糖苷酶能夠作用于一種無色化合物X gal，使其變成藍色物質，藍白斑篩選能成功，是因為培養基中添加了X gal。(4)由于用于藍白斑篩選的質粒載體一般含有抗性基因和將宿主菌β－半乳糖苷酶缺失部分補全的序列，因此最終培養基中出現的白色的菌落是目的基因和載體結合的菌落，故選A。(5)若需要長期保存該菌種，可采用的方法是甘油管藏法。
答案：(1)干熱滅菌　(2)50　防止皿蓋上的冷凝水落入培養基造成污染　(3)抗生素　X gal　(4)A　(5)甘油管藏法
3．解析：無菌操作包括消毒和滅菌。需進行消毒處理的有植物的外植體及操作人員的雙手等，需進行滅菌的有器皿、培養基、添加劑(指示劑或染色劑)等。煮沸可以殺死微生物的營養細胞和一部分芽孢，屬于消毒；為防止空氣中雜菌的污染，接種時要在酒精燈火焰附近進行；家庭制作葡萄酒時所利用的微生物是葡萄表面的酵母菌，故不能滅菌；培養基常用高壓蒸汽滅菌。故④⑥操作錯誤。
答案：D
4．解析：滅菌是指采用強烈的理化方法殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子，A正確；消毒是指使用較為溫和的物理、化學或生物等方法殺死物體表面或內部一部分微生物，使其無害化，滅菌則是要將所有的微生物全部殺滅，以達到無菌的目的，滅菌一定可以達到消毒的目的，但消毒不一定能達到滅菌的效果，B錯誤；接種工具常用灼燒法滅菌，C正確；常用的消毒方法有加熱法、過濾法、紫外線法、化學藥品法，D正確。
答案：ACD
5．解析：平板冷卻凝固后將平板倒置是為了防止皿蓋上的冷凝水落入培養基造成污染，D正確。
答案：D
6．解析：(1)純化大腸桿菌首先需要制備牛肉膏蛋白胨固體培養基，其步驟是計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板，對培養基進行滅菌的方法是高壓蒸汽滅菌法。檢驗培養基有沒有被雜菌污染，可選取未接種的培養基與接種樣品的培養基同時在恒溫箱中培養。如果在培養過程中未接種的培養基沒有菌落生長，則說明培養基沒有被雜菌污染；若未接種的培養基有菌落生長，則說明培養基被雜菌污染。(2)接種大腸桿菌的最常用方法是平板劃線法和稀釋涂布平板法，其中可以估算出樣品中大腸桿菌數量的是稀釋涂布平板法。由于兩個或多個細胞連在一起，在平板上觀察到的是一個菌落，因而該方法得到的結果一般比實際值偏小。(3)大腸桿菌的培養過程中，除考慮營養條件外，還要考慮溫度、溶氧量、酸堿度和滲透壓等條件；由于大腸桿菌對人和動物有一定的不利影響，所以對培養基和培養物要滅菌處理后才能丟棄。(4)鑒定大腸桿菌要用伊紅美藍培養基，若出現黑色菌落，則說明食品中有大腸桿菌。
答案：(1)倒平板　高壓蒸汽滅菌法　將未接種的培養基放在恒溫箱中培養　(2)稀釋涂布平板法　偏小　(3)氧氣　滅菌處理　(4)伊紅美藍　黑色
7．解析：漆酶降解“木質”，則漆酶菌株多存在于“木質”豐富的場所，故生活污水中含有大量微生物，但不一定含有產漆酶的菌株，A錯誤；篩選培養基中需加入漆酶的底物，通過菌落特征挑出產漆酶的菌落，從而獲得漆酶菌株，B正確；在涂布平板上長出的菌落，再通過劃線進一步純化，C正確；斜面培養基中含有大量營養物，可在低溫下長期保存菌株，D錯誤。
答案：BC
8．解析：在每次劃線前后都要對接種環進行滅菌，接種環的滅菌方法應是在酒精燈火焰上灼燒，不能用酒精消毒；接種時劃線操作是在酒精燈火焰附近進行；在5個區域中，只要有單個活細菌，通過培養即可獲得所需菌落；每次劃線前都要灼燒接種環，目的是殺死接種環上原有的微生物(第一次劃線前)和上次劃線結束后接種環上殘留的菌種，使每次劃線的菌種都來自上一次劃線的末端，劃線結束后灼燒接種環以防止污染環境和感染操作者。
答案：B
9．解析：(1)培養基需要滅菌，一般采用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌。滅菌后的培養基需要倒置，原因是防止培養皿蓋上的水珠落入培養基造成污染，在接種前，隨機取若干滅菌后的空白平板先行培養了一段時間，這樣做的目的是檢測培養基平板滅菌是否合格，如果有菌落，說明滅菌不合格，需要重新配制培養基并滅菌。(2)為了觀察培養的微生物種類及數量，需要用稀釋涂布平板法進行接種，在一定的稀釋倍數的條件下，一個菌落就是一個菌體繁殖的后代。在特定的培養基上，不同微生物形成的菌落在形態、顏色、大小、表面粗糙還是光滑等是不同的，因此可以判斷微生物的種類。(3)通過抑菌圈的大小來確定殺菌能力，即抑菌圈越大殺菌能力越強。在細菌種群中，含有抗藥性基因的個體畢竟只占極少數，抗生素會使細菌中不具抗藥性的個體大量死亡而數量下降，抗生素的選擇是定向的，故隨著培養次數的增加，抑菌圈會變小，抗藥性個體經過繁殖，其耐藥菌的比例會增大。
答案：(1)高壓蒸汽滅菌　防止培養皿蓋上的水珠落入培養基造成污染　檢測培養基平板滅菌是否合格　(2)稀釋涂布平板　菌落　(3)變小　抗生素對大腸桿菌起選擇作用，隨著培養次數增多，耐藥菌的比例增大
考點二
【任務驅動·探究突破】
任務1　(1)平板劃線　固體平板　菌落　選擇　鑒別　(2)固體　酚紅指示劑　剛果紅
任務2　某些微生物對某些物質或環境條件的嗜好、抗性　青霉素　明顯的特征變化　伊紅美藍培養基
任務4　一　血細胞　一　死活　小　大
【考向分類·對點落實】
1．解析：該實驗中，至少要涂布3個平板，選擇菌落數在30～300的平板進行計數，求平均值，A正確；沒有設置重復組，結果不具有說服力，B錯誤；設置對照實驗的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度，C正確；統計某一稀釋度的5個平板的菌落數依次為M1、M2、M3、M4、M5，首先選擇菌落數在30～300的平板進行計數，然后求平均值，D錯誤。
答案：BD
2．解析：(1)本實驗目的是分離能在Fe2＋污染的土壤環境下生存的希瓦氏菌，所以在培養基中添加含高濃度Fe2＋的溶液，這屬于選擇培養基。(2)取多個稀釋倍數的土壤樣品液0.1 mL分別接種到多個平板上，這樣做的目的是獲得菌落數量合適的平板，排除偶然因素造成的誤差；每克土壤樣品中的希瓦氏菌的數目為×105＝1.69×108(個)。(3)第一劃線區域上都不間斷地長滿了菌落，第二劃線區域上幾乎無菌落，可能是因為接種環灼燒后未冷卻就劃線(將菌種全部殺死)、未從第一區域末端開始劃線(未接種菌種)。(4)活細胞都需要ATP提供能量且含量穩定，所以可以采用測定ATP含量的方法估算希瓦氏菌數；由于死的細菌不能產生ATP，顯微鏡直接計數統計中包括死細胞和活細胞，所以該方法得到的希瓦氏菌數目少。
答案：(1)含高濃度Fe2＋的溶液　選擇　(2)獲得菌落數量合適的平板，排除偶然因素造成的誤差　1.69×108　(3)接種環灼燒后未冷卻就劃線；未從第一區域末端開始劃線　(4)活細胞都能產生ATP且含量穩定，因此可用于估算數目　少　顯微鏡直接計數統計中包括死細胞和活細胞
3．解析：(1)為了確定培養基的滅菌是否合格，應通過隨機取若干滅菌后的空白平板培養一段時間，觀察培養基上是否有菌落生長，用來進行對照。三個培養基上平均菌落數為38，所以每升水樣中活菌數為38×10×100×1 000＝3.8×107。(2)接種環應用灼燒法進行滅菌。在第二次及以后劃線時，總是從上一次的末端開始劃線，這樣做的目的是：隨著劃線次數的增加，使每次劃線時菌體的數目逐漸減少，以便得到單個菌落。(3)A表示平板劃線法接種培養后得到的結果，B表示稀釋涂布平板法接種培養后得到的結果。
答案：(1)檢測培養基平板滅菌是否合格　3.8×107
(2)灼燒　將聚集的菌體逐步稀釋以便獲得單個菌落
(3)B　(4)溶解氧(氧氣)　營養物質
4．解析：由菌落的分布情況可知，將大腸桿菌接種到甲培養皿的方法為稀釋涂布平板法，A錯誤；根據甲、丙兩種培養基中菌落位置可知，甲中的菌種在丙培養基中均能生長，再結合乙培養基中菌落的生長情況，可推測甲培養基和丙培養基都添加了某種特殊物質，B正確；乙培養皿中不能生長的為所需的營養缺陷型菌株，C錯誤；甲中的部分大腸桿菌發生了基因突變，不可能發生染色體變異，因為大腸桿菌不含染色體，D錯誤。
答案：B
5．解析：培養基中的淀粉能為微生物提供碳源，不能提供氮源，A錯誤；能夠水解淀粉的微生物不一定是同一種微生物，B錯誤；據圖分析可知，兩個菌落均產生了透明圈，說明兩個菌落中的微生物均能將淀粉酶分泌至細胞外，C正確；透明圈直徑與菌落直徑的比值越大，微生物分解淀粉能力越強，該值的大小反映了兩個菌落中的微生物分解淀粉能力的差異，D正確。
答案：CD
6．解析：(1)培養基常用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌。倒平板操作時，應在酒精燈的火焰附近進行。(2)制成1∶10的樣品液時，先將酸奶樣品充分搖勻，用無菌吸管吸取樣品25 mL放入裝有225 mL無菌水錐形瓶中，充分振蕩。(3)培養一段時間后，從MRS固體培養基上挑多個單菌落，使用平板劃線法接種于MC瓊脂平板或MRS瓊脂平板上；乳酸菌是厭氧菌，因此應該置于36±1 ℃厭氧條件下倒置培養48 h后，再挑取單個菌落進行菌種鑒定。(4)菌種鑒定后將其接種至MRS液體培養基的目的是擴大培養，增加菌種數目。長期保藏菌種可采用甘油管藏法。
答案：(1)高壓蒸汽滅菌　酒精燈的火焰　 (2)25　(3)平板劃線　厭氧　(4)擴大培養，增加菌種數目　甘油管藏
課堂總結　網絡聚焦大概念
網絡建構提升
①平板劃線　②稀釋涂布平板　③分離　④計數　⑤纖維素分解菌
歷屆真題　分類集訓培素養
1．解析：利用尿素固體培養基篩選尿素分解菌時，尿素固體培養基并不直接殺死其他微生物，而是其他微生物不能以尿素為氮源，無法在尿素固體培養基中存活，A錯誤；不同的微生物生長所需的最適pH不同，如細菌適宜生活在中性偏堿環境，霉菌適宜生活在中性偏酸環境，因此配制培養基時應根據微生物的種類調整培養基的pH，B正確；利用糯米釀酒需要先進行糖化，酵母菌不能直接利用淀粉進行發酵，C正確；醋化醋桿菌的發酵底物為一定濃度的酒—水混合物，適宜濃度的酒精可使醋化醋桿菌活化，D正確。
答案：A
2．解析：(1)在用纖維素作為唯一碳源的培養基中，纖維素分解菌能夠很好地生長，其他微生物則不能生長。為篩選纖維素分解菌，將大熊貓新鮮糞便樣品稀釋液接種至以纖維素為唯一碳源的固體培養基上進行培養；培養基從功能上分類可分為選擇培養基和鑒別培養基，故該培養基從功能上分類屬于選擇培養基。(2)配制的培養基常用高壓蒸汽滅菌，即將培養基置于壓力100 kPa、溫度121 ℃條件下維持15～30分鐘，目的是為了殺死培養基中的所有微生物(微生物和芽孢、孢子)。為檢測滅菌效果可對培養基進行空白培養，即將未接種的培養基在適宜條件下培養一段時間，若在適宜條件下培養無菌落出現，說明培養基滅菌徹底，否則說明培養基滅菌不徹底。(3)為測定大熊貓新鮮糞便中纖維素分解菌活菌數，常采用稀釋涂布平板法，在適宜的條件下對大熊貓新鮮糞便中纖維素分解菌進行純化并計數時，對照組應該涂布等量的無菌水。將大熊貓新鮮糞便樣液稀釋適當倍數后，取0.1 mL涂布到若干個平板(每個稀釋度至少涂布三個平板)，對菌落數在30～300的平板進行計數，則可根據公式推測大熊貓新鮮糞便中纖維素分解菌活菌數。(4)測定酶活力時可以用單位時間內、單位體積中反應物的減少量或產物的增加量來表示。由表格可知，在適宜的條件下，C菌株在相同的溫度和時間下，秸稈失重最多，纖維素降解率最大，說明該菌株的纖維素分解菌產生的纖維素酶活力最大。
答案：(1)纖維素　選擇　(2)為了殺死培養基中的所有微生物(微生物和芽孢、孢子)　不接種培養(或空白培養)　(3)將大熊貓新鮮糞便樣液稀釋適當倍數后，取0.1 mL涂布到若干個平板(每個稀釋度至少涂布三個平板)，對菌落數在30～300的平板進行計數，則可根據公式推測大熊貓新鮮糞便中纖維素分解菌活菌數　(4)C　接種C菌株后秸稈失重最多，纖維素降解率最大
3．解析：(1)涂布器一般用干熱滅菌法或灼燒滅菌法進行滅菌。(2)99 mL無菌水中加入1.0 g土壤制成的菌懸液為100 mL，取稀釋10倍后的菌懸液0.1 mL涂布平板，平板上的平均菌落數為46，則每克土壤約含酵母菌46×100×10÷0.1＝4.6×105(個)。(3)輻射可以提高基因突變的頻率，利用射線輻照進行的育種為誘變育種。本實驗的目的是篩選產脂肪酶的菌株，所用的培養基應該以脂肪(或油脂)為唯一碳源；最終形成的菌落直徑越大，形成該菌落的菌株分解脂肪(或油脂)的能力越強，生產脂肪酶的能力也越大。(4)由圖可知，相對于菌株A，菌株B的增殖速度更快，降解脂肪的能力更強。根據題干信息“在處理含油廢水的同時，可獲得單細胞蛋白”可進一步推知菌株B處理含油廢水時可得到更多的單細胞蛋白，故菌株B更適合作為后續研究的材料。
答案：(1)④　(2)梯度稀釋　4.6×105(或460 000)　(3)誘變　脂肪(或油脂)　較大　(4)B　該菌株增殖速度快，單細胞蛋白產量高；降解脂肪能力強，凈化效果好
4．解析：(1)實驗時，盛有水或培養基的搖瓶常采用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌。題圖中搖瓶M內裝有液體培養基甲，培養皿中的培養基乙為固體培養基，相比甲需添加凝固劑Y為瓊脂。依據題干信息，甲、乙培養基均為以S(一種含有C、H、N的有機物)為唯一氮源和碳源的培養基，可抑制或阻止其他微生物繁殖，僅使能夠降解和利用S的菌株生長和繁殖，故屬于選擇培養基。(2)若使平板上長出的菌落數不超過200個，則接種液中的菌體濃度至多為200個/0.1 mL＝2×103個/mL，已知搖瓶M中的細菌細胞數為2×107個/mL，則至少應將搖瓶M中的菌液稀釋104倍。(3)S作為一種營養物質，在培養基中濃度過高，可導致培養液滲透壓升高，細菌細胞滲透失水，使其代謝速率下降；另一方面S作為污染物，其濃度過高可能抑制菌體生長、代謝和繁殖。(4)若要測定淤泥中能降解S的細菌細胞數，需進行的實驗步驟如下：稱取一定質量(10 g)的淤泥溶于一定體積的(90 mL)無菌水中，制備土壤浸出液，經梯度稀釋(對于細菌，一般選用104、105、106倍的稀釋液)后，采用稀釋涂布平板法接種于以S為唯一碳源和氮源的固體培養基(即乙培養基)中，每個稀釋倍數下設置三組重復實驗；在適宜條件下培養，待長出菌落且菌落數目達到穩定后，選取菌落數在30～300的平板進行計數，統計并計算平均值。(5)在甲、乙兩種培養基中，S既作為碳源，又作為氮源，同時培養基中還含有水、無機鹽等營養物質。
答案：(1)高壓蒸汽滅菌　瓊脂　選擇　(2)104　(3)S的濃度超過某一值時會抑制菌株的生長　(4)取淤泥加入無菌水中，涂布(或稀釋涂布)到乙培養基上，培養后計數　(5)水、碳源、氮源和無機鹽
5．解析：(1)在Ⅰ號培養基中，牛肉膏、蛋白胨可以為微生物提供氮源，Ⅱ、Ⅲ號培養基中為微生物提供碳源的是有機物X。(2)Ⅱ號培養基中，碳源只有X，不能降解X的細菌會因缺乏碳源而不能增殖，使該類細菌比例降低。(3)利用固體培養基對菌落進行計數時，需采用稀釋涂布平板法進行接種。(4)在有氧條件下，丙酮酸可被分解為CO2和H2O且釋放能量，為該菌的生長提供能量和合成其他物質的原料。
答案：(1)牛肉膏、蛋白胨　X　(2)下降　不能降解X的細菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的細菌能夠增殖　(3)稀釋涂布平板法　(4)能量　合成其他物質的原料
6．解析：(1)要從土壤中分離能降解W的細菌，培養基中應以W為唯一氮源。(2)乙菌落周圍出現透明圈，說明乙菌能降解W。(3)要判斷甲、乙能否利用空氣中的氮氣作為氮源，應將甲、乙菌分別接種在無氮源的培養基上，觀察細菌能否生長，若細菌能生長，則說明該細菌能利用空氣中的氮氣作為氮源，否則不能。(4)①實驗設計應遵循單一變量原則，C處應滴加等量不含酶的緩沖液。②C處只滴加等量緩沖液，若C處沒有出現透明圈，則說明緩沖液不能降解W；若A、B處形成的透明圈直徑大小相近，說明酶E與天然酶降解W的能力相近。
答案：(1)W　(2)乙　乙菌落周圍出現透明圈，說明乙菌能降解W　(3)將甲、乙菌分別接種在無氮源培養基上，若細菌能生長，則說明該細菌能利用空氣中的氮氣作為氮源
(4)①緩沖液　②緩沖液不能降解W　酶E與天然酶降解W的能力相近

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