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高考生物二輪復(fù)習(xí)專題專練
(31)　 基因工程中限制酶的選取與基因表達(dá)載體的構(gòu)建
從“高度”上研究高考
[典例]　(2021·福建高考)微生物吸附是重金屬廢水的處理方法之一。金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在于動(dòng)植物中的金屬結(jié)合蛋白，具有吸附重金屬的作用。科研人員將棗樹的MT基因?qū)氪竽c桿菌構(gòu)建工程菌。回答下列問題：
(1)根據(jù)棗樹的MT cDNA的核苷酸序列設(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物(圖1甲)，通過PCR擴(kuò)增MT基因。已知A位點(diǎn)和B位點(diǎn)分別是起始密碼子和終止密碼子對(duì)應(yīng)的基因位置。選用的引物組合應(yīng)為__________。
(2)本實(shí)驗(yàn)中，PCR所用的DNA聚合酶擴(kuò)增出的MT基因的末端為平末端。由于載體E只有能產(chǎn)生黏性末端的酶切位點(diǎn)，需借助中間載體P將MT基因接入載體E。載體P和載體E的酶切位點(diǎn)及相應(yīng)的酶切序列如圖1乙所示。
①選用____________酶將載體P切開，再用__________(填“T4 DNA”或“E.coli DNA”)連接酶將MT基因與載體P相連，構(gòu)成重組載體P′。
②載體P′不具有表達(dá)MT基因的____________和______________。選用____________酶組合對(duì)載體P′和載體E進(jìn)行酶切，將切下的MT基因和載體E用DNA連接酶進(jìn)行連接，將得到的混合物導(dǎo)入到用________離子處理的大腸桿菌，篩出MT工程菌。
(3)MT基因在工程菌的表達(dá)量如圖2所示。結(jié)果仍無法說明已經(jīng)成功構(gòu)建能較強(qiáng)吸附廢水中重金屬的MT工程菌，理由是_____________
____________________________________________________________。
[解析]　(1)密碼子位于mRNA上，是決定氨基酸的三個(gè)相鄰堿基，起始密碼子和終止密碼子分別控制翻譯的開始和結(jié)束，故為保證基因的正常表達(dá)，一對(duì)引物應(yīng)分別位于A位點(diǎn)和B位點(diǎn)的外側(cè)。(2)①為得到平末端，可用EcoRⅤ或Sma Ⅰ切割載體P，但后續(xù)需進(jìn)一步將重組載體P′中的MT基因接入載體E，此時(shí)需將MT基因插入Xho Ⅰ和Pst Ⅰ兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，故選EcoRⅤ將載入體P切開；由于E.coli DNA連接酶只能連接黏性末端，而T4 DNA連接酶既可以連接黏性末端又可以連接平末端，結(jié)合題意可知，MT基因的末端為平末端，故需要用T4 DNA連接酶將MT基因與載體P相連，構(gòu)成重組載體P′。②由圖1可知，載體P′不含有表達(dá)MT基因的啟動(dòng)子和終止子；為避免自身環(huán)化和反向連接，可選用兩種酶切割兩種載體，據(jù)圖1可知，載體P′和載體E均含有Xho Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位點(diǎn)，故可選用Xho Ⅰ和Pst Ⅰ酶進(jìn)行酶切；將目的基因?qū)氪竽c桿菌的方法是感受態(tài)細(xì)胞法，需用鈣離子處理大腸桿菌。(3)由于尚未在個(gè)體生物學(xué)水平上對(duì)MT工程菌吸附重金屬的能力進(jìn)行鑒定，故即使MT工程菌的MT蛋白相對(duì)表達(dá)量較高，也無法說明已經(jīng)成功構(gòu)建能較強(qiáng)吸附廢水中重金屬的MT工程菌。
[答案]　(1)引物1和引物4　(2)①EcoRⅤ　T4 DNA　②啟動(dòng)子　終止子　Xho Ⅰ和Pst Ⅰ　鈣　(3)尚未在個(gè)體生物學(xué)水平上對(duì)MT工程菌吸附重金屬的能力進(jìn)行鑒定
從“深度”上提升知能
1．限制酶的選擇技巧
(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點(diǎn)選擇限制酶
①應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，不能選擇切點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。 ②為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和反向連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點(diǎn)，如圖乙)
(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)選擇限制酶(如圖)
2．基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程
從“寬度”上拓展訓(xùn)練
1．如圖為某質(zhì)粒限制酶酶切圖譜。某基因不含圖中限制酶識(shí)別序列，為使PCR擴(kuò)增的該基因與該質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒，則擴(kuò)增的該基因兩端需分別引入哪兩種限制酶的識(shí)別序列(　 )
A．NdeⅠ和BamHⅠ　　　B．NdeⅠ和XbaⅠ
C．XbaⅠ和BamHⅠ D．EcoRⅠ和KpnⅠ
解析：選A　構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，要將目的基因插入到啟動(dòng)子和終止子之間，而且不能破壞啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)、抗生素抗性基因等部位。故只能選用Nde Ⅰ和BamH Ⅰ切割質(zhì)粒，因此在PCR擴(kuò)增的該基因的兩端需分別引入Nde Ⅰ和BamH Ⅰ兩種限制酶的識(shí)別序列。
2．為了獲得抗蚜蟲棉花新品種，研究人員將雪花蓮凝集素基因(GNA)和尾穗莧凝集素基因(ACA)與載體(pBI121)結(jié)合(如圖)，然后導(dǎo)入棉花細(xì)胞。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(　 )
A．用限制酶BsaBⅠ和DNA連接酶處理兩種基因可獲得GNA-ACA融合基因
B．與只用KpnⅠ相比，用KpnⅠ和XhoⅠ同時(shí)處理融合基因和載體可保證基因轉(zhuǎn)錄方向正確
C．在含卡那霉素培養(yǎng)基上可成活的棉花細(xì)胞就是導(dǎo)入了目的基因的棉花細(xì)胞
D．用PCR技術(shù)可檢測(cè)GNA和ACA基因是否導(dǎo)入棉花細(xì)胞中
解析：選C　由ACA、GNA、GNA-ACA的示意圖可知，應(yīng)用限制酶BsaBⅠ和DNA連接酶處理兩種基因獲得GNA-ACA融合基因，A正確；圖中質(zhì)粒與GNA-ACA融合基因上都含有Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ的酶切位點(diǎn)，與只用KpnⅠ相比，用KpnⅠ和XhoⅠ處理融合基因和載體可保證基因轉(zhuǎn)錄方向正確，避免反向連接，B正確；在含卡那霉素的培養(yǎng)基上能存活的植物細(xì)胞為成功轉(zhuǎn)入目的基因的細(xì)胞或含有普通質(zhì)粒的細(xì)胞，C錯(cuò)誤；PCR技術(shù)可用于基因探針的制備，可用來檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞，D正確。
3．科學(xué)家從某細(xì)菌中提取抗煙草花葉病毒基因并轉(zhuǎn)入煙草，來培育轉(zhuǎn)基因抗病毒煙草。如圖是轉(zhuǎn)基因抗病毒煙草的部分培育過程，含目的基因的外源DNA和質(zhì)粒上的箭頭表示相關(guān)限制酶的切割位點(diǎn)。圖中各種限制酶切割后均獲得不同的黏性末端，下列有關(guān)說法錯(cuò)誤的是(　 )
A．為了防止目的基因與質(zhì)粒反向連接應(yīng)使用限制酶EcoRⅠ和HindⅢ切割
B．圖中限制酶均能在它們識(shí)別序列的中軸線處切割DNA分子
C．圖中所使用的質(zhì)粒是農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒
D．通過煙草花葉病毒的侵染實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草是否培育成功
解析：選B　為了防止目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和反向連接，應(yīng)選用EcoRⅠ和HindⅢ對(duì)外源DNA和質(zhì)粒進(jìn)行切割，這樣使目的基因兩端的黏性末端不同，可以防止反向連接，不使用SmaⅠ是因?yàn)槠鋾?huì)破壞目的基因和標(biāo)記基因，A正確；經(jīng)限制酶沿識(shí)別序列的中軸線處切割DNA分子后產(chǎn)生的一般是平末端，若不在中軸線處切割DNA分子則產(chǎn)生黏性末端，B錯(cuò)誤；重組質(zhì)粒能夠?qū)朕r(nóng)桿菌進(jìn)行增殖，所以圖中所使用的質(zhì)粒是農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒，C正確；在個(gè)體水平上進(jìn)行目的基因的檢測(cè)與鑒定，可以進(jìn)行抗病鑒定，所以通過煙草花葉病毒的侵染實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草是否培育成功，D正確。
[微課微練·一點(diǎn)一評(píng)]
一、選擇題
1．(2022·東城區(qū)一模)自然界中很少出現(xiàn)藍(lán)色的花，天然藍(lán)色花產(chǎn)生的主要原因是花瓣細(xì)胞液泡中花青素在堿性條件下顯藍(lán)色。我國(guó)科學(xué)家利用鏈霉菌的靛藍(lán)合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)構(gòu)建基因表達(dá)載體(如圖)，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入白玫瑰中，在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中形成穩(wěn)定顯色的靛藍(lán)。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(　 )
A．上述獲得藍(lán)色玫瑰的方案中無需轉(zhuǎn)入能調(diào)控液泡pH的基因
B．將sfp基因插入Ti質(zhì)粒時(shí)使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ
C．sfp和idgS基因具有各自的啟動(dòng)子，表達(dá)是相互獨(dú)立進(jìn)行的
D．農(nóng)桿菌可將Ti質(zhì)粒上的T-DNA整合到白玫瑰染色體DNA上
解析：選B　藍(lán)色玫瑰細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的靛藍(lán)能夠穩(wěn)定顯色，不受pH的影響，故本題方案中無需轉(zhuǎn)入能調(diào)控液泡pH的基因，A正確；將sfp基因插入Ti質(zhì)粒時(shí)若使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ，則會(huì)將終止子1一同切除，故只能用BamH Ⅰ，B錯(cuò)誤；sfp和idgS基因具有各自的啟動(dòng)子，表達(dá)是相互獨(dú)立進(jìn)行的，C正確；將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞可采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，故農(nóng)桿菌可將Ti質(zhì)粒上的T-DNA整合到白玫瑰染色體DNA上，D正確。
2．(2022·遼寧三模)ACC合成酶是乙烯合成的關(guān)鍵酶，乙烯的合成會(huì)影響番茄的儲(chǔ)藏和運(yùn)輸。如圖為科學(xué)家利用ACC合成酶基因的反向連接構(gòu)建載體，通過基因工程設(shè)計(jì)的耐儲(chǔ)轉(zhuǎn)基因番茄流程圖。下列說法不正確的是(　 )
A．引物的特異性是能夠從番茄DNA中獲取ACC合成酶基因的關(guān)鍵
B．反向連接的ACC合成酶基因合成的mRNA通過與正常的ACC合成酶基因的mRNA互補(bǔ)，限制了細(xì)胞內(nèi)乙烯的合成
C．可以在培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素和四環(huán)素，存活下來的細(xì)胞內(nèi)則含有攜帶目的基因的質(zhì)粒
D．設(shè)計(jì)雙酶切處理目的基因及載體的目的是更好地保證目的基因的反向連接
解析：選C　引物能與ACC合成酶基因通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合定位ACC合成酶基因的位置，因此引物的特異性是能夠從番茄DNA中獲取ACC合成酶基因的關(guān)鍵，A正確；反向連接的ACC合成酶基因合成的mRNA通過與正常的ACC合成酶基因的mRNA互補(bǔ)，使ACC合成酶基因不能正常表達(dá)，限制了細(xì)胞內(nèi)乙烯的合成，B正確；從題圖中可知，基因表達(dá)載體中ACC合成酶基因破壞了四環(huán)素抗性基因，因此含有攜帶目的基因質(zhì)粒的細(xì)胞能在氨芐青霉素培養(yǎng)基中存活，但不能在四環(huán)素培養(yǎng)基中存活，C錯(cuò)誤；設(shè)計(jì)雙酶切處理目的基因及載體是為了更好地保證目的基因的反向連接，D正確。
二、非選擇題
3．(2022·菏澤一模)普通棉花中含β-甘露糖苷酶基因(GhMnaA2)，能在纖維細(xì)胞中特異性表達(dá)，產(chǎn)生的β-甘露糖苷酶催化半纖維素降解，棉纖維長(zhǎng)度變短。科研人員通過構(gòu)建反義GhMnaA2基因表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入棉花細(xì)胞，成功獲得轉(zhuǎn)基因棉花品種，具體過程如圖：
(1)基因表達(dá)載體除圖示組成外，還有復(fù)制原點(diǎn)、______________(答兩個(gè))等。①②過程中所用的限制酶分別是________________和________。
(2)PCR技術(shù)擴(kuò)增β-甘露糖苷酶基因(GhMnaA2)的原理是______________________，該過程需要根據(jù)GhMnaA2基因設(shè)計(jì)____種引物，為保證GhMnaA2插入到質(zhì)粒2中，需在引物的______端添加限制酶識(shí)別序列。
(3)③過程中用酶切法可鑒定正、反義基因表達(dá)載體。用SmaⅠ酶和NotⅠ酶切割正義基因表達(dá)載體獲得0.1 kb、3.75 kb、5.25 kb、8.6 kb四種長(zhǎng)度的DNA片段，則用NotⅠ酶切割反義基因表達(dá)載體獲得DNA片段的長(zhǎng)度應(yīng)是____________和____________。
(4)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的反義GhMnaA2能阻止β-甘露糖苷酶合成，使棉纖維更長(zhǎng)的原理是____________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(5)為什么不能用GhMnaA2探針進(jìn)行DNA分子雜交來鑒定基因表達(dá)載體是否導(dǎo)入棉花細(xì)胞？____________________________________________________________________。
解析：(1)基因表達(dá)載體除了圖示組成(啟動(dòng)子)外，還應(yīng)包括復(fù)制原點(diǎn)、終止子、標(biāo)記基因等。結(jié)合題圖分析可知，①過程中所用的限制酶是HindⅢ、BamHⅠ②過程所用的限制酶是SmaⅠ。(2)PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的原理是DNA復(fù)制；該過程需要根據(jù)目的基因(GhMnaA2)兩端部分核苷酸序列設(shè)計(jì)2種引物；DNA聚合酶只能使新合成的DNA子鏈從5′端→3′端方向延伸，為保證GhMnaA2能插入到質(zhì)粒2中，還需要在引物的5′端添加限制酶識(shí)別序列。(3)③過程中，用SmaⅠ酶和NotⅠ酶切割正義基因表達(dá)載體獲得0.1 kb、3.75 kb、5.25 kb、8.6 kb四種長(zhǎng)度的DNA片段，則用NotⅠ酶切割反義基因表達(dá)載體獲得DNA片段的長(zhǎng)度應(yīng)是0.1 kb＋5.25 kb＝5.35 kb、3.75 kb＋8.6 kb＝12.35 kb。(4)(5)參見答案。
答案：(1)終止子、標(biāo)記基因　HindⅢ、BamHⅠ　SmaⅠ　(2)DNA復(fù)制　2　5′　(3)5.35 kb　12.35 kb　(4)由于反義GhMnaA2轉(zhuǎn)錄的mRNA能與棉花細(xì)胞內(nèi)的GhMnaA2轉(zhuǎn)錄的mRNA互補(bǔ)配對(duì)，從而抑制基因的表達(dá)(翻譯)，故導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的反義GhMnaA2能阻止β-苷露糖苷酶合成，使棉纖維更長(zhǎng)　(5)因?yàn)槊藁?xì)胞中本來就有GhMnaA2，不管是否導(dǎo)入都能與該探針發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)

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