資源簡介

3.2基因工程的基本操作程序
【學習目標】
1.【生命觀念】通過對抗蟲棉案例的學習，闡述基因工程的基本操作程序主要包括哪些步驟。
2.【科學探究】嘗試進行PCR的基本操作并用電泳鑒定PCR的產物。
【課前預習15min】
一、第一步：目的基因的篩選與獲取
1．培育轉基因抗蟲棉的四個步驟:(1)目的基因的 。(2) 。(3)將目的基因 。(4)目的基因的 。
2．目的基因
(1)概念：在基因工程的設計和操作中，用于 就是目的基因。
(2)作用：根據不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指 。
(3)實例：培育轉基因抗蟲棉用到的 ，即 基因。
3．篩選合適的目的基因：從 中進行篩選是較為有效的方法之一。
4．獲取目的基因的方法
(1) 目的基因。
(2)常用 地快速擴增目的基因。
(3)通過 來獲取目的基因。
5．利用PCR獲取和擴增目的基因
(1)含義：PCR是 的縮寫。它是一項在 提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的 進行大量復制的技術。
(2)原理： 。
(3)基本條件
①場所：在一定的 中進行，其中一般要添加 。
②模板：DNA母鏈。
③原料： 。
④酶： 酶。
⑤引物：使DNA聚合酶能夠從 開始連接脫氧核苷酸。
(4)過程
①變性：當溫度 ℃時，雙鏈DNA 為單鏈。
②復性：當溫度下降到 ℃左右時， 通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。
③延伸：當溫度 ℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在 酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。
(5)鑒定：常采用 來鑒定PCR的產物。
二、第二步：基因表達載體的構建——核心步驟
1．基因表達載體構建的目的:讓目的基因在受體細胞中 ，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠 。
2．基因表達載體的組成
3.基因表達載體的構建過程
(1)首先用一定的 切割載體。
（2）然后用同種限制酶或能產生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
(3)再利用 酶將含目的基因的DNA片段拼接到載體的切口處(如圖所示)。
三．第三步：將目的基因導入受體細胞
(1)將目的基因導入植物細胞
①花粉管通道法：
a．用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入 中。
b．在植物 的一定時間內，剪去柱頭，將 滴加在花柱切面上，使目的基因 。
②農桿菌轉化法
a．轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內 的過程。
b．農桿菌的特點：農桿菌細胞內含有 ，當它侵染植物細胞后，能將Ti質粒上的 (可轉移的DNA)轉移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的 上。
(2)將目的基因導入動物細胞
①方法： 技術。②受體細胞： 。
(3)將目的基因導入微生物細胞：常以 作為受體細胞，一般先用 處理大腸桿菌細胞，使細胞處于一種能 的生理狀態，然后再將重組的基因表達載體導入其中。
四．第四步：目的基因的檢測與鑒定
(1)分子水平的檢測
①通過 檢測受體細胞的染色體DNA上是否插入了目的基因。
②利用PCR技術檢測目的基因是否轉錄出了 。
③用相應抗體進行 檢測目的基因是否翻譯成蛋白質等。
(2)個體生物學水平的鑒定： 實驗等。
牛刀小試：判斷正誤
(1)PCR過程不需要解旋酶( )
(2)表達載體的復制和胰島素基因的表達均起始于啟動子( )
(3)目的基因導入雙子葉植物細胞一般采用農桿菌轉化法( )
(4)為培育抗除草劑的作物新品種，導入抗除草劑基因時只能以受精卵為受體( )
(5)抗蟲基因即使成功地插入植物細胞染色體上也未必能正常表達( )
(6)檢測目的基因是否導入受體細胞可用抗原抗體雜交技術( )
【教學過程】
學習目標一：通過對抗蟲棉案例的學習，闡述基因工程的基本操作程序主要包括哪些步驟。（20min）
任務一：，閱讀課本76-80頁回答下列問題
1．獲取目的基因是實施基因工程的第一步，目前獲取目的基因的常用方法有利用PCR獲取和擴增目的基因、通過構建基因文庫來獲取目的基因等。聚合酶鏈式反應簡稱PCR，是一種體外迅速擴增DNA片段的技術，這項技術中DNA復制的過程和細胞內DNA復制的過程是類似的。請結合已學過的DNA分子結構和復制的相關知識，回答下列問題：
(1)什么是引物？DNA復制時為什么需要引物？
(2)PCR擴增目的基因需要知道目的基因的全部核苷酸序列嗎？
(3)PCR過程中需要解旋酶嗎？所需要的DNA聚合酶應具有什么特點？
（4）經過n次循環后，有關PCR過程的計算
①n代后，DNA分子有_____個
②n代后，DNA鏈有_____條
③第____代出現完整的目的基因
④n代后，含引物的DNA分子有_____個
⑤n代后，共消耗_____個引物
⑥第n代復制，消耗了______個引物
⑦n代后，完整的目的基因有_____個
2．基因表達載體的構建是實施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其目的是使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發揮作用。填圖并回答下列問題：
(1)完善基因表達載體構成圖
(2)基因表達載體的構建需要 酶和 酶。
(3)目的基因的插入位點是隨意的嗎？為什么？
(4)啟動子和終止子與起始密碼子和終止密碼子相同嗎？
[小結一]1.目的基因的獲取
文庫類型 cDNA文庫 基因組文庫
文庫大小 小 大
基因中啟動子 無 有
基因中內含子 無 有
基因多少 某種生物的部分基因 某種生物的全部基因
說明 基因文庫的組建過程就包含基因工程的基本操作步驟； 從基因文庫中獲取目的基因的優點是操作簡便，缺點是工作量大，具有一定的盲目性。
2.生物體內DNA復制與PCR反應的比較
比較項目 體內DNA復制 PCR反應
解旋 在解旋酶作用下，細胞提供能量，部分DNA雙鏈解開 90 ℃以上高溫下解旋，DNA雙鏈全部解開，不需要解旋酶
酶 解旋酶、DNA聚合酶、DNA連接酶 耐高溫的DNA聚合酶
引物 一小段RNA 可以是RNA或單鏈DNA分子片段
合成子鏈 在引物基礎上，一條鏈連續合成；另一條鏈不連續合成，再由DNA連接酶連接 分別從兩條鏈的引物的3′端開始延伸，都是連續合成
過程
循環次數 受生物體自身控制 30多次
產物 完整DNA 兩個引物之間的DNA片段
相同點 都需要DNA模板、4種脫氧核苷酸、分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物；都是半保留復制，嚴格遵循堿基互補配對原則
3.啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比
【評標】題組一1.(2022遼寧省六校聯考)下面關于聚合酶鏈式反應(PCR)的敘述錯誤的是 (　　)
A.常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產物
B.PCR的循環過程一般分為變性、復性和延伸三步
C.PCR技術利用DNA半保留復制的原理,可在短時間內大量擴增目的基因
D.一個目的基因用PCR擴增生成2n個目的基因的過程中需要2n+1個引物
2.(2021北京十一學校期中)用PCR擴增下面的DNA片段:
5'-3'-GCATCGCGTAGCTAGCATATGCCG…………CGATTAATCGGCGCGCATTATAGC-3'-5'
供選擇的引物有:①5'-GACCTGTGGAAGC-3'、②5'-CATACGGGATTG-3'、③5'-GTATGCCCTAAC-3'、④5'-CAATCCCGTATG-3'共四種,應選擇 (　　)　　　　　　　　　　　　　　　　　　
A.①② B.②③ C.③④ D.①④
3. (2022河南洛陽聯考)如圖是PCR擴增的過程示意圖,其中敘述正確的是 (　　)
A.A過程不需要解旋酶參與
B.TaqDNA聚合酶是在B過程中發揮作用的
C.該過程需要一對特異性的引物,要求一對引物的序列是互補的
D.PCR反應體系只需要加入模板DNA、Taq DNA聚合酶和四種脫氧核苷酸
題組二　基因表達載體的構建
4.水母發光蛋白由236個氨基酸構成,現已將決定這種蛋白質的基因作為基因工程技術的標記基因。在基因工程技術中,這種蛋白質的作用是 (　　)
A.促使目的基因導入受體細胞 B.促使目的基因在受體細胞中復制
C.使目的基因容易被檢測出來 D.使目的基因容易成功表達
5.(2022天津西青楊柳青一中月考)下圖為基因表達載體的模式圖。下列相關敘述正確的是　 (　　)
A.甲表示啟動子,位于基因的上游,它是DNA聚合酶識別和結合的部位
B.乙表示終止密碼子,位于基因的下游,其作用是使轉錄過程停止
C.丙表示目的基因,其作用是獲得人們所需要的性狀
D.復制原點的存在有利于目的基因在受體細胞中擴增
6.(2022北京一五六中期中)如圖為甲、乙、丙分別是目的基因、質粒載體、重組DNA(重組質粒)的三個示意圖,限制酶有BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。要獲得理想的可表達目的基因的重組DNA,最佳的限制酶組合方式是 (　　)
A.用EcoRⅠ切割目的基因和質粒載體 B.用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和質粒載體
C.用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和質粒載體 D.用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和質粒載體
【回標】7.(2021山東濟寧期中)中科院動物研究所利用CRISPR/Cas9技術,向豬的基因組內插入一個解耦聯蛋白基因(UCP1),經過基因改造的豬瘦肉率高、脂肪少、抗寒能力強。如圖是基因改造過程中涉及的相關限制酶及酶切位點。請回答下列問題:
(1)圖中的抗生素抗性基因的作用是作為　 　　　基因,以便于重組DNA分子的篩選。為了獲取重組質粒,除了使用限制酶外,還需使用　　 　　酶。
(2)重組質粒上應有　　　 識別和結合的部位,以驅動解耦聯蛋白基因(UCP1)轉錄,該部位稱為　　 　　。
(3)在構建基因表達載體過程中,為避免出現質粒和目的基因自身連接,常用　　　 　　　兩種限制酶同時切割質粒和UCP1基因。
任務二：；閱讀課本80-82頁，回答下列問題（20min）
1．將目的基因導入受體細胞是實施基因工程的第三步。目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程，稱為轉化。結合圖1、圖2、圖3，根據教材相關內容完成下列問題：
(1)將目的基因導入植物細胞的方法有 和 等，其中由我國科學家獨創的一種方法是 ，適用于雙子葉植物和裸子植物的是 。
(2)農桿菌轉化法利用了農桿菌的什么特性？
(3)為什么植物基因工程常用的受體細胞可以是體細胞，而動物基因工程一般只用受精卵？
(4)從細胞器的功能上分析，若通過基因工程生產人的糖蛋白，可以用大腸桿菌作受體細胞嗎？
2．目的基因導入受體細胞后，是否可以維持穩定和表達其遺傳特性，只有通過檢測與鑒定才能知道。這是基因工程的第四步工作，也是檢查基因工程是否成功的一步。結合相關內容，回答下列問題：
(1)目的基因能否在真核生物中穩定遺傳的關鍵是什么？如何檢測？
(2)檢測棉花中導入的抗蟲基因是否表達的最簡便的方法是什么？
[小結二]
1．目的基因導入不同受體細胞的過程
植物 動物 微生物
常用方法 農桿菌轉化法 顯微注射技術 感受態細胞法
受體細胞 體細胞或受精卵 受精卵 原核細胞
轉化過程 將目的基因插入到Ti質粒的TDNA上→農桿菌→導入植物細胞→整合到受體細胞染色體的DNA上→表達 將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發育→獲得具有新性狀的動物 Ca2＋處理細胞→感受態細胞→重組表達載體與感受態細胞混合→感受態細胞吸收DNA分子
2．目的基因的檢測與鑒定的方法
類型 檢測內容 方法 結果顯示
分子水平檢測 目的基因是否插入轉基因生物的DNA上 DNA分子雜交技術(DNA和DNA之間)或PCR等 是否成功顯示出雜交帶
目的基因是否轉錄出mRNA 核酸分子雜交技術(DNA和mRNA之間)或PCR等
目的基因是否翻譯成蛋白質 抗原-抗體雜交(蛋白質和蛋白質之間)
個體生物學水平鑒定　 是否具有抗性及抗性程度 對轉基因生物進行抗性的接種實驗 是否賦予了預期抗性或蛋白質活性
基因工程產品與天然產品的功能活性是否相同 比較基因工程產品與天然產品的功能活性
【評標】題組三8.將目的基因導入大豆莖尖分生區細胞和小鼠受精卵,常用的方法分別是 (　　)
A.顯微注射法、農桿菌轉化法 B.顯微注射法、花粉管通道法
C.農桿菌轉化法、顯微注射法 D.花粉管通道法、顯微注射法
9.(2022江蘇揚州期中改編)如圖是利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖。以下相關敘述不正確的是 (　　)
A.②的構建需要限制性內切核酸酶和DNA連接酶參與
B.②→③可用氯化鈣處理農桿菌,有助于重組Ti質粒轉化到農桿菌細胞中
C.③→④用農桿菌侵染植物細胞,重組Ti質粒整合到植物細胞的染色體上
D.④的染色體上若含抗蟲基因,則⑤不一定表現出抗蟲性狀
【回標】題組四　10.下列關于目的基因的檢測與鑒定的敘述,錯誤的是 (　　)
A.目的基因在真核細胞中能否穩定遺傳的關鍵是目的基因是否插入細胞質DNA中
B.檢測受體細胞是否含有目的基因及其是否成功轉錄可采用PCR等技術
C.目的基因的鑒定可在個體生物學水平上進行
D.如在受體細胞內檢測到目的基因表達的蛋白質,可確定目的基因首端含有啟動子
11.(2022山東榮成一中月考)下列技術依據堿基互補配對原理的是 (　　)
①檢測轉基因生物的DNA上是否插入了目的基因　②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA　③檢測目的基因是否翻譯出蛋白質　④通過觀察害蟲吃棉葉是否死亡判斷棉花是否被賦予了抗蟲特性
①②③④　　　　　　　B.①② C.①②④ D.①②③
12.(2022安徽安豐高級中學月考改編)DNA探針是利用放射性同位素等標記的特定DNA片段。當DNA探針與待測的非標記單鏈DNA(或RNA)按堿基順序互補結合時,形成標記的DNA-DNA(或標記的DNA-RNA)雙鏈雜交分子,可檢測雜交反應結果。依據人的生長激素基因序列制成DNA探針,對樣品進行檢測,以下不能與探針形成雜交分子的是 (　　)
A.胰島B細胞的DNA B.胰島B細胞的mRNA
C.垂體細胞的DNA D.垂體細胞的mRNA
【知識建構】
【隨堂檢測】
　1.(2022山東菏澤一中月考)限制酶MunⅠ和限制酶 EcoRⅠ的識別序列及其切割位點分別是—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。如圖表示某一目的基因片段與質粒拼接形成重組質粒的過程,下列相關敘述錯誤的是 (　　)
A.用限制酶 EcoRⅠ切割目的基因,同時用限制酶MunⅠ切割質粒
B.構建重組質粒時,會形成5種脫氧核苷酸序列(最多考慮DNA片段兩兩連接)
C.將重組質粒同時用以上2 種限制酶切割,則會再形成1 種長度的 DNA 片段
D.限制酶能識別特定的核苷酸序列并在特定位點切割磷酸二酯鍵
2.將馬鈴薯胰蛋白酶抑制劑基因Pin-Ⅱ導入楊樹細胞培育成抗蟲楊樹。如圖表示含目的基因的DNA分子和農桿菌質粒,圖2中AmpR表示氨芐青霉素抗性基因,NeoR表示新霉素抗性基因,箭頭表示識別序列完全不同的4種限制酶的酶切位點。下列敘述錯誤的是(　　)
A.農桿菌在自然情況下容易感染雙子葉植物和裸子植物
B.為使目的基因與質粒高效重組,最好選用限制酶XbaⅠ和EcoRⅠ
C.成功導入重組質粒的細胞會表現為不抗氨芐青霉素、抗新霉素
D.可用抗蟲接種實驗檢測楊樹抗蟲基因是否成功表達
3.(2022河北武強中學期中)利用基因工程技術生產羧酸酯酶(CarE)制劑的流程如圖所示,有關敘述正確的是 (　　)
A.過程①需使用反轉錄酶
B.過程②利用PCR擴增CarE基因需使用解旋酶和耐高溫的DNA聚合酶
C.過程③可用NaCl溶液處理大腸桿菌,使之成為感受態細胞
D.過程④可利用抗原—抗體雜交鑒定目的基因是否已導入受體細胞
4.菊花是一種雙子葉植物,易感桃蚜。桃蚜不但直接影響植物生長,還是多種植物病毒的傳播媒介。雪花蓮凝集素基因GNA的表達產物能有效抑制桃蚜生長,某科研團隊運用農桿菌轉化法獲得了轉GNA基因菊花。下列有關敘述不正確的是 (　　)
A.受體細胞可以選擇菊花葉片細胞或桃蚜細胞
B.將目的基因GNA插入Ti質粒的T-DNA上構建基因表達載體
C.菊花外植體產生的酚類化合物能吸引農桿菌移向受體細胞
D.應用抗蟲接種實驗,檢測轉基因菊花對桃蚜的抗性及抗性的程度
5.(2022北京豐臺一模)小鼠腫瘤轉移抑制基因(kiss1基因)僅在特定組織中表達。在雌激素誘導下,細胞內信號轉導系統可以與kiss1基因啟動子的特定區域結合,激活kiss1基因的轉錄。研究者擴增了kiss1基因啟動子不同長度的片段P1、P2、P3和P4,分別構建這些片段與綠色熒光蛋白基因(G)融合的載體,轉入體外培養的特定細胞中,在培養液中添加雌激素,以確定不同片段的轉錄活性。下列敘述不正確的是 (　　)
A.PCR獲取不同長度片段時每組所用的引物有一個是統一的
B.應選擇有kiss1基因且能表達的小鼠細胞作為轉化的受體細胞
C.在細胞中表達出綠色熒光強度弱的片段具有較高的轉錄活性
D.該啟動子能響應外源激素信號,可在基因工程中發揮重要作用
6.(多選)(2022河北石家莊元氏一中月考改編)下列關于基因工程的敘述,正確的是 (　　)
A.載體上的抗性基因作為標記基因,有利于目的基因的插入和表達
B.限制性內切核酸酶和DNA連接酶是兩類常用的工具酶
C.人胰島素原基因在大腸桿菌中表達的胰島素原無生物活性
D.目的基因由載體導入受體細胞
7.（12分）乙烯具有促進果實成熟的作用,ACC氧化酶和ACC合成酶是番茄細胞內合成乙烯的兩個關鍵酶。利用反義DNA技術(原理如圖1),可以抑制這兩個基因的表達,從而使番茄具有耐儲存、宜運輸的優點。圖2為融合ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因的反義基因表達載體的結構示意圖。回答下列問題:
(1)從番茄細胞中提取RNA,利用RT-PCR技術獲取ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因,即利用RNA和PCR獲取目的基因。該技術獲取目的基因所需要的酶主要有　　　　　　　　　　　　　　　　（2分）。
(2)合成出的ACC氧化酶基因兩端分別含限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位點,ACC合成酶基因兩端含KpnⅠ和Sau3AⅠ的酶切位點,這四種限制酶及其識別序列和切割位點如下表:
限制性內切核酸酶 識別序列和切割位點
BamHⅠ —G↓GATCC—
EcoRⅠ —G↓AATTC—
KpnⅠ —GGTAC↓C—
Sau3AⅠ —↓GATC—
先用限制酶　　　　　　　分別對ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因進行切割后,再將它們拼接成融合基因,相應的Ti質粒和融合基因均使用限制酶　　　　　　　進行切割,以確保融合基因能夠插入載體中。載體上卡那霉素抗性基因的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　 　（2分）。
為了獲得耐儲藏、宜運輸的番茄,應將融合基因　　　　(填“正向”或“反向”)插入啟動子2A11的下游,原因是　 （2分）。
(4)在檢測番茄細胞中是否存在反義融合基因時,　　　　(填“能”或“不能”)用放射性物質標記的ACC氧化(合成)酶基因片段作探針進行檢測,理由是　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　 （2分）。
得分 扣分
閱卷得分 審題規范（強化審題） 思維（析題）規范 呈現（答題）規范
采點計分 審題時間(3) 審清設問（層次化） 審讀材料、情境（標注化） 析題時間(2) 角度步驟要點（角度化） 特別注意事項（對號化） 答題時間(4) 書寫卷面(清晰化) 學科術語(術語化)
【課后作業】1.復習作業：依托本節課學案，整理本節課重難點及相關題型。
練習作業：
8.（8分）(2022山東日照青山學校期中)家禽飼料中富含纖維素,但家禽消化道中缺少降解纖維素的酶,阻礙了家禽對飼料的吸收與利用。研究人員從枯草芽孢桿菌中分離出編碼纖維素酶的W基因,并借助圖1所示的質粒載體導入乳酸桿菌體內,以提高添加乳酸桿菌飼料的利用率,節省成本。圖2為克隆得到的含W基因的DNA片段。回答下列問題:
(1)啟動子是一段有特殊序列結構的DNA片段,是　　　　識別和結合的部位。多數啟動子具有物種特異性,為滿足應用需要,在圖1質粒中插入W基因的上游應選擇　　 　　(填“枯草芽孢桿菌”或“乳酸桿菌”)的啟動子。
(2)分析兩圖可知,應使用限制酶　　　　　　切割質粒和含W基因的DNA片段,以獲得W基因能正確連接的重組質粒。所得重組質粒導入乳酸桿菌后,使用含　　 　　　　的培養基篩選,以得到成功導入W基因的乳酸桿菌。
(3)將纖維素含量為20%的培養基分為甲、乙、丙三組,其中甲組接種乳酸桿菌,乙組接種導入重組質粒的乳酸桿菌,丙組接種導入普通質粒的乳酸桿菌。相同條件下培養一段時間,發現甲、丙兩組培養基中纖維素的含量無變化,而乙組含量下降,試從分子水平簡要闡述出現上述結果的原因:　　　　　　　 　　　　　　　　　　　
　　　 （2分）。
(4)有人認為,增加導入W基因的數量會提高轉基因乳酸桿菌降解纖維素的能力。請設計一個實驗方案加以判定。(簡要寫出實驗思路)（2分）
3.預習作業：依托下節課學案熟悉相關知識點，勾畫重難點，寫出困惑。
答案
【課前預習15min】
一、篩選與獲取 基因表達載體的構建 導入受體細胞 檢測與鑒定。
2．改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因 編碼蛋白質的基因。Bt抗蟲蛋白基因
3．相關的已知結構和功能清晰的基因
4．人工合成 PCR特異性地快速擴增 構建基因文庫
5． (1) 聚合酶鏈式反應 體外 核苷酸序列
(2) DNA半保留復制。
(3) 緩沖溶液 Mg2＋ ② DNA母鏈。③ 4種脫氧核苷酸。④ 耐高溫的DNA聚合酶 ⑤引物： 引物的3′端
(4) 超過90 ℃ 解聚 ② 下降到50 ℃ 兩種引物 ③ 上升到72 ℃ 耐高溫的DNA聚合酶
(5) 瓊脂糖凝膠電泳
二、基因表達載體的構建
1． 穩定存在 表達和發揮作用。
2．
限制酶 (2) 同種限制酶或能產生相同末端 (3) DNA連接酶
三．將目的基因導入受體細胞
(1) 子房 受粉后 DNA溶液 借助花粉管通道進入胚囊。
②維持穩定和表達 Ti質粒 T DNA 染色體DNA
(2)① 顯微注射 ② 受精卵。
(3) 大腸桿菌 Ca2＋ 吸收周圍環境中DNA分子
四．目的基因的檢測與鑒定
(1) PCR等技術 ② mRNA。③抗原—抗體雜交 (2) 抗蟲、抗病接種
牛刀小試 √×√×√×
【教學過程】
學習目標一：1.（1）引物是指兩段與待擴增的DNA序列互補的一小段DNA或RNA片段。原因：在DNA擴增時，DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從引物的3′端延伸DNA鏈，因此克隆DNA時應加入兩種引物。
(2)不需要，只要知道目的基因兩端的部分核苷酸序列即可(以便根據這部分序列合成兩種引物)。
(3)PCR過程中，DNA雙鏈解開是在高溫下完成的，不需要解旋酶；由于PCR過程溫度較高，所以需要能耐高溫的DNA聚合酶。
（4）2n 2n+1 3 2n 2n+1-2 2n 2n-2n
2.RNA聚合酶 轉錄 下游 目的基因
(2)限制酶 DNA連接酶。
(3)不是。基因表達需要啟動子與終止子的調控，所以目的基因應插入啟動子與終止子之間，若目的基因插入啟動子內部，啟動子將失去原有的功能。
(4)不相同。啟動子和終止子位于DNA上，是基因表達必需的部分；起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，決定翻譯的開始和結束。
【評標】1.D　PCR是一項根據DNA半保留復制的原理,在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件,對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術(教材第77頁),其循環過程一般可分為三步:變性、復性和延伸,其產物常采用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定,A、B、C正確。根據DNA半保留復制特點可知,隨著重復次數的增多,DNA分子以2n的形式增加,共有-2個引物參與子代DNA分子的合成,D錯誤。
2.D　用PCR擴增DNA片段的過程中,在引物作用下,DNA聚合酶從引物3'端開始延伸DNA鏈,即DNA的合成方向是從子鏈的5'端→3'端延伸的,故引物的堿基序列應與每條模板鏈5'端的一段核苷酸鏈的堿基序列相同,即應以模板鏈5'端的一段脫氧核苷酸單鏈片段作為引物;由題干信息分析可知,5'端的堿基序列是5'-GACCTGTGGAAGC和5'-CAATCCCGTATG,故對應的引物為①5'-GACCTGTGGAAGC-3'和④5'-CAATCCCGTATG-3',故選D。
3.A　分析題圖:A是變性過程,B為復性過程,C為延伸過程。變性過程中高溫會破壞DNA雙鏈間的氫鍵,從而達到解旋的目的,因此A過程不需要解旋酶的參與,A正確;Taq DNA聚合酶是在C延伸過程中發揮作用的,B錯誤;該過程需要一對特異性的引物,要求一對引物的序列是不互補的,否則會影響目的基因的擴增,C錯誤;PCR反應體系需要加入模板DNA、Taq DNA聚合酶、四種脫氧核苷酸和兩種引物,D錯誤。
4.C　標記基因不能促使目的基因導入受體細胞,A不符合題意;復制原點有利于目的基因在受體細胞中復制,標記基因不能促使目的基因在受體細胞中復制,B不符合題意;水母發光蛋白基因可以表達出發光蛋白,使目的基因容易被檢測出來,C符合題意;標記基因與目的基因的表達沒有直接關系,D不符合題意。
5.D　基因表達載體包括啟動子、目的基因、終止子、標記基因和復制原點等,其中啟動子位于基因的上游,它是RNA聚合酶識別和結合的部位,則甲表示啟動子;終止子位于基因的下游,作用是使轉錄過程停止,則乙表示終止子;標記基因用于篩選含有目的基因的受體細胞,則丙表示標記基因;復制原點的存在有利于目的基因在受體細胞中擴增。綜上可知,A、B、C錯誤,D正確。
6.D　用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和質粒載體,在構建的重組DNA(重組質粒)中,RNA聚合酶在插入的目的基因上的移動方向才與圖丙相同,D正確。
【回標】7.答案　(1)標記　DNA連接　(2)RNA聚合酶　啟動子　(3)BamHⅠ和HindⅢ
解析(3)在構建基因表達載體的過程中,使用BamHⅠ和HindⅢ這兩種限制酶同時切割質粒和含UCP1基因的外源DNA,可以避免出現質粒和目的基因(UCP1基因)自身連接。
任務二：1．(1)農桿菌轉化法 花粉管通道法 花粉管通道法 農桿菌轉化法。
（2）農桿菌中Ti質粒上的TDNA(可轉移的DNA)可轉移至受體細胞，并且整合到受體細胞的染色體DNA上。
(3)植物體細胞的全能性較高，可經植物組織培養過程形成完整植物體，因此受體細胞可以是體細胞；動物體細胞的全能性受到嚴格限制，因此動物基因工程中的受體細胞一般只用受精卵。
(4)不可以。因為糖蛋白上的糖鏈是在內質網和高爾基體上加工完成的，而內質網和高爾基體存在于真核細胞中，大腸桿菌是原核生物，細胞中不含有這兩種細胞器。
2．(1)目的基因是否插入受體細胞的染色體DNA上，這是其能否在真核生物中穩定遺傳的關鍵。可以用DNA分子雜交、PCR等技術進行檢測。
(2)用葉片飼喂棉鈴蟲，觀察棉鈴蟲是否死亡。如果棉鈴蟲死亡，說明抗蟲基因已經表達；否則，抗蟲基因沒有表達。
【評標】8.C　大豆是雙子葉植物,農桿菌轉化法是將目的基因導入雙子葉植物細胞常用的方法;顯微注射法是將目的基因導入動物受精卵最常用的方法。
9.C　②→③可用氯化鈣處理農桿菌,使之處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態,這樣有助于重組Ti質粒轉化到農桿菌細胞中,B正確;農桿菌侵染植物細胞后,能將Ti質粒上的T-DNA(可轉移的DNA)轉移到被侵染的細胞,并將其整合到該細胞的染色體DNA上(教材第81頁),故用農桿菌侵染植物細胞,重組Ti質粒的T-DNA片段整合到植物細胞的染色體上,C錯誤;染色體上含有抗蟲基因,但抗蟲基因可能不能轉錄或翻譯,或者表達的蛋白質不具有生物活性,就會導致植物不能表現出抗蟲性狀,D正確。
【回標】10.A　目的基因在真核細胞中能否穩定遺傳的關鍵是目的基因是否插入核DNA中;檢測目的基因是否導入受體細胞或檢測目的基因是否轉錄出了mRNA可采用PCR等技術;目的基因能成功表達,說明其首端含有啟動子。
11.B　檢測轉基因生物的DNA上是否插入了目的基因、檢測目的基因是否轉錄出了mRNA可采用PCR等技術,其原理是堿基互補配對,①②符合題意;檢測目的基因是否翻譯出蛋白質可采用抗原—抗體雜交技術,不存在利用堿基互補配對原理,③不符合題意;通過觀察害蟲吃棉葉是否死亡判斷棉花是否被賦予了抗蟲特性,屬于個體生物學水平檢測,不存在利用堿基互補配對原理,④不符合題意。
12.B　胰島B細胞、垂體細胞中含有人的生長激素基因,其DNA可與探針形成雜交分子,A、C不符合題意。人的生長激素基因只在垂體細胞中表達,則垂體細胞中人的生長激素基因會轉錄出相應的mRNA,該mRNA能與探針形成雜交分子,D不符合題意。胰島B細胞中人的生長激素基因不表達,該細胞中的mRNA不能與探針形成雜交分子,B符合題意。
【隨堂檢測】
題組一　1.B　目的基因兩側都是限制酶EcoRⅠ的切割位點,因此應選用限制酶EcoRⅠ切割含有目的基因的外源DNA分子;質粒中含有限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的切割位點,但EcoRⅠ的切割位點位于標記基因中,用其切割會破壞標記基因,因此應選用限制酶MunⅠ切割質粒,A正確。最多考慮DNA片段兩兩連接時,DNA拼接時可能形成不拼接的兩種核苷酸序列,目的基因與目的基因同方向拼接和不同方向拼接兩種,質粒與質粒同方向拼接和不同方向拼接兩種,質粒與目的基因同方向拼接和不同方向拼接兩種,共8種,B錯誤。切割后的質粒與目的基因連接形成重組質粒,連接處形成—CAATTC—和—GAATTG—的新序列,不能被題中的2 種限制酶識別、切割,但EcoRⅠ能識別重組質粒中標記基因中的相應序列并切割,使重組質粒斷裂形成1種長度的DNA片段,C正確。
2.B　農桿菌是一種在土壤中生活的微生物,能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物(教材第81頁),A正確。由分析可知,為使目的基因與質粒高效重組,最好選用限制酶EcoRⅠ和PstⅠ同時切割目的基因和質粒,B錯誤。選用限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割質粒,氨芐青霉素抗性基因被破壞,新霉素抗性基因完好,故成功導入重組質粒的細胞會表現為不抗氨芐青霉素、抗新霉素,C正確。可用抗蟲接種實驗檢測楊樹抗蟲基因是否成功表達,若楊樹表現出抗蟲性,則楊樹抗蟲基因成功表達,D正確。
3.A　過程①表示反轉錄,需要反轉錄酶的催化,A正確;在利用PCR技術對獲取的目的基因進行擴增的過程中,不需要使用解旋酶,B錯誤;過程③表示將重組表達載體導入大腸桿菌,需要用CaCl2溶液處理大腸桿菌,使之成為感受態細胞,C錯誤;過程④可利用PCR等技術鑒定目的基因是否已導入受體細胞,而抗原—抗體雜交技術可鑒定目的基因是否成功表達,D錯誤。
4.A　要獲得轉基因菊花,可以選擇菊花葉片細胞作為受體細胞,但不能選擇桃蚜細胞作為受體細胞,A錯誤;Ti質粒上的T-DNA可以轉移到受體細胞中,并且整合到受體細胞染色體DNA上,根據這一特點,構建基因表達載體時,應該將目的基因GNA插入Ti質粒的T-DNA上,B正確;菊花外植體產生的酚類化合物能吸引農桿菌移向受體細胞,有利于目的基因成功導入,C正確;已知雪花蓮凝集素基因GNA的表達產物能有效抑制桃蚜生長,故應用抗蟲接種實驗,檢測轉基因菊花對桃蚜的抗性及抗性的程度,D正確。
5.C　結合圖示可知,構建不同長度的片段P1、P2、P3、P4與綠色熒光蛋白基因(G)融合的載體,與G融合的那段是一樣的,即下游引物是一樣的,但上游引物不同,A正確;該實驗要探究不同片段的轉錄活性,應選擇有kiss1基因且能表達的小鼠細胞作為轉化的受體細胞,B正確;若某片段轉錄,則綠色熒光蛋白基因也表達,在細胞中表達出綠色熒光強度強的片段具有較高的轉錄活性,C錯誤;在雌激素誘導下,細胞內信號轉導系統可以與kiss1基因啟動子的特定區域結合,激活kiss1基因的轉錄,該啟動子能響應外源激素信號,可在基因工程中發揮重要作用,D正確。
6.BCD　載體上的抗性基因作為標記基因,有利于篩選含重組DNA的細胞,但不能促進目的基因的插入和表達,A錯誤;大腸桿菌是原核生物,其細胞中無內質網和高爾基體,不能對胰島素原進行加工,因此人胰島素原基因在大腸桿菌中表達的胰島素原無生物活性,C正確。
7.答案　(1)反轉錄酶和耐高溫的DNA聚合酶
(2)BamHⅠ和Sau3AⅠ　EcoRⅠ和KpnⅠ　便于重組DNA分子的篩選　(3)反向　只有反向插入,轉錄出的mRNA才能和目的基因轉錄出的mRNA形成互補雙鏈RNA,使目的基因不能表達出兩種酶,從而抑制乙烯的合成　(4)不能　番茄細胞內本來就存在ACC氧化(合成)酶基因,能與ACC氧化(合成)酶基因探針發生分子雜交
解析　(1)通過RNA 獲取目的基因應使用反轉錄酶,而通過PCR技術擴增目的基因應使用耐高溫的DNA聚合酶。(2)因為合成出的 ACC 氧化酶基因兩端分別含限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位點,ACC合成酶基因兩端含KpnⅠ和Sau3AⅠ的酶切位點,而限制酶BamHⅠ和Sau3AⅠ切割出來的黏性末端相同,可將ACC 氧化酶基因和ACC 合成酶基因拼接成融合基因,最后對相應的Ti 質粒和融合基因均使用限制酶EcoRⅠ和KpnⅠ進行切割,以確保融合基因能夠插入載體中,載體上的卡那霉素抗性基因作為標記基因,其作用是便于重組DNA分子的篩選。(3)為了獲得耐儲藏、宜運輸的番茄,應將融合基因反向插入啟動子2A11的下游,因為只有反向插入,轉錄出的mRNA才能和目的基因轉錄出的mRNA形成互補雙鏈RNA,使目的基因不能表達出兩種酶,從而抑制乙烯的合成。(4)在檢測番茄細胞中是否存在反義融合基因時,不能用放射性物質標記的ACC 氧化(合成)酶基因片段作探針進行檢測,理由是番茄細胞內本來就存在ACC氧化(合成)酶基因,能與ACC氧化(合成)酶基因探針發生分子雜交。
【課后作業】
8.答案　(1)RNA 聚合酶　乳酸桿菌　(2)EcoRⅠ和HindⅢ　氨芐青霉素　(3)W基因在乳酸桿菌中成功表達出分解纖維素的酶　(4)將不同拷貝數的W 基因分別導入乳酸桿菌體內,比較各轉基因乳酸桿菌降解纖維素的能力差異。
解析　(4)由題意可知,實驗的自變量為W基因的數量,因變量為乳酸桿菌降解纖維素的能力,故可設計實驗方案:將不同拷貝數的W 基因分別導入乳酸桿菌體內,比較各轉基因乳酸桿菌降解纖維素的能力差異。

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