資源簡介

第2節 基因工程的基本操作程序
1. 掌握目的基因的篩選與獲取方法
2. 學會基因表達載體構建的方法和要求
3. 理解目的基因導入受體細胞的具體過程
4. 掌握目的基因檢測與鑒定的方法
5. 掌握DNA片段的擴增及電泳鑒定的方法
一、目的基因的篩選與獲取
基礎梳理
1. 目的基因的概念：用于改變 或獲得
2. 篩選目的基因的有效方法：從相關的已知結構和 的基因中進行篩選
3. 常見的獲取目的基因的方法： 、
4. PCR的定義：PCR是 的縮寫，是一項根據DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的僅有的 進行大量復制的技術
1.PCR反應需要在一定的緩沖液中進行（ ）
2.PCR反應需要的能量由ATP直接提供（ ）
2、基因表達載體的構建
1.構建目的基因的目的：讓基因在受體細胞中穩定存在，并 ；同時，是Bt基因能夠 和
2.基因表達載體的組成
（1） ：外源DNA 分子中具有遺傳效應的片段
位置：
功能：是RNA聚合酶 和 的部位，驅動基因轉錄出mRNA
位置：
功能：終止轉錄
（4） ：鑒別受體細胞中是否含有目的基因
3.填寫基因表達載體構建模式圖
① ② ③
④ ⑤
1.基因表達載體的構建必須在細胞內進行（ ）
2.啟動子和終止子位于DNA 上，分別啟動和終止DNA 的復制（ ）
3.起始密碼子和終止密碼子分別轉錄自啟動子和終止子（ ）
三、將目的基因導入受體細胞
1. 目的基因導入受體細胞的方法： 、
2. 轉化的概念：轉化是指目的基因進入 內，并且在受體細胞內 和
的過程
3. 農桿菌轉化法的原理：將目的基因插入Ti質粒的 中，通過農桿菌的轉化作用，就可以使目的基因進入植物細胞
1.目的基因導入受體細胞前不用提純（ ）
四、目的基因的檢測與鑒定
1. 目的基因的檢測與鑒定的目的：目的基因進入受體細胞后， ，只有通過檢測與鑒定才知道
2. 分子水平的檢測內容有三方面：
（1）利用PCR技術檢測轉基因生物的DNA是否插入了目的基因
（2）利用PCR技術檢測出轉基因生物的DNA中的目的基因是否
（3）檢測目的基因是否 ，進行
3. 將目的基因導入受體細胞的方法：
4. 將目的基因導入微生物細胞的方法：
1.檢測目的基因是否翻譯成蛋白質屬于目的基因的檢查與檢測環節（ ）
隨堂訓練
1.下列有關基因工程的敘述,不正確的是( )
A.將目的基因導入動物細胞目前最常用的,也是最為有效的方式是顯微注射技術
B.將目的基因導入植物細胞采用最多的方法是農桿菌轉化法
C.轉基因動物的受體細胞必須是受精卵,然后利用胚胎移植技術獲得轉基因動物
D.轉基因植物的受體細胞必須是受精卵,然后利用植物組織培養技術獲得轉基因植株
2.下圖表示轉基因動、植物的培育過程。據圖分析下列有關敘述正確的是( )
A.在獲得目的基因的過程中，需要使用限制性核酸內切酶和DNA連接酶等工具酶
B.受體細胞A、B一定均為受精卵
C.目的基因導入受體細胞A中通常用顯微鏡注射法
D.將目的基因導入受體細胞B時常使用大腸桿菌作為工具去侵染植物細胞
3.對基因工程操作的敘述，正確的是( )
A.用限制性核酸內切酶切割煙草花葉病毒的核酸
B.用顯微注射法將人生長激素基因直接注入動物的受精卵
C.用氯化鈣處理可增加細菌細胞膜的通透性，有利于目的基因的導入
D.利用DNA分子雜交技術無法檢測目的基因是否表達
4.如圖為某一重組質粒示意圖，下列敘述錯誤的是( )
A.用限制酶EcoRⅤ處理該質粒得到的分子共含有4個游離的磷酸基團
B.同時用限制酶EcoRⅤ和BamHⅠ處理該質粒可得到3個雙鏈DNA片段
C.在獲得目的基因時應該使用的限制酶是BamHⅠ
D.將受體細胞培養于含有卡那霉素的培養基中，可篩選出含有目的基因的細胞
5.下列關于基因工程的敘述，錯誤的是( )
A.DNA連接酶使粘性末端的堿基進行堿基互補配對
B.限制性核酸內切酶可用于目的基因的獲得
C.目的基因需由載體導入受體細胞
D.化學方法合成目的基因不需要限制性核酸內切酶
6.運用轉基因技術，將奶牛細胞中編碼凝乳酶的基因轉移到大腸桿菌細胞中，達到大規模生產凝乳酶的目的。如圖表示用作載體的質粒和目的基因所在的DNA片段。下列操作與實驗目的不符的是( )
A.用限制酶BamHⅠ、PstⅠ和DNA連接酶構建基因表達載體
B.用含氨芐青霉素的培養基篩選出的一定為導入目的基因的細菌
C.可用PCR技術大量擴增目的基因
D.用Ca2+處理大腸桿菌使其易于轉化
7.基因工程操作中，需要篩選和獲取目的基因。下列關于目的基因的說法，不正確的是( )
A.目的基因是指用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因
B.目的基因都有自我復制能力
C.可以根據相應的表達產物，從序列數據庫中尋找目的基因
D.目的基因可以人工合成，也可以利用PCR快速獲取或擴增
8.反向PCR可擴增已知序列兩端的未知序列。如圖所示，在一段未知序列的突變體DNA片段中，插入了已知序列的T-DNA，要想對T-DNA兩側的未知序列進行擴增，下列做法正確的是( )
A.用引物①和引物④直接進行PCR擴增
B.用引物②和引物③直接進行PCR擴增
C.用限制酶酶切后連接成環狀DNA，再用引物①④進行PCR擴增
D.用限制酶酶切后連接成環狀DNA，再用引物②③進行PCR擴增
9.基因工程中選用的細菌質粒常帶有抗生素抗性基因，該基因的主要作用是( )
A.提高受體細胞在自然環境中的耐藥性 B.有利于對目的基因是否導入進行檢測
C.有利于對目的基因是否表達進行檢測 D.有利于對目的基因的表達
10.利用基因工程技術將目的基因導入相應生物體內使之表達，可以得到人們所需要的產品。下列選項中，不可能的是( )
選項 目的基因 導入方法 受體細胞 表達產物
A 植物蛋白酶抑制劑基因 農桿菌轉化法 棉花葉肉細胞 植物蛋白酶抑制劑
B 魚抗凍蛋白基因 農桿菌轉化法 番茄葉肉細胞 魚抗凍蛋白
C 人生長激素基因 顯微注射法 綿羊成熟紅細胞 生長激素
D 人干擾素基因 Ca2+處理法 大腸桿菌工程菌細胞 人干擾素
A.A B.B C.C D.D
11.下列不能說明目的基因已成功導入受體細胞的是( )
A.檢測受體細胞是否有質粒
B.檢測受體細胞是否含有目的基因
C.檢測受體細胞是否含有目的基因的表達產物
D.檢測受體細胞是否含有目的基因轉錄出的mRNA
12.青枯病是一種由青枯菌引起的毀滅性土傳病害，是世界上危害大、分布廣、造成損失嚴重的植物病害之一。為了更好地防止番茄青枯病的發生，科學家利用昆蟲體內的一種抗菌肽B（AP-B）能殺死青枯菌，通過培育轉基因番茄用于生產。如圖為基因工程操作程序及幾種限制酶的識別序列、質粒上酶切位點和基因、目的基因所在片段上部分堿基序列，請回答問題：
（1）已知目的基因所在DNA上部分基因序列，應選擇__________酶和__________酶切割獲取目的基因。上述操作程序中第⑤步應轉入含__________的培養基上培養，目的是__________。
（2）若要從重組質粒中獲取抗菌肽B（AP-B），__________（填“可以”或“不可以”）選用上述限制酶中的BamHⅠ或BclⅠ原因是______________________________。
（3）過程⑦若要檢測目的基因是否導入，應選含有__________的片段作探針，若要從個體水平檢測目的基因是否表達，方法是______________________________。
答案以及解析
1.答案：D
解析：
2.答案：C
解析：獲得目的基因的過程中，需要使用限制性核酸內切酶，不需要DNA連接酶，A錯誤；一般受體細胞A為受精卵，受體細胞B為受精卵或體細胞，B錯誤；將目的基因導入動物細胞通常用顯微鏡注射法，C正確；將目的基因導入受體細胞B時，常用土壤農桿菌作為工具去侵染植物細胞，D錯誤。
3.答案：D
解析：限制性核酸內切酶只能切割特定的脫氧核苷酸序列，而煙草花葉病毒的核酸是由核糖核苷酸構成的，A錯誤；目的基因不能直接導入受體細胞，可用顯微注射法將含人生長激素基因的重組質粒注入動物的受精卵，B錯誤；用氯化鈣處理可增加細菌細胞壁的通透性，并使細菌處于感受態，從而有利于目的基因的導入，C錯誤；利用DNA分子雜交技術只能檢測目的基因是否導入，無法檢測目的基因是否表達，D正確。
4.答案：C
解析：A、限制酶EcoRV在圖中含有兩個切點，用限制酶EcoRV處理該質粒可得到2個線形DNA分子，每個線形DNA分子含有兩個游離的磷酸基團，共含有4個游離的磷酸基團，A正確；
B、限制酶EcoRⅤ和BamHⅠ酶在圖中共含有3個切點，同時用它們處理該質粒可得到3個雙鏈DNA分子，B正確；
C、在獲得該重組質粒時，不應該使用限制酶BamHⅠ，若使用該限制酶，則會破壞目的基因，C錯誤；
D、重組質粒含有卡那霉素抗性基因，故將受體細胞培養于含有卡那霉素的培養基中，可篩選出含有目的基因的細胞，D正確。
故選C。
5.答案：A
解析：DNA連接酶將粘性末端的磷酸二酯鍵連接起來，A錯誤；限制性核酸內切酶可用于目的基因的獲得和重組DNA分子的構建，B正確；目的基因需要與載體構建成重組DNA分子，然后導入受體細胞，C正確；化學方法合成目的基因不需要限制性核酸內切酶，D正確。
6.答案：B
解析：限制酶不能破壞目的基因，也不能破壞質粒上的標記基因，且用不同的限制酶進行切割，可防止質粒和目的基因自身的連接以及目的基因與載體的反向連接，所以應選用限制酶BamHⅠ、PstⅠ和DNA連接酶構建基因表達載體，A不符合題意；載體和插入目的基因的載體上都存在抗氨芐青霉素基因，因此用含氨芐青霉素的培養基篩選出的不一定為導入目的基因的細菌，B符合題意；可用PCR技術大量擴增目的基因，C不符合題意；用Ca2+處理大腸桿菌，使其處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，易于轉化，D不符合題意。
7.答案：B
解析：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因就是目的基因，A正確；目的基因通常不具有自我復制能力，B錯誤；可以根據目的基因的結構和功能等，從序列數據庫等中尋找目的基因，C正確；目的基因可以人工合成，也可以利用PCR快速獲取或擴增，D正確。
8.答案：C
解析：根據DNA復制時子鏈延伸的方向可知，利用圖中的引物①、④組合進行PCR時，兩條子鏈分別向圖中左側和右側延伸，但每一個延伸方向上都缺少一條引物，達不到預期目的，A錯誤；用引物②和引物③直接進行PCR擴增及將DNA連接成環狀后再用引物②③進行PCR擴增得到的都是T-DNA序列，達不到預期目的，B、D錯誤；將DNA連接成環狀后，再用引物①④進行PCR擴增時，引物④和引物①恰好位于連接在一起的未知序列的兩側，經PCR可擴增出T-DNA兩側的未知序列，C正確。
9.答案：B
解析：基因工程中的質粒載體上常常帶有標記基因如抗生素抗性基因，便于對受體細胞進行篩選，檢測重組質粒是否導入受體細胞，B正確。
10.答案：C
解析：轉基因動物的受體細胞一般是受精卵，且綿羊成熟紅細胞不具有內質網、高爾基體等細胞器，無法正常表達分泌蛋白。
11.答案：A
解析：質粒上不一定含目的基因，因此受體細胞中檢測到質粒并不意味著一定含目的基因，A錯誤。可直接檢測目的基因或檢測其轉錄、翻譯的產物，B、C、D正確。
12.答案：（1）BclⅠ；HindⅢ；青霉素；篩選含重組DNA和質粒的細菌
（2）不可以；BamHⅠ或BclⅠ酶切產生的末端可以連接形成重組DNA，但兩個黏性末端連接后的重組序列不能再被BamHⅠ或BclⅠ切割，故不能再用BamHⅠ或BclⅠ從重組質粒中重新獲取目的基因
（3）目的基因；用一定量的青枯菌液在轉基因番茄根部接種，觀察植株是否出現青枯癥狀
解析：（1）根據限制酶的識別序列和酶切位點可以確定應選擇BclⅠ酶和HindⅢ酶切割獲取目的基因；上述操作程序中第⑤步應轉入含青霉素的培養基上培養，目的是篩選含重組DNA和質粒的細菌。
（2）若要從重組質粒中獲取抗菌肽B（AP-B），不可選用限制酶中的BamHⅠ或BclⅠ，原因是BamHⅠ或BclⅠ酶切產生的末端可以連接形成重組DNA，但兩個黏性末端連接后的重組序列不能再被BamHⅠ或BclⅠ切割，故不能再用BamHⅠ或BclⅠ從重組質粒中重新獲取目的基因。
（3）過程⑦若要檢測目的基因是否導入，應選含有目的基因的片段作探針；若要從個體水平檢測目的基因是否表達的方法是用一定量的青枯菌液在轉基因番茄根部接種，觀察植株是否出現青枯癥狀。
學習目標
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基礎梳理
（2）啟動子
（3）終止子
⑤
④
③
①
②
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