資源簡介

高中生物（新人教版）·選擇性必修三-知識點
1.1　傳統發酵技術的應用-知識點
【基礎知識】
知識點一　發酵與傳統發酵技術
1．發酵
(1)概念：是指人們利用微生物，在適宜的條件下，將原料通過微生物的代謝轉化為人類所需要的產物的過程。
(2)原理：不同的微生物具有產生不同代謝物的能力，利用它們就可生產出人們所需要的多種產物。
2．傳統發酵技術
(1)概念：直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次發酵保存下來的發酵物中的微生物進行發酵、制作食品的技術。
(2)方式：以混合菌種的固體發酵及半固體發酵為主，通常是家庭式或作坊式的。
(3)利用傳統發酵技術制作的食品
②其他：酒、醬、醬油、醋、泡菜和豆豉等。
知識點二　制作傳統發酵食品的微生物
1．乳酸菌
(1)生物類型：細菌。
(2)代謝類型：異養厭氧型菌。
(3)常見的種類：乳酸鏈球菌和乳酸桿菌兩種。
(4)分布：在自然界中分布廣泛，空氣、土壤、植物體表、人或動物腸道內都有分布。
(5)發酵原理：
在無氧條件下，乳酸菌經無氧呼吸將葡萄糖分解為乳酸。反應式：C6H12O62C3H6O3(乳酸)＋能量。
(6)應用：乳酸菌可用于乳制品的發酵、泡菜的腌制等。
2．酵母菌
(1)生物類型：單細胞真菌。
(2)代謝類型：異養兼性厭氧型。
(3)分布：一些含糖量較高的水果、蔬菜表面經常可以發現酵母菌的存在。
(4)生長溫度：釀酒酵母的最適生長溫度約為28℃。
(5)酒精發酵的反應式：C6H12O62C2H5OH(酒精)＋2CO2＋能量
(6)應用：在無氧條件下可以進行酒精發酵，可用于釀酒、制作饅頭和面包等。
3．醋酸菌
(1)生物類型：細菌。
(2)代謝類型：異養需氧型。
(3)生長溫度：多數醋酸菌的最適生長溫度為30～35 ℃。
(4)發酵原理：①當氧氣和糖源都充足時，醋酸菌能通過復雜的化學反應將糖分解成乙酸。
反應式：C6H12O6＋2O22CH3COOH(乙酸)＋2CO2＋2H2O＋能量。
②當氧氣充足，缺少糖源時，醋酸菌直接將乙醇轉化為乙醛，再將乙醛變為乙酸。
反應式：C2H5OH＋O2CH3COOH(乙酸)＋H2O＋能量
知識點三　嘗試制作傳統發酵食品
1．制作泡菜
(1)菌種來源：植物體表面天然乳酸菌。
(2)泡菜制作原理：在發酵期間，乳酸菌發酵，乳酸會不斷積累，當它的質量分數為0.4%～0.8%時，泡菜的口味、品質最佳。
(3)制作過程
(4)泡菜在腌制過程中會有亞硝酸鹽產生。膳食中的亞硝酸鹽一般不會危害人體健康，但如果人體攝入過量，會發生中毒，甚至死亡，因此需要跟蹤檢測制作過程中亞硝酸鹽含量的變化，探索腌制方法、時間長短和溫度高低等條件對亞硝酸鹽含量的影響。
2．制作果酒和果醋
(1)制作原理：許多新鮮水果(如葡萄)的果皮表面附著大量的不同種類的野生酵母菌，在它們的作用下，水果可以發酵成果酒。在有氧的條件下，果酒經醋酸菌的作用還可以進一步發酵成果醋。
(2)果酒和果醋的制作過程(以葡萄酒和葡萄醋的制作為例)
(3)結果鑒定
果酒：發酵后取樣，可通過嗅味和品嘗進行初步鑒定。此外，還可用顯微鏡觀察酵母菌，并用酸性重鉻酸鉀檢驗酒精的存在。
果醋：可通過觀察菌膜的形成、嗅味和品嘗進行初步鑒定，再通過檢測和比較乙酸發酵前后的pH(可用pH試紙)做進一步的鑒定。此外，還可以通過在顯微鏡下觀察發酵液中是否有醋酸菌，并統計其數量做進一步鑒定。
3．傳統發酵食品的缺點
存在菌種差異、雜菌情況不明和發酵過程的控制缺乏標準等問題，往往會造成發酵食品的品質不一。
【深入思考】
1．制作泡菜時，鹽水為什么配制成質量分數為5%～20%
食鹽用量過高，口味不佳，乳酸發酵受抑制，泡菜風味差；食鹽用量過低，則會導致雜菌大量繁殖，泡菜腐敗。
2．制作泡菜時，鹽水為什么煮沸后冷卻？
煮沸有兩大作用，一是除去水中氧氣，二是殺滅鹽水中的微生物。冷卻是為了防止殺死壇內的微生物。
3．用水密封泡菜壇的目的是什么？
給泡菜壇內創造無氧環境，嚴格控制無氧條件。
4．泡菜制作過程中，是否只有乳酸菌起作用？
不是，還有一些酵母菌和大腸桿菌等。
5．為什么泡菜壇只能裝八分滿？
提示：防止由于產生CO2而導致發酵液溢出壇外；防止因裝太滿使鹽水未完全淹沒菜料而導致菜料變質腐爛。
6．先沖洗葡萄后去枝梗的原因？為什么沖洗葡萄的次數不能過多？
先沖洗再除去枝梗可以避免除去枝梗時引起葡萄破損，增加被雜菌污染的機會。沖洗葡萄的次數不能過多，以防將葡萄皮上的野生型酵母菌沖洗掉。
7．葡萄汁裝入發酵瓶時，為什么要留有大約1/3的發酵空間？
因為初期有氧呼吸階段酵母菌需要氧氣，保留1/3的體積(空氣)可以為酵母菌提供氧氣，使酵母菌可以大量增殖，還可以防止發酵液在發酵過程中溢出甚至引起爆炸。
8．為什么果酒擱置時間過久會有酸味？
醋酸菌在缺乏糖源時，可以將酒精轉化為乙醛，再將乙醛轉化為乙酸，所以果酒擱置時間過久，會因醋酸菌的代謝產生乙酸而有酸味。
【課后歸納】
1、制作泡菜的注意事項
(1)用于制作泡菜的蔬菜應新鮮，若放置時間過長，蔬菜中的亞硝酸鹽含量相對較高。
(2)控制嚴格的無氧條件
①選擇合理的發酵容器，如泡菜壇，這是一種既科學又簡單的厭氧容器。
②鹽水煮沸后冷卻待用。
③裝壇時壓實，鹽水沒過全部菜料。
④泡菜壇用水封口不讓空氣進入，創造一個封閉無氧的環境，故發酵期間不宜開蓋，并注意在發酵過程中經常補水。
(3)控制適宜的發酵溫度
溫度過高易滋生雜菌，過低不利于乳酸發酵，會使發酵時間延長。
(4)控制發酵時間
發酵時間過短，會造成亞硝酸鹽含量偏高。
2、果酒發酵與果醋發酵的比較
果酒發酵 果醋發酵
發酵菌種 酵母菌 醋酸菌
菌種來源 附著在新鮮水果果皮表面的野生酵母菌 空氣中的醋酸菌或人工接種的醋酸菌
菌種代謝類型 異養兼性厭氧型 異養需氧型
菌種生物類型 真核生物 原核生物
發酵原理 C6H12O62C2H5OH(酒精)＋2CO2＋能量 C2H5OH＋O2 CH3COOH(乙酸)＋H2O＋能量(缺少糖源) C6H12O6＋2O22CH3COOH(乙酸)＋2H2O＋2CO2＋能量(糖源充足)
發酵條件 溫度 18～30℃ 30～35℃
時間 10～12 d 7～8 d
氧氣 前期需氧，后期不需氧 始終需氧
【課堂補充】
泡菜發酵過程中乳酸菌數量的變化情況
初期少：O2抑制乳酸菌活動
中期最多：乳酸抑制其他微生物活動
后期減少：乳酸積累，pH下降，抑制乳酸菌活動
泡菜發酵過程中乳酸含量的變化情況
初期少，中期增多，后期繼續增多，最后保持穩定
泡菜發酵過程中亞硝酸鹽含量的變化情況
初期增加：硝酸鹽還原菌的作用
中期開始下降：硝酸鹽還原菌受抑制，部分亞硝酸鹽被分解
后期繼續下降：硝酸鹽還原菌被完全抑制
器具消毒：防止污染發酵液
醋酸發酵：打開瓶蓋，創造有氧環境進行醋酸發酵
1.2.1　微生物的基本培養技術-知識點
【基礎知識】
知識點一　培養基的配制
1．實驗室培養微生物的要求
(1)為人們需要的微生物提供合適的營養和環境條件。
(2)確保其他微生物無法混入，并將需要的微生物分離出來。
2．培養基的概念
人們按照微生物對營養物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養基質，用以培養、分離、鑒定、保存微生物或積累其代謝物。
3．培養基的分類
4．培養基的營養組成
(1)一般組成：水、碳源、氮源和無機鹽等營養物質。
(2)特殊需求：滿足微生物生長對pH、特殊營養物質以及氧氣的需求。
①培養乳酸桿菌時，需要在培養基中添加維生素。
②培養霉菌時，一般需將培養基調至酸性。
③培養細菌時，一般需將培養基調至中性或弱堿性。
④培養厭氧微生物時，則需要提供無氧的條件。
易漏邊角
1．微生物是難以用肉眼觀察的微小生物的統稱，包括細菌、真菌、病毒及一些原生生物等。本章中提及的微生物主要指用于發酵的細菌和真菌。
2．牛肉膏和蛋白胨來源于動物，含有糖、維生素和有機氮等營養物質。
知識點二　無菌技術
1．目的：獲得純凈的微生物培養物。
2．關鍵是：防止雜菌污染。
3．主要方法
消毒 滅菌
概念 使用較為溫和的物理、化學或生物等方法殺死物體表面或內部一部分微生物 使用強烈的理化方法殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子
常用 方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化學藥物消毒法、紫外線消毒法 灼燒滅菌、干熱滅菌、濕熱滅菌等
適用對象 操作的空間、操作者的雙手和衣著等 接種環、接種針、玻璃器皿、培養基等
4．特別提醒
(1)做好消毒和滅菌工作后，應避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品接觸。
(2)為避免周圍環境中微生物的污染，實驗操作應在超凈工作臺上并在酒精燈火焰附近進行。
知識點三　微生物的純培養
1．相關概念
(1)培養物：在微生物學中，將接種于培養基內，在合適條件下形成的含特定種類微生物的群體。
(2)純培養物：由單一個體繁殖所獲得的微生物群體。
(3)純培養：獲得純培養物的過程。
2．微生物的純培養步驟：包括配制培養基、滅菌、接種、分離和培養等步驟。
知識點四　酵母菌的純培養
1．原理
(1)菌落：分散的微生物在適宜的固體培養基表面或內部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態結構的子細胞群體，這就是菌落。
(2)單菌落：一般是由單個微生物繁殖形成的純培養物。
(3)獲得單菌落的方法：稀釋涂布平板法、平板劃線法。
2．目的要求
(1)學會配制培養酵母菌的培養基并倒平板。
(2)學會進行無菌操作。
(3)嘗試通過平板劃線操作來獲得純化的酵母菌菌落。
3．酵母菌的純培養的方法步驟
(1)制備培養基
①配制培養基：馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂、蒸餾水。
②滅菌：培養基用高壓蒸汽滅菌；培養皿用干熱滅菌箱滅菌。
③倒平板：待培養基冷卻至50 ℃左右，在酒精燈火焰附近倒平板。步驟如下：
a．拔出錐形瓶的棉塞。
b．將瓶口迅速通過火焰。
c．用拇指和食指將培養皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，將培養基(10～20 mL)倒入培養皿，立即蓋上皿蓋。
d．等待培養基冷卻凝固后，將培養皿倒過來放置。
(2)接種和分離酵母菌
①方法
平板劃線法：通過接種環在固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基的表面。
聚集的菌群單個細胞菌落
②操作步驟
a．將接種環放在火焰上灼燒，直到接種環的金屬絲燒紅。
b．在火焰旁冷卻接種環。同時，拔出裝有酵母菌培養液的試管的棉塞。
c．將試管口通過火焰。
d．在火焰附近用接種環蘸取一環菌液。
e．將試管口通過火焰，并塞上棉塞。
f．在火焰附近將皿蓋打開一條縫隙，用接種環在培養基表面迅速劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。
g．灼燒接種環，待其冷卻后，從第一次劃線的末端開始作第二次劃線。重復以上操作，作第三、四、五次劃線。
③注意事項
a．蘸取菌液及每次劃線之前都需要灼燒接種環，劃線操作結束后仍需灼燒接種環，三種灼燒的目的不同。
灼燒時期 目的
蘸取菌液前 殺死接種環上原有的微生物
每次劃線前 殺死上一次劃線結束后接種環上殘留的菌種，使下一次劃線時接種環上的菌種直接來源于上一次劃線的末端
劃線操作結束后 殺死接種環上殘留的菌種，避免菌種污染環境和感染操作者
b．灼燒接種環之后，要等其冷卻后才能伸入菌液，以免溫度太高殺死菌種。
c．接種環只蘸一次菌液，但要在培養基不同位置連續劃線多次。
d．注意不要將最后一次的劃線與第一次的劃線相連。
e．在做第二次以及其后的劃線操作時，需要從上一次劃線的末端開始劃線。
目的：線條末端細菌的數目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。
f．劃線后，培養皿倒置培養。
(3)培養酵母菌
完成平板劃線后，待菌液被培養基吸收，將接種后的平板和一個未接種的平板倒置，放入28_℃左右(培養溫度因酵母菌種類的不同而稍有差異)的恒溫培養箱中培養24～48 h。
【深入思考】
1．如何通過培養基的營養組成判斷微生物的同化類型？
培養基中含有機碳源培養的是異養型微生物；培養基中不含有機碳源培養的是自養型微生物。
2．為什么各種培養基的具體配方不同，但一般都有水、無機鹽、碳源和氮源？
微生物的化學組成大體相同，主要由C、H、O、N、P、S等大量元素和Fe、Mn、Cu、Zn、B、Mo等微量元素組成，這些元素最終來自外界環境中的各種有機物和無機物。
3. 培養基滅菌后，需要冷卻到50 ℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養基的溫度？
可以用手觸摸盛有培養基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。
4. 為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？
通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養基。
5. 平板冷凝后，為什么要將平板倒置？
可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染。
6. 怎么確定所倒平板未被雜菌污染？
將所倒平板放入適宜溫度下的恒溫箱中培養一定的時間，觀察是否有菌落存在以確定是否被污染或滅菌是否徹底。
7．為什么要同時放入未接種的平板？
作對照，該培養皿無菌落說明培養基沒有污染。
8．如果你在培養基上觀察到了不同形態的菌落，你認為是由什么原因造成的？
培養基滅菌不徹底或接種過程中有雜菌污染。
【課堂補充】
1、怎樣才能保證無處不在的雜菌不混入發酵物中呢？
應該先對制作用具和原料進行滅菌處理，再接種純的菌種，并控制發酵條件，避免雜菌進入。
2、培養基的營養構成
碳源：無機碳源：CO2、CO32-、HCO3-（自養微生物）；有機碳源：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等（異養微生物）
氮源：無機氮源：NH4＋、NO3-、NH3等；有機氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
無機鹽：大量元素：Ca、K 、Mg等；微量元素：Zn、Cu、Mn、Co、Mo等
3、為什么培養基需要氮源？
是微生物合成蛋白質、核酸等物質所必需的。
4、無菌技術除用來防止實驗室的培養物被其他外來微生物污染外，還有什么作用？
有效避免操作者被微生物感染
5、為什么等待培養基冷卻凝固后，將培養皿倒轉過來放置
既可以防止培養基表面的水分揮發；又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染
6、平板劃線法注意事項
①接種環只蘸一次菌液，但要在培養基不同位置連續劃線多次；
②劃線首尾不能相接；
③每次劃線前接種環進行滅菌；
④劃線后，培養皿倒置培養
【知識拓展】
1．培養基的成分
培養不同的微生物所需要的營養物質可能不同，如自養型微生物的培養基不需要加入碳源。
2．培養基的配制原則
(1)目的要明確：配制時應根據微生物的種類、培養目的等確定配制的培養基種類，因為不同微生物對營養物質的需求不同。
(2)營養要協調：注意各種營養物質的濃度和比例。
(3)pH要適宜：各種微生物適宜生長的pH范圍不同。
(1)培養基滅菌后，需冷卻至50 ℃左右時才能倒平板，溫度過高會燙手，溫度過低培養基又會凝固。
(2)整個操作在酒精燈火焰旁進行，避免周圍環境中微生物的污染。
(3)倒平板時不要將培養基濺在皿蓋與皿底之間，否則此培養基不能用來培養微生物，因為空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養基上滋生。
3. 幾種常用滅菌和消毒方法的比較
滅菌和消毒種類 主要方法 應用范圍
煮沸消毒法 100 ℃煮沸5～6 min 家庭餐具等生活用品的消毒
巴氏消毒法 62～65 ℃消毒30 min或80～90 ℃處理30 s～1 min 牛奶、啤酒、果酒和醬油等不宜進行高溫滅菌的液體
紫外線消毒法 紫外線照射30 min 接種室、接種箱、超凈工作臺
化學藥物消毒法 用體積分數為70%～75%的酒精 用于皮膚、傷口、動植物組織表面、塑料或玻璃器皿等的消毒
氯氣 消毒水源
灼燒滅菌 酒精燈火焰灼燒 如涂布器、接種環、接種針或其他金屬用具等，接種過程中的試管口或瓶口等
干熱滅菌 干熱滅菌箱160～170 ℃維持2～3 h 玻璃器皿(如吸管、培養皿等)、金屬用具等
高壓蒸汽滅菌(屬于濕熱滅菌) 100 kPa、121 ℃維持15～30 min 培養基及多種器材、物品
1.2.2　微生物的選擇培養和計數-知識點
【基礎知識】
知識點一　選擇培養基
1．自然界中目的菌的篩選
(1)篩選的依據：根據微生物對生存環境的要求，到相應的環境中去尋找。
(2)實例：從熱泉中篩選出水生棲熱菌。
2．實驗室中微生物的篩選
(1)原理：人為提供有利于目的菌生長的條件(包括營養、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物的生長。
(2)方法：利用選擇培養基篩選。
3．選擇培養基
(1)概念：在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基，稱為選擇培養基。
(2)選擇培養基配方的設計(以篩選能分解尿素的細菌的培養基為例)
①土壤中尿素被分解的原理：土壤中某些細菌能合成脲酶，其可以催化尿素分解產生NH3，NH3再轉化為NO、NH等被植物吸收，NH3還可以作為細菌生長的氮源。
培養基配方
知識點二　微生物的選擇培養
1．方法
稀釋涂布平板法：對土壤進行充分稀釋，然后再將菌液涂布到制備好的選擇培養基上。
2．步驟
(1)梯度稀釋
①鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中。
②將10 g土樣加到盛有90 mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻。取1 mL上清液加入盛有9 mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。
(2)涂布平板
①取0.1 mL菌液，滴加到培養基表面。
②將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。
③將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進行涂布。
④用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基表面。涂布時可轉動培養皿，使涂布均勻。
(3)培養：待涂布的菌液被培養基吸收后，將平板倒置，放入30～37 ℃的恒溫培養箱中培養1～2 d。在涂布有合適濃度菌液的平板上就可以觀察到分離的單菌落。
3．注意事項
(1)將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中，取出時，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后再放在火焰上灼燒。
(2)操作中一定要注意防火！不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃酒精。
知識點三　微生物的數量測定
1．稀釋涂布平板法
(1)原理：當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。
(2)計數原則
①一般選擇菌落數為30～300、適于計數的平板。
②在同一稀釋度下，應至少對3個平板進行重復計算，然后求出平均值。
(3)結果分析
①統計的菌落數往往比活菌的實際數目少，這是因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。
②統計結果一般用菌落數而不是用活菌數表示。
(4)作用：分離微生物；統計活菌數量。
2．顯微鏡直接計數法
(1)原理：利用特定的細菌計數板或血細胞計數板，在顯微鏡下觀察、計數，然后再計算一定體積的樣品中微生物的數量。
(2)結果：一般統計的是活菌數和死菌數的總和。
(3)優點：一種常用的、快速直觀地測定微生物數量的方法。
易漏邊角
細菌計數板和血細胞計數板的計數原理相同。血細胞計數板比細菌計數板厚，常用于相對較大的酵母菌細胞、霉菌孢子等的計數。用細菌計數板可對細菌等較小的細胞進行觀察和計數。
知識點四　實驗：土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
1．原理：絕大多數微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作為唯一氮源的選擇培養基，可以從土壤中分離出分解尿素的細菌。
2．步驟
(1)培養基配方
培養基 含量 提供的營養或作用
KH2PO4 1.4 g 無機鹽
Na2HPO4 2.1 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
葡萄糖 10.0 g 碳源
尿素 1.0 g 氮源
瓊脂 15.0 g 凝固劑
蒸餾水 定容至1000 mL 水
(2)土壤取樣
①要求：從酸堿度接近中性的潮濕土壤中取樣。
②取樣層：先鏟去表層土，在距地表約3～8 cm的土壤層取樣。
(3)樣品的稀釋
①稀釋倍數：測定土壤中細菌的數量，一般選用1×104、1×105和1×106倍稀釋的稀釋液進行平板培養。
②初次實驗時，對于稀釋的范圍沒有把握，可以選擇一個比較寬的稀釋范圍，將1×103～1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布到平板上培養，以保證能從中選擇出菌落數在30～300的平板進行計數。
(4)微生物的培養與觀察
①不同種類的微生物往往需要不同的培養溫度和時間，細菌一般在30～37 ℃的溫度下培養1～2 d。
②本實驗中，我們可以每隔24 h統計一次菌落數目，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果。
③一般來說，在相同的培養條件下，同種微生物表現出穩定的菌落特征，包括菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等方面。
3．注意事項
(1)要按照前面學習過的無菌操作的方法，進行規范操作。取土樣時用的鐵鏟和取樣紙袋在使用前都需要滅菌。操作完成后，一定要洗手。
(2)本實驗使用的平板和試管較多，為了避免混淆，最好在使用前做好標記。例如，在標記培養皿時應該注明組別、培養日期和平板上培養樣品的稀釋度等。
(3)本實驗耗時較長，需要事先規劃時間，以便提高實驗效率，在操作時有條不紊。
4．分解尿素的細菌的進一步鑒定
(1)鑒定原理
細菌合成的脲酶將尿素分解成氨，氨會使培養基的堿性增強，pH升高。因此，可通過檢測培養基pH的變化來判斷該化學反應是否發生。
(2)鑒定方法
在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑，培養某種細菌后，如果pH升高，指示劑將變紅，可初步鑒定該種細菌能夠分解尿素。
【深入思考】
1、能在選擇培養基上生長的一定是目的菌嗎？為什么？
不一定。原則上選擇培養基只能允許特定種類的微生物生長，但實際上，微生物的培養是一個非常復雜的問題，有些微生物可以利用其他微生物的代謝產物生長繁殖，因此能在選擇培養基上生長的微生物不一定都是所需的微生物，還需進一步的鑒定。
2、如何設置對照組？
設置牛肉膏蛋白胨培養基作對照。
3、如何鑒定培養物中是否有雜菌污染以及選擇培養基是否篩選出菌落？
空白對照的培養皿在培養過程中沒有菌落生長，說明培養基沒有被雜菌污染。牛肉膏蛋白胨培養基的菌落數目明顯大于選擇培養基的數目，說明選擇培養基已篩選出一些菌落。
【課后歸納】
平板劃線法和稀釋涂布平板法的異同點
平板劃線法 稀釋涂布平板法
相同點 都能將微生物分散到固體培養基表面，以獲得單細胞菌落；接種工具都需要滅菌(無菌操作)
不同點 接種工具 接種環 涂布器
操作難易程度 操作簡便 需要先進行梯度稀釋，再進行涂布，操作相對繁瑣
選擇培養微生物的兩種方法
(1)可利用分離對象對某一營養物質有“嗜好”的原理，專門在培養基中加入該營養物質，從而使分離對象可大量增殖，在數量上占優勢。
(2)可利用分離對象對某種抑菌物質的抗性，在混合培養物中加入該抑菌物質，經培養后，其他微生物生長受抑制，而分離對象卻可大量增殖，在數量上占優勢。
【課堂補充】
1、不加碳源：自養微生物；不加氮源：固氮微生物；加入青霉素：酵母菌和霉菌(青霉素能殺死細菌、放線菌)
；加高濃度食鹽：金黃色葡萄球菌；石油是唯一碳源：能消除石油污染的微生物
2、你如何設計培養基配方，將土壤稀釋液中能分解尿素的細菌分離出來？
培養基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生長發育繁殖。
3、分離、研究土壤樣品中中能分解尿素的細菌實驗流程：
選擇培養基的制備→對土壤樣品進行稀釋→涂布平板操作→培養并觀察培養基菌落→計數土壤樣品中菌落數目
4、取樣涂布平板：一浸、二滴、三燒、四涂
5、設置兩個空白對照：不涂布稀釋液的選擇培養基和牛肉膏蛋白胨培養基（以驗證培養基中是否含有雜菌
）
6、選擇培養基、完全培養基對照：判斷選擇培養基是否具有篩選作用
7、培養時設置對照組一同培養
對照組：驗證是否有雜菌：未接種的選擇培養基、未接種的牛肉膏蛋白胨培養基
驗證是否具有篩選作用：接種的牛肉膏蛋白胨培養基
8、每克樣品中的菌落數＝(C÷V)×M（C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數）
9、土壤中分解尿素的細菌的分離和計數
（1）原理：脲酶催化尿素分解成氨→培養基堿性增強→ 酚紅變紅→脲酶陽性
（2）在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑。培養某種細菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細菌能夠分解尿素。
①液體培養基可以直接看液體的變色情況；
②固體培養基上可以觀察菌落周圍是否出現紅色環帶，紅色環帶直徑與菌落直徑比值越大，說明分解能力越強
10、測定飲水中大腸桿菌數量的方法：
將一定體積的水用細菌過濾器過濾后，將濾膜放到伊紅—美藍培養基上培養，大腸桿菌菌落呈現黑色，通過記算得出水樣中大腸桿菌的數量
1.3　發酵工程及其應用-知識點
【基礎知識】
知識點一　發酵工程的概念及形成
1．發酵工程的概念：是指利用微生物的特定功能，通過現代工程技術，規模化生產對人類有用的產品。
2．發酵工程的形成
知識點二　發酵工程的基本環節
1．菌種的選育
(1)來源：性狀優良的菌種可以從自然界中篩選出來，也可以通過誘變育種或基因工程育種獲得。
(2)目的：可以加速發酵過程，縮短生產周期。
(3)實例：生產檸檬酸就需要篩選產酸量高的黑曲霉。在啤酒生產中，使用基因工程改造的啤酒酵母。
2．擴大培養
工業發酵罐的體積一般為幾十立方米到幾百立方米，接入的菌種總體積需要幾立方米到幾十立方米。所以，在發酵之前還需要對菌種進行擴大培養。
3．培養基的配制
在菌種確定之后，要選擇原料制備培養基。在生產實踐中，培養基的配方要經過反復試驗才能確定。
4．滅菌
(1)原因：發酵工程中所用的菌種大多是單一菌種，一旦有雜菌污染，可能導致產量大大下降。
(2)要求：培養基和發酵設備都必須經過嚴格的滅菌。
(3)實例：在青霉素生產過程中如果污染了雜菌，某些雜菌會分泌青霉素酶將青霉素分解掉。
5．發酵——發酵工程的中心環節
(1)發酵時要求：在發酵過程中，要隨時檢測培養液中的微生物數量、產物濃度等，以了解發酵進程。還要及時添加必需的營養組分，要嚴格控制溫度、pH和溶解氧等發酵條件。
(2)嚴格控制發酵條件的原因：環境條件不僅會影響微生物的生長繁殖，而且會影響微生物代謝物的形成。例如，谷氨酸的發酵生產：在中性和弱堿性條件下會積累谷氨酸；在酸性條件下則容易形成谷氨酰胺和N 乙酰谷氨酰胺。
(3)大型發酵罐的優點：現代發酵工程使用的大型發酵罐均有計算機控制系統，能對發酵過程中的溫度、pH、溶解氧、罐壓、通氣量、攪拌、泡沫和營養等進行監測和控制；還可以進行反饋控制，使發酵全過程處于最佳狀態。
6．分離、提純產物
(1)如果發酵產品是微生物細胞本身：可在發酵結束之后，采用過濾、沉淀等方法將菌體分離和干燥，即可得到產品。
(2)如果發酵產品是代謝物：可根據產物的性質采取適當的提取、分離和純化措施來獲得產品。
知識點三　發酵工程的應用
1．發酵工程特點：生產條件溫和、原料來源豐富且價格低廉、產物專一、廢棄物對環境的污染小和容易處理等特點。
2．在食品工業上的應用
(1)生產傳統的發酵產品
①意義：使這些產品的產量和質量明顯提高。
②實例：醬油(霉菌)、酒類(酵母菌)。
③案例：啤酒的工業化生產流程
a．發酵過程分為主發酵和后發酵兩個階段。
酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代謝物的生成都在主發酵階段完成，主發酵結束后，發酵液不適合飲用，要在低溫、密閉的環境下儲存一段時間進行后發酵，才能形成澄清、成熟的啤酒。
b．發酵的溫度和發酵的時間隨啤酒品種和口味要求的不同而有所差異。
c．工業化生產流程
(2)生產各種各樣的食品添加劑
①食品添加劑的作用
增加食品的營養，改善食品的口味、色澤和品質，有時還可以延長食品的保存期。
②實例
添加劑類型 舉例
酸度調節劑 L 蘋果酸、檸檬酸、乳酸
增味劑 5′ 肌苷酸二鈉、谷氨酸鈉
著色劑 β－胡蘿卜素、紅曲黃色素
增稠劑 黃原膠、β 環狀糊精、結冷膠
防腐劑 乳酸鏈球菌素、溶菌酶
(3)生產酶制劑
①實例：α－淀粉酶、β－淀粉酶、果膠酶、氨基肽酶和脂肪酶等。
②酶制劑的作用
可用于食品的直接生產、改進生產工藝、簡化生產過程、改善產品的品質和口味、延長食品儲存期和提高產品產量等。
3．在醫藥工業上的應用
(1)人們可以采用基因工程的方法，將植物或動物的基因轉移到微生物中，獲得具有某種藥物生產能力的微生物。
(2)直接對菌種進行改造，再通過發酵技術大量生產所需要的產品。例如，利用經過基因改造的微生物進行發酵生產生長激素釋放抑制激素。
(3)未來甚至還可能用微生物來生產過去只能從植物中分離提取的紫杉醇、青蒿素前體等化合物。
(4)科學家還利用基因工程，將病原體的某個或某幾個抗原基因轉入適當的微生物細胞，獲得的表達產物就可以作為疫苗使用。例如，一種生產乙型肝炎疫苗的方法就是將乙型肝炎病毒的抗原基因轉入酵母菌，再通過發酵生產。
4．在農牧業上的應用
(1)生產微生物肥料
①利用微生物在代謝過程中產生的有機酸、生物活性物質等來增進土壤肥力，改良土壤結構，促進植株生長，常見的有根瘤菌肥、固氮菌肥等。
②有的微生物肥料還可以抑制土壤中病原微生物的生長，從而減少病害的發生。
(2)生產微生物農藥
①作用原理：利用微生物或其代謝物來防治病蟲害。
②實例：蘇云金桿菌用來防治農林蟲害；白僵菌可以防治玉米螟、松毛蟲等蟲害；一種放線菌產生的井岡霉素可以用于防治水稻枯紋病。
(3)生產微生物飼料
①微生物的優點：a.含有豐富的蛋白質，如細菌的蛋白質含量占細胞干重的60%～80%；b.生長繁殖速度很快；c.利用途徑廣泛。
②實例
a．單細胞蛋白：以淀粉或纖維素的水解液、制糖工業的廢液等為原料，通過發酵獲得了大量的微生物菌體，即單細胞蛋白。用酵母菌等生產的單細胞蛋白可以作為食品添加劑；用單細胞蛋白制成的微生物飼料，能使家畜、家禽增重快，產奶或產蛋量顯著提高。
b．在青貯飼料中添加乳酸菌，可以提高飼料的品質，使飼料保鮮，動物食用后還能提高免疫力。
5．在其他方面的應用
(1)利用纖維廢料發酵生產酒精、乙烯等能源物質。
(2)嗜熱菌、嗜鹽菌可以用來生產洗滌劑。
(3)嗜低溫菌有助于提高熱敏性產品的產量。
【課堂補充】
1、溫度控制;
前期：采用稍高的溫度，能促進菌的呼吸與代謝，使菌生長迅速
中期：適當降低溫度，延長發酵時間，提高產量
后期：提高發酵溫度，刺激產物釋放
2、溶解氧調控的主要手段：通風和攪拌
2.1.1　植物細胞工程的基本技術-知識點
【基礎知識】
知識點一　細胞工程和細胞的全能性
1．細胞工程的含義
原理和方法 細胞生物學、分子生物學和發育生物學等
操作水平 細胞器、細胞或組織水平
目的 有目的地獲得特定的細胞、組織、器官、個體或其產品
分類 植物細胞工程和動物細胞工程(含胚胎工程)
2．細胞的全能性
(1)定義：細胞經分裂和分化后，仍然具有產生完整生物體或分化成其他各種細胞的潛能。
(2)生物的生長發育過程中，并不是所有的細胞都表現出全能性
①原因：在特定的時間和空間條件下，細胞中的基因會選擇性表達。
②實例：芽原基的細胞只能發育成芽，葉原基的細胞只能發育成葉。
知識點二　植物組織培養技術
1．概念：將離體的植物器官、組織或細胞等，培養在人工配制的培養基上，給予適宜的培養條件，誘導其形成完整植株的技術。
2．原理：植物細胞的全能性。
3．過程
知識點三　實驗：菊花的組織培養
1．實驗原理
(1)植物細胞一般具有全能性。
(2)植物激素中生長素和細胞分裂素是啟動細胞分裂、脫分化和再分化的關鍵激素，它們的濃度、比例等都會影響植物細胞的發育方向。
(3)將愈傷組織接種到含有特定激素的培養基上，就可以誘導其再分化成胚狀體，長出芽和根，進而發育成完整的植株。
2．方法步驟
(1)制備外植體
①材料：幼嫩的菊花莖段。
②消毒：
③切割：將消過毒的外植體置于無菌的培養皿中，用無菌濾紙吸去表面的水分。用解剖刀將外植體切成0.5～1 cm長的小段。
(2)接種到誘導愈傷組織的培養基
①在酒精燈火焰旁，將外植體的1/3～1/2插入誘導愈傷組織的培養基中。用封口膜或瓶蓋封蓋瓶口，并在培養瓶上做好標記。
②將接種了外植體的錐形瓶或植物組織培養瓶置于18～22 ℃的培養箱中培養。在培養過程中，定期觀察和記錄愈傷組織的生長情況。
(3)接種到誘導生芽、生根的培養基
培養15～20 d后，將生長良好的愈傷組織轉接到誘導生芽的培養基上。長出芽后，再將其轉接到誘導生根的培養基上，進一步誘導形成試管苗。
(4)移栽
移栽前先打開封口膜或瓶蓋，讓試管苗在培養箱內生長幾日。用流水清洗掉根部的培養基后，將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環境中，待其長壯后再移栽入土。每天觀察并記錄幼苗的生長情況，適時澆水、施肥，直至開花。
3．注意事項
(1)實驗中使用的培養基和所有的器械都要滅菌。接種操作必須在酒精燈火焰旁進行，并且每次使用后的器械都要滅菌。
(2)接種時注意外植體的方向，不要倒插。
(3)誘導愈傷組織期間一般不需要光照，在后續的培養過程中，每日需要給予適當時間和強度的光照。
(4)植物組織培養中兩個重要激素：生長素和細胞分裂素。它們比值不同，作用不同。若生長素含量高(生長素/細胞分裂素>1)，促進根的分化；若細胞分裂素含量高(生長素/細胞分裂素<1)，促進芽的分化；若二者含量相當，促進愈傷組織的形成。
4．細胞表現全能性的條件
(1)離體狀態。
(2)無菌操作。
(3)種類齊全、比例適合的營養物質。
(4)植物激素(主要是生長素和細胞分裂素)誘導和調節。
(5)適宜的外界條件(溫度、pH、光照等)。
知識點四　植物體細胞雜交技術
1．概念：將不同來源的植物體細胞，在一定條件下融合成雜種細胞，并把雜種細胞培育成新植物體的技術。
2．過程
(1)基本過程
(2)操作要點
①去壁：用纖維素酶和果膠酶去除植物細胞壁，獲得原生質體。
②誘導原生質體融合的方法
物理法：電融合法、離心法等。
化學法：聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2＋—高pH融合法等。
3．原理
(1)原生質體的融合依賴于細胞膜的流動性。
(2)將雜種細胞培育成雜種植株是組織培養的過程，依賴于植物細胞的全能性。
4．意義（優點）：在打破生殖隔離，實現遠緣雜交育種，培育植物新品種等方面展示出獨特的優勢
【深入思考】
1．理論上每種植物的活細胞都具有全能性，原因是什么？
正常的植物細胞具有發育成該物種個體所需的全部遺傳物質。
2．植物的種子發育成完整植株是否體現了全能性？為什么？
否。因為種子中的胚已經完成早期發育，相當于新植株的幼體，由幼體發育成完整植株不能體現出細胞的全能性。
3．為什么融合后的雜種細胞經過篩選后才能進行植物組織培養？
提示：體細胞融合成功以后，既有AB型雜種細胞，還有AA型和BB型兩種融合細胞，但只有AB型細胞是植物體細胞雜交技術所需的雜種細胞，因此在雜種細胞形成后還應有一個篩選過程。
4．植物體細胞融合與植物體細胞雜交技術結束的標志有何不同？
提示：前者是再生出細胞壁，后者是形成雜種植株。
5．為什么用酶解法去除細胞壁？
提示：酶解法是在常溫下進行的，且酶具有專一性，不會影響原生質體的生命活動。
【課后歸納】
植物體細胞雜交后的遺傳物質分析
(1)遺傳特性：雜種植株中含有兩種植物的遺傳物質，故雜種植株具備兩種植物的遺傳特性。
(2)染色體組數
①染色體組數＝兩種植物體細胞內染色體組數之和。
②植物體細胞雜交形成的雜種植株，有幾個染色體組就稱為幾倍體。
③若一植物細胞含有2x條染色體，2個染色體組，基因型為Aabb，另一植物細胞含有2y條染色體，2個染色體組，基因型為ccDd，經體細胞雜交以及組織培養形成雜種植株，則新植株應為異源四倍體，其體細胞中染色體為(2x＋2y)條，4個染色體組，基因型為AabbccDd。
【課堂補充】
1、如何能讓名貴的蘭花大量、快速地繁殖？
利用植物組織培養技術可以大量、快速地培育蘭花
2、細胞具有全能性原因：細胞含有該物種生長發育所特有的全套遺傳物質
細胞全能性的標志：細胞 → 完整個體或其他各種細胞
全能性的高低：分化程度越高，全能性越低
受精卵>胚胎干細胞>生殖細胞(精細胞、卵細胞)>體細胞；植物細胞的全能性>動物細胞全能性
3、植物組織培養技術：
生殖方式：無性生殖
分裂方式：有絲分裂
4、芽發育成葉，葉肉細胞中葉綠素的合成需要光照
5、誘導愈傷組織需避光培養；誘導芽和根需適時光照培養
6、接種3-4d后，檢查外植體的生長情況，統計有多少外植體被污染，試分析它們被污染的可能原因：
外植體消毒不徹底；培養基、接種工具滅菌不徹底；操作過程不符合無菌操作要求等
7、植物組織培養的兩種途徑：
器官發生途徑：
胚狀體途徑：
韌皮部→
8、胚狀體：離體培養條件下，沒有經過受精過程，但經過胚胎發育過程形成的胚狀類似物
9、植物體細胞雜交技術：
基礎技術：植物組織培養
變異類型：染色體數目的變異
成功標志：獲得雜種植株
植物細胞融合完成的標志：獲得雜種細胞（再生出細胞壁）
植物體細胞雜交技術完成的標志：獲得雜種植株
2.1.2　植物細胞工程的應用-知識點
【基礎知識】、
知識點一　植物繁殖的新途徑
1．快速繁殖
(1)概念：快速繁殖優良品種的植物組織培養技術稱為植物的快速繁殖技術，也叫作微型繁殖技術。
(2)實質：植物的組織培養。
(3)特點
①高效、快速地實現種苗的大量繁殖。
②保持優良品種的遺傳特性。
(4)適用對象：一些優良的觀賞植物、經濟林木、無性繁殖作物和瀕危植物等。
(5)實例：甘蔗、桉樹和鐵皮石斛等試管苗的生產。
易漏邊角
鐵皮石斛富含某些糖類和生物堿，可以用來提取藥物。
2．作物脫毒
(1)選材及原因：植物頂端分生區附近(如莖尖)的病毒極少，甚至無病毒。
(2)方法：莖尖組織培養技術。
(3)優點：脫毒作物產量和品質明顯優于沒有脫毒的作物。
(4)實例：馬鈴薯、草莓、大蒜、甘蔗、菠蘿、香蕉等脫毒植株的培育。
【脫毒苗不等于抗毒苗，與微型繁殖相比較，二者無本質區別，只是取材部位不同。】
知識點二　作物新品種的培育
1．單倍體育種
(1)過程：花藥(或花粉)單倍體幼苗正常植株優良品種
(2)原理：染色體數目變異、植物細胞全能性。
(3)優點
①當年就能培育出遺傳性狀相對穩定的純合二倍體植株，極大地縮短了育種的年限，節約了大量的人力和物力。
②由于大多數單倍體植株的細胞中只含有一套染色體，染色體加倍后得到的植株的隱性性狀容易顯現，因此它也是進行體細胞誘變育種和研究遺傳突變的理想材料。
(4)實例
①1974年，我國科學家成功培育出世界上第一個單倍體作物新品種——單育1號煙草。
②把單倍體育種與常規育種結合起來，育成了水稻、玉米、油菜和甜椒等作物的新品種。
2．突變體的利用
(1)過程：在植物組織培養過程中，由于培養細胞一直處于不斷增殖的狀態，因此它們容易受到培養條件和誘變因素(如射線、化學物質等)的影響而產生突變。從產生突變的個體中可以篩選出對人們有用的突變體，進而培育成新品種。
(2)原理：突變和植物細胞的全能性。
(3)實例：抗病、抗鹽、高產以及蛋白質含量高的突變體，有些品種已經用于生產，如抗花葉病毒的甘蔗、抗鹽堿的煙草等
知識點三　細胞產物的工廠化生產
1．次生代謝物
(1)含義：植物代謝會產生一些一般認為不是植物基本的生命活動所必需的產物——次生代謝物。
(2)本質：小分子有機化合物(如酚類、萜類和含氮化合物等)。
(3)作用：在植物抗病、抗蟲等方面發揮作用，也是很多藥物、香料和色素等的重要來源。
易漏邊角
初生代謝是生物生長和生存所必需的代謝活動，因此在整個生命過程中它一直進行著。初生代謝物有糖類、脂質、蛋白質和核酸等。次生代謝不是生物生長所必需的，一般在特定的組織或器官中，并在一定的環境和時間條件下才進行。
2．細胞產物的工廠化生產
(1)定義：利用植物細胞培養來獲得目標產物的過程就是細胞產物的工廠化生產。
(2)植物細胞培養：指在離體條件下對單個植物細胞或細胞團進行培養使其增殖的技術。
(3)優點：它不占用耕地，幾乎不受季節、天氣等的限制，因此對于社會、經濟、環境保護具有重要意義。
(4)實例：紫草寧、紫杉醇、人參皂苷
【深入思考】
1．快速繁殖是無性生殖嗎？
快速繁殖實際是一種無性生殖，繁殖過程中細胞的分裂方式是有絲分裂，親、子代細胞內遺傳物質相同，因此能保證親、子代遺傳特性不變。
2．為何植物分生區附近病毒少？
植物分生區附近，細胞分裂十分迅速，病毒來不及侵入，因此就成為植物體相對無病毒的特殊區域。
4．單倍體育種中為何要進行人工誘導染色體加倍？常用的誘導方法是什么？
單倍體植株弱小，高度不育。通常用秋水仙素或低溫處理單倍體幼苗，誘導其染色體加倍。
5．二倍體的單倍體育種和花藥離體培養獲得的植株有什么區別？
花藥離體培養得到的植株是單倍體，表現為高度不育；單倍體育種是在花藥離體培養的基礎上，用適當濃度的秋水仙素或低溫處理，獲得純合的二倍體植株是可育的
6、單倍體育種與多倍體育種的異同。
單倍體育種和多倍體育種均需要用秋水仙素或低溫誘導染色體數目加倍。單倍體育種需要植物組織培養先形成單倍體幼苗，但多倍體育種一般不使用植物組織培養技術
【課后歸納】
1、四種生物技術的比較
項目 植物組織培養 突變體的利用 單倍體育種 植物體細胞雜交
原理 植物細胞的全能性 突變、植物細胞的全能性 花粉細胞的全能性、染色體數目變異 細胞膜的流動性、植物細胞的全能性
重要步驟 脫分化、再分化 對愈傷組織誘變處理 花藥離體培養、秋水仙素或低溫誘導染色體數目加倍 原生質體融合、雜種細胞組織培養
優點 保持優良品種的遺傳特性 提高突變率，獲得優良性狀 明顯縮短育種年限 打破生殖隔離，實現遠緣雜交育種
舉例 微型繁殖、脫毒苗培育、人工種子培育 抗花葉病毒的甘蔗、抗鹽堿的煙草 單育1號煙草 培育“番茄—馬鈴薯”雜種植株
2、植物組織培養與植物細胞培養的比較
項目 植物組織培養 植物細胞培養
目的 獲得植物體 獲得細胞產物
培養基 固體培養基 液體培養基
實例 脫毒苗 人參皂苷的生產
【課堂補充】
1、
① 一般組織培養到愈傷組織即可（因為此時細胞分裂能力旺盛，代謝快，有利于產物生成。）
②液體培養基（培養液）有利于培養的細胞與營養物質充分接觸
2.2.1動物細胞培養-知識點
【基礎知識】
知識點一　動物細胞工程
1．常用的技術手段：動物細胞培養、動物細胞核移植、動物細胞融合等。
2．基礎：動物細胞培養。
知識點二　動物細胞培養
1．概念：從動物體中取出相關的組織，將它分散成單個細胞，然后在適宜的培養條件下，讓這些細胞生長和增殖的技術。
2．地位：動物細胞工程的基礎。
3．條件
(1)營養
①細胞在體外培養時，培養基中應含有細胞所需要的各種營養物質，例如，糖類、氨基酸、無機鹽、維生素等。
②將細胞所需的營養物質按種類和所需量嚴格配制而成的培養基，稱為合成培養基。在使用合成培養基時，通常需要加入血清等一些天然成分。培養動物細胞一般使用液體培養基，也稱為培養液。
(2)無菌、無毒的環境
①對培養液和所有培養用具進行滅菌處理。
②在無菌環境下進行操作。
③還需要定期更換培養液以便清除代謝物，防止細胞代謝物積累對細胞自身造成危害。
(3)溫度、pH和滲透壓
①適宜溫度：哺乳動物細胞培養的溫度多以 (36.5±0.5) ℃為宜。
②適宜pH：多數動物細胞生存的適宜pH為7.2～7.4。
③適宜滲透壓：維持適宜滲透壓的目的是維持細胞正常的形態和功能。
(4)氣體環境
①組成
動物細胞培養所需氣體主要有O2和CO2。
②不同氣體的作用
O2是細胞代謝所必需的；CO2的主要作用是維持培養液的pH。
③培養容器
通常采用培養皿或松蓋培養瓶。
④培養儀器
含有95%空氣和5%CO2的混合氣體的CO2培養箱。
4．基本過程
5．注意事項
(1)將動物組織分散成單個細胞的方法
(2)原代培養
①具體做法
將組織分散成單個細胞，用培養液將細胞制成細胞懸液，將細胞懸液放入培養皿或培養瓶內。
②體外培養細胞的兩大類
a．能夠懸浮在培養液中生長增殖。
b．需要貼附于某些基質表面才能生長增殖(大多數細胞)。
(3)分瓶、傳代培養
①需分瓶進行傳代培養的原因
懸浮培養的細胞會因細胞密度過大、有害代謝物積累和培養液中營養物質缺乏等因素而分裂受阻。貼壁細胞在生長增殖時，除受上述因素影響外，還會發生接觸抑制現象。
②分瓶的具體做法
a．懸浮生長類
直接用離心法收集之后，將收集的細胞制成細胞懸液，分瓶培養。
b．貼壁生長類
重新用胰蛋白酶等處理，使之分散成單個細胞，然后再用離心法收集，將收集的細胞制成細胞懸液，分瓶培養。
(4)重要名詞解釋
①原代培養
通常將分瓶之前的細胞培養，即動物組織經處理后的初次培養稱為原代培養。
②傳代培養
將分瓶后的細胞培養稱為傳代培養。
③細胞貼壁
大多數體外培養的細胞需要貼附于某些基質表面才能生長增殖，這類細胞往往貼附在培養瓶的瓶壁上，這種現象稱為細胞貼壁。
④接觸抑制
當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞通常會停止分裂增殖。
知識點三　干細胞培養及其應用
1．存在場所：早期胚胎、骨髓和臍帶血等多種組織和器官中。
2．類型
(1)胚胎干細胞(簡稱ES細胞)
①定義：存在于早期胚胎中，具有分化為成年動物體內的任何一種類型的細胞，并進一步形成機體的所有組織和器官甚至個體的潛能。
②應用：ES細胞可以在體外分化成心肌細胞、神經元和造血干細胞等細胞。
(2)成體干細胞
①定義：是成體組織或器官內的干細胞，包括骨髓中的造血干細胞、神經系統中的神經干細胞和睪丸中的精原干細胞等。
②特點：有組織特異性，只能分化成特定的細胞或組織，不具有發育成完整個體的能力。
③發現最早、研究最多、應用也最為成熟的實例：造血干細胞，主要存在于成體的骨髓、外周血和臍帶血中。
3．應用
(1)與組織、器官的發育、再生和修復等密切相關，因而在醫學上有著廣泛的應用
①將正常的造血干細胞移植到病人體內，恢復病人的造血和免疫功能，已成為治療白血病及一些惡性腫瘤放療或化療后引起的造血系統、免疫系統功能障礙等疾病的一種重要手段。
②神經干細胞在治療神經組織損傷和神經系統退行性疾病(如帕金森病、阿爾茨海默病等)方面有重要的應用價值。
(2)誘導多能干細胞(簡稱iPS細胞)
①最初是經體外誘導小鼠成纖維細胞獲得的，并用iPS細胞治療了小鼠的鐮狀細胞貧血。
②現在，用iPS細胞治療阿爾茨海默病、心血管疾病等領域的研究也取得了新進展。
③iPS細胞的應用前景優于胚胎干細胞。
易漏邊角
科學家已嘗試采用多種方法來制備iPS細胞，包括借助載體將特定基因導入細胞中，直接將特定蛋白導入細胞中或者用小分子化合物等來誘導形成iPS細胞。iPS細胞最初是由成纖維細胞轉化而來的，后來發現已分化的T細胞、B細胞等也能被誘導為iPS細胞。
【深入思考】
1．如何防止培養過程中的微生物污染？
在細胞培養液中添加一定量的抗生素。
2．培養前為什么要將動物組織分散成單個細胞？
分散后細胞能與培養液充分接觸，更易進行物質交換；且成塊的組織中細胞靠在一起限制了彼此的生長和增殖。
3．動物細胞培養過程中，用胰蛋白酶處理的時間是不是越長越好？可不可以用胃蛋白酶處理？
不是。時間過長胰蛋白酶會催化分解細胞膜蛋白等，對細胞有損傷。不可以。由于大多數動物細胞培養的適宜pH為7.2～7.4，而胃蛋白酶作用的適宜pH約為1.5，當pH大于6時，胃蛋白酶會失去活性。
4．如何打破接觸抑制呢？癌細胞存在接觸抑制嗎？
貼滿瓶壁的細胞需要重新用胰蛋白酶等處理，然后分瓶繼續培養，讓細胞繼續增殖。癌細胞增殖時不存在接觸抑制，在培養瓶中可以形成多層細胞。
5．動物細胞培養技術有沒有體現動物細胞的全能性？
未體現，因為動物細胞培養只是細胞增殖的過程。
【課后歸納】
1、動物細胞培養和植物組織培養的比較
植物組織培養 動物細胞培養
原理 植物細胞的全能性 細胞增殖
培養前處理 離體 用機械法或胰蛋白酶、膠原蛋白酶將組織細胞分散開
取材 離體植物器官、組織、細胞 動物胚胎或幼齡動物的組織、器官
培養基的物理性質 固體 液體(又稱培養液)
培養基的成分 有機營養成分、無機營養成分、植物激素 糖類、氨基酸、無機鹽、維生素等營養物質及一些天然成分如血清
特有成分 植物激素 血清
特殊環境條件 再分化需光 氣體環境
結果 一般獲得新的植株 獲得大量細胞
是否體現細胞的全能性 是 否
過程
相同點 1．培養過程中細胞都進行有絲分裂，不涉及減數分裂； 2．均需無菌操作，需要適宜的溫度、pH等條件
【課堂補充】
2.2.2動物細胞融合技術與單克隆抗體-知識點
【基礎知識】
知識點一　動物細胞融合技術
1．概念：就是使兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的技術。
2．結果：融合后形成的雜交細胞具有原來兩個或多個細胞的遺傳信息。
3．原理：細胞膜的流動性。
4．誘導方法
常用方法有PEG融合法、電融合法和滅活病毒誘導法等。
5．意義：突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能。
6．應用：是研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段，特別是利用動物細胞融合技術發展起來的雜交瘤技術，為制造單克隆抗體開辟了新途徑。
易漏邊角
滅活是指用物理或化學手段使病毒或細菌失去感染能力，但并不破壞它們的抗原結構。滅活病毒誘導細胞融合的原理是：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞膜上的糖蛋白發生作用，使細胞互相凝聚，細胞膜上的蛋白質分子和脂質分子重新排布，細胞膜打開，細胞發生融合。
知識點二　單克隆抗體及其應用
1．B淋巴細胞的特點：每一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體，但在體外培養條件下，不能無限增殖。
2．單克隆抗體制備的思路
把一種B淋巴細胞與能在體外大量增殖的骨髓瘤細胞融合，所得到的融合細胞就可能大量增殖，產生足夠數量的特定抗體。
3．制備過程
(1)基本過程
(2)過程分析
①該過程中應用到的技術：動物細胞融合、動物細胞培養。
②原理：細胞膜具有一定的流動性、細胞增殖。
③注射特定抗原的目的：用特定的抗原對小鼠進行免疫，并從該小鼠的脾中得到能產生特定抗體的B淋巴細胞。
④誘導融合的方法：PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導法。動物細胞特有的為滅活病毒誘導法。
⑤第一次篩選的目的：篩選獲得雜交瘤細胞。
⑥第一次如何篩選：用特定的選擇培養基進行篩選。
⑦篩選原理：在選擇培養基上，未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長。
⑧雜交瘤細胞的特點：既能迅速大量增殖，又能產生抗體。
⑨第二次篩選：對經選擇培養的雜交瘤細胞進行克隆化培養和抗體檢測，經多次篩選，就可獲得足夠數量的能分泌所需抗體的細胞。
⑩選擇抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞，即分泌的抗體能與特定的抗原結合。
4．單克隆抗體的優點
(1)能準確識別抗原的細微差異，與特定抗原發生特異性結合。
(2)可以大量制備。
5．應用
(1)作為診斷試劑
廣泛用作診斷試劑，在多種疾病的診斷和病原體鑒定中發揮重要的作用。例如，利用同位素或熒光標記的單克隆抗體在特定組織中成像的技術，可定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病。
(2)運載藥物
抗體—藥物偶聯物(ADC)通過將細胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結合，實現了對腫瘤細胞的選擇性殺傷。ADC通常由抗體、接頭和藥物(如細胞毒素)三部分組成。
(3)治療疾病
在醫藥領域，單克隆抗體藥物占有非常重要的地位。
【深入思考】
1．動、植物細胞融合時，所用誘導方法有何不同？
動物細胞可用滅活的病毒進行誘導；植物細胞可以采用高Ca2＋—高pH融合法。
2．不滅活的病毒能否作為誘導劑？
不能。用病毒作為誘導劑時，必須事先滅活使病毒失去感染和增殖能力，但不破壞病毒的抗原結構。而不滅活的病毒會感染細胞，不能誘導細胞融合。
3. 血清抗體與單克隆抗體有什么區別？
①血清抗體：由B淋巴細胞(漿細胞)分泌，產量低、種類多、純度低、特異性差、反應不夠靈敏。②單克隆抗體：由雜交瘤細胞分泌，化學性質單一、特異性強、反應靈敏、可大量制備。
【課后歸納】
1、動物細胞融合技術和植物體細胞雜交技術的比較
動物細胞融合技術 植物體細胞雜交技術
原理 細胞膜的流動性 細胞膜的流動性、細胞的全能性
細胞融合前的處理方法 用機械方法或胰蛋白酶、膠原蛋白酶等使組織分散成單個細胞 用果膠酶和纖維素酶去除細胞壁
誘導手段 物理法：電融合法 化學法：聚乙二醇(PEG)融合法 生物法：滅活病毒誘導法 物理法：離心法、電融合法 化學法：聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2＋—高pH融合法
誘導過程
用途 制備單克隆抗體 培育新品種
意義 使遠緣雜交成為可能 打破生殖隔離，實現遠緣雜交育種
2、細胞融合過程中，有同種細胞間的融合和不同種細胞間的融合，還有未融合的細胞。
3、單克隆抗體的制備與動物細胞融合相比，其原理不僅包括細胞膜的流動性，還包括細胞增殖。
4、能產生特定抗體的雜交瘤細胞在小鼠腹腔內培養與體外培養相比的優點是不需特定的培養基，不需嚴格的外界環境條件。
【課堂補充】
2.2.3 動物體細胞核移植技術和克隆動物-知識點
【基礎知識】
1．動物細胞核移植技術概念：是將動物一個細胞的細胞核移入去核的卵母細胞中，使這個重新組合的細胞發育成新胚胎，繼而發育成動物個體的技術。該個體不經過有性生殖過程，其遺傳物質與細胞核供體基本相同，叫作克隆動物。
易漏邊角
減數分裂Ⅱ中期(MⅡ期)卵母細胞中的“核”其實是紡錘體——染色體復合物。文中所說的“去核”是去除該復合物。
2．理論基礎：動物細胞核的全能性。
3．生殖方式：無性生殖。
4．分類
(1)胚胎細胞核移植
動物胚胎細胞分化程度低，表現全能性相對容易。
(2)體細胞核移植
動物體細胞分化程度高，表現全能性十分困難。
5．非人靈長類動物體細胞核移植困難的原因
(1)供體細胞的細胞核在去核卵母細胞中不能完全恢復其分化前的功能狀態，這導致了胚胎發育率低。
(2)對非人靈長類動物胚胎進行操作的技術尚不完善。
6．動物體細胞核移植的過程
(1)該過程中應用到的技術
動物細胞核移植技術、動物細胞培養技術、動物細胞融合技術、胚胎移植技術。
(2)激活重構胚的方法：電刺激、Ca2＋載體、乙醇、蛋白酶合成抑制劑等。
(3)激活重構胚的目的
使其完成細胞分裂和發育進程。
(4)實驗結論
證明了動物已分化的體細胞的細胞核具有全能性。
易漏邊角
重構胚是指人工重新構建的胚胎，具有發育成完整個體的能力。
7．動物體細胞核移植技術的應用前景及存在的問題
應用前景 畜牧生產 加速家畜遺傳改良進程、促進優良畜群繁育
保護瀕危物種 有望增加瀕危物種的存活數量
醫藥衛生 轉基因克隆動物可以作為生物反應器，生產珍貴的醫用蛋白 治療人類疾病： ①轉基因克隆動物的細胞、組織或器官可以用于異種移植。 ②以患者作為供體培育的人核移植胚胎干細胞，經過誘導分化能形成相應的細胞、組織或器官，將它們移植給患者時可以避免發生免疫排斥反應
科研 ①研究克隆動物可使人類更深入地了解胚胎發育及衰老過程。 ②克隆一批遺傳背景相同的動物，可以通過它們之間的對比來分析致病基因。 ③克隆特定疾病模型的動物，還能為研究該疾病的致病機制和開發相應的藥物提供幫助
存在的問題 ①成功率非常低，各個技術環節有待進一步改進。 ②相對于技術研究，核移植的理論研究較為滯后。 ③絕大多數克隆動物存在健康問題，表現出遺傳和生理缺陷
【深入思考】
1．受體細胞去核的原因是什么？
受體細胞去核可以保證克隆動物的核基因全部來自供體細胞。
2．選取MⅡ期的卵母細胞作為受體細胞的原因是什么？
①卵母細胞細胞質內存在激發細胞核全能性表達的物質。
②卵母細胞體積大，便于操作。
③卵母細胞內卵黃多，營養物質豐富。
3．克隆動物的特點及各特點的原因是什么？
①基因型與核供體完全相同。
原因：克隆動物的細胞核遺傳物質全部來自核供體。
②性狀與供體基本相同。
原因：a．克隆動物的大部分性狀受細胞核控制，而細胞核來自核供體；
b．克隆動物的細胞質遺傳物質來自卵母細胞的細胞質；
c．生物的性狀不僅與遺傳物質有關，還受環境影響。
【課后歸納】
對克隆的理解
(1)概念：是指從一個共同的祖先，通過無性繁殖的方法產生出來的一群遺傳特性相同的DNA分子、細胞或個體。
(2)克隆的不同層次
①分子水平：如PCR技術擴增DNA、DNA的復制。
②細胞水平：如動物細胞培養、細胞分裂。
③器官水平：利用干細胞培養一個新器官。
④個體水平：如“多莉”羊的誕生、扦插枝條形成植物體、植物組織培養形成植物體。
【課堂補充】
1、克隆動物不是核供體動物100%復制的原因是什么？
①克隆動物的細胞質遺傳物質來自受體卵母細胞的細胞質
②生物的性狀不僅與遺傳物質有關，還受環境等因素的影響
2、供體細胞的選擇：一般選用傳代10代以內的細胞，因為10代以內的細胞一般能保持正常的二倍體核型，保證了供體細胞正常的遺傳基礎
3、卵母細胞去核的方法：顯微操作去核法
4、
5、在將體細胞的核移植到卵母細胞之前，為什么必須對卵母細胞進行去核操作？
為了使核移植的胚胎或動物的核遺傳物質全部來自有重要利用價值的動物提供的體細胞
2.3.1胚胎工程的理論基礎-知識點
【基礎知識】
知識點一　胚胎工程
1．概念：指對生殖細胞、受精卵或早期胚胎細胞進行多種顯微操作和處理，然后將獲得的胚胎移植到雌性動物體內生產后代，以滿足人類的各種需求。
2．技術手段：體外受精、胚胎移植和胚胎分割等。
知識點二　受精
1．概念：受精是精子與卵子結合形成合子(即受精卵)的過程。
2．場所：雌性的輸卵管。
3．過程：包括受精前的準備階段和受精階段。
4．準備階段
(1)準備階段1——精子獲能
①概念：剛剛排出的精子不能立即與卵子受精，必須在雌性動物生殖道發生相應的生理變化后，才能獲得受精能力，這一生理現象稱為“精子獲能”。
②研究精子獲能機制的意義：實現了各種哺乳動物精子在體外條件下的獲能，為體外受精技術的建立奠定了基礎。
③成熟精子結構：頭、頸、線粒體鞘、尾。
易漏邊角
使精子獲能的方法
①直接利用雌性動物的生殖道使精子獲能；
②將精子培養在人工配制的獲能液中使其獲能等。
獲能液的成分因動物種類不同而有所差異，常見的有效成分有肝素、Ca2＋載體等。
(2)準備階段2——卵子的準備
①卵子一般在排出2～3 h后才能被精子穿入。
②動物排出的卵子成熟程度不同
有的可能是初級卵母細胞，如馬、犬等；
有的可能是次級卵母細胞，如豬、羊等。
③卵子成熟的場所
排出的卵子都要在輸卵管內進一步成熟。
④卵子具備與精子受精能力的時期為MⅡ期。
⑤具備受精能力的卵子結構。
5．受精階段
過程 主要變化
精子穿越卵細胞膜外的結構，接觸卵細胞膜 獲能后的精子與卵子相遇時，首先它釋放多種酶，以溶解卵細胞膜外一些結構，同時借助自身的運動接觸卵細胞膜。在精子觸及卵細胞膜的瞬間，卵細胞膜外的透明帶會迅速發生生理反應，阻止后來的精子進入透明帶(透明帶反應：防止多精入卵的第一道屏障)
精子入卵 精子入卵后，卵細胞膜也會立即發生生理反應，拒絕其他精子再進入卵內(卵細胞膜反應：防止多精入卵的第二道屏障)
形成雄、雌原核 精子入卵后，尾部脫離，原有的核膜破裂并形成一個新的核膜，形成雄原核；同時卵子完成減數分裂Ⅱ，排出第二極體后，形成雌原核
受精卵形成 雄、雌原核充分發育后，相向移動，彼此靠近，核膜消失。這個含有兩個染色體組的合子就是受精卵
易漏邊角
多數哺乳動物的第一極體不進行減數分裂Ⅱ，因而不會形成兩個第二極體。在實際胚胎工程操作中，常以觀察到兩個極體或者雌、雄原核作為受精的標志。
知識點三　胚胎早期發育
1．起點：受精卵。
2．開始發育場所：輸卵管。
3．分裂方式：有絲分裂。
4．卵裂
(1)概念：受精卵的早期分裂。
(2)場所：透明帶。
(3)特點
①細胞數量不斷增加；
②胚胎總體積并不增加。
5．早期發育的胚胎各階段及特點
(1)桑葚胚：當卵裂產生的子細胞逐漸形成致密的細胞團，形似桑葚時，這時的胚胎稱為桑葚胚。
(2)囊胚
①概念
胚胎進一步發育，細胞逐漸分化，形成內細胞團、滋養層；隨著胚胎進一步發育，胚胎內部出現了含有液體的腔——囊胚腔，這個時期的胚胎叫作囊胚。
②結構組成
③孵化：囊胚進一步擴大，會導致透明帶破裂，胚胎從其中伸展出來。
易漏邊角
囊胚孵化后，將發育形成原腸胚。原腸胚表面的細胞層為外胚層，向內遷移的細胞形成內胚層。隨著發育的進行，一部分細胞還會在內、外兩個胚層之間形成中胚層。這三個胚層將逐漸分化形成各種組織、器官等。
【課后歸納】
(1)個體發育的過程包括胚胎發育和胚后發育，胚胎發育的起點是受精卵，終點是成熟的胎兒；胎兒出生后的發育過程屬于胚后發育。因此，個體發育的起點是受精卵，終點是性成熟的個體。
(2)受精卵是新生命的第一個細胞，其全能性最高。細胞全能性隨發育的深化而降低。
(3)桑葚胚階段及之前的每一個細胞都具有發育成完整胚胎的潛能，屬于全能細胞。
(4)桑葚胚進一步發育，細胞開始出現分化，并逐漸形成囊胚，囊胚階段細胞的全能性仍然很高。
胚胎發育早期細胞或物質的變化規律
細胞數目：增多：所有細胞總體積：不增加；每個細胞體積：減小；核DNA總量：增多；每個細胞內的核DNA含量：不變；有機物總量：減少；物質種類：增多；所含能量：減少
【課堂補充】
1、精子的頭部主要是細胞核，線粒體鞘為精子的運動提供能量
2、
2.3.2胚胎工程技術及其應用-知識點
【基礎知識】
知識點一　體外受精
1．試管動物含義：通過人工操作使卵子在體外受精，經培養發育為早期胚胎后，再進行移植產生的個體。
2．體外受精
(1)主要包括：卵母細胞的采集、精子的獲取和受精等步驟。采集到的卵母細胞和精子，要分別在體外進行成熟培養和獲能處理，之后再將二者置于適當的培養液中共同培養一段時間，促使其完成受精。
(2)哺乳動物體外受精過程
(3)意義：是提高動物繁殖能力的有效措施，還可以為胚胎移植提供可用的胚胎。
知識點二　胚胎移植
1．胚胎移植的概念
通過體外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同種的、生理狀態相同的雌性動物體內，使之繼續發育為新個體的技術。
2．胚胎移植的供體及受體
(1)供體
①定義：在胚胎移植中提供胚胎的個體。
②供體選擇標準：遺傳性狀優良、生產能力強。
③供體職能：產生具有優良遺傳特性的胚胎。
(2)受體
①定義：在胚胎移植中接受胚胎的個體。
②受體選擇標準：有健康體質和正常繁殖能力。
③受體職能：承擔繁重而漫長的妊娠和育仔任務。
3．胚胎移植的基本程序(以牛的胚胎移植為例)
供體、受體的選擇和處理→配種或人工授精→胚胎的收集、檢查、培養或保存→胚胎的移植→移植后的檢查。
4．牛胚胎移植的過程
易漏邊角
超數排卵是指應用外源促性腺激素，誘發卵巢排出比自然情況下更多的成熟卵子。
5．胚胎移植的優勢
(1)充分發揮雌性優良個體的繁殖潛力。
(2)大大縮短了供體本身的繁殖周期。
(3)對供體施行超數排卵處理后，可獲得多枚胚胎，增加供體一生繁殖后代的數量。
6．地位：胚胎移植作為胚胎工程的最終技術環節，還將推動胚胎工程其他技術的研究和應用。
7．胚胎移植的生理學基礎
生理學基礎 意義
同種動物的供、受體排卵后，生殖器官的生理變化是相同的 為供體的胚胎移入受體提供了相同的生理環境
早期胚胎形成后，在一定時間內不會與母體子宮建立組織上的聯系，而是處于游離狀態 為胚胎的收集提供了可能
受體對外來胚胎基本上不發生免疫排斥反應 為胚胎在受體內存活提供了可能
供體胚胎可與受體子宮建立正常的生理和組織聯系，但其遺傳特性不受影響 為移植后的胚胎繼續發育提供了營養等方面的保障
8．胚胎移植的實質：早期胚胎在相同生理環境條件下空間位置的轉移。
知識點三　胚胎分割
1．概念：是指采用機械方法將早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等，經移植獲得同卵雙胎或多胎的技術。
2．實質：來自同一胚胎的后代具有相同的遺傳物質，因此胚胎分割可以看作動物無性繁殖或克隆的方法之一。
3．儀器設備：體視顯微鏡和顯微操作儀。
4．操作程序
(1)選擇發育良好、形態正常的桑葚胚或囊胚，移入盛有操作液的培養皿中。
(2)在顯微鏡下用分割針或分割刀分割。在分割囊胚階段的胚胎時，要注意將內細胞團均等分割。此時還可用分割針在滋養層處取樣，做DNA分析，鑒定性別。
注：對于不同發育階段的胚胎，分割的具體操作不完全相同。
(3)分割后的胚胎可以直接移植給受體，或經體外培養后，再移植給受體。
5．意義
(1)可以促進優良動物品種的繁殖，產生的遺傳性狀相同的后代是進行遺傳學研究的寶貴材料。
(2)胚胎移植前，進行性別鑒定、遺傳病篩查等，對于人工控制動物性別、動物繁育健康后代具有重要意義。
【深入思考】
1．在胚胎移植操作中，怎樣才能使胚胎在移植前后所處的生理環境保持一致？原因是什么？
對供體和受體母畜進行同期發情處理。同期發情處理使供、受體排卵后，生殖器官的生理變化相同，為供體的胚胎移入受體提供相同的生理環境。
2．胚胎移植中胚胎來源有哪些？生殖方式是什么？
①動物體細胞核移植——無性繁殖。②體外受精——有性生殖。③體內受精——有性生殖。④轉基因受精卵——有性生殖。
3．為什么同種動物之間進行胚胎移植易于成功？
這里的“同種”是指“同物種”，同一物種的動物才有可能具有相同的生理特征。
4．胚胎移植的后代具有供體和受體共同的遺傳性狀嗎？性別由誰決定？
不具有。后代的遺傳性狀是由供體決定的，受體只是提供了胚胎發育的場所，不影響后代的遺傳特性；性別取決于公牛提供何種精子。
5．為什么選擇桑葚胚或囊胚進行胚胎分割？
①桑葚胚階段及之前的每一個細胞都具有發育成完整胚胎的潛能，屬于全能細胞。②桑葚胚進一步發育，細胞開始分化，逐漸形成囊胚，囊胚階段的細胞全能性仍然很高，可用于胚胎分割。
6．對囊胚階段的胚胎分割時，為什么將內細胞團均等分割？
若分割時不能將內細胞團均等分割，會出現含內細胞團多的部分正常發育，少的部分發育受阻或發育不良，甚至不能發育等問題。
7．做性別鑒定時，為什么取滋養層細胞？
取滋養層細胞不影響胚胎分割和發育。
8．胚胎分割是不是分割的份數越多，效率越高？
分割的份數越多，技術難度會越大，移植后的恢復和發育的難度會越大，移植成功率自然會降低。
【課后歸納】
人工授精和體外受精的比較
比較項目 人工授精 體外受精
概念 人工授精技術是指用相應的器械采集公畜的精液，再將其注入正在發情的母畜的生殖道中，使母畜受孕的過程 體外受精是指哺乳動物的精子和卵子在體外人工控制的環境中完成受精過程的技術
場所 母畜的生殖道內 體外
過程 人工采精→檢查與儲存精液→人工授精(用人工的方法將精液注入正在發情的母畜生殖道中) →
胚胎發育場所 受精卵的形成和胚胎發育場所在母畜體內 受精卵的形成和早期胚胎發育在體外，胚胎移植后的胚胎發育在母畜體內
胚胎移植的三點提醒
(1)“移植的胚胎在受體內存活的基礎條件”是指受體對外來胚胎基本上不發生免疫排斥反應。
(2)哺乳動物發情排卵后，不管雌性動物妊娠與否，都會產生黃體，并維持一段時間，稱為黃體期。在這段時間里，同種動物的供、受體生殖器官的生理變化是相同的。
(3)胚胎移植涉及牛的種類及作用
供體配種
受體母牛：提供子宮
【課堂補充】
1、精子離心處理的目的：精液由精子和精清兩部分組成。精清中含有一種能抑制精子獲能的物質，精子獲能前進行離心處理，目的是除去精清以利于精子獲能。
2、什么是同期發情處理？
利用某些激素人為地控制并調整一群母畜發情周期的進程，使之在預定時間內集中發情。
3、超數排卵：用促性腺激素處理供體母牛，誘發卵巢排出比自然情況下更多的成熟卵子
4、胚胎的收集：用特制的沖卵裝置，把供體母牛子宮內的胚胎沖洗出來(也叫沖卵
沖卵：是指用配制好的沖卵液，借助特制的沖卵裝置，將供體母畜子宮或輸卵管中的胚胎沖洗出來
5、胚胎的檢查：胚胎應該發育到桑葚胚或囊胚階段。
6、將收集的胚胎直接向受體移植或放入-196℃的液氮中保存
7、胚胎移植后，經受體孕育的后代，其遺傳特性與供體保持一致的原因：供體胚胎與受體子宮建立的僅是生理和組織上的聯系，其遺傳物質在孕育過程中不會發生任何變化。
3.1重組DNA技術的基本工具-知識點
【基礎知識】
知識點一　基因工程概念及工具
1．基因工程概念
基因工程是指按照人們的愿望，通過轉基因等技術，賦予生物新的遺傳特性，創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。從技術操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫作重組DNA技術。
2．限制性內切核酸酶(簡稱限制酶)——“分子手術刀”
(1)來源：主要來自原核生物。
(2)種類：數千種。
(3)作用
①識別：識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列。
②切割：使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。
(4)識別序列特點
大多數限制酶識別序列由6個核苷酸組成，少數由4個、8個或其他數量的核苷酸組成。
(5)結果：產生黏性末端或平末端。
①一個限制酶切割一次斷開兩個磷酸二酯鍵形成兩個末端。
②同一種限制酶切割形成的末端相同。
③兩個末端有2個游離的磷酸基團。
3．DNA連接酶——“分子縫合針”
(1)作用：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。
(2)DNA連接酶種類
種類 E.coli DNA連接酶 T4 DNA連接酶
來源 大腸桿菌 T4噬菌體
功能特性 只能將具有互補黏性末端的DNA片段連接起來 “縫合”兩種末端，但連接平末端的效率相對較低
相同點 都恢復被限制酶切開的磷酸二酯鍵，如圖：
4．基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”
(1)作用
①將目的基因運輸到受體細胞中去。
②使目的基因能夠在受體細胞內進行大量復制。
(2)種類
①常用載體：質粒。在基因工程操作中，真正被用作載體的質粒，都是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的。
②其他載體：噬菌體、動植物病毒等。
(3)質粒
①定義：是一種裸露的、結構簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有自我復制能力的環狀雙鏈DNA分子。
②質粒作為載體所具備的條件
a．有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA片段(基因)插入其中。
b．攜帶外源DNA片段的質粒進入受體細胞后，能在細胞中進行自我復制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復制。
c．常有特殊的標記基因，以便重組DNA分子的篩選，如四環素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等。
知識點二　DNA的粗提取與鑒定
1．提取DNA的思路
DNA、RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當的物理或化學方法對它們進行提取。
2．提取DNA的原理
(1)DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精。
(2)DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L的NaCl溶液。
3．鑒定DNA的原理
在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現藍色，因此二苯胺試劑可以作為鑒定DNA的試劑。
4．材料用具
(1)選材
DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。
(2)試劑
①研磨液。
②體積分數為95%的酒精，作用：析出DNA。
③2 mol/L的NaCl溶液，作用：溶解DNA。
④二苯胺試劑，作用：鑒定DNA。要現配現用。
⑤蒸餾水。
5．實驗步驟(以洋蔥為例)
(1)取材和研磨
稱取約30 g洋蔥，切碎，然后放入研缽中，倒入10 mL研磨液，充分研磨。
(2)過濾或離心取上清液
在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4 ℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。也可以直接將研磨液倒入塑料離心管中，在1500 r/min的轉速下離心5 min，再取上清液放入燒杯中。
(3)預冷酒精析出DNA并收集DNA
在上清液中加入體積相等的、預冷的酒精溶液(體積分數為95%)，靜置2～3 min，溶液中出現的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分；或者將溶液倒入塑料離心管中，在10000 r/min的轉速下離心5 min，棄上清液，將管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。
(4)NaCl溶液溶解DNA并鑒定
取兩支20 mL的試管，各加入2 mol/L的NaCl溶液5 mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCl溶液中。然后，向兩支試管中各加入4 mL的二苯胺試劑。混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5 min。待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化。6．結果：加入沉淀物或絲狀物的試管中溶液變成藍色。
【深入思考】
1．基因工程操作導致的基因重組與有性生殖中的基因重組的主要區別是什么？
①有性生殖中的基因重組是隨機的，并且只能在同一物種間進行；②基因工程可以在不同物種間進行重組，并且方向性強，可以定向地改變生物的性狀。
2．原核生物體內的限制酶不切割自身DNA的原因？
原核生物的DNA中不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾。
3．病毒為什么可以作為基因工程的載體？
因病毒能夠侵染正常細胞，有的病毒還能將自己的核酸整合到宿主細胞的染色體上，所以病毒也可作為基因工程的載體。
4．可否選用哺乳動物成熟的紅細胞作為實驗材料？為什么？
不可以。哺乳動物成熟的紅細胞內沒有細胞核和各種復雜的細胞器，不含有DNA。
5．提純時，為什么要選用體積分數為95%的冷酒精？
預冷的酒精溶液具有以下優點：一是可抑制核酸水解酶的活性，防止DNA降解；二是降低分子運動，使DNA易形成沉淀析出；三是低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少斷裂。
【課后歸納】
幾種酶的比較
名稱 作用部位 作用底物 作用結果
限制酶 磷酸二酯鍵 DNA 將DNA切成兩個片段
DNA連接酶 磷酸二酯鍵 DNA片段 將兩個DNA片段連接為一個DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯鍵 脫氧核苷酸 將單個脫氧核苷酸依次連接到DNA單鏈末端
DNA (水解)酶 磷酸二酯鍵 DNA 將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸
解旋酶 堿基對之間的氫鍵 DNA 將雙鏈DNA分子解旋為單鏈
RNA聚合酶 磷酸二酯鍵 核糖核苷酸 將單個核糖核苷酸依次連接到RNA單鏈末端
判斷兩個黏性末端是否為同一種限制酶切割產生的：一看游離堿基能否相互配對；二看兩條鏈上的切點是否相同。
技巧：將兩個黏性末端擺成同樣的形狀，若完全相同，則說明這兩個黏性末端是由同一種限制酶切割產生的
【課堂補充】
1、為什么需要載體？
目的基因是一個DNA片段，不含有復制原點、不含有啟動子和終止子
2、形成一個重組質粒會形成四個磷酸二酯鍵
3、DNA的粗提取與鑒定：DNA純度——看提取物顏色；DNA的量——看與二苯胺反應顏色的深淺
4、提取DNA時為什么要充分研磨？
充分研磨，可以破壞細胞壁，裂解細胞，釋放DNA
3.2 基因工程的基本操作程序-知識點
【基礎知識】
知識點一　基因工程操作的基本程序
1．目的基因的篩選與獲取。
2．基因表達載體的構建。
3．將目的基因導入受體細胞。
4．目的基因的檢測與鑒定。
知識點二　目的基因的篩選與獲取
1．目的基因概念
基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因。主要是指編碼蛋白質的基因，如與生物抗逆性、生產藥物、毒物降解、工業用酶等相關的基因。
2．篩選合適的目的基因
(1)方法：從相關的已知結構和功能清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。
(2)實例：蘇云金桿菌的殺蟲作用與Bt基因有關，通過對Bt基因的序列信息還有Bt抗蟲蛋白的研究，選擇Bt基因作轉基因抗蟲棉的目的基因。
3．獲取目的基因的具體方法：人工合成；利用PCR技術獲取和擴增；構建基因文庫等。
4．利用PCR獲取和擴增目的基因
(1)PCR概念
PCR是聚合酶鏈式反應的縮寫。它是一項根據DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。
(2)PCR條件
①原料：4種脫氧核苷酸。
②模板：加熱變性解旋后的兩條DNA母鏈。
③酶：耐高溫的DNA聚合酶。
④引物：2種，使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸。
⑤其他條件：需要一定的緩沖溶液和能夠自動調節溫度的溫控設備等。
易漏邊角
真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應緩沖溶液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。用于PCR的引物長度通常為20～30個核苷酸。
(3)PCR過程
①變性：當溫度上升到90 ℃以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈。
②復性：當溫度下降到50 ℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。
③延伸：當溫度上升到72 ℃左右時，溶液中的四種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。
④結果：由于延伸后得到的產物又可以作為下一個循環的模板，因而每一次循環后目的基因的量可以增加一倍，即成指數形式擴增(約為2n，其中n為擴增循環的次數)。
(4)反應儀器：PCR擴增儀(PCR儀)。
(5)產物鑒定：瓊脂糖凝膠電泳。
5．拓展
(1)兩種引物都結合在DNA模板鏈的3′端，脫氧核苷酸連接在引物的3′端進行延伸。
(2)①n代后，DNA分子有2n個。
②n代后，DNA鏈有2n＋1條。
③n代后，含引物的DNA分子有2n個。
④n代后，共消耗了2n＋1－2個引物。
⑤第n代復制，消耗了2n個引物。
知識點三　基因表達載體的構建
1．重要性：基因表達載體的構建是實施基因工程的第二步，也是基因工程的核心工作。
2．操作目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代；同時，使目的基因能夠表達和發揮作用。
3．組成
4．構建過程：首先用一定的限制酶切割載體，使它出現一個切口；然后用同種限制酶或能產生相同末端的限制酶切割含目的基因的DNA片段；再用DNA連接酶把兩者連接(如圖)。
知識點四　將目的基因導入受體細胞
1．將目的基因導入植物細胞
(1)方法：花粉管通道法——我國獨創的方法。
(2)實例：將Bt基因導入棉花細胞。
(3)操作方式：可以用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；可以在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。
(4)受體細胞：受精卵或體細胞。
易漏邊角
農桿菌轉化法
(1)轉化：是指目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。
(2)農桿菌特點：①能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數單子葉植物沒有侵染能力。②農桿菌細胞內含有Ti質粒，當它侵染植物細胞后，能將Ti質粒上的T DNA(可轉移的DNA)轉移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色體DNA上。
(3)農桿菌轉化法的過程
將目的基因插入Ti質粒的T DNA中，將含目的基因的Ti質粒導入農桿菌，通過農桿菌的轉化作用，就可以使目的基因進入植物細胞，并整合到受體細胞的染色體DNA上，使目的基因能夠維持穩定和表達。
2．將目的基因導入動物受精卵
(1)方法：顯微注射技術，最常用的方法。
(2)受體細胞：受精卵。
(3)結果：這個受精卵將發育成具有新性狀的動物。
3．將目的基因導入微生物細胞
(1)受體細胞：原核生物(使用最廣泛的是大腸桿菌)。
(2)方法：用Ca2＋處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，然后再將重組的基因表達載體導入其中。
知識點五　目的基因的檢測與鑒定
1．操作目的：目的基因進入受體細胞后，是否穩定維持和表達其遺傳特性，只有通過檢測和鑒定才能知道，這是檢查基因工程是否成功的一步。
2．目的基因檢測與鑒定的方法
類型 檢測內容 方法
分子水平的檢測 檢測受體細胞的染色體DNA上是否插入了目的基因 PCR等技術
檢測目的基因是否轉錄出了mRNA
檢測目的基因是否翻譯成蛋白質 抗原—抗體雜交技術
個體生物學水平的鑒定 檢測表達產物是否具有生物學活性(或生物個體是否具有相應性狀) 接種實驗
知識點六　DNA片段的擴增及電泳鑒定
1．PCR儀
PCR儀實質上就是一臺能夠自動調控溫度的儀器。一次PCR一般要經歷30次循環。
2．電泳鑒定PCR產物的原理
(1)電泳
DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。
(2)鑒定方法
PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。
(3)鑒定原理
在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300 nm的紫外燈下被檢測出來。
3．實驗操作
(1)用微量移液器在微量離心管中依次加入PCR反應體系配方的各組分。
(2)待所有的組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約10 s，使反應液集中在管的底部。
(3)設置好PCR儀的循環程序，將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。
(4)根據待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質量分數為0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內加熱至瓊脂糖熔化，稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。
(5)將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。
(6)待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內。
(7)將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1 mm為宜。
(8)將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液(內含指示劑)混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物。
(9)接通電源，根據電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5 V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。
(10)取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。
4．注意事項
(1)為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。
(2)該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在－20 ℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。
(3)在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。
(4)在進行操作時，一定要戴好一次性手套。
【深入思考】
1．PCR過程中需要解旋酶嗎？所需要的DNA聚合酶應具有什么特點？
PCR過程中，DNA雙鏈解開是在高溫下完成的，不需要解旋酶；由于PCR過程溫度較高，所以需要能耐高溫的DNA聚合酶。
2．DNA復制時為什么需要引物？
在DNA擴增時，DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從引物的3′端延伸DNA鏈，因此克隆DNA時應加入兩種引物。
3．PCR技術中需要的兩種引物堿基序列相同嗎？為什么？
不同。由于DNA兩條模板鏈中堿基序列并不相同，引物需要分別與兩條模板鏈進行堿基互補配對，因此DNA兩條模板鏈在進行擴增時，需要的引物堿基序列是不同的。
4．延伸過程是否需要ATP供能？
不需要。
6．用同一種限制酶切割質粒和含有目的基因的DNA，再用DNA連接酶處理后，可能有幾種產物？
三種：載體—載體、目的基因—目的基因、載體—目的基因。
7．用同一種限制酶切割質粒和含有目的基因的DNA，再用DNA連接酶處理后，形成的“載體—目的基因”產物一定符合要求嗎？
不一定，目的基因可能反向連接到質粒上。
8．如何避免上述(1、2題)問題？
同時用兩種限制酶切割含目的基因的DNA片段和載體(使得目的基因的一端與載體一端的黏性末端相同，而目的基因的另一端與載體另一端的黏性末端相同)。
9．將生物的所有DNA直接導入受體細胞效果會怎樣？
這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法確定哪些基因導入了受體細胞。
10．目的基因插入載體的位置是隨機的嗎？
目的基因插入載體的位置不是隨機的：基因表達載體需要啟動子與終止子的調控，所以目的基因應插入啟動子和終止子之間的部位，若目的基因插入啟動子部位，啟動子將失去原功能，同時也不能插入標記基因中，否則會使標記基因被破壞無法進行篩選。
11．植物基因工程常用的受體細胞為什么是體細胞，而動物基因工程一般只用受精卵？
植物體細胞的全能性較高，可經植物組織培養過程形成完整植物體，因此受體細胞可以是體細胞；動物體細胞的全能性受到嚴格限制，因此動物基因工程中

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