資源簡介

中小學(xué)教育資源及組卷應(yīng)用平臺
新人教生物一輪復(fù)習(xí)課堂互動探究案
12-6　 基因工程及生物技術(shù)的安全性與倫理問題
考點一　基因工程的概念及操作工具
任務(wù)驅(qū)動·探究突破
任務(wù)1　完善基因工程的理論基礎(chǔ)
任務(wù)2　與DNA有關(guān)的酶的比較
名稱 作用部位 作用底物 作用結(jié)果
限制酶 ________ DNA 將DNA切成兩個片段
DNA連接酶 ________ DNA片段 將兩個DNA片段連接為一個DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯鍵 ________ 將單個脫氧核苷酸依次連接到DNA單鏈末端
DNA酶 ________ DNA 將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸
解旋酶 堿基對之間的氫鍵 ________ 將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈
RNA聚合酶 ________ 核糖核苷酸 將單個核糖核苷酸依次連接到RNA單鏈末端
　正確認(rèn)識限制酶
①限制酶是一類酶，而不是一種酶。
②將一個基因從DNA分子上切割下來，需要切兩處，同時產(chǎn)生四個黏性末端或平末端。
③不同DNA分子用同一種限制酶切割，產(chǎn)生的末端都相同，同一個DNA分子用不同的限制酶切割，產(chǎn)生的末端一般不相同。
④限制酶切割位點應(yīng)位于標(biāo)記基因之外，不能破壞標(biāo)記基因，以便進行檢測。
⑤限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾。
[名師提醒]　選擇限制酶的注意事項
(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點來確定限制酶的種類
①應(yīng)選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。
②不能選擇切點位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。
③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點)。
(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點來確定限制酶的種類
①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶相一致，以確保具有相同的黏性末端。
②質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中限制酶Sma Ⅰ會破壞標(biāo)記基因。如果所選酶的切點不止一個，則切割重組后可能會丟失某些片段，若丟失的片段含復(fù)制原點，則切割重組后的片段進入受體細胞后將不能自主復(fù)制。
任務(wù)3　明確載體上標(biāo)記基因的標(biāo)記原理
載體上的標(biāo)記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細胞沒有抵抗相關(guān)抗生素的能力。當(dāng)含有抗生素抗性基因的載體進入受體細胞后，抗性基因在受體細胞內(nèi)表達，使受體細胞能夠抵抗相應(yīng)抗生素，所以在受體細胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可以只保留轉(zhuǎn)入載體的受體細胞，原理如圖所示：
　基因載體與膜載體的區(qū)別
基因工程中的載體是DNA分子，能將目的基因?qū)胧荏w細胞內(nèi)，它能在宿主細胞內(nèi)穩(wěn)定存在，并可對目的基因進行大量復(fù)制；膜載體是蛋白質(zhì)，與細胞膜的通透性有關(guān)。
考向分類·對點落實
考向一 基因工程操作工具的基礎(chǔ)考查
1.(不定項選擇)用Xho Ⅰ和Sal Ⅰ兩種限制性內(nèi)切核酸酶分別處理同一DNA片段，酶切位點及酶切產(chǎn)物分離結(jié)果如圖。以下敘述正確的是(　　)
A．圖1中兩種酶識別的核苷酸序列不同
B．圖2中酶切產(chǎn)物可用于構(gòu)建重組DNA
C．泳道①中是用SalⅠ處理得到的酶切產(chǎn)物
D．圖中被酶切的DNA片段是單鏈DNA
2．[經(jīng)典模擬]如圖為DNA分子在不同酶的作用下所發(fā)生的變化，圖中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、解旋酶作用的正確順序是(　　)
A.①②③④　　 B．①②④③
C．①④②③ D．①④③②
3．[2022·江蘇省東臺中學(xué)高三檢測]“工欲善其事，必先利其器”。限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)為DNA切割、連接、功能基因的獲得以及表達載體的構(gòu)建創(chuàng)造了條件，下列關(guān)于限制性內(nèi)切核酸酶和DNA連接酶的敘述，正確的是(　　)
A．兩者都是從原核生物中分離純化出來的
B．兩者的催化都會導(dǎo)致磷酸二酯鍵數(shù)目的改變
C．限制性內(nèi)切核酸酶都能在特定位點切割產(chǎn)生黏性末端
D．T4 DNA連接酶只能連接雙鏈DNA片段互補的黏性末端
4．[經(jīng)典模擬]已知一雙鏈DNA分子，用限制酶Ⅰ切割得到長度為120 kb(kb：千堿基對)片段；用限制酶Ⅱ切割得到40 kb和80 kb兩個片段；同時用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割時，得到10 kb、80 kb和30 kb 3個片段。據(jù)此分析該雙鏈DNA分子結(jié)構(gòu)及酶切位點情況為(　　)
5. (不定項選擇)下列關(guān)于載體的敘述中，正確的是(　　)
A．載體與目的基因結(jié)合后，實質(zhì)上就是一個重組DNA分子
B．對某種限制酶而言，載體最好只有一個切點，但還要有其他多種酶的切點
C．目前常用的載體有質(zhì)粒、λ噬菌體的衍生物和動植物病毒
D．載體具有某些標(biāo)記基因，便于對其進行切割
6．(不定項選擇)近年誕生的 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可進行基因定點編輯。 CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要包括Cas9(限制性內(nèi)切核酸酶)和向?qū)NA，其原理是由向?qū)NA引導(dǎo)Cas9到一個特定的基因位點進行切割(上述過程見下圖)。下列相關(guān)敘述不正確的是(　　)
A．CRISPR/Cas9的組成物質(zhì)是在核糖體上合成的
B.向?qū)NA的合成需要逆轉(zhuǎn)錄酶的參與
C．基因的定點編輯過程只涉及堿基A—U，G—C的互補配對
D．切割后形成的每個DNA片段均含有兩個游離的磷酸基團
考向二 基因工程操作工具的綜合考查
7.[2022·湖北高三模擬]大米的鐵含量極低，科研人員通過基因工程、植物組織培養(yǎng)等現(xiàn)代生物技術(shù)，培育出了鐵含量比普通大米高60%的轉(zhuǎn)基因水稻，改良了稻米的營養(yǎng)品質(zhì)。下圖為培育轉(zhuǎn)基因水稻過程示意圖，其中①～⑥為過程，EcoRⅠ、Hind Ⅲ、BamHⅠ為限制酶。
(1)該轉(zhuǎn)基因水稻培育過程中選取目的基因用到的限制酶是____________。這么操作的優(yōu)點是________________________。(回答3點)
(2)PCR是獲取大量目的基因的一種方法，反應(yīng)體系的成分中有兩種引物，對兩種引物的設(shè)計要求之一是：兩種引物之間不能堿基互補配對，試分析原因________________________________；下圖展示了用PCR技術(shù)從DNA分子中獲取鐵合蛋白基因的過程，A、B、C、D是四種引物，選擇圖中的________引物通過PCR三次循環(huán)就可將鐵合蛋白基因分離出來。
(3)圖中④⑤⑥過程，屬于________________技術(shù)，制備的培養(yǎng)基是由無機營養(yǎng)成分、有機營養(yǎng)成分、________________四部分組成。
考點二　基因工程的基本操作程序及應(yīng)用
任務(wù)驅(qū)動·探究突破
任務(wù)1　結(jié)合抗蟲棉的培育過程圖填空
(1)從圖中可以看出，目的基因是________________，使用的載體是________，將目的基因表達載體導(dǎo)入受體細胞的方法是________________。
(2)請寫出兩種檢測目的基因是否表達的方法：________________________________。
任務(wù)2　觀察基因工程的操作過程，分析每一步驟的操作程序
　基因工程操作的四個易錯點
(1)目的基因的插入位點不是隨意的，基因表達需要啟動子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入啟動子與終止子之間的部位。
(2)基因工程操作過程中只有第三步(將目的基因?qū)胧荏w細胞)沒有堿基互補配對現(xiàn)象。
(3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法原理：農(nóng)桿菌易感染雙子葉或裸子植物的細胞，并將其Ti質(zhì)粒上的T DNA轉(zhuǎn)移并整合到受體細胞染色體DNA上。
(4)啟動子≠起始密碼子，終止子≠終止密碼子
啟動子和終止子位于DNA片段上，分別控制轉(zhuǎn)錄過程的啟動和終止；起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，分別控制翻譯過程的啟動和終止。
任務(wù)3　目的基因的檢測和鑒定
任務(wù)4　完善基因工程的應(yīng)用
技術(shù)名稱 應(yīng)用
植物基 因工程 培育轉(zhuǎn)基因抗蟲植物、轉(zhuǎn)基因抗病植物和轉(zhuǎn)基因________植物，利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)
動物基 因工程 提高動物生長速率，改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)，用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)________，用轉(zhuǎn)基因動物作____________的供體
基因治療 把____________導(dǎo)入病人體內(nèi)，使其表達產(chǎn)物發(fā)揮作用，從而治療疾病，分為體內(nèi)基因治療和體外基因治療
考向分類·對點落實
考向一 對基因工程的操作程序的考查
1.為使玉米獲得抗除草劑性狀， 需進行如圖所示的操作。報告基因的產(chǎn)物能催化無色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍色。轉(zhuǎn)化過程中，愈傷組織表面常殘留農(nóng)桿菌，導(dǎo)致未轉(zhuǎn)化的愈傷組織也可能在選擇培養(yǎng)基上生長。下列敘述不正確的是(　　)
A．篩選1需要用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選出成功導(dǎo)入表達載體的農(nóng)桿菌
B．篩選2需要用無色物質(zhì)K處理愈傷組織并篩選出呈現(xiàn)藍色的組織
C．為使除草劑抗性基因G在農(nóng)桿菌中高效表達，需要把目的基因片段插入到表達載體的復(fù)制原點和啟動子之間
D．為從個體水平上檢測圖中玉米植株A是否具有抗除草劑性狀，可采用的方法是用相應(yīng)除草劑噴灑待測玉米植株
2．[經(jīng)典模擬]如圖表示用化學(xué)方法合成目的基因Ⅰ的過程。據(jù)圖分析，下列敘述正確的是(　　)
A．過程①需要DNA連接酶
B．過程②需要限制性內(nèi)切核酸酶
C．目的基因Ⅰ的堿基序列是已知的
D．若某質(zhì)粒能與目的基因Ⅰ重組，則該質(zhì)粒和目的基因Ⅰ的堿基序列相同
3. (不定項選擇)甲基對硫磷是常見的農(nóng)藥污染物。科研人員嘗試改造并分離得到能夠降解甲基對硫磷的微生物。下列操作中必需的是(　　)
A．構(gòu)建含有甲基對硫磷分解酶基因的表達載體
B．將甲基對硫磷分解酶基因表達載體導(dǎo)入受體菌
C.用甲基對硫磷為唯一碳源的培養(yǎng)基選擇所需工程菌
D．提取工程菌的質(zhì)粒并檢測甲基對硫磷基因的含量
考向二 基因工程的綜合考查
4.[2022·重慶市江津中學(xué)高三模擬]黃萎病是危害棉花種植的常見疾病，科學(xué)家通過基因工程技術(shù)將抗黃萎病基因——葡萄糖氧化酶基因(GO)導(dǎo)入棉花，獲得抗黃萎病棉花。已知T DNA上的基因在農(nóng)桿菌中不表達，在植物細胞中可以表達，請將轉(zhuǎn)基因棉花培育步驟補充完整：
(1)構(gòu)建上圖所示重組Ti質(zhì)粒，用________處理農(nóng)桿菌，使重組Ti質(zhì)粒進入農(nóng)桿菌中，將農(nóng)桿菌接種到含________的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)適宜時間后，離心，去除上清液，加入適量MS液體培養(yǎng)基，可通過測定菌液在600 nm波長處的OD值來確定農(nóng)桿菌密度是否適宜。
(2)切取經(jīng)________培養(yǎng)的棉花幼苗的下胚軸，直接轉(zhuǎn)入菌液中侵染5～10 min后，倒出菌液，用滅菌濾紙吸取下胚軸表面多余菌液，將下胚軸放入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天。2天后，向培養(yǎng)基中加入適量________和青霉素，其目的是篩選出轉(zhuǎn)化成功的棉花細胞和________________。
(3)將所得愈傷組織接種到適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)形成胚狀體，在適宜人工條件下繼續(xù)發(fā)育成棉花幼苗。利用____________技術(shù)檢測棉花細胞是否合成____________，選出抗黃萎病棉花。通過____________可以從個體水平上鑒定該棉花對黃萎病的抗性。
5．[2022·山東省濰坊市高三模擬]番茄果實后熟問題是影響番茄生產(chǎn)、加工和運輸?shù)碾y題。ACC合成酶(控制其合成的基因在細胞核中)是番茄細胞合成乙烯的關(guān)鍵酶，科學(xué)家利用反義基因技術(shù)培育出了耐儲存、利于長途運輸?shù)姆研缕贩N，具體做法是采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將攜帶有反義ACC合成酶基因的重組質(zhì)粒M導(dǎo)入番茄栽培品種中，經(jīng)過卡那霉素篩選后，獲得番茄新品種。反義基因是指人工合成出一段與某種基因堿基序列相同的DNA。經(jīng)過人為操作使之在轉(zhuǎn)錄生成mRNA時，模板鏈與原基因不同。
(1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法適用的植物種類是______________；重組質(zhì)粒M中的抗性基因是________________________________________________________________________。
(2)有同學(xué)提出若要提取番茄中控制ACC合成酶的基因，只能利用成熟的番茄組織。你認(rèn)為他的說法是否有道理，作出判斷的依據(jù)是_______________________________。
(3)ACC合成酶基因在番茄細胞中表達的過程發(fā)生在細胞內(nèi)的________________中；反義ACC合成酶基因轉(zhuǎn)錄啟動后，檢測發(fā)現(xiàn)番茄果實中乙烯含量顯著降低，推測其機理最可能是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
考向三 基因工程的應(yīng)用
6.[天津卷]人血清白蛋白(HSA)具有重要的醫(yī)用價值，只能從人血漿中制備。下圖是以基因工程技術(shù)獲取重組HSA(rHSA)的兩條途徑：
(1)為獲取HSA基因，首先需采集人的血液，提取__________合成總cDNA，然后以cDNA為模板，使用PCR技術(shù)擴增HSA基因。圖中箭頭表示一條引物結(jié)合模板的位置及擴增方向，請用箭頭在方框內(nèi)標(biāo)出另一條引物的位置及擴增方向。
(2)啟動子通常具有物種及組織特異性，構(gòu)建在水稻胚乳細胞內(nèi)特異表達rHSA的載體，需要選擇的啟動子是__________(填寫字母，單選)。
A．人血細胞啟動子
B．水稻胚乳細胞啟動子
C．大腸桿菌啟動子
D．農(nóng)桿菌啟動子
(3)利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻受體細胞的過程中，需添加酚類物質(zhì)，其目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)人體合成的初始HSA多肽，需要經(jīng)過生物膜系統(tǒng)加工形成正確的空間結(jié)構(gòu)才能有活性。與途徑Ⅱ相比，選擇途徑Ⅰ獲取rHSA的優(yōu)勢是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(5)為證明rHSA具有醫(yī)用價值，須確認(rèn)rHSA與________的生物學(xué)功能一致。
考點三　DNA的粗提取與鑒定及PCR技術(shù)
任務(wù)驅(qū)動·探究突破
任務(wù)1　完善實驗原理
(1)DNA與蛋白質(zhì)在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同
溶解規(guī)律 2 mol/L NaCl溶液 0.14 mol/L NaCl溶液
DNA ________ ________
蛋白質(zhì) NaCl溶液物質(zhì)的量濃度從2 mol/L逐漸降低的過程中，溶解度逐漸________ 部分發(fā)生鹽析沉淀 ________
(2)DNA不溶于____________，但是細胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精，利用這一原理可將DNA與蛋白質(zhì)進一步分離。
(3)DNA與二苯胺在沸水浴加熱，呈____色。
任務(wù)2　實驗步驟
①稱取30 g洋蔥，切碎，加入10 mL研磨液，充分研磨。
②漏斗中墊________，將研磨液過濾到燒杯中，________ ℃處理，取上清液。
③在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的________溶液，靜置2～3 min，用玻璃棒沿同一方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去水分。
④取兩支20 mL的試管編號A、B，各加入2 mol/L的________溶液5 mL，將絲狀物溶于B試管的NaCl溶液中。然后向兩支試管中各加入4 mL的________。混勻后，將試管置于________中加熱5 min。
⑤結(jié)果觀察：A試管____________，B試管____________。
任務(wù)3　通過PCR技術(shù)(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴增DNA片段
(1)PCR原理：在一定的緩沖溶液中提供______，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種______，四種脫氧核苷酸，耐高溫的______，同時控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進行。
(2)PCR的反應(yīng)過程
①______：當(dāng)溫度上升到______以上時，雙鏈DNA解旋為單鏈，如下圖：
②______：系統(tǒng)溫度下降至______左右時，兩種______通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合，如下圖：
③______：當(dāng)系統(tǒng)溫度上升至72 ℃左右，溶液中的四種脫氧核苷酸(A、T、G、C)在________的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈，如下圖：
(3)結(jié)果
①PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為______、復(fù)性和______三步。
②兩引物間固定長度的DNA序列呈______擴增(即______)。
考向分類·對點落實
考向一 對DNA粗提取過程的考查
1.[江蘇卷](不定項選擇)圖1、2分別為“DNA的粗提取與鑒定”實驗中部分操作步驟示意圖，下列敘述正確的是(　　)
A．圖1、2中加入蒸餾水稀釋的目的相同
B．圖1中完成過濾之后保留濾液
C．圖2中完成過濾之后棄去濾液
D．在圖1雞血細胞液中加入少許嫩肉粉有助于去除雜質(zhì)
2．下列關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實驗敘述，錯誤的是(　　)
A．酵母和菜花均可作為提取DNA的材料
B．DNA既溶于2 mol/L NaCl溶液也溶于蒸餾水
C．過濾時用濾紙代替紗布效果更好
D．DNA溶液加入二苯胺試劑沸水浴加熱，冷卻后變藍
3．實驗中對DNA進行鑒定時，做如下操作：
　　試管 序號　　 A B
1 加2 mol/L的NaCl溶液5 mL 加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
2 不加 加入提取的DNA絲狀物并攪拌
3 加4 mL二苯胺，混勻 加4 mL二苯胺，混勻
4 沸水浴5分鐘 沸水浴5分鐘
實驗現(xiàn)象
實驗結(jié)論
(1)根據(jù)下圖，完成表格空白處的實驗內(nèi)容。
(2)對于B試管，完成1、2、3的操作后溶液顏色如何變化？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)在沸水浴中加熱的目的是_________________________________________________，
同時說明DNA對高溫有較強的________。
(4)A試管在實驗中的作用是________。
(5)B試管中溶液顏色的變化程度主要與________________________________有關(guān)。
考向二 對PCR技術(shù)的考查
4.目前廣泛應(yīng)用的新型冠狀病毒檢測方法是實時熒光RT－PCR技術(shù)。RT－PCR是將RNA逆轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U增反應(yīng)相結(jié)合的技術(shù)，具體過程如圖所示。下列說法錯誤的是(　　)
A．與該mRNA結(jié)合的引物，可以是A也可以是B
B.引物A與引物B的基本單位都是脫氧核苷酸
C．過程Ⅱ通過控制溫度的變化實現(xiàn)目標(biāo)序列的循環(huán)擴增
D．該反應(yīng)體系中應(yīng)加入逆轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶等物質(zhì)
5．熒光定量PCR技術(shù)可定量檢測樣本中某種DNA含量。其原理是在PCR體系中每加入一對引物的同時加入一個與某條模板鏈互補的熒光探針(探針是指以放射性同位素、生物素或熒光染料等進行標(biāo)記的已知核苷酸序列的核酸片段)，當(dāng)Taq DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處，會水解探針，使熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到熒光信號，即每擴增一次，就有一個熒光分子生成。下列相關(guān)敘述錯誤的是(　　)
A．引物與探針均具特異性，與模板結(jié)合時遵循堿基互補配對原則
B．反應(yīng)最終的熒光強度與起始狀態(tài)模板DNA含量呈正相關(guān)
C．若用cDNA(部分基因文庫)作模板，上述技術(shù)也可檢測某基因的轉(zhuǎn)錄水平
D．Taq DNA聚合酶催化DNA的合成方向總是從子鏈的3′端向5′端延伸
6．[2022·江蘇連云港市高三模擬]常用的PCR技術(shù)有實時熒光定量PCR、RT－PCR、重疊延伸PCR等，其中重疊延伸PCR技術(shù)是一種通過寡聚核苷酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板，通過多次PCR擴增，從而獲得目的基因的方法。該技術(shù)在擴增較長片段的DNA、不同來源的DNA片段拼接、基因的定點誘變等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。利用重疊延伸PCR技術(shù)進行定點突變可以實現(xiàn)對纖維素酶基因進行合理改造，其過程如圖所示。回答下列問題：
(1)PCR定點突變需要設(shè)計的引物是________________；②過程獲得突變產(chǎn)物AD，需要使用的引物是________________。
(2)在第一階段為獲得產(chǎn)物AB和產(chǎn)物CD，必須將引物a、b和引物c、d置于不同反應(yīng)系統(tǒng)中，這是因為____________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)新冠病毒常用“熒光RT－PCR技術(shù)”進行檢測。
①“熒光RT－PCR技術(shù)”所用的試劑盒中通常都應(yīng)該含有__________________________________、熒光標(biāo)記的核酸探針、引物、dNTP、緩沖體系。
②用________________向微量離心管中依次加入各組分，稍微進行________，使反應(yīng)液集中在微量離心管底部，將微量離心管放入PCR儀設(shè)計好PCR儀的循環(huán)程序，進行PCR反應(yīng)。
考向三 PCR技術(shù)的應(yīng)用
7.[2022·四省八校高三開學(xué)考試]用PCR技術(shù)將DNA分子中的A1片段進行擴增，實驗中設(shè)計了引物Ⅰ、Ⅱ，其連接部位如圖所示，X為某限制酶的識別序列。擴增后得到的絕大部分DNA片段是下圖中的(　　)
8．[2022·江蘇東臺中學(xué)高三檢測]某新型病毒是一種RNA病毒，醫(yī)務(wù)工作者利用PCR技術(shù)進行病毒檢測時，所使用的方法中合理的是(　　)
A．用細菌培養(yǎng)基直接培養(yǎng)被測試者體內(nèi)獲取的病毒樣本
B．分析該病毒的RNA序列是設(shè)計PCR引物的前提條件
C．PCR擴增過程需使用RNA聚合酶和耐高溫的DNA聚合酶
D．在恒溫條件下進行PCR擴增以避免溫度變化導(dǎo)致酶失活
9．(不定項選擇)SRY基因為Y染色體上的性別決定基因，可用SRY－PCR法鑒定胚胎性別，其基本程序如圖。相關(guān)說法不正確的是(　　)
A．PCR擴增的操作步驟依次是：高溫變性、中溫復(fù)性、低溫延伸
B．上述過程需要使用的工具酶之一是RNA聚合酶
C．PCR技術(shù)中以核糖核苷酸為原料，以指數(shù)方式擴增
D．SRY探針能與雄性胚胎樣品中DNA配對
考點四　蛋白質(zhì)工程、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的安全性及生物武器
任務(wù)驅(qū)動·探究突破
任務(wù)1　完善蛋白質(zhì)工程概念的相關(guān)填空
蛋白質(zhì)工程 具體內(nèi)容
別稱 第二代基因工程
目標(biāo) 獲得____________________的蛋白質(zhì)
原理 由于基因決定蛋白質(zhì)，因此要對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行改造，必須從________入手
手段 __________________，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)
關(guān)鍵技術(shù) ____________
基礎(chǔ) 蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系
結(jié)果 改造了現(xiàn)有蛋白質(zhì)或制造出____________
任務(wù)2　完善蛋白質(zhì)工程的操作過程
從預(yù)期的________________出發(fā)→設(shè)計預(yù)期的________________→推測應(yīng)有的________________→找到相對應(yīng)的____________________(基因)或合成新的基因→獲得所需要的蛋白質(zhì)。
任務(wù)3　完善轉(zhuǎn)基因技術(shù)的安全性的相關(guān)內(nèi)容
(1)安全性問題
①________安全：滯后效應(yīng)、________、營養(yǎng)成分改變等。
②生物安全：對______________的影響等。
③環(huán)境安全：對______________的影響等。
(2)理性看待轉(zhuǎn)基因技術(shù)
①需要正確的社會輿論導(dǎo)向：____________，不能因噎廢食。
②制定____________，最大程度保證轉(zhuǎn)基因技術(shù)和產(chǎn)品的安全性。
[名師提醒]　轉(zhuǎn)基因生物存在安全性問題的原因
(1)目前對基因的結(jié)構(gòu)、調(diào)控機制及基因間的相互作用了解有限。
(2)目的基因往往是異種生物的基因。
(3)外源基因插入宿主細胞基因組的部位往往是隨機的。
任務(wù)4　完善生物武器的相關(guān)內(nèi)容
生物武器的特點
①致病力強、________；②污染面廣、危害時間長；③難以防治；④具有一定的________；⑤受____________影響大。
任務(wù)5　蛋白質(zhì)工程與基因工程的區(qū)別和聯(lián)系
項目 蛋白質(zhì)工程 基因工程
區(qū) 別 過 程 預(yù)期蛋白質(zhì)的________→設(shè)計預(yù)期的蛋白質(zhì)________→推測應(yīng)有的氨基酸________→找到并改變相對應(yīng)的脫氧核苷酸________(基因)或合成新的基因→獲得所需要的蛋白質(zhì) ____________的篩選與獲取→______________的構(gòu)建→將目的基因?qū)隷_______→目的基因的____________
實 質(zhì) 定向改造或生產(chǎn)人類所需要的蛋白質(zhì) 定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的生物類型或生物產(chǎn)品
結(jié) 果 生產(chǎn)自然界中沒有的蛋白質(zhì) 生產(chǎn)自然界中已有的蛋白質(zhì)
聯(lián)系 蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上延伸出來的第二代基因工程，因為對現(xiàn)有蛋白質(zhì)的改造或制造新的蛋白質(zhì)，都必須通過____________________來實現(xiàn)
任務(wù)6　填寫蛋白質(zhì)工程流程圖中字母代表的含義
A.________，B.________，C.____________，
D.________________，E.____________。
考向分類·對點落實
考向一 對蛋白質(zhì)工程的考查
1.[2022·寧夏石嘴山三中高三月考]目前科學(xué)家們通過蛋白質(zhì)工程制造出了藍色熒光蛋白、黃色熒光蛋白等。采用蛋白質(zhì)工程技術(shù)制造出藍色熒光蛋白過程的正確順序是(　　)
①推測藍色熒光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸序列
②藍色熒光蛋白的功能分析和結(jié)構(gòu)設(shè)計序列
③藍色熒光蛋白基因的合成
④表達出藍色熒光蛋白
A．①②③④ B．②①③④
C．②③①④ D．④②①③
2．(不定項選擇)下圖表示蛋白質(zhì)工程的操作過程，相關(guān)說法正確的是(　　)
A．蛋白質(zhì)工程中對蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的了解是非常關(guān)鍵的工作
B．蛋白質(zhì)工程是完全擺脫基因工程技術(shù)的一項全新的生物工程技術(shù)
C．a(chǎn)、b過程分別是轉(zhuǎn)錄、翻譯
D．蛋白質(zhì)工程中可能構(gòu)建出一種全新的基因
3．[全國卷Ⅱ]已知生物體內(nèi)有一種蛋白質(zhì)(P)，該蛋白質(zhì)是一種轉(zhuǎn)運蛋白，由305個氨基酸組成。如果將P分子中158位的絲氨酸變成亮氨酸，240位的谷氨酰胺變成苯丙氨酸，改變后的蛋白質(zhì)(P1)不但保留P的功能，而且具有酶的催化活性。回答下列問題：
(1)從上述資料可知，若要改變蛋白質(zhì)的功能，可以考慮對蛋白質(zhì)的________________進行改造。
(2)以P基因序列為基礎(chǔ)，獲得P1基因的途徑有修飾________基因或合成________基因。所獲得的基因表達時是遵循中心法則的，中心法則的全部內(nèi)容包括____________________的復(fù)制；以及遺傳信息在不同分子之間的流動，即：____________________。
(3)蛋白質(zhì)工程也被稱為第二代基因工程，其基本途徑是從預(yù)期蛋白質(zhì)功能出發(fā)，通過__________________和__________________進而確定相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列，據(jù)此獲得基因，再經(jīng)表達、純化獲得蛋白質(zhì)，之后還需要對蛋白質(zhì)的生物____________進行鑒定。
考向二 轉(zhuǎn)基因技術(shù)安全性的考查
4.(不定項選擇)下列關(guān)于轉(zhuǎn)基因生物安全性的敘述中，正確的是(　　)
A．我國已經(jīng)對轉(zhuǎn)基因食品和轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品強制實施了產(chǎn)品標(biāo)識制度
B．國際上大多數(shù)國家都在轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)簽上警示性注明可能的危害
C．開展風(fēng)險評估、預(yù)警跟蹤和風(fēng)險管理是保障轉(zhuǎn)基因生物安全的前提
D．目前對轉(zhuǎn)基因生物安全性的爭論主要集中在食用安全性和環(huán)境安全性上
5．病毒疫苗的研制是現(xiàn)代生物技術(shù)應(yīng)用最廣泛的領(lǐng)域，現(xiàn)在研發(fā)的第二、三代病毒疫苗都基于DNA重組技術(shù)而建立。請分析并回答下列問題：
(1)第二代疫苗是以編碼病毒抗原蛋白的RNA為模板，經(jīng)__________酶的作用而獲得目的基因，再利用____________________這些工具酶來構(gòu)建重組質(zhì)粒。形成的重組質(zhì)粒與經(jīng)過____________________處理的大腸桿菌細胞混合可轉(zhuǎn)化大腸桿菌，再擴增大腸桿菌以獲得大量的抗原蛋白。
(2)在構(gòu)建好的重組質(zhì)粒中，引導(dǎo)目的基因表達的序列是__________，它是__________的識別和結(jié)合位點。
(3)第三代疫苗即“DNA疫苗”，是將編碼某種抗原蛋白的DNA注射到動物體內(nèi)，該DNA可在生物體內(nèi)______________出相應(yīng)的抗原蛋白。
(4)現(xiàn)代對于基因工程產(chǎn)品安全性的爭論越來越激烈，轉(zhuǎn)基因生物的安全性主要體現(xiàn)在__________、__________、__________三個方面。
[網(wǎng)絡(luò)建構(gòu)提升]
[長句應(yīng)答必備]
1．限制酶具有特異性，即一種限制酶只能識別特定的核苷酸序列，并在特定的位點上切割DNA分子。
2．DNA連接酶的作用部位是磷酸二酯鍵。
3．質(zhì)粒是常用的載體，它是一種小型的雙鏈環(huán)狀DNA分子，具有一個至多個限制酶切割位點及標(biāo)記基因。
4．基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。
5．目的基因?qū)胫参锛毎Ｓ棉r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；導(dǎo)入動物細胞常用顯微注射法，導(dǎo)入微生物細胞常用感受態(tài)細胞法。
[等級選考研考向]
1．[2021·廣東卷]非細胞合成技術(shù)是一種運用合成生物學(xué)方法，在細胞外構(gòu)建多酶催化體系，獲得目標(biāo)產(chǎn)物的新技術(shù)，其核心是各種酶基因的挖掘、表達等。中國科學(xué)家設(shè)計了4步酶促反應(yīng)的非細胞合成路線(如圖)，可直接用淀粉生產(chǎn)肌醇(重要的醫(yī)藥食品原料)，以期解決高溫強酸水解方法造成的嚴(yán)重污染問題，并可以提高產(chǎn)率。
回答下列問題：
(1)研究人員采用PCR技術(shù)從土壤微生物基因組中擴增得到目標(biāo)酶基因。此外，獲得酶基因的方法還有____________________________________。(答出兩種即可)
(2)高質(zhì)量的DNA模板是成功擴增出目的基因的前提條件之一。在制備高質(zhì)量DNA模板時必須除去蛋白，方法有______________________。(答出兩種即可)
(3)研究人員使用大腸桿菌BL21作為受體細胞、pET20b為表達載體分別進行4種酶的表達。表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌時，首先應(yīng)制備__________細胞。為了檢測目的基因是否成功表達出酶蛋白，需要采用的方法有______________________________。
(4)依圖所示流程，在一定的溫度、pH等條件下，將4種酶與可溶性淀粉溶液混合組成一個反應(yīng)體系。若這些酶最適反應(yīng)條件不同，可能導(dǎo)致的結(jié)果是______________________。在分子水平上，可以通過改變____________，從而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)對酶特性的改造和優(yōu)化。
2．[2021·河北卷]采礦污染和不當(dāng)使用化肥導(dǎo)致重金屬鎘(Cd)在土壤中過量積累。利用植物修復(fù)技術(shù)將土壤中的Cd富集到植物體內(nèi)，進行后續(xù)處理(例如，收集植物組織器官異地妥善儲存)，可降低土壤中Cd的含量。為提高植物對Cd污染土壤的修復(fù)能力，研究者將酵母液泡Cd轉(zhuǎn)運蛋白(YCF1)基因?qū)胧茉囍参铮z測了相關(guān)指標(biāo)。回答下列問題：
(1)為獲取YCF1基因，將酵母細胞的全部DNA提取、切割后與載體連接，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，這個群體稱為__________________。
(2)將DNA序列插入Ti質(zhì)粒構(gòu)建重組載體時，所需要的兩種酶是__________________。構(gòu)建的重組基因表達載體中必須含有標(biāo)記基因，其作用是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)進行前期研究時，將含有YCF1基因的重組載體導(dǎo)入受試雙子葉植物印度芥菜，采用最多的方法是__________。研究者進一步獲得了轉(zhuǎn)YCF1基因的不育楊樹株系，采用不育株系作為實驗材料的目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)將長勢一致的野生型和轉(zhuǎn)基因楊樹苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后測定植株干重(圖1)及不同器官中Cd含量(圖2)。據(jù)圖1可知，與野生型比，轉(zhuǎn)基因植株對Cd具有更強的__________(填“耐性”或“富集能力”)；據(jù)圖2可知，對轉(zhuǎn)基因植株的__________進行后續(xù)處理對于緩解土壤Cd污染最為方便有效。
(5)已知YCF1特異定位于轉(zhuǎn)基因植物細胞的液泡膜上。據(jù)此分析，轉(zhuǎn)基因楊樹比野生型能更好地適應(yīng)高Cd環(huán)境的原因是________________________________。相較于草本植物，采用楊樹這種喬木作為Cd污染土壤修復(fù)植物的優(yōu)勢在于__________________________________(寫出兩點即可)。
3．[2020·江蘇卷]如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如圖(以EcoR Ⅰ酶切為例)：
請據(jù)圖回答問題：
(1)步驟Ⅰ用的EcoRⅠ是一種______________酶，它通過識別特定的______________切割特定位點。
(2)步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′－羥基與5′－磷酸間形成________；PCR循環(huán)中，升溫到95℃是為了獲得__________；Taq DNA聚合酶的作用是催化
________________________________________________________________________。
(3)若如表所列為已知的DNA序列和設(shè)計的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是________(從引物①②③④中選擇，填編號)。
DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)
已知 序列
PCR 引物 ①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′ ②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′ ③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′ ④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
(4)對PCR產(chǎn)物測序，經(jīng)分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列)，結(jié)果正確的是________。
4．[2020·山東卷]水稻胚乳中含直鏈淀粉和支鏈淀粉，直鏈淀粉所占比例越小糯性越強。科研人員將能表達出基因編輯系統(tǒng)的DNA序列轉(zhuǎn)入水稻，實現(xiàn)了對直鏈淀粉合成酶基因(Wx基因)啟動子序列的定點編輯，從而獲得了3個突變品系。
(1)將能表達出基因編輯系統(tǒng)的DNA序列插入Ti質(zhì)粒構(gòu)建重組載體時，所需的酶是__________________________________，重組載體進入水稻細胞并在細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程稱為________。
(2)根據(jù)啟動子的作用推測，Wx基因啟動子序列的改變影響了________________________，從而改變了Wx基因的轉(zhuǎn)錄水平。與野生型水稻相比，3個突變品系中Wx基因控制合成的直鏈淀粉合成酶的氨基酸序列________(填“發(fā)生”或“不發(fā)生”)改變，原因是________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)為檢測啟動子變化對Wx基因表達的影響，科研人員需要檢測Wx基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA(Wx mRNA)的量。檢測時分別提取各品系胚乳中的總RNA，經(jīng)________過程獲得總cDNA。通過PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性地擴增出Wx基因的cDNA，原因是
________________________________________________________________________。
(4)各品系Wx mRNA量的檢測結(jié)果如圖所示，據(jù)圖推測糯性最強的品系為__________，原因是________________________________________________________________________。
[國考真題研規(guī)律]
5．[2021·全國甲卷]PCR技術(shù)可用于臨床的病原菌檢測。為檢測病人是否感染了某種病原菌，醫(yī)生進行了相關(guān)操作：①分析PCR擴增結(jié)果；②從病人組織樣本中提取DNA；③利用PCR擴增DNA片段；④采集病人組織樣本。回答下列問題：
(1)若要得到正確的檢測結(jié)果，正確的操作順序應(yīng)該是______________(用數(shù)字序號表示)。
(2)操作③中使用的酶是________。PCR反應(yīng)中的每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、________三步，其中復(fù)性的結(jié)果是__________________________________________________。
(3)為了做出正確的診斷，PCR反應(yīng)所用的引物應(yīng)該能與________________特異性結(jié)合。
(4)PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)是指________________________________________________________________________
________。該技術(shù)目前被廣泛地應(yīng)用于疾病診斷等方面。
6．[2021·全國乙卷]用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點如圖所示。
回答下列問題：
(1)常用的DNA連接酶有E·coli DNA連接酶和T4 DNA連接酶。圖中________________________________________________________________________
酶切割后的DNA片段可以用E·coli DNA連接酶連接。圖中________________________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA連接酶連接。
(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是________。
(3)DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征。如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點，可以保證質(zhì)粒在受體細胞中能________；質(zhì)粒DNA分子上有________，便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細胞，方法是____________________________________________________。
(4)表達載體含有啟動子，啟動子是指__________________________________________
________________________________________________________________________。
7．[全國卷Ⅰ]基因工程中可以通過PCR技術(shù)擴增目的基因。回答下列問題。
(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以從基因文庫中獲得。基因文庫包括____________和____________。
(2)生物體細胞內(nèi)的DNA復(fù)制開始時，解開DNA雙鏈的酶是______________。在體外利用PCR技術(shù)擴增目的基因時，使反應(yīng)體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是__________。上述兩個解鏈過程的共同點是破壞了DNA雙鏈分子中的________。
(3)目前在PCR反應(yīng)中使用TaqDNA聚合酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是______________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
課堂互動探究案6
考點一
【任務(wù)驅(qū)動·探究突破】
任務(wù)2　磷酸二酯鍵　磷酸二酯鍵　脫氧核苷酸　磷酸二酯鍵　DNA　磷酸二酯鍵
【考向分類·對點落實】
1．解析：限制酶識別特定的核苷酸序列，不同的限制酶能識別不同的核苷酸序列，由電泳圖可知XhoⅠ和SalⅠ兩種酶分別切割時，識別的序列不同，A正確；同種限制酶切割出的DNA片段，具有相同的黏性末端，再用DNA連接酶進行連接，可以構(gòu)成重組DNA，B正確；SalⅠ將DNA片段切成4段，XhoⅠ將DNA片段切成3段，根據(jù)電泳結(jié)果可知泳道①為SalⅠ，泳道②為XhoⅠ，C正確；限制酶切割雙鏈DNA，酶切后的DNA片段仍然是雙鏈DNA為主，只在黏性末端出現(xiàn)部分單鏈，D錯誤。
答案：ABC
2．解析：限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂，形成黏性末端，因此該酶可作用于①；DNA聚合酶用于DNA分子的復(fù)制，能在單鏈上將一個個脫氧核苷酸連接起來，因此該酶可作用于④；DNA連接酶能在具有相同堿基末端的兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，因此該酶可作用于②；解旋酶能夠?qū)NA分子的雙螺旋解開，故作用于③。故選C。
答案：C
3．解析：限制性內(nèi)切核酸酶主要是從原核生物中分離純化出來的，A錯誤；限制性內(nèi)切核酸酶可以切割磷酸二酯鍵，DNA連接酶可以催化磷酸二酯鍵的形成，故兩者的催化都會導(dǎo)致磷酸二酯鍵數(shù)目的改變，B正確；限制性內(nèi)切核酸酶能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂，形成黏性末端或平末端，C錯誤；T4DNA連接酶既可以連接黏性末端，也可以連接平末端，但連接平末端時的效率比較低，D錯誤。
答案：B
4．解析：根據(jù)題意，該DNA用限制酶Ⅰ切割后長度不變，故為環(huán)狀DNA，根據(jù)兩酶的作用特點，可知酶切圖譜為D。
答案：D
5．解析：運載體與目的基因結(jié)合后會形成一個重組DNA分子，A正確；運載體中，對某種限制酶而言，最好只有一個切點，但還要有其他多種限制酶的切點，便于與目的基因定向連接，B正確；目前常用的運載體有質(zhì)粒、λ噬菌體的衍生物和動植物病毒，C正確；運載體上要具有某些標(biāo)記基因，便 于篩選重組DNA分子，D錯誤。
答案：ABC
6．解析：CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要包括Cas9(限制性內(nèi)切核酸酶)和向?qū)NA，前者是在核糖體上合成，后者是通過轉(zhuǎn)錄形成的，其場所不在核糖體，A錯誤；向?qū)NA可通過轉(zhuǎn)錄形成，逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成DNA，B錯誤；向?qū)NA和目標(biāo)DNA互補配對過程中，涉及的配對方式有A—U，G—C，T—A，C—G，C錯誤；由于DNA分子是雙鏈結(jié)構(gòu)，因此切割后形成的每個DNA分子的片段中均含有2個游離的磷酸基團，D正確。
答案：ABC
7．解析：(1)圖中①過程為基因表達載體的構(gòu)建。若選用EcoRⅠ，會破壞目的基因；由于目的基因兩側(cè)的酶切位點被Hind Ⅲ、BamHⅠ識別，且質(zhì)粒中也存在同樣的酶切位點，則所選用的限制酶為BamHⅠ和HindⅢ。使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，可以避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化，也可以避免反向連接，不用EcoRⅠ，可以防止目的基因被破壞。(2)兩種引物之間若能堿基互補配對，會導(dǎo)致引物結(jié)合形成雙鏈，進而降低引物與DNA模板鏈結(jié)合的效率。DNA聚合酶不能連接單個的脫氧核苷酸，只能把單個的脫氧核苷酸添加到已有DNA片段的末端，子鏈延伸方向為5′→3′端。故要擴增目的基因，只能選擇引物B和C。(3)據(jù)圖分析，④⑤⑥過程屬于植物組織培養(yǎng)，植物組織培養(yǎng)一般用固體培養(yǎng)基，需要加入瓊脂，同時需要控制生長素和細胞分裂素的比例，以調(diào)控細胞的分裂和分化。因此制備的培養(yǎng)基是由無機營養(yǎng)成分、有機營養(yǎng)成分、激素、瓊脂四部分組成。
答案：(1)BamHⅠ和HindⅢ　防止自身環(huán)化，避免反向連接，防止目的基因被破壞　(2)防止引物之間結(jié)合形成雙鏈，并因此降低了引物與DNA模板鏈結(jié)合的效率　B和C　(3)植物組織培養(yǎng)　激素、瓊脂
考點二
【任務(wù)驅(qū)動·探究突破】
任務(wù)1　(1)Bt毒蛋白基因　Ti質(zhì)粒　農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法　(2)抗原—抗體雜交法、用棉葉飼喂棉鈴蟲
任務(wù)2　(1)PCR　人工合成　基因文庫　(2)啟動子　標(biāo)記基因　(3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法　花粉管通道法　顯微注射　(4)DNA分子雜交　分子雜交　抗原—抗體雜交　個體生物學(xué)水平　
任務(wù)3　是否出現(xiàn)雜交帶　是否出現(xiàn)雜交帶　是否出現(xiàn)雜交帶　是否抗蟲；是否抗病
任務(wù)4　抗除草劑　藥物　器官移植　正常基因
【考向分類·對點落實】
1．解析：分析圖解可知，該基因工程的標(biāo)記基因為氨芐青霉素抗性基因，因此篩選1需要用氨芐青霉素培養(yǎng)基篩選出成功導(dǎo)入表達載體的農(nóng)桿菌，A正確；根據(jù)題意可知，報告基因的產(chǎn)物能催化無色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍色，因此篩選2需要用無色物質(zhì)K處理愈傷組織并篩選出呈現(xiàn)藍色的組織，B正確；為使除草劑抗性基因G在農(nóng)桿菌中高效表達，需要把目的基因片段插入到表達載體的啟動子、終止子之間，C錯誤；為從個體水平上檢測圖中玉米植株A是否具有抗除草劑性狀，可采用的方法是用相應(yīng)除草劑噴灑待測玉米植株，D正確。
答案：C
2．解析：過程①僅僅是單鏈a和單鏈b之間形成氫鍵，不需要DNA連接酶，A錯誤；過程②與過程①的本質(zhì)相同，故不需要DNA限制性內(nèi)切核酸酶，B錯誤；圖中顯示的是人工合成基因的流程圖，因此需要知道目的基因Ⅰ的堿基序列，C正確；形成重組DNA分子的過程中，質(zhì)粒與目的基因Ⅰ的堿基序列是不可能相同的，D錯誤。
答案：C
3．解析：要改造能夠降解甲基對硫磷的微生物，需要構(gòu)建含有甲基對硫磷分解酶基因的表達載體，A正確；將甲基對硫磷分解酶基因表達載體導(dǎo)入受體菌，是基因表達載體的構(gòu)建，是基因工程的核心步驟，B正確；甲基對硫磷是一種含碳農(nóng)藥，故用甲基對硫磷為唯一碳源的培養(yǎng)基選擇所需工程菌，C正確；目的基因的檢測和鑒定應(yīng)重點監(jiān)測目的基因的插入與否及插入后的表達結(jié)果，可采用DNA分子雜交技術(shù)等手段，而非提取工程菌的質(zhì)粒并檢測甲基對硫磷基因的含量，D錯誤。
答案：ABC
4．解析：(1)質(zhì)粒的化學(xué)本質(zhì)為DNA，構(gòu)建重組Ti質(zhì)粒時，遵循堿基互補配對原則；為了提高轉(zhuǎn)化成功率，先用CaCl2(或Ca2＋)處理農(nóng)桿菌，使其成為感受態(tài)細胞，增加其細胞壁的通透性，使得重組質(zhì)粒進入農(nóng)桿菌中。將農(nóng)桿菌接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，因為質(zhì)粒中含有抗卡那霉素基因，故以此檢測是否成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒。培養(yǎng)適宜時間后，離心，去除上清液，加入適量MS液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并通過測定菌液在600 nm波長處的OD值確定農(nóng)桿菌密度。(2)切取經(jīng)無菌培養(yǎng)的棉花幼苗的下胚軸，直接轉(zhuǎn)入菌液中侵染5～10 min后，倒出菌液，用滅菌濾紙吸取下胚軸表面多余菌液，將下胚軸放入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天。2天后，向培養(yǎng)基中加入適量草丁膦和青霉素，加入草丁膦可以篩選出轉(zhuǎn)化成功的棉花細胞，加入青霉素可以抑制農(nóng)桿菌的生長。(3)將所得愈傷組織接種到適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)誘導(dǎo)形成胚狀體，在適宜人工條件下繼續(xù)發(fā)育成棉花幼苗，利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，采用抗原－抗體分子雜交技術(shù)檢測棉花細胞是否合成葡萄糖氧化酶，選出抗黃萎病棉花。通過病原體感染實驗可以從個體水平上鑒定該棉花對黃萎病的抗性。
答案：(1)CaCl2(或Ca2＋)　卡那霉素　(2)無菌　草丁膦　抑制農(nóng)桿菌生長　(3)抗原－抗體分子雜交　葡萄糖氧化酶　病原體感染實驗
5．解析：(1)農(nóng)桿菌能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，故農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法適用的植物種類是大多數(shù)雙子葉植物和裸子植物；采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將攜帶有反義ACC合成酶基因的重組質(zhì)粒M導(dǎo)入番茄栽培品種中，經(jīng)過卡那霉素篩選后，獲得番茄新品種。由以上分析可知，重組質(zhì)粒M中的抗性基因是卡那霉素抗性基因。(2)控制ACC合成酶的基因幾乎存在于番茄的所有細胞中，所以這位同學(xué)提出的說法沒有道理。(3)ACC合成酶基因在番茄細胞中表達的過程包括基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，發(fā)生在細胞內(nèi)的細胞核和核糖體中；反義ACC合成酶基因轉(zhuǎn)錄啟動后反義ACC合成酶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA可與ACC合成酶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA堿基互補配對結(jié)合，ACC合成酶的合成受阻，導(dǎo)致乙烯的產(chǎn)生量下降。
答案：(1)大多數(shù)雙子葉植物和裸子植物　卡那霉素抗性基因　(2)否，控制ACC合成酶的基因幾乎存在于番茄的所有細胞中　(3)細胞核和核糖體　反義ACC合成酶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA可與ACC合成酶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA堿基互補配對結(jié)合，ACC合成酶的合成受阻，導(dǎo)致乙烯的產(chǎn)生量下降
6．解析：(1)總cDNA是由細胞內(nèi)mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得。DNA兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模硪粭l引物擴增方向應(yīng)向左。(2)據(jù)題意可知，啟動子具有物種特異性，它應(yīng)與受體細胞啟動子一致，應(yīng)選B。(3)在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時，加入某物質(zhì)，其目的應(yīng)為“促進”或“有利于”轉(zhuǎn)化，推測酚類物質(zhì)可吸引農(nóng)桿菌侵染水稻受體細胞。(4)水稻是真核細胞，具有對分泌蛋白加工的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體。Ⅱ途徑受體為大腸桿菌，沒有上述細胞器。(5)制備的rHSA應(yīng)具有與HSA相同的生物學(xué)功能才具有醫(yī)用價值。
答案：(1)總RNA(或mRNA)
(2)B　(3)吸引農(nóng)桿菌移向水稻受體細胞，有利于目的基因成功轉(zhuǎn)化　(4)水稻是真核生物，具有生物膜系統(tǒng)，能對初始rHSA多肽進行高效加工　(5)HSA
考點三
【任務(wù)驅(qū)動·探究突破】
任務(wù)1　(1)溶解　析出　增大　溶解　(2)酒精溶液　(3)藍
任務(wù)2　紗布　4　酒精　NaCl　二苯胺試劑　沸水　不變藍　變藍
任務(wù)3　(1)DNA模板　引物　DNA聚合酶　(2)變性　90 ℃　復(fù)性　50 ℃　引物　延伸　耐高溫的DNA聚合酶　(3)變性　延伸　指數(shù)　2n
【考向分類·對點落實】
1．解析：圖1中加入蒸餾水的目的是使雞血細胞吸水漲破，釋放其中的核物質(zhì)，圖2中加入蒸餾水的目的是降低NaCl的濃度，使DNA的溶解度降低而析出，A錯誤；DNA溶于水，圖1中完成過濾后，DNA溶解于濾液中，需保留濾液，B正確；圖2中DNA已析出，則過濾后棄去濾液，保留含DNA的黏稠物，C正確；在圖1中雞血細胞液中加入少許嫩肉粉，其中的木瓜蛋白酶能分解DNA中的雜質(zhì)蛋白，有利于去除雜質(zhì)蛋白，D正確。
答案：BCD
2．解析：只要含DNA的生物材料原則上都可進行本實驗，只是DNA含量高的成功的可能性更大，所以酵母和菜花均可作為提取DNA的材料，A正確；DNA在2 mol/L NaCl溶液中溶解度較大，也可溶解于蒸餾水中，B正確；DNA會被吸附到濾紙上而大量損失，影響最終提取的DNA量，C錯誤；DNA溶液加入二苯胺試劑沸水浴加熱，冷卻后變藍，故D正確。
答案：C
3．解析：A、B兩試管可形成對照，B試管中含DNA絲狀物，A試管中不含，起對照作用，其他條件均完全相同。本實驗的反應(yīng)條件是沸水浴加熱5 min，這樣可加快顏色反應(yīng)的速度，觀察對比兩試管的顏色時要等到冷卻以后。
答案：(1)溶液不變藍色　溶液逐漸變藍色　DNA在沸水浴的情況下遇二苯胺會被染成藍色　(2)溶液顏色基本不變　(3)加快顏色反應(yīng)速度　耐受性　(4)對照　(5)加入試管中的DNA(絲狀物)的多少
4．解析：通過圖示可知，與該mRNA結(jié)合的引物是A引物，A錯誤；引物A與引物B是一段DNA序列，其基本單位都是脫氧核苷酸，B正確；過程Ⅱ為PCR的反應(yīng)階段，通過控制溫度的變化實現(xiàn)變性、復(fù)性、延伸，實現(xiàn)目標(biāo)序列的循環(huán)擴增，C正確；RT－PCR反應(yīng)體系中應(yīng)加入緩沖液、引物、四種脫氧核糖核苷酸、逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶等物質(zhì)，D正確。
答案：A
5．解析：引物與探針的本質(zhì)都是核苷酸序列，二者均具特異性，與模板結(jié)合時遵循堿基互補配對原則，A正確；題干中提出“每加入一對引物的同時加入一個與某條模板鏈互補的熒光探針”，并且“每擴增一次，就有一個熒光分子生成”，因此反應(yīng)最終的熒光強度與起始狀態(tài)模板DNA含量呈正相關(guān)，B正確；由于cDNA是以某基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄形成的，能反映細胞轉(zhuǎn)錄的基因種類和水平，所以若用cDNA作模板，上述技術(shù)也可檢測某基因的轉(zhuǎn)錄水平，C正確；由題圖可知，Taq DNA聚合酶催化DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸，D錯誤。
答案：D
6．解析：(1)由圖中信息可知，定點突變位點在引物b和引物c的結(jié)合位點處，而引物a與引物b是合成產(chǎn)物AB的引物，引物c和引物d是合成產(chǎn)物CD的引物，因此需要設(shè)計引物b和引物c，使它們不發(fā)揮作用才可以得到突變產(chǎn)物AD；②過程獲得突變引物AD是由產(chǎn)物AB上鏈延伸與CD下鏈延伸得到的，因此需要使用的引物是引物a和引物d。(2)引物是一段DNA，引物b和引物c對應(yīng)的堿基之間多數(shù)可以配對，在一個反應(yīng)系統(tǒng)中配對后失效。(3)①新冠病毒是RNA病毒，因此在進行RT－PCR時，需要先進行逆轉(zhuǎn)錄合成DNA，然后再進行PCR，因此需要逆轉(zhuǎn)錄酶，而RT－PCR過程中除原料、模板、能量外，還需要TaqDNA聚合酶以合成子鏈DNA。②向微量離心管中加入成分時需要用微量移液器；加入到微量離心管后使反應(yīng)液集中到微量離心管底部的方法是離心。
答案：(1)引物b、引物c　引物a和引物d　(2)引物b和引物c對應(yīng)的堿基之間多數(shù)可以配對，在一個反應(yīng)系統(tǒng)中配對后失效　(3)①逆(反)轉(zhuǎn)錄酶、耐高溫的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)　②微量移液器　離心
7．解析：利用PCR技術(shù)將DNA分子中的A1片段進行擴增，當(dāng)引物與母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后，子鏈延伸的方向總是從5′端到3′端，據(jù)此依題意和圖示分析可知，A、B、C均錯誤，D正確。
答案：D
8．解析：病毒沒有細胞結(jié)構(gòu)，不能用培養(yǎng)基直接培養(yǎng)，A錯誤；PCR進行的前提條件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一對引物，B正確；RNA病毒的RNA通過PCR擴增需要先進行逆轉(zhuǎn)錄形成DNA，然后使用耐高溫DNA聚合酶進行DNA復(fù)制，不需要使用RNA聚合酶，C錯誤；根據(jù)上述分析可知，PCR擴增過程經(jīng)歷了高溫變性、低溫復(fù)性和中溫延伸的過程，而不是在恒溫條件下進行的，D錯誤。
答案：B
9．解析：PCR擴增的操作步驟依次是高溫變性、低溫復(fù)性及適溫延伸等，A錯誤；上述過程需要使用的工具酶之一是耐高溫的DNA聚合酶，B錯誤；PCR技術(shù)的原理是DNA雙鏈的復(fù)制，其產(chǎn)物是大量的DNA，所以需要以脫氧核苷酸為原料，C錯誤；SRY基因為Y染色體上的性別決定基因，SRY探針是用位于Y染色體上的性別決定基因(SRY基因)制成的，因此SRY探針能與雄性胚胎樣品中DNA配對，D正確。
答案：ABC
考點四
【任務(wù)驅(qū)動·探究突破】
任務(wù)1　滿足人類生產(chǎn)和生活需求　基因　基因修飾或基因合成　基因工程　新的蛋白質(zhì)
任務(wù)2　蛋白質(zhì)功能　蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)　氨基酸序列　脫氧核苷酸序列
任務(wù)3　(1)食品　過敏原　生物多樣性　生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性　(2)趨利避害　政策和法規(guī)
任務(wù)4　傳染性大　潛伏期　自然條件
任務(wù)5　功能　結(jié)構(gòu)　序列　序列　目的基因　基因表達載體　受體細胞　檢測與鑒定　基因修飾或基因合成
任務(wù)6　轉(zhuǎn)錄　翻譯　分子設(shè)計　氨基酸序列　預(yù)期功能
【考向分類·對點落實】
1．解析：蛋白質(zhì)工程的基本途徑是：從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)→設(shè)計預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測應(yīng)有的氨基酸序列(基因)或合成新的基因→找到并改變相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→獲得所需要的蛋白質(zhì)→相應(yīng)的表達。因此，采用蛋白質(zhì)工程技術(shù)制造出藍色熒光蛋白過程的正確順序是：②藍色熒光蛋白的功能分析和結(jié)構(gòu)設(shè)計→①推測藍色熒光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸序列→③藍色熒光蛋白基因的合成→④表達出藍色熒光蛋白。
答案：B
2．解析：蛋白質(zhì)工程中了解蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)如蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、氨基酸的排列順序等，對于合成或改造基因至關(guān)重要；蛋白質(zhì)工程的進行離不開基因工程，對蛋白質(zhì)的改造是通過對基因的改造來完成的；圖中a、b過程分別是轉(zhuǎn)錄、翻譯過程；蛋白質(zhì)工程中可根據(jù)已經(jīng)明確的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)構(gòu)建出一種全新的基因。
答案：ACD
3．解析：(1)對蛋白質(zhì)的氨基酸序列(或結(jié)構(gòu))進行改造，可達到改變蛋白質(zhì)功能的目的。(2)以P基因序列為基礎(chǔ)，獲得P1基因，可以對P基因進行修飾改造，也可以用人工方法合成P1基因；中心法則的全部內(nèi)容包括DNA和RNA的復(fù)制、DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白質(zhì)(或轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄、翻譯)。(3)蛋白質(zhì)工程的基本途徑是從預(yù)期蛋白質(zhì)功能出發(fā)，通過設(shè)計蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和推測氨基酸序列，推測相應(yīng)的核苷酸序列，并合成基因。經(jīng)表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，還要對其進行生物功能鑒定。
答案：(1)氨基酸序列(或結(jié)構(gòu))
(2)P　P1　DNA和RNA(或遺傳物質(zhì))　DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白質(zhì)(或轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄、翻譯)
(3)設(shè)計蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)　推測氨基酸序列　功能
4．解析：為了維護消費者對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的知情權(quán)和選擇權(quán)，我國對轉(zhuǎn)基因食品和轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品實行了標(biāo)識制度，A正確；轉(zhuǎn)基因食品上只標(biāo)明原料來自于轉(zhuǎn)基因生物，并未標(biāo)明其危害，B錯誤；為保障轉(zhuǎn)基因生物的安全性，可開展風(fēng)險評估、預(yù)警跟蹤和風(fēng)險管理等措施，C正確；轉(zhuǎn)基因生物是否安全的爭論主要集中在它是否能保證食用安全及環(huán)境安全上，D正確。
答案：ACD
5．答案：(1)逆轉(zhuǎn)錄　限制酶和DNA連接酶　氯化鈣溶液(Ca2＋)　(2)啟動子　RNA聚合酶　(3)轉(zhuǎn)錄、翻譯　(4)食品安全　生物安全　環(huán)境安全
課堂總結(jié)　網(wǎng)絡(luò)聚焦大概念
網(wǎng)絡(luò)建構(gòu)提升
①限制性內(nèi)切核酸　②DNA連接　③目的基因　④基因表達載體　⑤受體　⑥目的基因　⑦熱穩(wěn)定　⑧醫(yī)藥
歷屆真題　分類集訓(xùn)培素養(yǎng)
1．解析：(1)分析題意，研究人員從土壤微生物基因組中擴增得到目標(biāo)酶基因采用了PCR技術(shù)，此外獲得酶基因的方法還有從基因文庫中獲取和人工合成法。(2)高質(zhì)量的DNA模板是成功擴增出目的基因的前提條件之一。在制備高質(zhì)量DNA模板時必須除去蛋白，可根據(jù)DNA和蛋白質(zhì)的溶解性、對酶、高溫和洗滌劑的耐受性去除蛋白質(zhì)，方法有鹽析、酶解法或高溫變性法等。(3)研究人員使用大腸桿菌BL21作為受體細胞、pET20b為表達載體分別進行4種酶的表達。表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌時，首先應(yīng)制備感受態(tài)細胞，即利用鈣離子處理大腸桿菌，使其成為感受態(tài)細胞，使其易于接受外來的DNA分子。基因工程中，酶基因(目的基因)成功表達的產(chǎn)物酶蛋白的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，常用抗原—抗體雜交技術(shù)進行檢測。(4)依圖所示流程，在一定的溫度、pH等條件下，將4種酶與可溶性淀粉溶液混合組成一個反應(yīng)體系。由于酶的作用條件較溫和，若這些酶最適反應(yīng)條件不同，則可能導(dǎo)致有的酶失活而使反應(yīng)中斷。在分子水平上，可以通過改變基因的堿基序列，從而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)對酶特性的改造和優(yōu)化。
答案：(1)基因文庫中獲取、人工合成法　(2)鹽析法、酶解法或高溫變性　(3)感受態(tài)　抗原—抗體雜交技術(shù)　(4)有的酶失活而使反應(yīng)中斷　基因的堿基序列
2．解析：(1)將某種生物體內(nèi)的全部DNA提取出來，選用適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈睿缓髮⑶懈詈蟮腄NA片段分別與載體連接，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，這個群體包含了這種生物的所有基因，稱為這種生物的基因組文庫。(2)將DNA序列插入Ti質(zhì)粒構(gòu)建重組載體時，需要用到限制酶(或限制性核酸內(nèi)切酶)和DNA連接酶；構(gòu)建的重組基因表達載體必須含有標(biāo)記基因，其作用是鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含目的基因的細胞篩選出來。(3)農(nóng)桿菌能在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，其含有的Ti質(zhì)粒可攜帶目的基因進入受體細胞并整合到受體細胞染色體的DNA上，因此將含有YCF1基因的重組載體導(dǎo)入受試雙子葉植物印度芥菜，采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；采用不育株系作為實驗材料的目的是避免轉(zhuǎn)基因植物所含的目的基因通過花粉傳播，使目的基因進入近緣作物造成基因污染。(4)與野生型比較，轉(zhuǎn)基因植株無論是地上部分還是地下部分，Cd含量都比野生型高，說明轉(zhuǎn)基因植株對Cd具有更強的富集能力，轉(zhuǎn)基因植物葉片中Cd含量最高，因此對轉(zhuǎn)基因植株的葉進行后續(xù)處理對于緩解土壤Cd污染最為方便有效。(5)根據(jù)題意分析，轉(zhuǎn)基因楊樹與野生型相比，能通過YCF1將Cd主動運輸進入液泡儲存，從而更好地適應(yīng)高Cd環(huán)境；相較于草本植物，采用楊樹這種喬木作為Cd污染土壤修復(fù)植物的優(yōu)勢在于對Cd的吸收能力強、植株生長旺盛富集更快、便于后續(xù)收集處理。
答案：(1)基因組文庫　(2)限制酶(或限制性核酸內(nèi)切酶)和DNA連接酶　鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含目的基因的細胞篩選出來　(3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法　避免轉(zhuǎn)基因植物所含的目的基因通過花粉傳播，使目的基因進入近緣作物造成基因污染　(4)富集能力　葉　(5)通過YCF1將Cd主動運輸進入液泡儲存　對Cd的吸收能力強、植株生長旺盛富集更快、便于后續(xù)收集處理
3．解析：(1)根據(jù)題圖可知，步驟Ⅰ是獲取目的DNA片段，所用的酶EcoRⅠ是一種限制酶，其能識別特定的核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。(2)步驟Ⅱ是將目的DNA片段連接成環(huán)狀，其中DNA連接酶的作用是催化相鄰核苷酸之間的3′－ 羥基和5′－ 磷酸間形成磷酸二酯鍵。PCR循環(huán)中，升高溫度到95℃是為了打開氫鍵使雙鏈解旋，獲得DNA單鏈，Taq DNA聚合酶的作用是催化游離的脫氧核苷酸連接到引物3′端，合成DNA子鏈。(3)引物的作用是使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始延伸DNA子鏈，因為DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸，故為擴增未知序列，選擇的與模板鏈相結(jié)合的引物應(yīng)為5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′(引物④)和5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′(引物②)。(4)分析題意可知，片段F的兩端為限制酶EcoRⅠ切割后產(chǎn)生的黏性末端，因此其5′端序列應(yīng)為AATT－，3′端序列應(yīng)為－TTAA，B正確。
答案：(1)限制性核酸內(nèi)切(或限制)　核苷酸序列　(2)磷酸二酯鍵　DNA單鏈　以DNA為模板的DNA鏈的延伸　(3)②④　(4)B
4．解析：(1)限制性核酸內(nèi)切酶能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開；DNA連接酶能將DNA片段拼接起來。將能表達出基因編輯系統(tǒng)的DNA序列插入Ti質(zhì)粒構(gòu)建重組載體時，需要限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶的參與。轉(zhuǎn)化是指目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。(2)啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。Wx基因啟動子序列的改變影響了RNA聚合酶與啟動子的識別和結(jié)合，從而改變了Wx基因的轉(zhuǎn)錄水平，使直鏈淀粉合成酶基因的表達量改變。根據(jù)題干信息可知，基因編輯系統(tǒng)是對啟動子序列進行定點編輯，由于編碼直鏈淀粉合成酶的堿基序列中不含啟動子，所以與野生型水稻相比，3個突變品系中Wx基因控制合成的直鏈淀粉合成酶的氨基酸序列沒有發(fā)生變化。(3)用提取的各品系胚乳中的總RNA合成總cDNA的過程為逆轉(zhuǎn)錄，需要逆轉(zhuǎn)錄酶的參與。由于引物能與Wx基因的cDNA特異性結(jié)合，故通過PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性地擴增出Wx基因的cDNA。(4)mRNA是蛋白質(zhì)合成的直接模板，根據(jù)題圖分析可知，4個品系中品系3的Wx mRNA量最低，控制合成的直鏈淀粉合成酶最少，直鏈淀粉合成量最少，糯性最強。
答案：(1)限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶　轉(zhuǎn)化
(2)RNA聚合酶與啟動子的識別和結(jié)合　不發(fā)生　編碼直鏈淀粉合成酶的堿基序列中不含啟動子　(3)逆轉(zhuǎn)錄(或反轉(zhuǎn)錄)　引物是根據(jù)Wx基因的一段已知序列設(shè)計合成的(或引物能與Wx基因的cDNA特異性結(jié)合)
(4)品系3　品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直鏈淀粉合成酶最少，直鏈淀粉合成量最少，糯性最強
5．解析：(1)用PCR技術(shù)進行臨床的病原菌檢測時，首先應(yīng)采集病人組織樣本，從病人組織樣本中提取DNA，再利用PCR技術(shù)擴增DNA片段，分析PCR擴增結(jié)果。(2)利用PCR擴增DNA片段過程中使用的酶是TaqDNA聚合酶。PCR由變性—復(fù)性—延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成，其中復(fù)性的結(jié)果是兩種引物分別與兩條單鏈DNA模板結(jié)合。(3)要擴增病原菌DNA，設(shè)計的引物就應(yīng)該能和病原菌DNA特異性結(jié)合。(4)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外迅速擴增DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在短時間內(nèi)大量擴增目的基因。
答案：(1)④②③①　(2)熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶)　延伸　兩種引物分別與兩條單鏈DNA模板結(jié)合　(3)病原菌DNA　(4)一種在生物體外迅速擴增DNA片段的技術(shù)
6．解析：(1)由圖可以直接看出，EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ切割后分別形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端；E·coli DNA連接酶可用于連接黏性末端，T4 DNA連接酶可用于連接黏性末端和平末端。(2)DNA連接酶催化形成磷酸二酯鍵。(3)復(fù)制原點是在基因組上復(fù)制起始的一段序列，可以保證質(zhì)粒在宿主細胞中復(fù)制。質(zhì)粒上有限制酶的切割位點，可被限制酶切開并使目的基因插入其中。采用在含有特定抗生素的選擇培養(yǎng)基上進行選擇培養(yǎng)的方法可將含質(zhì)粒載體的細胞篩選出來。(4)啟動子是RNA聚合酶識別、結(jié)合和驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。
答案：(1)EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ　EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoRⅤ　(2)磷酸二酯鍵　(3)復(fù)制　限制酶的切割位點　用含抗生素的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)　(4)RNA聚合酶識別、結(jié)合和驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列
7．解析：(1)基因文庫包括基因組文庫和部分基因文庫。(2)體內(nèi)DNA復(fù)制時，需用解旋酶打開氫鍵使雙鏈DNA解旋，而PCR擴增目的基因時，是借助高溫加熱至90～95 ℃破壞雙鏈之間的氫鍵，使DNA成為單鏈。(3)PCR反應(yīng)體系中進行互補鏈的合成時，溫度需控制在70～75 ℃，則應(yīng)使用耐高溫的DNA聚合酶，即TaqDNA聚合酶，而不能使用大腸桿菌DNA聚合酶(高溫下會失活)。
答案：(1)基因組文庫　部分基因文庫　(2)解旋酶　加熱至90～95 ℃　氫鍵　(3)TaqDNA聚合酶熱穩(wěn)定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活

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