資源簡介

【備考2024】生物高考一輪復習
第36講　微生物的培養技術及應用
[課標要求] 1.闡明在發酵工程中滅菌是獲得純凈的微生物培養物的前提2.闡明無菌技術是在操作過程中，保持無菌物品與無菌區域不被微生物污染的技術3.舉例說明通過調整培養基的配方可有目的地培養某種微生物4.概述平板劃線法和稀釋涂布平板法是實驗室中進行微生物分離和純化的常用方法5.概述稀釋涂布平板法和顯微鏡計數法是測定微生物數量的常用方法
[核心素養](教師用書獨具) 1.分析培養基的成分及其作用；平板劃線法和稀釋涂布平板法的異同；選擇培養基和鑒別培養基的區別。(科學思維)2.設計實驗探究微生物培養的條件及如何分離某種微生物等。(科學探究)3.關注有害微生物的控制及宣傳健康生活方式等。(社會責任)
考點1　微生物的基本培養技術
1．培養基的配制
2．無菌技術
3．微生物的純培養
1．在培養細菌時，要將培養基調至中性或弱酸性。 (×)
提示：在培養細菌時，要將培養基調至中性或弱堿性。
2．蛋白胨中含有糖、維生素和有機氮等營養物質。 (√)
3．玻璃器皿、金屬用具等可以采用干熱滅菌。 (√)
4．微生物的純培養步驟為配制培養基→接種→滅菌→分離和培養等。 (×)
提示：微生物的純培養步驟為配制培養基→滅菌→接種→分離和培養等。
5．待滅菌后的培養基冷卻至50 ℃左右時，在酒精燈火焰附近倒平板。 (√)
1．無菌技術除用來防止實驗室的培養物被其他外來微生物污染外，還有什么作用？(選擇性必修3　P10“旁欄思考”)
提示：無菌技術還能有效避免操作者自身被微生物感染。
2．操作時，接種環通過滅菌，在第二次及以后劃線時，總是從上一次的末端開始劃線。這樣做的目的是什么？(選擇性必修3　P13“文字信息”)
提示：將聚集的菌體逐步稀釋以便獲得不連續的單個菌落。
1．倒平板操作中，平板冷凝后，要將平板倒置，其主要原因是________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________。
提示：防止冷凝后形成的水珠滴落在培養基上(污染培養基和破壞菌落)和防止培養基水分過快蒸發
2．牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高溫瞬時消毒法，與煮沸消毒法相比，這兩種方法的優點是__________________________________________________
___________________________________________________________________。
提示：在達到消毒目的的同時，營養物質損失較少
1．兩種純化細菌的方法的比較
項目 平板劃線法 稀釋涂布平板法
純化原理 通過接種環在固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面 將菌液進行一系列的梯度稀釋，稀釋度足夠高時，聚集在一起的微生物將被分散成單個細胞
主要步驟 平板劃線操作 系列稀釋操作和涂布平板操作
接種工具 接種環 涂布器
平板示意圖
2.平板劃線操作中灼燒接種環的目的
灼燒時間 灼燒目的
第一次劃線前 殺死接種環上原有的微生物，防止外來雜菌污染培養基
第二次及以后每次劃線前 殺死上次劃線后接種環上殘留的菌種，使下次劃線的菌種直接來源于上次劃線的末端
最后一次劃線后 殺死接種環上殘存的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者
1．某同學為探究已純化的菌株能否分解纖維素，他將此菌株接種在纖維素分解菌選擇培養基上，一段時間后，培養基上出現了菌落，該同學認為此菌株能分解纖維素，但其他的同學并不認同他的觀點，你認為他們的理由是什么？
提示：實驗缺少空白對照；操作不規范。
2．某同學在利用稀釋涂布平板法純化土壤中的細菌時，發現培養基上的菌落連成一片，最可能的原因是什么？為了防止雜菌污染，有同學建議加入抗生素，你覺得可以嗎？并說明理由。
提示：最可能的原因是菌液濃度過高(土壤溶液稀釋不夠)。不可以，因為抗生素不但能殺滅雜菌，而且也可以殺滅目的菌，因此在培養基上不可以加入抗生素。
考查無菌技術
1．(2021·南通高三模擬)巴氏殺菌乳是以生牛(羊)乳為原料，經巴氏殺菌等工序制得的液體產品，殺滅了牛奶中有害菌群的同時也保存了營養物質和純正口感。據國家標準每毫升合格巴氏殺菌乳中細菌總數不得超過50 000個。某興趣小組進行了新鮮牛奶合適的消毒溫度的探究，相關實驗操作不合理的是(　　)
A．配制牛肉膏蛋白胨培養基并在121 ℃、100 kPa條件下處理15～30 min
B．將等量的新鮮牛奶分別置于60 ℃、70 ℃、 80 ℃、 90 ℃恒溫水浴鍋中處理30 min
C．對處理后的牛奶進行梯度稀釋后，利用涂布法接種平板并在37 ℃下培養24 h
D．統計培養基上全部菌落數，以菌落數最少組的處理溫度作為牛奶最適消毒溫度
D　[配制的牛肉膏蛋白胨培養基需使用高壓蒸汽滅菌法滅菌，即在121 ℃、100 kPa條件下處理15～30 min，將培養基徹底滅菌，以避免培養基上的微生物影響實驗結果，A正確；新鮮牛奶應使用巴氏消毒法消毒，為了探究新鮮牛奶合適的消毒溫度，可將等量的新鮮牛奶分別置于60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃恒溫水浴鍋中處理30 min，并檢測不同溫度處理下的牛奶中微生物的數量進行比較，B正確；若要統計消毒后的牛奶中微生物的數量，可用稀釋涂布平板法接種，即可對處理后的牛奶進行梯度稀釋后，利用涂布法接種平板并在37 ℃下培養24 h，C正確；由于溫度過高會破壞牛奶中的營養成分，所以菌落數最少的組對應的溫度不一定是最適的消毒溫度，因為還需要考慮牛奶的營養價值不被破壞，D錯誤。]
2．(2021·南充高三模擬)“掌心對掌心，手心壓手背，十指交叉摩，手握關節搓，拇指圍軸轉，指尖掌心揉，手腕別放過。”七步洗手法可以清除手部的污物和微生物，是預防新冠病毒感染的有效措施之一。某生物實驗小組設計了“比較洗手前后手上細菌分布情況”的探究活動：各小組成員分別將拇指在甲組培養基上輕輕按一下，然后用肥皂將該手洗干凈，再將洗凈后的拇指在乙組培養基上輕輕按一下。將這兩組培養基放入恒溫培養箱中，在適宜溫度下培養24小時后，統計兩組培養基中菌落數目。
(1)該實驗中用到的培養基中加入了牛肉膏、蛋白胨、NaCl和水，蛋白胨可以為微生物的生長提供____________________________等營養物質，為了使配制的溶液呈固體狀態，還需要加入________。為了防止外來雜菌的入侵，可以將培養基放入盛有適量________的高壓滅菌鍋內滅菌15～30 min。
(2)實驗中“將拇指在培養基上輕輕按一下”相當于微生物培養操作中的________，該操作應該在酒精燈火焰附近進行，原因是____________________
_________________________________________________________________。
(3)統計甲乙兩組培養皿中的菌落，乙組中菌落數比甲少得多，實驗結果說明肥皂洗手不能徹底清除手上的微生物。為避免手上微生物在無菌操作中污染培養基，洗過的手還應進行____________________________________________
___________________________________________等方法處理(答出1種即可)。
(4)有同學認為乙中也有菌落產生，是因為培養過程受到雜菌污染，請你在本實驗的基礎上設計一個簡單的方案驗證他的猜想是否正確，并預期結果和結論。________________________________________________________________
__________________________________________________________________。
[解析]　(1)該實驗中用到的培養基中加入了牛肉膏、蛋白胨、NaCl和水，蛋白胨來源于動物，含有糖、維生素和有機氮等營養物質，故蛋白胨可以為微生物的生長提供碳源、氮源和維生素等營養物質，為了使配制的溶液呈固體狀態，還需要加入瓊脂。為了防止外來雜菌的入侵，可以將培養基放入盛有適量水的高壓滅菌鍋內滅菌15～30 min。
(2)實驗中“將拇指在培養基上輕輕按一下”相當于微生物培養操作中的接種，該操作應該在酒精燈火焰附近進行，這樣能夠保證接種時處于一個無菌的環境，防止周圍環境中的微生物污染培養基。
(3)為避免手上微生物在無菌操作中污染培養基，洗過的手還應用酒精棉球擦拭雙手、戴消毒手套等方法處理。
(4)有同學認為乙中也有菌落產生，是因為培養過程受到雜菌污染，若要驗證乙培養基是否被污染，需要再加一個不接種的相同培養基作為對照，與甲乙在相同條件下培養，若該培養基上沒有生長菌落，說明培養過程中未被雜菌污染，故猜想錯誤；若該培養基上生長菌落，則說明猜想正確。
[答案]　(1)碳源、氮源和維生素　瓊脂　水　(2)接種　避免周圍環境中的微生物污染培養基　(3)酒精棉球擦拭雙手、戴消毒手套　(4)再加一個不接種的相同培養基(空白培養基)，與甲乙在相同條件下培養，若該培養基上沒有生長菌落，說明培養過程未被雜菌污染，猜想錯誤；若該培養基上生長菌落，說明培養基中被雜菌污染，猜想正確
考查微生物的純培養
3．(不定項)(2021·江蘇七市高三調研)為了探究從重組大腸桿菌中提取質粒的適宜培養時間，科研人員通過培養大腸桿菌并抽樣計數、提取質粒進行電泳分析，得到如下結果。相關敘述正確的是(　　)
A．培養大腸桿菌時需設置空白對照，以檢測實驗過程是否有雜菌污染
B．培養大腸桿菌過程中，搖床培養可防止大腸桿菌聚沉、減少菌體間的質粒轉化
C．涂布平板培養大腸桿菌時，倒置培養有利于減少水分蒸發，減少雜菌污染
D．在0～28 h培養液中大腸桿菌種群數量呈“S”形增長，16 h左右提取質粒較為適宜
ACD　[為了檢測實驗過程中是否有雜菌污染，需設置空白對照組，即不接種大腸桿菌的培養液，A正確；培養大腸桿菌過程中，搖床培養的目的是提供充足氧氣，并使細菌與營養物質充分接觸，擴大培養，B錯誤；涂布平板培養大腸桿菌時，倒置培養既可以防止培養基表面的水分更快地揮發，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染，C正確；由曲線圖分析可知，在0～28 h培養液中大腸桿菌種群數量呈“S”形增長，其中在16 h時菌體數量的相對值最高；而觀察電泳圖可知，培養時間在10 h后才能夠看到明顯的電泳帶，其中16 h時的電泳帶亮度最高，由此推測16 h左右提取質粒較為適宜，D正確。]
4．(不定項)(2021·濰坊高三模擬)營養缺陷型菌株就是在人工誘變或自發突變后，微生物細胞代謝調節機制中的某些酶被破壞，使代謝過程中的某些合成反應不能進行的菌株。這種菌株能積累正常菌株不能積累的某些代謝中間產物，為工業生產提供大量的原料產物。以下是實驗人員利用影印法初檢氨基酸缺陷型菌株的過程。下列說法不合理的是(　　)
A．過程①的接種方法為稀釋涂布平板法，過程②兩種培養基的成分相同
B．進行過程②培養時必須先將絲絨布轉印至基本培養基上，順序不能顛倒
C．統計菌落種類和數量時要每隔24 h觀察統計一次，直到各類菌落數目穩定，以防止培養時間不足導致菌落數目偏大
D．營養缺陷型菌株細胞代謝調節機制中的某些酶被破壞，可能與核孔復合體的蛋白質空間結構發生改變有關
ACD　[過程①得到的菌落均勻分布，接種方法為稀釋涂布平板法，過程②兩種培養基的成分不同，基本培養基中缺乏某種氨基酸，A錯誤；進行過程②培養時先將絲絨布轉印至完全培養基上，可能會攜帶某種氨基酸進入基本培養基，因此順序不能顛倒，B正確；統計菌落種類和數量時要每隔24 h觀察統計一次，直到各類菌落數目穩定，以防止培養時間不足導致菌落數目偏小，C錯誤；若該菌株為原核細胞，則不存在核孔復合體，營養缺陷型菌株細胞代謝調節機制中的某些酶被破壞，應是控制該酶合成的基因發生突變，D錯誤。]
考點2　微生物的選擇培養和計數
1．選擇培養基
2．微生物的選擇培養
(1)土壤取樣
鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中
(2)等比稀釋
將10 g土樣加入盛有90 mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻。取1 mL上清液加入盛有9 mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。
(3)涂布平板
(4)培養觀察
①待涂布的菌液被培養基吸收后，將平板倒置，放入30～37 ℃的恒溫培養箱中培養1～2 d。
②在涂布有合適濃度菌液的平板上可以觀察到分離的單菌落。
3．微生物的數量測定
(1)利用稀釋涂布平板法計數
①為了保證結果準確，一般選擇菌落數為30～300的平板計數，并且在同一稀釋度下，應至少對3個平板進行重復計數，并求平均值。
②統計結果往往比實際值少。
(2)利用顯微鏡直接計數
①需用細菌計數板或血細胞計數板。
②統計結果是一般活菌數和死菌數的總和。
1．選擇培養基可以鑒定某種微生物的種類。 (×)
提示：選擇培養基可以篩選分離出某種微生物。
2．脲酶催化尿素分解產生NH3。 (√)
3．對細菌進行計數時，可以用平板劃線法。 (×)
提示：對細菌計數可以采用稀釋涂布平板法或顯微鏡直接計數法。
4．篩選能分解尿素的細菌所利用的培養基中，尿素是唯一的氮源。 (√)
5．剛果紅與纖維素形成紅色復合物，可以通過是否產生透明圈來分離纖維素分解菌。 (√)
6．用細菌計數板可對細菌等較小的細胞進行觀察和計數。 (√)
1．該實驗中的選擇培養基對分解尿素的細菌具有選擇作用。若要判斷選擇培養基是否起到了篩選的作用，對照組應如何設置？(選擇性必修3　P19“探究·實踐”)
提示：用完全培養基接種后在相同條件下同時培養。
2．若分離纖維素分解菌，需將土壤浸出液接種到僅含有纖維素作為唯一碳源的培養基進行培養，培養2天后可“濃縮”纖維素分解菌，分析其原因。(選擇性必修3　P20“拓展應用”)
提示：在僅含有纖維素作為唯一碳源的培養基上，纖維素分解菌能夠分解纖維素獲取營養進行繁殖，不能分解纖維素的微生物因缺乏營養而繁殖受到抑制。
1．利用稀釋涂布平板法進行微生物數量測定時，統計的菌落數往往比活菌的實際數目要少，這是因為_____________________________________________
___________________________________________________________________。
提示：當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落
2．在進行土壤中分解尿素的細菌的分離與計數的相關實驗時，甲同學從對應1×106倍稀釋的培養基中篩選出大約200個菌落，但是其他同學在同樣稀釋度下只篩選出大約90個菌落，若甲同學的結果有問題，則可能的原因是_________
___________________________________________________________________。
提示：培養基被雜菌污染或培養基中混入了其他含氮物質或土壤樣品不同
1．統計菌落時所用兩種計數方法的比較
比較項目 活菌計數法(稀釋涂布平板法) 顯微鏡直接計數法
原理 當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌 利用特定細菌計數板或血細胞計數板，在顯微鏡下計算一定容積的樣品中微生物的數量
公式 每克樣品中的菌落數＝(C÷V)×MC：某稀釋度下平板上生長的平均菌落數；V：涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)；M：稀釋倍數 每毫升原液所含細菌數：每小格平均細菌數×400×104×稀釋倍數
缺點 當兩個或多個菌體連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落 不能區分細胞的死活
結果 比實際值小 比實際值大
2.微生物的分離與計數實驗中對照組和重復組的設置及作用
(1)兩種對照組的設置及作用
①判斷培養基中“是否有雜菌污染”，需將未接種的培養基同時進行培養。
②判斷選擇培養基“是否具有篩選作用”，需設置牛肉膏蛋白胨培養基進行接種后培養，觀察兩種培養基上菌落數目，進行對比得出結論。
(2)重復組的設置及作用：為排除偶然因素對實驗結果的干擾，在每一稀釋度下宜設置至少3個平板作重復組，選擇菌落數均在30～300且數目相差不大的三個平板，用“平均值”代入計數公式予以計算菌落數。
1．傳統酒曲含有多種有助于釀酒的微生物，某同學想研究一種傳統酒曲中所含的微生物，進行了實驗。將酒曲制成懸液稀釋到一定的倍數，接種到以淀粉為唯一碳源的培養基上，培養一段時間后，觀察透明圈的大小，并從最大的透明圈中央挑取菌落并保存。
有人說，實驗中形成的菌落并不只是能分解淀粉的菌落，你是否同意他的說法？請說明你的理由。
提示：同意。分解淀粉的微生物將淀粉分解后形成的有機物，可供不能分解淀粉的微生物生活。
2．土壤中的某些微生物可以利用空氣中的氮氣作為氮源。若要設計實驗進一步確定甲、乙菌能否利用空氣中的氮氣作為氮源，請簡要寫出實驗思路、預期結果和結論。
提示：將甲、乙菌分別接種在無氮源培養基上，若細菌能生長，則說明該細菌能利用空氣中的氮氣作為氮源。
微生物的選擇培養
1．(2021·山東等級考)解脂菌能利用分泌的脂肪酶將脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸會使醇溶青瓊脂平板變為深藍色。將不能直接吸收脂肪的甲、乙兩種菌分別等量接種在醇溶青瓊脂平板上培養。甲菌菌落周圍呈現深藍色，乙菌菌落周圍不變色，下列說法錯誤的是(　　)
A．甲菌屬于解脂菌
B．實驗中所用培養基以脂肪為唯一碳源
C．可將兩種菌分別接種在同一平板的不同區域進行對比
D．該平板可用來比較解脂菌分泌脂肪酶的能力
B　[根據題干信息“甲菌菌落周圍呈現深藍色”，說明甲可以分泌脂肪酶將脂肪分解成甘油和脂肪酸，脂肪酸會使醇溶青瓊脂平板變為深藍色，因此甲菌屬于解脂菌，A正確；乙菌落周圍沒有出現深藍色，說明乙菌落不能產生脂肪酶，不能利用脂肪為其供能，但乙菌落也可以在培養基上生存，說明該培養基不是以脂肪為唯一碳源，B錯誤；可將兩種菌分別接種在同一平板的不同區域進行對比，更加直觀，C正確；可以利用該平板來比較解脂菌分泌脂肪酶的能力，觀察指標可以是菌落周圍深藍色圈的大小，D正確。故選B。]
2．(2021·廣東選擇考適應性測試)幾丁質廣泛存在于甲殼類動物的外殼、昆蟲的外骨骼和真菌的細胞壁中。某些微生物能合成幾丁質酶(胞外酶)，使幾丁質降解為N 乙酰氨基葡萄糖，然后進一步轉化利用。科研人員試圖從土壤中篩選出能高效降解幾丁質的菌株，通過微生物培養獲得幾丁質酶，用于生物防治。回答下列問題：
　　　　　 　　
(1)在篩選過程中，應將土壤樣品稀釋液接種于以______________為唯一碳源的固體選擇性培養基上篩選目標菌株。
(2)培養所篩選出的目標菌株，計算各單菌落周圍的“水解圈直徑/菌落直徑”的比值，比值大小反映了__________________________________________
__________________________________________________________________。
(3)科研人員篩選出了產幾丁質酶的菌株A。將菌株A發酵產生的幾丁質酶粗提液加入盛有馬鈴薯培養基的培養皿中，涂布均勻后分別接種4種病原真菌，以____________________代替幾丁質酶粗提液作為對照，結果見圖，幾丁質酶粗提液對________(填病原菌編號)的抑菌效果最強。推測幾丁質酶的抑菌機理是_________________________________________________________________。
[解析]　(1)篩選過程中，將土壤樣品稀釋液接種于以幾丁質為唯一碳源的選擇培養基上，在該培養基上只有可以利用幾丁質的微生物可以生存，其他不能利用幾丁質的微生物被淘汰而達到篩選的作用。
(2)水解圈直徑/菌落直徑的值可以反映水解能力的大小，水解圈直徑/菌落直徑的值越大，說明該菌降解幾丁質的能力越強，反之越弱。
(3)對照組實驗應滿足單一變量原則，實驗組添加幾丁質酶，對照組加入不含幾丁質酶粗提液的等量的無菌水，對4組實驗進行觀察比較，d組水解圈直徑/菌落直徑最大，即抑制效果最強，幾丁質是真菌細胞壁的組成成分，幾丁質酶水解了幾丁質導致真菌細胞壁不能合成，抑制了真菌的繁殖。
[答案]　(1)幾丁質　(2)微生物的降解能力　(3)等量的無菌水　d　幾丁質是真菌細胞壁的組成成分，幾丁質酶水解了幾丁質導致真菌細胞壁不能合成，抑制了真菌的繁殖
微生物的計數
3．(不定項)(2021·濱州高三二模)一次性口罩的主要成分為聚丙烯纖維(PP)，某科研團隊準備從土壤中篩選出高效降解一次性口罩的細菌。圖甲表示PP分解菌分離與計數的過程，6號試管涂布的三個平板的菌落數為550、601、688；7號試管涂布的三個平板的菌落數為58、73、97；8號試管涂布的三個平板的菌落數為8、15、28。圖乙表示在培養基中加入能與PP結合而顯色的染色劑，目的菌落周圍出現透明圈的情況。下列說法正確的是(　　)
圖甲
圖乙
A．圖甲、圖乙所用培養基分別為選擇培養基和鑒別培養基，都以PP作為唯一碳源
B．圖甲、圖乙所用接種方法分別為稀釋涂布平板法和平板劃線法，都需在酒精燈火焰旁進行
C．1 g土壤樣品中含有PP分解菌的估算數目是7.6×1010個，此數值一般偏小
D．可選擇圖乙培養基中d/D比值大的PP分解菌作為目的菌種推廣使用
AC　[甲是篩選PP分解菌的過程，培養基為選擇培養基，圖乙表示在培養基中加入能與PP結合而顯色的染色劑，鑒別PP分解菌的過程，所以圖乙所用培養基為鑒別培養基，都以PP作為唯一碳源，A正確；圖甲、圖乙所用接種方法都是稀釋涂布平板法，都需在酒精燈火焰旁進行，B錯誤；由于平板計數范圍為30～300，故取7號試管中的數量，7號試管的稀釋倍數為108，則[(58＋73＋97)÷3]÷0.1×108＝7.6×1010，即1 g 土壤樣品中含有PP分解菌的估算數目是7.6×1010個，此數值一般偏小，因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落，C正確；可選擇圖乙培養基中D/d較大的菌株(降解圈直徑D、菌落直徑d)，因為這一指標越大說明單個菌株分解PP的能力強，所以可作為目的菌種推廣使用，D錯誤。]
4．(2021·十堰高三模擬)自生固氮菌是土壤中能獨立固定空氣中N2的細菌，將玉米種子用自生固氮菌拌種后播種，可顯著提高產量并降低化肥的使用量。科研人員進行了土壤中自生固氮菌的分離和固氮能力測定的研究，部分實驗流程如下圖。回答下列問題：
(1)步驟①土樣應取自當地表層土壤的原因是_________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________；
步驟②需充分振蕩的主要目的是____________________________________
_________________________________________________________________
_______________________________________________________________。
(2)下表為兩種培養基的配方，步驟④應選其中的________培養基，原因是
________________________________________________________________
_______________________________________________________________。
培養基類型 培養基組分
Ashby培養基 甘露醇(C6H14O6)、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl、K2SO4、CaCO3、蒸餾水、瓊脂
LB培養基 蛋白胨、酵母提取物、NaCl、蒸餾水、瓊脂
(3)步驟④所用的接種工具是________，若在④的平板上統計的菌落的平均數量為126個，則每克土壤中含有的固氮菌為________個。
(4)將純化的固氮菌置于完全培養液中擴大培養48小時，經離心后收集下層細胞并轉移至特定培養基中進行固氮能力的測定，篩選出固氮能力最強的菌種CM12，為進一步鑒定其固氮能力，科研人員選用發芽一致的玉米種子進行3組盆栽實驗，30天后測定土壤微生物有機氮含量，結果如右圖。
注：CK：對照處理組；N：尿素處理組(每盆土壤澆50 mL有氮全營養液：成分為在1 000 mL無氮植物營養液中加入0.12 g尿素)；CM12：自生固氮菌CM12處理組(每盆土壤澆50 mL，接種自生固氮菌的無氮植物營養液)。
①對照組(CK)的處理為_______________________________________。
②實驗結果表明：施用尿素處理和接種固氮菌CM12處理均能顯著增加土壤微生物有機氮含量。與尿素處理組相比，CM12處理組土壤微生物有機氮含量增加了約__________%(保留1位小數)。
③自生固氮菌較共生固氮菌(如根瘤菌)的應用范圍更廣，原因是________
_______________________________________________________________。
[解析]　(1)土壤中含有豐富微生物，同其他生活環境相比，土壤中的微生物數量最大、種類最多。在富含有機質的土壤表層，有更多的固氮菌生長，故步驟①土樣取自當地表層土壤；步驟②需充分振蕩20 min，主要目的是使土壤中的微生物充分釋放到無菌水中。
(2)步驟④應選其中的Ashby培養基，原因是該培養基不含氮源，具有選擇作用，自生固氮菌可以利用空氣中的氮氣作為氮源，LB培養基中的蛋白胨可以提供氮源，不具有選擇作用。
(3)實驗采用的是稀釋涂布平板法，所以步驟④中所用的接種工具是涂布器。若在④的平板上統計的菌落的平均數量為126個，則每克土壤中含有的固氮菌為126÷0.1×104＝1.26×107。
(4)①對照組的目的是排除無關變量對實驗的影響，故對照組(CK)的處理為每盆土壤澆50 mL無氮植物營養液。
②由柱狀圖可知，空白對照組中土壤微生物有機氮含量為10，尿素處理組的土壤微生物有機氮含量為12，而CM12處理組土壤微生物有機氮含量為22，故與尿素處理組相比，CM12處理組土壤微生物有機氮含量增加值大概為(22－12)÷12×100%≈83.3%。
③自生固氮菌較共生固氮菌(如根瘤菌)的應用范圍更廣，原因是自生固氮菌能在土壤中獨立固氮，不受宿主的限制。
[答案]　(1)在富含有機質的土壤表層，有更多的固氮菌生長　使土壤中的微生物充分釋放到無菌水中　(2)Ashby　該培養基不含氮源，具有選擇作用，自生固氮菌可以利用空氣中的氮氣作為氮源，LB培養基中的蛋白胨可以提供氮源，不具有選擇作用　(3)涂布器　1.26×107　(4)①每盆土壤澆50 mL無氮植物營養液　②83.3　③自生固氮菌能在土壤中獨立固氮，不受宿主的限制
1．核心概念
(1)(選擇性必修3 P9)培養基：人們按照微生物對營養物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養基質。
(2)(選擇性必修3 P10)消毒：是指使用較為溫和的物理、化學或生物等方法殺死物體表面或內部一部分微生物。
(3)(選擇性必修3 P10)滅菌：是指使用強烈的理化方法殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
(4)(選擇性必修3 P12)菌落：分散的微生物在適宜的固體培養基表面或內部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態結構的子細胞群體。
(5)(選擇性必修3 P16)選擇培養基：在微生物學中，將允許特定種　類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基。
2．結論語句
(1)(選擇性必修3 P16)土壤中某些細菌能分解尿素，是因為它們能合成脲酶，脲酶催化尿素分解產生NH3，NH3可作為細菌生長的氮源。
(2)(選擇性必修3 P18)當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落，統計的菌落數往往比活菌的實際數目少。
(3)(選擇性必修3 P18)同一稀釋度下，應至少對3個平板進行重復計數，然后求出平均值。
1．(2021·北京等級考)人體皮膚表面存在著多種微生物，某同學擬從中分離出葡萄球菌。下述操作不正確的是(　　)
A．對配制的培養基進行高壓蒸汽滅菌
B．使用無菌棉拭子從皮膚表面取樣
C．用取樣后的棉拭子在固體培養基上涂布
D．觀察菌落的形態和顏色等進行初步判斷
C　[為避免雜菌污染干擾，需對配制的培養基進行高壓蒸汽滅菌，A正確；葡萄球菌需從人體皮膚的微生物中分離，為避免雜菌污染，故需要使用無菌棉拭子從皮膚表面取樣，B正確；棉拭子上的微生物需要用平板劃線法在培養基上進行接種，C錯誤；根據微生物在固體平板培養基表面形成的菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等特征進行鑒別，D正確。]
2．(2021·山東等級考)含硫蛋白質在某些微生物的作用下產生硫化氫導致生活污水發臭。硫化氫可以與硫酸亞鐵銨結合形成黑色沉淀。為探究發臭水體中甲、乙菌是否產生硫化氫及兩種菌的運動能力，用穿刺接種的方法，分別將兩種菌接種在含有硫酸亞鐵銨的培養基上進行培養，如圖所示。若兩種菌繁殖速度相等，下列說法錯誤的是(　　)
A．乙菌的運動能力比甲菌強
B．為不影響菌的運動需選用液體培養基
C．該實驗不能比較出兩種菌產生硫化氫的量
D．穿刺接種等接種技術的核心是防止雜菌的污染
B　[從圖中可以看出甲菌在試管中分布范圍小于乙菌，說明了乙菌的運動能力比甲菌強，A正確；為不影響菌的運動需選用半固體培養基，B錯誤；該實驗可以根據黑色沉淀的多少初步比較細菌產生硫化氫的能力，但不能測定產生硫化氫的量，C正確；微生物接種技術的核心是防止雜菌的污染，D正確。故選B。]
3．(2020·江蘇高考)為純化菌種，在鑒別培養基上劃線接種纖維素分解菌，培養結果如圖所示。下列敘述正確的是(　　)
A．倒平板后需間歇晃動，以保證表面平整
B．圖中Ⅰ、Ⅱ區的細菌數量均太多，應從Ⅲ區挑取單菌落
C．該實驗結果因單菌落太多，不能達到菌種純化的目的
D．菌落周圍的纖維素被降解后，可被剛果紅染成紅色
B　[倒平板后無須間歇晃動，A錯誤；圖中Ⅰ區、Ⅱ區的細菌數量太多，Ⅲ區的細菌數量較少，可從Ⅲ區挑取單菌落，B正確；Ⅲ區中存在單菌落，該實驗結果能達到菌種純化的目的，C錯誤；剛果紅能與纖維素形成紅色復合物，但不能和纖維素水解后的纖維二糖和葡萄糖形成紅色復合物，因此菌落周圍的纖維素被降解后，不能被剛果紅染成紅色，D錯誤。]
4．(2020·全國卷Ⅰ)某種物質S(一種含有C、H、N的有機物)難以降解，會對環境造成污染，只有某些細菌能降解S。研究人員按照如圖所示流程從淤泥中分離得到能高效降解S的細菌菌株。實驗過程中需要甲、乙兩種培養基，甲的組分為無機鹽、水和S，乙的組分為無機鹽、水、S和Y。
無菌水　　甲　　乙　　　　甲
請回答下列問題：
(1)實驗時，盛有水或培養基的搖瓶通常采用________的方法進行滅菌。乙培養基中的Y物質是________。甲、乙培養基均屬于________培養基。
(2)實驗中初步估測搖瓶M中細菌細胞數為2×107個/mL，若要在每個平板上涂布100 μL稀釋后的菌液，且保證每個平板上長出的菌落數不超過200個，則至少應將搖瓶M中的菌液稀釋________倍。
(3)在步驟⑤的篩選過程中，發現當培養基中的S超過某一濃度時，某菌株對S的降解量反而下降，其原因可能是____________________________(答出1點即可)。
(4)若要測定淤泥中能降解S的細菌細胞數，請寫出主要實驗步驟：________________________________________________________________
______________________________________________________________。
(5)上述實驗中，甲、乙兩種培養基所含有的組分雖然不同，但都能為細菌的生長提供4類營養物質，即________________。
[解析]　(1)實驗過程中，對盛有水或培養基的搖瓶進行滅菌時，常采用高壓蒸汽滅菌法。據題圖分析可知，乙培養基為固體培養基，與甲培養基相比，其特有的組分Y物質應是凝固劑瓊脂。甲、乙培養基均只允許能利用物質S作為氮源和碳源的微生物生長，因此均為選擇培養基。(2)據題意，假設至少將搖瓶M中的菌液稀釋X倍，才能保證稀釋后的100 μL菌液中細菌細胞數不超過200個，初步估測搖瓶M中細菌細胞數為2×107個/mL，則稀釋之前100 μL菌液中有2×106個細菌，可得2×106×(1/X)＝200，則X＝104，因此至少應將搖瓶M中的菌液稀釋104倍。(3)在篩選過程中，若培養基中S濃度過高，可能會導致細胞失水，進而抑制菌株的生長。(4)將含有能降解S的細菌的淤泥加入無菌水中，進行適當稀釋后，利用稀釋涂布平板法，取適量的菌液涂布到乙培養基上，在適宜條件下進行培養，一段時間后，統計菌落數，即可估算出淤泥中能降解S的細菌細胞數。(5)本實驗中，甲、乙兩種培養基所含有的組分雖然不同，但都能為細菌的生長提供的營養物質是水、碳源、氮源和無機鹽。
[答案]　(1)高壓蒸汽滅菌　瓊脂　選擇　(2)104　(3)S的濃度超過某一值時會抑制菌株的生長　(4)取淤泥加入無菌水中，涂布(或稀釋涂布)到乙培養基上，培養后計數　(5)水、碳源、氮源和無機鹽
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