資源簡介

專題10　生物工程
微專題2　基因工程(含PCR技術(shù))
1.基因工程的基本工具
①基因工程中的載體與細(xì)胞膜上的載體不同。
②若用兩種不同的限制酶同時(shí)切割目的基因和同時(shí)切割載體，則可使基因和載體定向連接，避免自身環(huán)化和反向連接，提高連接的有效性。
2.基因工程的四個(gè)操作步驟
(1)目的基因的篩選與獲取
　①目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。
②在已有mRNA前提下，可通過逆轉(zhuǎn)錄法獲取目的基因。
③當(dāng)基因較小且序列已知時(shí)，可采用化學(xué)合成法進(jìn)行人工合成。
(2)基因表達(dá)載體的構(gòu)建——重組質(zhì)粒的構(gòu)建
①啟動(dòng)子、終止子
a.啟動(dòng)子(DNA片段)≠起始密碼子(位于mRNA上)。
b.終止子(DNA片段)≠終止密碼子(位于mRNA上)。
②目的基因插入位置：啟動(dòng)子與終止子之間。
③利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物時(shí)，應(yīng)將目的基因與乳腺中特異表達(dá)的基因的啟動(dòng)子連接到一起，再通過顯微注射的方法導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的受精卵中。
(3)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
細(xì)胞類型 植物細(xì)胞 動(dòng)物細(xì)胞 微生物細(xì)胞
常用方法 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法 顯微注射技術(shù) Ca2＋處理法(感受態(tài)細(xì)胞法)
受體細(xì)胞 受精卵、體細(xì)胞 受精卵 原核細(xì)胞 使用最廣泛的是大腸桿菌
辨析農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的“兩個(gè)兩次”
①兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T DNA的中間部位；第二次拼接指被插入目的基因的T DNA被拼接到受體細(xì)胞染色體的DNA上。
②兩次導(dǎo)入：第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌；第二次導(dǎo)入是指將含目的基因的T DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。
(4)目的基因的檢測與鑒定
3.PCR技術(shù)及應(yīng)用
(1)PCR技術(shù)原理與條件
(2)PCR技術(shù)的過程
可通過引物控制PCR擴(kuò)增的基因片段，并在基因兩側(cè)引入限制酶識(shí)別序列。
4.蛋白質(zhì)工程
高考重點(diǎn)訓(xùn)練
1.(2021·遼寧卷，4)下列有關(guān)細(xì)胞內(nèi)的DNA及其復(fù)制過程的敘述，正確的是(　　)
A.子鏈延伸時(shí)游離的脫氧核苷酸添加到3′端
B.子鏈的合成過程不需要引物參與
C.DNA每條鏈的5′端是羥基末端
D.DNA聚合酶的作用是打開DNA雙鏈
答案　A
解析　細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制時(shí)，子鏈延伸方向?yàn)?′→3′，故游離的脫氧核苷酸添加到3′端，A正確；子鏈的合成過程需要引物參與，B錯(cuò)誤；DNA每條鏈的5′端是磷酸基團(tuán)末端，3′端是羥基末端，C錯(cuò)誤；解旋酶的作用是打開DNA雙鏈，D錯(cuò)誤。
2.(2021·湖北卷，16)某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對(duì))外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對(duì))。為了減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是(　　)
A.增加模板DNA的量 B.延長熱變性的時(shí)間
C.延長延伸的時(shí)間 D.提高復(fù)性的溫度
答案　D
解析　PCR過程中，引物和模板不完全配對(duì)會(huì)形成非特異條帶，增加模板DNA的量不會(huì)減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，A錯(cuò)誤；延長熱變性的時(shí)間，有利于雙鏈DNA解聚為單鏈，不能減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，B錯(cuò)誤；延長延伸的時(shí)間，有利于合成新的DNA鏈，但不能減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，C錯(cuò)誤；在一定溫度范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，D正確。
3.(2021·江蘇卷，13)下圖是剔除轉(zhuǎn)基因植物中標(biāo)記基因的一種策略，下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A.分別帶有目的基因和標(biāo)記基因的兩個(gè)質(zhì)粒，都帶有T－DNA序列
B.該方法建立在高轉(zhuǎn)化頻率基礎(chǔ)上，標(biāo)記基因和目的基因須轉(zhuǎn)到不同染色體上
C.若要獲得剔除標(biāo)記基因的植株，轉(zhuǎn)化植株必須經(jīng)過有性繁殖階段遺傳重組
D.獲得的無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株發(fā)生了染色體結(jié)構(gòu)變異
答案　D
解析　農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T－DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上，故分別帶有目的基因和標(biāo)記基因的兩個(gè)質(zhì)粒，都帶有T－DNA序列，進(jìn)而成功整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上，A正確；該方法需要利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，在高轉(zhuǎn)化頻率的基礎(chǔ)上，將目的基因和標(biāo)記基因整合到染色體上，由圖可知，標(biāo)記基因和目的基因位于細(xì)胞中不同的染色體上，B正確；通過雜交分離結(jié)果可知，經(jīng)過有性繁殖階段遺傳重組后獲得了四種類型細(xì)胞，其中包括目的基因與標(biāo)記基因都不含的、只含目的基因的、只含標(biāo)記基因的和既含目的基因又含標(biāo)記基因的，C正確；獲得的無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株發(fā)生了基因重組，D錯(cuò)誤。
4.(2020·江蘇卷，33)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如圖(以EcoR Ⅰ酶切為例)：
請(qǐng)據(jù)圖回答問題：
(1)步驟Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一種________酶，它通過識(shí)別特定的________切割特定位點(diǎn)。
(2)步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′－羥基與5′－磷酸間形成________；PCR循環(huán)中，升溫到95 ℃是為了獲得________；TaqDNA聚合酶的作用是催化______________________________________________________。
(3)若如表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是________(從引物①②③④中選擇，填編號(hào))。
DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物 ①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′ ②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′ ③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′ ④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
(4)對(duì)PCR產(chǎn)物測序，經(jīng)分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列)，結(jié)果正確的是________。
A.5′－AACTATGCG┈┈AGCCCTT－3′
B.5′－AATTCCATG┈┈CTGAATT－3′
C.5′－GCAATGCGT┈┈TCGGGAA－3′
D.5′－TTGATACGC┈┈CGAGTAC－3′
答案　(1)限制性內(nèi)切核酸(或限制)　核苷酸序列　(2)磷酸二酯鍵　DNA單鏈
以DNA為模板的DNA鏈的延伸　(3)②④　(4)B
解析　(1)根據(jù)題圖可知，步驟Ⅰ是獲取目的DNA片段，所用的EcoR Ⅰ是一種限制酶，其能識(shí)別特定的核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。(2)步驟Ⅱ是將目的DNA片段連接成環(huán)狀，其中DNA連接酶的作用是催化相鄰核苷酸之間的3′—羥基和5′—磷酸間形成磷酸二酯鍵。PCR循環(huán)中，升高溫度到95 ℃是為了打開氫鍵使雙鏈解旋，獲得DNA單鏈，TaqDNA聚合酶的作用是催化游離的脫氧核苷酸連接到引物3′端，合成DNA子鏈。(3)引物的作用是使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始延伸DNA子鏈，因?yàn)镈NA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸，故為擴(kuò)增未知序列，選擇的與模板鏈相結(jié)合的引物應(yīng)為5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′(引物④)和5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′(引物②)。(4)分析題意可知，片段F的兩端為限制酶EcoR Ⅰ切割后產(chǎn)生的黏性末端，因此其5′端序列應(yīng)為－AATT，3′端序列應(yīng)為－TTAA，B正確。
5.(2019·江蘇卷，33)圖1是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程示意圖，載體質(zhì)粒P0具有四環(huán)素抗性基因(tetr)和氨芐青霉素抗性基因(ampr)。請(qǐng)回答下列問題：
圖1
(1)EcoR V酶切位點(diǎn)為，EcoR V酶切出來的線性載體P1為________末端。
(2)用TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的目的基因片段，其兩端各自帶有一個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸。載體P1用酶處理，在兩端各添加了一個(gè)堿基為________的脫氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在________酶作用下，形成重組質(zhì)粒P3。
(3)為篩選出含有重組質(zhì)粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板進(jìn)行篩選，得到A、B、C三類菌落，其生長情況如表(“＋”代表生長，“－”代表不生長)。根據(jù)表中結(jié)果判斷，應(yīng)選擇的菌落是________(填表中字母)類，另外兩類菌落質(zhì)粒導(dǎo)入情況分別是________、________。
菌落類型 平板類型　　　　 A B C
無抗生素 ＋ ＋ ＋
氨芐青霉素 ＋ ＋ －
四環(huán)素 ＋ － －
氨芐青霉素＋四環(huán)素 ＋ － －
圖2
(4)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖2所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇的一對(duì)引物是________。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對(duì)引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400 bp片段，原因是_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
答案　(1)平　(2)胸腺嘧啶(T)　DNA連接　(3)B　A菌落含有P0　C類菌落未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒　(4)乙、丙　目的基因反向連接
解析　(1)EcoR V酶切位點(diǎn)在酶所識(shí)別序列的中心軸線處，產(chǎn)生的是平末端。(2)DNA連接酶對(duì)平末端的連接效率較低，因此通常要將平末端改造成黏性末端后再進(jìn)行連接。由于目的基因片段的兩端各自帶一個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，處理后的載體質(zhì)粒兩端需要各添加一個(gè)堿基為胸腺嘧啶的脫氧核苷酸；要將處理后的質(zhì)粒與目的基因連接起來，需要用DNA連接酶。(3)由于四環(huán)素抗性基因中含有EcoR V酶識(shí)別的序列及切割位點(diǎn)，所以形成的重組質(zhì)粒中四環(huán)素抗性基因已經(jīng)被破壞，而氨芐青霉素抗性基因正常。根據(jù)表中結(jié)果可知，A菌落抗氨芐青霉素和四環(huán)素，說明A菌落中導(dǎo)入的是P0質(zhì)粒；B菌落抗氨芐青霉素而不抗四環(huán)素，說明B菌落中導(dǎo)入的是重組質(zhì)粒；C菌落既不抗氨芐青霉素，也不抗四環(huán)素，說明C菌落中沒有導(dǎo)入質(zhì)粒。(4)由于處理后的P2質(zhì)粒的兩個(gè)末端都含一個(gè)胸腺嘧啶的脫氧核苷酸，而目的基因片段的兩端各自帶一個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸，所以目的基因在和P2質(zhì)粒連接時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)兩種情況：正向連接和反向連接。分析圖2可知，理論上可以選擇的引物組合有甲和丙、乙和丙兩種情況。如果選擇甲和丙這對(duì)引物，則無論目的基因是否正確插入，擴(kuò)增的片段都是50 bp＋300 bp＋100 bp＝450 bp，不符合要求；如果選擇乙和丙這對(duì)引物，正向連接和反向連接后所得結(jié)果不同，所以應(yīng)選擇乙和丙這對(duì)引物進(jìn)行PCR鑒定。如果目的基因和P2質(zhì)粒反向連接，則引物乙會(huì)出現(xiàn)在重組質(zhì)粒的外側(cè)，此時(shí)若加入引物甲和乙，則可以擴(kuò)增出300 bp＋100 bp＝400 bp的片段。

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