資源簡介

(共131張PPT)
第6課時
基因工程的基本工具和基本操作程序
課標要求
1.闡明DNA重組技術的實現需要利用限制性內切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。
2.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞和目的基因的檢測與鑒定等步驟。
3.按照實驗操作步驟，進行DNA的粗提取與鑒定實驗。
4.利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增DNA片段并完成電泳鑒定，或運用軟件進行虛擬PCR實驗。
考點一　重組DNA技術的基本工具
考點二　基因工程的基本操作程序
考點三　DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴增與電泳鑒定
內容索引
重溫高考 真題演練
課時精練
考點一
重組DNA技術的基本工具
1.基因工程的概念
歸納 夯實必備知識
別名 技術
操作環(huán)境 生物體外
操作對象 ______
操作水平 水平
結果 創(chuàng)造出更符合人們需要的新的 和__________
重組DNA
基因
DNA分子
生物類型
生物產品
2.基因工程的誕生和發(fā)展
(1)肺炎鏈球菌轉化實驗不僅證明DNA是遺傳物質，還證明了DNA可在同種生物不同個體之間 。
(2)DNA雙螺旋結構的提出和 的證明。
(3)中心法則的確立。
(4) 的破譯。
(5)基因轉移載體和 的發(fā)現為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。
轉移
半保留復制
遺傳密碼
限制酶、DNA連接酶和逆轉錄酶
(6) 體外重組的實現。
(7)重組DNA表達實驗的成功。
(8)DNA測序和合成技術的發(fā)明。
(9) 技術的發(fā)明。
(10) 技術可以實現對特定基因的定點插入、敲除或替換。
DNA
PCR
基因組編輯
3.重組DNA技術的基本工具
(1)限制性內切核酸酶(也稱“限制酶”)
黏性末端
原核生物
數千
特定核苷酸序列
磷酸二酯鍵
(2)DNA連接酶
磷酸二酯鍵
大腸桿菌
黏性末端
黏性末端
(3)載體
環(huán)狀雙鏈DNA分子
噬菌體
有一個至多個
自我復制
受體DNA
標記
(1)源于選擇性必修3 P71“旁欄思考”：①原核生物中存在限制酶的意義是什么？
提示　原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保證自身安全，防止外來病原物的危害。
②限制酶來源于原核生物，為什么不能切割自己的DNA分子？
提示　原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾。
(2)源于選擇性必修3 P72“旁欄思考”：DNA連接酶和DNA聚合酶 (填“是”或“不是”)一回事。原因是①DNA連接酶連接的是 ，而DNA聚合酶是把單個的 連接到已有的DNA片段上。② 起作用時需要以一條DNA鏈為模板，而 不需要模板。
不是
兩個DNA片段
脫氧核苷酸
DNA聚合酶
DNA連接酶
延伸
應用
圖解限制酶的選擇原則
(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。
(2)保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點原則：質粒作為載體必須具備標記基因，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中不選擇SmaⅠ。
延伸
應用
(3)確保出現相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶，如圖甲中PstⅠ；為避免目的基因和質粒自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。
構建基因表達載體時，需要選擇合適的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和載體。
已知限制性內切核酸酶Ⅰ的識別序列和切點是 ，限制性內切
核酸酶Ⅱ的識別序列和切點是 ，根據圖示分析回答下列問題：
拓展 提升科學思維
(1)請用圖示法寫出限制性內切核酸酶Ⅰ和限制性內切核酸酶Ⅱ切割后形成黏性末端的過程。
提示　限制性內切核酸酶Ⅰ：
限制性內切核酸酶Ⅱ：
(2)切割圖示中的目的基因和質粒應選用哪類限制酶？請說明理由。
提示　用限制酶Ⅱ切割目的基因，用
限制酶Ⅰ切割質粒。
限制酶Ⅰ的識別序列包含限制酶Ⅱ的
識別序列，因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位點，故使用限制酶Ⅱ時，可在目的基因兩端同時作切割，從而切出“目的基因”，但若使用限制酶Ⅱ切割質粒，會同時破壞質粒中的兩個“標記基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割質粒。
1.下表為常用的限制性內切核酸酶(限制酶)及其識別序列和切割位點，由此推斷，下列說法錯誤的是
突破 強化關鍵能力
注：Y為C或T，R為A或G。
限制酶名稱　 識別序列和切割位點 限制酶名稱 識別序列和切割位點
BamHⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoRⅠ C↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
HindⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
A.HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶切割后形成平末端
B.Sau3AⅠ限制酶的切割位點在識別序列的外部
C.BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種限制酶切割后形成相同的黏性末端
D.一種限制酶一定只能識別一種核苷酸序列
限制酶名稱　 識別序列和切割位點 限制酶名稱 識別序列和切割位點
BamHⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoRⅠ C↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
HindⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
√
HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶沿著中軸線切口切開，切割后形成平末端，A正確；
Sau3AⅠ限制酶識別GATC序列，切割位點在識別序列的外部，B正確；
BamHⅠ限制酶識別GGATCC序列，Sau3AⅠ限制酶識別GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC，C正確；
HindⅡ能識別GTCAAC，也能識別GTTAAC，D錯誤。
2.(不定項)質粒是基因工程中最常用的目的基因運載工具。下列有關敘述正確的是
A.質粒是只存在于細菌細胞質中能自主復制的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子
B.在所有的質粒上都能找到一個或多個限制酶切割位點
C.攜帶目的基因的重組質粒只有整合到宿主細胞的染色體DNA上才會隨
后者的復制而復制
D.質粒上的抗性基因常作為標記基因供重組DNA的鑒定和選擇
√
質粒不只分布于原核生物中，在真核生物——酵母菌細胞內也有分布；并不是所有的質粒上都有限制酶的切割位點，從而成為合適的運載目的基因的工具；重組質粒進入受體細胞后，可以在細胞內自我復制，也可以整合后復制。
與DNA有關的幾種酶的比較
歸納
提升
考點二
基因工程的基本操作程序
1.目的基因的篩選與獲取
(1)目的基因：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞 或獲得預期 等的基因。
(2)篩選合適的目的基因
①從相關的已知 的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。
②利用 和序列比對工具進行篩選。
歸納 夯實必備知識
性狀
表達產物
結構和功能清晰
序列數據庫
(3)目的基因的獲取
①人工合成目的基因。
②PCR 和擴增目的基因
a.PCR(聚合酶鏈式反應)：是一項根據 的原理，在體外提供參與DNA復制的各種 與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行 的技術。
b.PCR反應的條件：一定的 、DNA模板、2種 、4種______
、 DNA聚合酶，以及能自動調控 的儀器。
獲取
DNA半保留復制
組分
大量復制
緩沖溶液
引物
脫氧
核苷酸
耐高溫的
溫度
c.PCR擴增的過程
90
單鏈
50
引物
72
d.PCR產物的鑒定：常采用 來鑒定。
③通過構建 來獲取目的基因。
瓊脂糖凝膠電泳
基因文庫
(1)源于選擇性必修3 P77“相關信息”：Bt抗蟲蛋白基因產生的Bt抗蟲蛋白只在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現出毒性，而人和牲畜的胃液呈 ，腸道細胞也無特異性受體。因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產生危害。
(2)源于選擇性必修3 P77“相關信息”：真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應緩沖溶液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的 。
酸性
短單鏈核酸
2.基因表達載體的構建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因 ，同時，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。
(2)基因表達載體的組成及作用
在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代
啟動子
標記基因
(3)構建過程
提醒　啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比
項目 啟動子 終止子 起始密碼子 終止密碼子
本質 DNA DNA mRNA mRNA
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA 使轉錄在所需要的地方停下來 翻譯的起始信號(編碼氨基酸) 翻譯的結束信號(不編碼氨基酸)
3.將目的基因導入受體細胞
生物種類 植物 動物 微生物
常用方法 農桿菌轉化法、____________ 顯微注射法 處理法
受體細胞 ________________ _______ 原核細胞
花粉管通道法
體細胞或受精卵
受精卵
Ca2＋
轉化過程 將目的基因插入Ti質粒的T－DNA中→農桿菌→導入植物細胞→整合到受體細胞的染色體DNA上→表達 將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物 Ca2＋處理細胞→細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)→基因表達載體導入
辨析　(1)轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程。此處“轉化”與肺炎鏈球菌轉化實驗中的“轉化”含義相同，實質都是基因重組。
(2)農桿菌轉化法中的兩次拼接和兩次導入
第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受體細胞的染色體DNA上；第一次導入是將含目的基因的Ti質粒導入農桿菌，第二次導入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA導入受體細胞。
4.目的基因的檢測與鑒定
PCR是一項根據DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。在該過程中，引物非常關鍵，回答下列有關引物的問題：
(1)什么是引物？
提示　引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。
(2)PCR技術為什么需要引物？
提示　DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈。
拓展 提升科學思維
(3)利用PCR技術擴增目的基因時需要兩種引物，原因是什么？
提示　目的基因的兩條反向平行的鏈都作為模板，其堿基序列不同。
(4)在PCR擴增目的基因之前，需先設計引物，對設計的兩種引物之間的堿基序列的要求是什么？
提示　兩種引物之間不能互補配對。
(5)為檢測胚乳細胞中Wx基因是否表達，科研人員提取胚乳中的總RNA，經逆轉錄過程獲得總cDNA，通過PCR技術可在總cDNA中專一性地擴增出Wx基因的cDNA，原因是什么？
提示　引物是依據Wx基因的一段已知序列設計合成的(或引物能與Wx基因的cDNA特異性結合)。
(6)若一個DNA分子在PCR中經過n輪循環(huán)，理論上需要消耗多少個引物？第n輪循環(huán)需要消耗多少個引物數？
提示　經過n輪循環(huán)需要消耗引物數為(2n＋1－2)個，第n輪循環(huán)需要消耗的引物數為2n個。
3.(不定項)(2023·湖南懷化高三模擬)大引物PCR定點突變常用來研究蛋白質結構改變導致的功能變化。單核苷酸的定點誘變僅需進行兩輪PCR反應即可獲得，第一輪加誘變引物和側翼引物，第一輪產物作第二輪PCR擴增的大引物，過程如圖所示。下列有關敘述錯誤的是
A.PCR擴增的定點誘變產物通常需要連接到載體分
子上才能表達出相應的性狀，需具備啟動子、終
止子等結構才能進行轉錄和翻譯
B.單核苷酸的定點誘變所屬變異類型為基因重組
C.第二輪PCR所用的引物都是第一輪PCR產物DNA的兩條鏈
D.利用該技術將某功能蛋白的結構改變屬于蛋白質工程
突破 強化關鍵能力
√
√
單核苷酸的定點誘變所屬變異類型為基因突變，B錯誤；
除了第一輪產物作第二輪PCR擴增的大引物外，第二輪PCR仍需加入的引物是另一種側翼引物，以便進行另一條鏈的延伸，C錯誤；
蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規(guī)律及
其與生物功能的關系作為基礎，通過改造或合成基因，來改造現有蛋白質，或制造一種新的蛋白質，利用該技術將某功能蛋白的結構改變屬于蛋白質工程，D正確。
4.下圖表示培育轉基因抗植物病毒番茄的過程示意圖。下列敘述正確的是
A.過程A需要限制酶和DNA聚合酶的參與
B.過程B需要用CaCl2處理，以提高番茄細胞細胞壁的通透性
C.抗植物病毒基因一旦整合到番茄細胞的染色體上，就能正常表達
D.轉基因抗植物病毒番茄是否培育成功可通過抗病毒接種實驗進行鑒定
√
題圖中過程A為構建基因表達載體，需要用到限制酶和DNA連接酶，不需要DNA聚合酶，A錯誤；
CaCl2處理只是提高農桿菌細胞細胞膜的通透性，B錯誤；
抗植物病毒基因整合到番茄細胞的染色體上，不一定能表達，C錯誤；
轉基因抗植物病毒番茄是否培育成功可通過接種特定病毒，觀察番茄是否被感染來進行鑒定，D正確。
歸納
提升
(1)PCR技術和
DNA復制的比較
歸納
提升
(2)PCR擴增過程中的循環(huán)圖示與規(guī)律
歸納
提升
循環(huán)次數 1 2 3 n
DNA分子數 2 4 8 2n
含引物A(或B)的DNA分子數 1 3 7 2n－1
同時含引物A、B的DNA分子數 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗的引物數量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1－2 2n＋1－2
考點三
DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴增與電泳鑒定
1.DNA的粗提取與鑒定
(1)基本原理
歸納 夯實必備知識
不溶于
2 mol/L
二苯
胺
(2)操作流程
95%
沸水
注意　加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。
2.DNA片段的擴增及電泳鑒定
(1)實驗基礎
①PCR原理：利用了 原理。
②電泳：DNA分子具有可解離的基團，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷 的電極移動，這個過程就是電泳。
③PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的 等有關。
DNA的熱變性
相反
大小和構象
(2)PCR實驗操作步驟
微量移液器
底部
離心管
(3)DNA的電泳鑒定：凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為______的紫外燈下被檢測出來。
300 nm
1.在“DNA片段的擴增及電泳鑒定”實驗中，防止DNA被污染的操作有哪些？
提示　(1)為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。
(2)在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換，避免試劑的污染。
(3)在進行操作時，一定要戴好一次性手套。
拓展 提升科學思維
2.如何來評價擴增的效果？
提示　觀察DNA帶的分布及粗細程度來評價擴增的效果。
5.(2023·山東濟南高三期末)下列以洋蔥為實驗材料進行“DNA的粗提取與鑒定”實驗的敘述，正確的是
A.洋蔥研磨液需要用濾紙過濾，以保證提取的DNA量
B.濾液中加入冷酒精后，用玻璃棒攪拌會使DNA的提取量增加
C.向含DNA的濾液中加入2 mol/L的NaCl溶液有利于去除雜質
D.用二苯胺試劑鑒定DNA時，需沸水浴加熱冷卻后再觀察顏色變化
√
突破 強化關鍵能力
洋蔥研磨液要用紗布過濾，A錯誤；
DNA在冷酒精中的溶解度很低，蛋白質在冷酒精中的溶解度較高，故可以利用DNA不溶于冷酒精的原理，提純DNA，但提取量不變，B錯誤；
向含DNA的濾液中加入預冷的酒精溶液有利于去除雜質，加入2 mol/
L的NaCl溶液是溶解粗提取的DNA，C錯誤；
在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺會被染成藍色，用二苯胺試劑鑒定DNA時，需沸水浴加熱，冷卻后再觀察顏色變化，D正確。
6.(不定項)下圖是“DNA的粗提取與鑒定”實驗中的兩個操作步驟示意圖。下列相關敘述正確的是
A.選用植物細胞提取DNA時需先
研磨破碎細胞
B.圖2所示實驗操作中有一處明顯
錯誤，可能導致試管2中藍色變化不明顯
C.圖1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白質等雜質不溶
D.圖2試管1的作用是證明物質的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺試
劑出現藍色
√
√
圖2所示實驗的試管中溶液的液面高于燒杯中的液面，可能導致加熱不充分，試管2中藍色變化不明顯，B正確；
圖2試管1起對照作用，目的是證明沸水浴下物質的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺試劑不會出現藍色，而DNA遇二苯胺試劑出現藍色，D錯誤。
四
重溫高考 真題演練
1.(2021·湖北，16)某實驗利用PCR技術獲取目的基因，實驗結果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對)外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。為了減少反應非特異條帶的產生，以下措施中有效的是
A.增加模板DNA的量 B.延長熱變性的時間
C.延長延伸的時間 D.提高復性的溫度
1
2
3
4
√
增加模板DNA的量可以提高反應速度，但不能有效減少非特異性條帶，A錯誤；
延長熱變性的時間和延長延伸的時間會影響變性、延伸過程，但對于延伸中的配對影響不大，故不能有效減少反應非特異性條帶的產生，B、C錯誤。
1
2
3
4
2.(2021·山東，13)粗提取DNA時，向雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，過濾后所得濾液進行下列處理后再進行過濾，在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物的處理方式是
A.加入適量的木瓜蛋白酶
B.37～40 ℃的水浴箱中保溫10～15分鐘
C.加入與濾液體積相等的、體積分數為95%的冷卻的酒精
D.加入NaCl調節(jié)濃度至2 mol/L→過濾→調節(jié)濾液中NaCl濃度至0.14 mol/L
√
1
2
3
4
木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白質類雜質，由于酶具有專一性，不能水解DNA，過濾后在得到的濾液中加入木瓜蛋白酶后容易提取出 DNA相對含量較高的白色絲狀物，A正確；
37～40 ℃的水浴箱中保溫 10～15 分鐘不能去除濾液中的雜質，應該放在60～75 ℃的水浴箱中保溫10～15分鐘，使蛋白質變性析出，B錯誤；
向雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，過濾后在得到的濾液中加入與濾液體積相等的、體積分數為95%的冷卻的酒精，此時DNA析出，不會進入濾液中，C錯誤；
1
2
3
4
加入NaCl調節(jié)濃度至 2 mol/L→過濾→調節(jié)濾液中 NaCl 濃度至 0.14 mol/
L，DNA在0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度小，DNA析出，不會進入濾液中，D錯誤。故選A。
1
2
3
4
3.(2020·北京，12)為了對重金屬污染的土壤進行生物修復，研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉運蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動子連接，導入楊樹基因組中(如圖)。
1
2
3
4
A.①＋③ B.①＋② C.③＋② D.③＋④
為檢測獲得的轉基因楊樹苗中是否含有導入的HMA3基因，同時避免內源HMA3基因的干擾，在進行PCR擴增時，應選擇的引物組合是
√
引物①擴增的片段含有啟動子和HMA3基因，引物③擴增的片段不含啟動子，引物②擴增的片段既含有啟動子，又含有HMA3基因序列。圖示
1
2
3
4
中克隆的重金屬轉運蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動子連接，導入楊樹基因組中，若要檢測獲得的轉基因楊樹苗中是否含有導入的HMA3基因和高效啟動子，需要檢測是否含有高效啟動子序列和HMA3基因序列，應選擇的引物組合是①＋②，B正確。
4.(2022·江蘇，24)纖毛是廣泛存在的細胞表面結構，功能異常可引起多種疾病。因此，研究纖毛形成的作用機制具有重要意義。請回答下列問題：
1
2
3
4
(1)纖毛結構如圖Ⅰ所示，由細胞膜延伸形成的纖毛膜主要由______________組成。基體由中心體轉變而來，中心體在有絲分裂中的功能是______
_________________。
磷脂、蛋白質
射線，形成紡錘體
發(fā)出星
1
2
3
4
(2)某病人腎小管上皮細胞纖毛異常，為了分析纖毛相關基因X是否發(fā)生了變異，對基因X進行了PCR擴增與產物測序。從細胞樣品中分離DNA時，可通過交替調節(jié)鹽濃度將與核蛋白結合的DNA分離出來，溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是
__________。PCR擴增時，需在__________________________________催化下，在引物____端進行DNA鏈的延伸，獲得擴增產物用于測序。
溶解DNA
耐高溫DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)
3′
從細胞樣品中分離DNA時，可通過交替調節(jié)鹽濃度將與核蛋白結合的DNA分離出來，DNA在2.0 mol/L的NaCl溶液中的溶解最大，高于或低于這一濃度，DNA的溶解度均會下降，因此實驗過程中添加NaCl至2.0 mol/L的
1
2
3
4
目的是溶解DNA。PCR擴增時，需在TaqDNA聚合酶的催化下，在引物的3′端進行DNA鏈的延伸，獲得擴增產物用于測序。
1
2
3
4
(3)為研究蛋白質X在細胞中的定位，構建綠色熒光蛋白GFP與X的融合蛋白，融合蛋白具有綠色熒光，可示其在細胞內位置。將X－GFP基因融合片段M導入如圖Ⅱ所示載體質粒Y，構建Y－M重組質粒(在EcoRV位點插入片段)。
1
2
3
4
請完成下表。
分步實驗目標 簡易操作、結果、分析
PCR鑒定正向重組質粒Y－M(圖Ⅱ中融合片段M中有白色的箭頭，代表方向) ①選擇圖Ⅱ引物______；
②PCR目的產物約為______bp
確保M及連接處序列正確，Y－M的連接處上游含有Hind Ⅲ＋EcoR V的識別序列，下游含有EcoR V＋BamH Ⅰ的識別序列 ③質粒測序，圖Ⅲ中正確的是_____(選填序列編號)
a、b
1 100
Q3
1
2
3
4
檢測融合蛋白定位 ④對照質粒Y－GFP(僅表達GFP)與實驗質粒Y－M分別導入細胞，發(fā)現對照組整個細胞均有綠色熒光，而實驗組熒光集中在纖毛基部，說明________________________
X蛋白參與中心體的形成
1
2
3
4
PCR擴增目的DNA片段時，在引物的3′端進行DNA鏈的延伸，據圖可知，應選擇圖Ⅱ中的引物a和引物b，PCR目的產物約為300＋800＝1 100(bp)。
為確保M及連接處序列正確，Y－M的連接處上游含有Hind Ⅲ＋EcoR V的識別序列，下游含有EcoR V＋BamH Ⅰ的識別序列，根據題干信息構建Y－M重組質粒(在EcoRV位點插入片段)，Y－M的連接處測序后部分序列應含有Hind Ⅲ和BamH Ⅰ識別位點，
1
2
3
4
1
2
3
4
根據各限制酶識別位點，應選擇序列Q3。對照質粒Y－GFP(僅表達GFP)與實驗質粒Y－M分別導入細胞，發(fā)現對照組整個細胞均有綠色熒光，而實驗組熒光集中在纖毛基部，說明蛋白質X參與中心體的組成。
1
2
3
4
(4)為研究另一纖毛病相關基因Z表達的變化，采用熒光定量PCR法檢測健康人與病人基因Z的轉錄水平。采集樣本、提取總RNA，經_______形成cDNA作為模板，PCR擴增結果顯示，在總cDNA模板量相等的條件下，健康人Ct值為15，而病人Ct值為20(Ct值是產物熒光強度達到設定閾值時的PCR循環(huán)數)。從理論上估算，在PCR擴增20個循環(huán)的產物中，健康人樣品的目的產物大約是病人的____倍。
逆轉錄
32
1
2
3
4
研究另一纖毛病相關基因Z表達的變化，采用熒光定量PCR法檢測健康人與病人基因Z的轉錄水平。采集樣本、提取總RNA，經逆轉錄形成cDNA作為模板，PCR擴增結果顯示，在總cDNA模板量相等的條件下，健康人Ct值為15，而病人Ct值為20(Ct值是產物熒光強度達到設定閾值時的PCR循環(huán)數)，說明病人基因Z表達較弱，設健康人Z基因的cDNA數為x，病人Z基因的cDNA數為y，則有x×215＝y(tǒng)×220，從理論上估算，在PCR擴增20個循環(huán)的產物中，健康人樣品的目的產物大約是病人的25＝32(倍)。
1.判斷關于基因工程的基本工具的敘述
(1)限制酶只能用于切割目的基因(　　)
(2)切割質粒的限制性內切核酸酶均能特異性地識別6個核苷酸序列(　　)
(3)限制性內切核酸酶、DNA連接酶和質粒是基因工程中常用的三種工具酶(　　)
(4)載體質粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標記基因(　　)
五分鐘　查落實
×
×
×
×
2.判斷關于基因工程的基本操作程序的敘述
(1)根據不同的需要，目的基因是不同的，但都是能編碼蛋白質的基因
(　　)
(2)外源DNA必須位于重組質粒的啟動子和終止子之間才能進行復制(　　)
(3)表達載體的復制和胰島素基因的表達均啟動于復制原點(　　)
(4)PCR反應中溫度的周期性改變是為了使DNA聚合酶催化不同的反應
(　　)
×
×
×
×
3.判斷關于DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴增與電泳鑒定的敘述
(1)進行DNA片段的擴增及電泳鑒定實驗所需的緩沖液和酶應分裝成小份，并在20 ℃條件下儲存(　　)
(2)在凝膠中DNA分子的遷移速率只與DNA分子的大小相關(　　)
(3)為了節(jié)約資源，移液器上的槍頭在實驗過程中不必更換(　　)
(4)DNA遇二苯胺試劑會呈現藍色，遇甲紫會呈現紅色(　　)
×
×
×
×
4.填空默寫
(1)(選擇性必修3 P67)基因工程：___________________________________
____________________________________________________________________。
(2)(選擇性必修3 P71)限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的 序列，并且使每一條鏈中特定部位的 斷開。
(3)(選擇性必修3 P72)載體上有特殊的標記基因，便于________________
。
按照人們的愿望，通過轉基因等技術，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品
特定核苷酸
磷酸二酯鍵
重組DNA分子的
篩選
(4)(選擇性必修3 P77)PCR反應需要在一定的緩沖溶液中才能進行，需提供
、 、4種 和耐高溫的 。
(5)(選擇性必修3 P80)基因表達載體是載體的一種，除目的基因、標記基因外，還必須含有 等。
(6)(選擇性必修3 P81)轉化：_______________________________________
。
DNA模板
2種引物
脫氧核苷酸
DNA聚合酶
啟動子、終止子
目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞
內維持穩(wěn)定和表達的過程
五
課時精練
一、選擇題：每小題給出的四個選項中只有一個符合題目要求。
1.(2023·湖南常德高三質檢)如圖表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相關的酶作用位點。下列敘述錯誤的是
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A.甲、乙、丙都屬于黏性末端
B.甲、乙片段可形成重組DNA分子，但甲、丙不能
C.DNA連接酶的作用位點在圖乙中b處
D.切割甲的限制酶不能識別由甲、乙片段形成的重組DNA分子
√
甲、乙的黏性末端相同，因此可在DNA連接酶的作用下形成重組DNA分子，但甲、丙的黏性末端不同，它們之間不能形成重組DNA分子，B正確；
DNA連接酶將兩個DNA片段
連接為一個DNA分子，作用
部位是磷酸二酯鍵，即圖乙中a處，C錯誤；
切割甲的限制酶的識別序列為GAATTC∥CTTAAG，而甲、乙片段形成的重組DNA分子序列為GAATTG∥CTTAAC，因此切割甲的限制酶不能識別由甲、乙片段形成的重組DNA分子，D正確。
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2.T4 DNA連接酶可將任意2個具有相同黏性末端的DNA片段連接在一起。該反應過程需消耗ATP，其水解產生的腺苷一磷酸(AMP)通過共價鍵與酶相連，隨后AMP轉移至DNA片段，進而完成連接反應。下列敘述正確的是
A.T4 DNA連接酶的底物種類較多，故其無專一性
B.T4 DNA連接酶催化反應后，其組成成分已改變
C.ATP在該反應過程中可能打開兩個特殊的化學鍵
D.T4 DNA連接酶需保存于最適溫度和pH條件下
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√
T4 DNA連接酶有專一性，A錯誤；
酶在催化反應前后性質不變，故T4 DNA連接酶催化反應后，其組成成分不變，B錯誤；
ATP水解產生AMP需要打開兩個特殊的化學鍵，結合題干信息“該反應過程需消耗ATP，其水解產生的腺苷一磷酸(AMP)通過共價鍵與酶相連”可推測，ATP在該反應過程中可能打開兩個特殊的化學鍵，C正確；
T4 DNA連接酶需在低溫和最適pH條件下保存，D錯誤。
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3.(2023·山東日照高三檢測)基因工程利用某目的基因(圖甲)和P1噬菌體載體(圖乙)構建重組DNA。限制性內切核酸酶BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ的酶切位點分別如圖所示。下列分析錯誤的是
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A.構建重組DNA時，可用BglⅡ和
Sau3AⅠ切割目的基因所在片段
和P1噬菌體載體
B.構建重組DNA時，可用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體
C.圖乙中的P1噬菌體載體只用EcoRⅠ切割后，含有兩個游離的磷酸基團
D.用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體，再用DNA連接酶連接，只
能產生一種重組DNA
√
P1噬菌體載體為環(huán)狀DNA，其上只含有一個EcoRⅠ的酶切位點，因此用EcoRⅠ切割后，該環(huán)狀DNA分子變?yōu)殡p鏈DNA分子，因每條鏈各含有一個游離的磷酸基團，故切割后含有兩個游離的磷酸基團，C正確；
由圖甲可知，用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體后形成的黏性末端相同，可任意連接，不止產生一種重組DNA，D錯誤。
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4.下列有關獲取目的基因的敘述，錯誤的是
A.目的基因就是編碼蛋白質的基因
B.篩選和獲取目的基因是基因工程的第一步
C.來自蘇云金桿菌的Bt基因可作為轉基因抗蟲棉的目的基因
D.序列比對工具的應用為科學家找到合適的目的基因提供了更多的機會
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√
目的基因主要是指編碼蛋白質的基因，A錯誤；
目的基因的篩選與獲取是實施基因工程的第一步，B正確；
來自蘇云金桿菌的Bt基因是培育轉基因抗蟲棉較為合適的目的基因，C正確；
隨著測序技術的發(fā)展，以及序列數據庫和序列比對工具等的應用，越來越多的基因的結構和功能為人們所知，這為科學家找到合適的目的基因提供了更多的機會和可能，D正確。
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5.(2023·河北石家莊高三模擬)如圖是快速RT－PCR過程示意圖，①和②為逆轉錄酶催化的逆轉錄過程，③是PCR過程。據圖分析，下列敘述錯誤的是
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A.逆轉錄酶具有DNA聚合酶的能力
B.③PCR過程只需要引物b
C.RT－PCR可檢測基因表達水平
D.RT－PCR可檢測新冠病毒等RNA病毒
√
③PCR過程需要引物a、b，因為后續(xù)的模板鏈序列既有與靶RNA一致的，也有與cDNA一致的，B錯誤。
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6.(2022·山東，13)關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法錯誤的是
A.過濾液沉淀過程在4 ℃冰箱中進行是為了防止DNA降解
B.離心研磨液是為了加速DNA的沉淀
C.在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現藍色
D.粗提取的DNA中可能含有蛋白質
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√
離心研磨液是為了使細胞碎片沉淀，B錯誤；
在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑呈現藍色，C正確；
細胞中的某些蛋白質可以溶解于酒精，故粗提取的DNA中可能含有蛋白質，D正確。
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7.(2023·遼寧沈陽高三調研)引物的設計是影響PCR擴增反應的效率和特異性的關鍵因素，下列相關敘述正確的是
A.引物的堿基數量越少則退火溫度越低、目標DNA獲得率越高
B.根據需要可在引物的5′端添加限制酶識別序列、點突變序列等
C.兩種引物的退火溫度差異較大，可減少引物與模板的非特異性結合
D.引物的GC含量越高，結合特異性越強，越利于目標DNA的擴增
√
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退火溫度與時間取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，引物的堿基數量越少，變性時破開的氫鍵越少，則退火溫度越低，但能與引物發(fā)生配對的片段就越多，目標DNA獲得率越低，A錯誤；
根據需要可在引物的5′端添加限制酶識別序列、點突變序列等，以便更加準確地獲得目的基因，B正確；
兩種引物的退火溫度差異較大，導致不能同時退火，甚至一條鏈在延伸，一條鏈在退火，可增加引物與模板的非特異性結合，C錯誤；
引物的GC含量越高，結合特異性越強，但GC含量過高，氫鍵越多，不利于退火，從而阻礙目標DNA的擴增，D錯誤。
8.DNA瓊脂糖凝膠電泳是指利用在溶液中帶負電荷的DNA分子在電場中向正極移動的原理，分離、純化或分析PCR擴增后的待檢DNA片段的生物化學技術。下列說法錯誤的是
A.DNA片段相對分子質量越大，遷移就越慢
B.凝膠制備中加入的核酸染料能與DNA分子結合，用于分離后DNA片段的檢測
C.擬回收的DNA區(qū)帶融化后可先用DNA抽取劑抽提，再用70%的冷酒精沉淀抽
提DNA片段，從而提高回收率
D.新冠病毒核酸檢測出現假陽性的原因可能是陽性對照中模板核酸與樣品交叉
污染
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√
擬回收的DNA區(qū)帶融化后可先用DNA抽取劑抽提，再體積分數為用95%的冷酒精沉淀抽提DNA片段，從而提高回收率，C錯誤。
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二、選擇題：每小題給出的四個選項中有一個或多個符合題目要求。
9.(2023·遼寧錦州高三質檢)實時熒光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸檢測，其原理：在PCR復性過程中探針和引物一起與模板結合，探針兩側分別帶有熒光基團和抑制熒光發(fā)出的淬滅基團，新鏈延伸過程中，DNA聚合酶會破壞探針，導致熒光基團與淬滅基團分離而發(fā)出熒光。利用RT－PCR進行核酸檢測的相關過程如圖所示。
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下列說法不正確的是
A.做RT－PCR之前，需要先根據cDNA的核苷酸序列合成引物和探針
B.RNA不能作為PCR擴增的模板，故需要將樣本中的RNA逆轉錄為DNA
后再進行擴增
C.若檢測結果有強烈熒光信號發(fā)出，說明被檢測者沒有感染病毒
D.病毒的檢測還可以檢測病毒表面的物質或病毒引發(fā)產生的抗體，其原
理都是抗原—抗體雜交
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√
PCR擴增必須以DNA為模板，RNA不能作為PCR擴增的模板，所以需要將樣本中的RNA逆轉錄為DNA后再進行擴增，B正確；
若檢測結果有強烈熒光信號發(fā)出，說明被檢測者極有可能感染了病毒，C錯誤。
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10.(2023·江蘇淮安高三模擬)下圖表示pBR322質粒和人生長激素基因所在片段的結構信息，將二者構建的重組質粒導入受體菌并進行篩選。下列敘述錯誤的是
注：AmpR：氨芐青霉素抗性基因；TetR：四環(huán)素抗性基因。
A.應選擇的限制酶組合是酶F和酶G
B.所選用的受體菌含有AmpR和TetR基因
C.用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選出的是含重組質粒的受體菌
D.同時用三種限制酶處理圖中質粒，電泳后可得到4個條帶
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為避免切割后DNA片段的自身環(huán)化，又保留質粒上的標記基因，切割時應選擇的限制酶組合是酶F和酶G，A正確；
所選用的受體菌不能含有AmpR和TetR基因，以便于對含有目的基因的受體菌進行選擇，B錯誤；
用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選出的有導入重組質粒的受體菌和導入原質粒的受體菌，C錯誤；
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據題圖分析可知，同時用三種限制酶處理圖中質粒，因酶E有兩個作用位點，故將質粒切割成了4個DNA片段，電泳后可得到4個條帶，D正確。
11.(2023·遼寧沈陽高三質量監(jiān)測)科研人員通過PCR技術獲得白蛋白啟動子，將該啟動子與Cre重組酶基因結合構建基因表達載體，培育出在肝細胞中特異性表達Cre重組酶的轉基因小鼠。下列相關敘述正確的是
A.將基因表達載體導入肝細胞經培育獲得轉基因小鼠
B.利用PCR技術獲得白蛋白啟動子需要兩種引物
C.通過抗原－抗體雜交技術可檢測Cre基因是否完成表達
D.將發(fā)育到原腸胚時期的重構胚向受體進行移植
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√
√
將該表達載體導入受精卵以獲得轉基因小鼠，A錯誤；
DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從引物的3′端(子鏈的5′端)開始延伸DNA，因此PCR過程中需要添加引物才能完成復制過程，要合成兩條子鏈，需要兩種引物，B正確；
Cre基因完成表達的產物是蛋白質，故可通過抗原－抗體雜交技術進行檢測，C正確；
胚胎移植需要胚胎發(fā)育至桑葚胚或囊胚階段，D錯誤。
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三、非選擇題
12.如圖pIJ702是一種常用質粒，其中tsr為硫鏈絲菌素(一種抗生素)抗性基因；mel為黑色素合成基因，其表達能使白色的鏈霉菌菌落變成黑色菌落；而三種限制酶SacⅠ、SphⅠ、BglⅡ在pIJ702上分別只有一處識別序列。回答下列問題：
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表1
項目 pIJ702 pZHZ8
BglⅡ 5.7 kb 6.7 kb
固體培養(yǎng)基中硫鏈絲菌素濃度(μg/mL) 0 1 2 5 10
不含質粒的鏈霉菌生長狀況 ＋＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋ － －
注：“＋”表示生長；“－”表示不生長。
表2
(1)限制酶可以識別雙鏈DNA中特定核苷酸序列，并使每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的___________斷裂，切割形成的末端有__________________兩種。
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磷酸二酯鍵
黏性末端和平末端
(2)以SacⅠ和SphⅠ切取目的基因，與質粒pIJ702上長度為0.4 kb的SacⅠ/
SphⅠ片段進行置換，構建重組質粒pZHZ8。上述兩種質粒經限制酶BglⅡ酶切后所得片段長度見表1。由此判斷目的基因的片段長度為______kb，判定目的基因中含有一個BglⅡ切割位點的理由是_____________________
____________________________________________________________________。
1.4
pIJ702上的原有BglⅡ切割位點被目的基因置換得到的環(huán)狀pZHZ8，仍能被BglⅡ切割成一條線段
質粒pIJ702的長度為5.7 kb，而重組質粒pZHZ8的長度為6.7 kb，又已知構建基因表達載體時，目的基因置換了pIJ702上0.4 kb的片段，由此判斷目的基因的片段長度為6.7－5.7＋0.4＝1.4(kb)。
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(3)導入目的基因時，首先用Ca2＋處理鏈霉菌使其成為感受態(tài)(能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài))細胞，再將重組質粒pZHZ8溶于緩沖液中與感受態(tài)細胞混合，在一定的溫度下可以促進鏈霉菌完成______過程。
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轉化
(4)不含質粒的鏈霉菌在含硫鏈絲菌素的固體培養(yǎng)基上生長狀況如表2所示。若要篩選導入pZHZ8的鏈霉菌細胞，所需硫鏈絲菌素濃度至少應在____μg/mL以上，挑
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選成功導入pZHZ8的鏈霉菌的具體方法是___________________________
_______________________________________________________________
_________。若要檢測整合到染色體DNA上的目的基因是否發(fā)揮功能作用，第一步需檢測受體細胞的_______(填“DNA”或“RNA”)。
根據導入pIJ702的鏈霉菌菌落呈黑色、導入pZHZ8的鏈霉菌菌落呈白色的特點，通過觀察菌落的顏色進行挑選
RNA
從不含質粒的鏈霉菌在含硫鏈絲菌素固體培養(yǎng)基上的生長狀況表格可以看出，硫鏈絲菌素濃度低于5 μg/mL時，鏈霉菌能夠生長，因此所需的硫鏈絲菌素最小濃度應為5 μg/mL。檢測目的基因是否
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發(fā)揮功能作用的第一步是目的基因是否能轉錄形成mRNA。
13.(2021·江蘇，23)某小組為研究真菌基因m的功能，構建了融合表達蛋白M和tag標簽的質粒，請結合實驗流程回答下列問題：
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(1)目的基因的擴增
①提取真菌細胞______，經逆轉錄獲得cDNA，進一步獲得基因m片段。
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RNA
以逆轉錄獲得cDNA的方式，要先從真菌細胞中提取基因m轉錄出來的mRNA。
②為了獲得融合tag標簽的蛋白M，設計引物P2時，不能包含基因m終止密碼子的編碼序列，否則將導致__________
____________。
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不含tag標簽
蛋白M上
從構建好的重組質粒上看，tag序列位于目的基因下游，若基因m的轉錄產物mRNA上有終止密碼子，核糖體移動到終止密碼子多肽鏈就斷開，則不會對tag序列的轉錄產物繼續(xù)進行翻譯，蛋白M上就不含tag標簽。
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③熱啟動PCR可提高擴增效率，方法之一是：先將除Taq DNA聚合酶以外的各成分混合后，加熱到80 ℃以上再混入酶，然后直接從94 ℃開始PCR擴增。下列敘述正確的有_____。
A.TaqDNA聚合酶最適催化溫度范圍為50～60 ℃
B.與常規(guī)PCR相比，熱啟動PCR可減少反應起始時引物錯配形成的產物
C.兩條子鏈的合成一定都是從5′端向3′端延伸
D.PCR產物DNA堿基序列的特異性體現了TaqDNA聚合酶的特異性
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BC
從題干信息可知，“80 ℃以上再混入酶，然后直接從94 ℃開始PCR擴增”，故TaqDNA聚合酶最適催化溫度范圍為94 ℃左右，A錯誤；
PCR反應的最初加熱過程中，樣品溫度上升到70 ℃之前，在較低的溫度下引物可能與部分單鏈模板形成非特異性結合，并在Taq DNA聚合酶的作用下延伸，結果會導致引物錯配形成的產物的擴增，影響反應的特異性，熱啟動可減少引物錯配形成的產物的擴增，提高反應的特異性，B正確；
DNA分子復制具有方向性，都是從5′端向3′端延伸，C正確；
TaqDNA聚合酶沒有特異性，與普通的DNA聚合酶相比，TaqDNA聚合酶更耐高溫，D錯誤。故選BC。
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(2)重組質粒的構建
①將SmaⅠ切開的載體A與添加同源序列的m混合，用特定DNA酶處理形成黏性末端，然后降溫以促進_______________________，形成A－m結合體。將A－m結合體導入大腸桿菌，利用大腸桿菌中的DNA聚合酶及__________酶等，完成質粒的環(huán)化。
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DNA連接
黏性末端堿基互補配對
從圖上看，載體A只有一個SmaⅠ的酶切位點，故被SmaⅠ切開后，載體由環(huán)狀變?yōu)殒湢頓NA，將SmaⅠ切開的載體A與添加同源序列的m混合，用特定DNA酶處理形成黏性末端，然后降溫以促進載體A與添加同源序列的m的黏性末端堿基互補配對。將A－m結合體導入大腸桿菌，利用大腸桿菌中的DNA聚合酶及DNA連接酶等，完成質粒的環(huán)化。
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②若正確構建的重組質粒A－m仍能被SmaⅠ切開，則SmaⅠ的酶切位點可能在____________
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基因m的連接
處、基因m的內部
重組質粒中，載體A被SmaⅠ切開的位置已經與基因m相連，原來的酶切位點已不存在，若正確構建的重組質粒A－m仍能被SmaⅠ切開，則SmaⅠ的酶切位點可能在基因m的連接處或基因m內部。
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(3)融合蛋白的表達
①用含有尿嘧啶的培養(yǎng)基培養(yǎng)URA3基因缺失型酵母，將其作為受體菌，導入質粒A－m，然后涂布于無尿嘧啶的培養(yǎng)基上，篩選獲得目的菌株，其機理是_______________________________________________________
_______________________________。
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受體菌在無尿嘧啶的培養(yǎng)基上無法生長，導入重組質粒的受體菌含有URA3基因，可以長成菌落
篩選目的菌株的機理：導入了質粒A－m的目的菌株由于含有URA3基因，能在無尿嘧啶的培養(yǎng)基上存活，而URA3基因缺失型酵母則不能存活。
②若通過抗原－抗體雜交實驗檢測到酵母蛋白中含tag標簽，說明____
____________________________________，后續(xù)實驗可借助tag標簽進行蛋白M的分離純化。
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合基因表達(或重組質粒
A－m構建成功)
融
若通過抗原－抗體雜交實驗檢測到酵母蛋白中含tag標簽，位于tag標簽上游的基因m應該正常表達，說明融合基因表達(或重組質粒A－m構建成功)。
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14.如圖是利用工程菌(大腸桿菌)生產人生長激素的實驗流程。所用的pBR322質粒含有限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和Hind Ⅲ的切點各一個，且三種酶切割形成的末端各不相同，而AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，TetR表示四環(huán)素抗性基因。請回答以下相關問題：
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(1)目的基因主要是指編碼蛋白質的基因，也可以是一些具有_____
____的因子。過程①所用到的組織細胞是_______________，③過程的目的是___________________
______，⑤過程常用_____處理大腸桿菌。
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作用
人垂體組織細胞　
調控
將平末端處理為黏性
末端
Ca2＋
(2)如果用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ對圖中質粒進行切割，形成的DNA片段種類有____種，這些種類的DNA片段中含有完整氨芐青霉素抗性基因的DNA片段和四環(huán)素抗性基因的DNA片段分別有____種和____種。
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假設PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ三種酶的切點分別用1、2、3表示(后面的→均按照順時針方向)。一種酶分別酶切時，一共可以得到3種片段1→1、2→2、3→3；任意兩種酶分別同時酶切時，可得到1→2、2→1、2→3、3→2、1→3、3→1六種片段；三種酶同時酶切時，可得到1→2、2→3、3→1三種片段。綜上所述，共計9種不同的片段(1→1、1→2、1→3、2→1、2→2、2→3、3→1、3→2、3→3)。其中片段3→2、2→2、3→3共3種含有完整氨芐青霉素抗性基因，片段2→1、2→2、1→1共3種含有完整四環(huán)素抗性基因。
(3)如果只用限制酶PstⅠ切割目的基因和質粒，完成過程④、⑤后(受體大腸桿菌不含AmpR、TetR)，將三角瓶內的大腸桿菌先接種到甲培養(yǎng)基上，形成菌落后用無菌牙簽挑取甲培養(yǎng)基上的單個菌落，分別接種到乙和丙兩個培養(yǎng)基的相同位置上，一段時間后，菌落的生長狀況如圖乙、丙所示。接種到甲培
養(yǎng)基上的目的是篩選__________________的大腸桿菌；接種到乙培養(yǎng)基上的大腸桿菌菌落，能存活的大腸桿菌體內導入的是____________________________________
______。含有目的基因的大腸桿菌在培養(yǎng)基乙和丙上的生存情況是______________
_______________。
含四環(huán)素抗性基因
完整的pBR322質粒(或含有AmpR、TetR的
質粒)
在丙中能存活，
在乙中不能存活
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14第6課時　基因工程的基本工具和基本操作程序
課標要求　1.闡明DNA重組技術的實現需要利用限制性內切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。2.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞和目的基因的檢測與鑒定等步驟。3.按照實驗操作步驟，進行DNA的粗提取與鑒定實驗。4.利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增DNA片段并完成電泳鑒定，或運用軟件進行虛擬PCR實驗。
考點一　重組DNA技術的基本工具
1．基因工程的概念
別名 重組DNA技術
操作環(huán)境 生物體外
操作對象 基因
操作水平 DNA分子水平
結果 創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品
2.基因工程的誕生和發(fā)展
(1)肺炎鏈球菌轉化實驗不僅證明DNA是遺傳物質，還證明了DNA可在同種生物不同個體之間轉移。
(2)DNA雙螺旋結構的提出和半保留復制的證明。
(3)中心法則的確立。
(4)遺傳密碼的破譯。
(5)基因轉移載體和限制酶、DNA連接酶和逆轉錄酶的發(fā)現為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。
(6)DNA體外重組的實現。
(7)重組DNA表達實驗的成功。
(8)DNA測序和合成技術的發(fā)明。
(9)PCR技術的發(fā)明。
(10)基因組編輯技術可以實現對特定基因的定點插入、敲除或替換。
3．重組DNA技術的基本工具
(1)限制性內切核酸酶(也稱“限制酶”)
(2)DNA連接酶
(3)載體
(1)源于選擇性必修3 P71“旁欄思考”：①原核生物中存在限制酶的意義是什么？
提示　原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保證自身安全，防止外來病原物的危害。
②限制酶來源于原核生物，為什么不能切割自己的DNA分子？
提示　原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾。
(2)源于選擇性必修3 P72“旁欄思考”：DNA連接酶和DNA聚合酶不是(填“是”或“不是”)一回事。原因是①DNA連接酶連接的是兩個DNA片段，而DNA聚合酶是把單個的脫氧核苷酸連接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用時需要以一條DNA鏈為模板，而DNA連接酶不需要模板。
延伸應用　圖解限制酶的選擇原則
(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。
(2)保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點原則：質粒作為載體必須具備標記基因，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中不選擇SmaⅠ。
(3)確保出現相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶，如圖甲中PstⅠ；為避免目的基因和質粒自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。
構建基因表達載體時，需要選擇合適的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和載體。
已知限制性內切核酸酶Ⅰ的識別序列和切點是，限制性內切核酸酶Ⅱ的識別序列和切點是，根據圖示分析回答下列問題：
(1)請用圖示法寫出限制性內切核酸酶Ⅰ和限制性內切核酸酶Ⅱ切割后形成黏性末端的過程。
提示　限制性內切核酸酶Ⅰ：
限制性內切核酸酶Ⅱ：
(2)切割圖示中的目的基因和質粒應選用哪類限制酶？請說明理由。
提示　用限制酶Ⅱ切割目的基因，用限制酶Ⅰ切割質粒。
限制酶Ⅰ的識別序列包含限制酶Ⅱ的識別序列，因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位點，故使用限制酶Ⅱ時，可在目的基因兩端同時作切割，從而切出“目的基因”，但若使用限制酶Ⅱ切割質粒，會同時破壞質粒中的兩個“標記基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割質粒。
1．下表為常用的限制性內切核酸酶(限制酶)及其識別序列和切割位點，由此推斷，下列說法錯誤的是(　　)
限制酶名稱　 識別序列和切割位點 限制酶名稱 識別序列和切割位點
BamHⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoRⅠ C↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
HindⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
注：Y為C或T，R為A或G。
A．HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶切割后形成平末端
B．Sau3AⅠ限制酶的切割位點在識別序列的外部
C．BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種限制酶切割后形成相同的黏性末端
D．一種限制酶一定只能識別一種核苷酸序列
答案　D
解析　HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶沿著中軸線切口切開，切割后形成平末端，A正確；Sau3AⅠ限制酶識別GATC序列，切割位點在識別序列的外部，B正確；BamHⅠ限制酶識別GGATCC序列，Sau3AⅠ限制酶識別GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC，C正確；HindⅡ能識別GTCAAC，也能識別GTTAAC，D錯誤。
2．(不定項)質粒是基因工程中最常用的目的基因運載工具。下列有關敘述正確的是(　　)
A．質粒是只存在于細菌細胞質中能自主復制的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子
B．在所有的質粒上都能找到一個或多個限制酶切割位點
C．攜帶目的基因的重組質粒只有整合到宿主細胞的染色體DNA上才會隨后者的復制而復制
D．質粒上的抗性基因常作為標記基因供重組DNA的鑒定和選擇
答案　D
解析　質粒不只分布于原核生物中，在真核生物——酵母菌細胞內也有分布；并不是所有的質粒上都有限制酶的切割位點，從而成為合適的運載目的基因的工具；重組質粒進入受體細胞后，可以在細胞內自我復制，也可以整合后復制。
歸納提升　與DNA有關的幾種酶的比較
考點二　基因工程的基本操作程序
1．目的基因的篩選與獲取
(1)目的基因：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因。
(2)篩選合適的目的基因
①從相關的已知結構和功能清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。
②利用序列數據庫和序列比對工具進行篩選。
(3)目的基因的獲取
①人工合成目的基因。
②PCR獲取和擴增目的基因
a．PCR(聚合酶鏈式反應)：是一項根據DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。
b．PCR反應的條件：一定的緩沖溶液、DNA模板、2種引物、4種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶，以及能自動調控溫度的儀器。
c．PCR擴增的過程
d．PCR產物的鑒定：常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。
③通過構建基因文庫來獲取目的基因。
(1)源于選擇性必修3 P77“相關信息”：Bt抗蟲蛋白基因產生的Bt抗蟲蛋白只在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細胞也無特異性受體。因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產生危害。
(2)源于選擇性必修3 P77“相關信息”：真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應緩沖溶液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。
2．基因表達載體的構建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。
(2)基因表達載體的組成及作用
(3)構建過程
提醒　啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比
項目 啟動子 終止子 起始密碼子 終止密碼子
本質 DNA DNA mRNA mRNA
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA 使轉錄在所需要的地方停下來 翻譯的起始信號(編碼氨基酸) 翻譯的結束信號(不編碼氨基酸)
3.將目的基因導入受體細胞
生物種類 植物 動物 微生物
常用方法 農桿菌轉化法、花粉管通道法 顯微注射法 Ca2＋處理法
受體細胞 體細胞或受精卵 受精卵 原核細胞
轉化過程 將目的基因插入Ti質粒的T－DNA中→農桿菌→導入植物細胞→整合到受體細胞的染色體DNA上→表達 將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物 Ca2＋處理細胞→細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)→基因表達載體導入
辨析　(1)轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程。此處“轉化”與肺炎鏈球菌轉化實驗中的“轉化”含義相同，實質都是基因重組。
(2)農桿菌轉化法中的兩次拼接和兩次導入
第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受體細胞的染色體DNA上；第一次導入是將含目的基因的Ti質粒導入農桿菌，第二次導入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA導入受體細胞。
4．目的基因的檢測與鑒定
PCR是一項根據DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。在該過程中，引物非常關鍵，回答下列有關引物的問題：
(1)什么是引物？
提示　引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。
(2)PCR技術為什么需要引物？
提示　DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈。
(3)利用PCR技術擴增目的基因時需要兩種引物，原因是什么？
提示　目的基因的兩條反向平行的鏈都作為模板，其堿基序列不同。
(4)在PCR擴增目的基因之前，需先設計引物，對設計的兩種引物之間的堿基序列的要求是什么？
提示　兩種引物之間不能互補配對。
(5)為檢測胚乳細胞中Wx基因是否表達，科研人員提取胚乳中的總RNA，經逆轉錄過程獲得總cDNA，通過PCR技術可在總cDNA中專一性地擴增出Wx基因的cDNA，原因是什么？
提示　引物是依據Wx基因的一段已知序列設計合成的(或引物能與Wx基因的cDNA特異性結合)。
(6)若一個DNA分子在PCR中經過n輪循環(huán)，理論上需要消耗多少個引物？第n輪循環(huán)需要消耗多少個引物數？
提示　經過n輪循環(huán)需要消耗引物數為(2n＋1－2)個，第n輪循環(huán)需要消耗的引物數為2n個。
3．(不定項)(2023·湖南懷化高三模擬)大引物PCR定點突變常用來研究蛋白質結構改變導致的功能變化。單核苷酸的定點誘變僅需進行兩輪PCR反應即可獲得，第一輪加誘變引物和側翼引物，第一輪產物作第二輪PCR擴增的大引物，過程如圖所示。下列有關敘述錯誤的是(　　)
A．PCR擴增的定點誘變產物通常需要連接到載體分子上才能表達出相應的性狀，需具備啟動子、終止子等結構才能進行轉錄和翻譯
B．單核苷酸的定點誘變所屬變異類型為基因重組
C．第二輪PCR所用的引物都是第一輪PCR產物DNA的兩條鏈
D．利用該技術將某功能蛋白的結構改變屬于蛋白質工程
答案　BC
解析　單核苷酸的定點誘變所屬變異類型為基因突變，B錯誤；除了第一輪產物作第二輪PCR擴增的大引物外，第二輪PCR仍需加入的引物是另一種側翼引物，以便進行另一條鏈的延伸，C錯誤；蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規(guī)律及其與生物功能的關系作為基礎，通過改造或合成基因，來改造現有蛋白質，或制造一種新的蛋白質，利用該技術將某功能蛋白的結構改變屬于蛋白質工程，D正確。
4．下圖表示培育轉基因抗植物病毒番茄的過程示意圖。下列敘述正確的是(　　)
A．過程A需要限制酶和DNA聚合酶的參與
B．過程B需要用CaCl2處理，以提高番茄細胞細胞壁的通透性
C．抗植物病毒基因一旦整合到番茄細胞的染色體上，就能正常表達
D．轉基因抗植物病毒番茄是否培育成功可通過抗病毒接種實驗進行鑒定
答案　D
解析　題圖中過程A為構建基因表達載體，需要用到限制酶和DNA連接酶，不需要DNA聚合酶，A錯誤；CaCl2處理只是提高農桿菌細胞細胞膜的通透性，B錯誤；抗植物病毒基因整合到番茄細胞的染色體上，不一定能表達，C錯誤；轉基因抗植物病毒番茄是否培育成功可通過接種特定病毒，觀察番茄是否被感染來進行鑒定，D正確。
歸納提升　(1)PCR技術和DNA復制的比較
(2)PCR擴增過程中的循環(huán)圖示與規(guī)律
循環(huán)次數 1 2 3 n
DNA分子數 2 4 8 2n
含引物A(或B)的DNA分子數 1 3 7 2n－1
同時含引物A、B的DNA分子數 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗的引物數量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1－2 2n＋1－2
考點三　DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴增與電泳鑒定
1．DNA的粗提取與鑒定
(1)基本原理
(2)操作流程
注意　加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。
2．DNA片段的擴增及電泳鑒定
(1)實驗基礎
①PCR原理：利用了DNA的熱變性原理。
②電泳：DNA分子具有可解離的基團，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。
③PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關。
(2)PCR實驗操作步驟
(3)DNA的電泳鑒定：凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300_nm的紫外燈下被檢測出來。
1．在“DNA片段的擴增及電泳鑒定”實驗中，防止DNA被污染的操作有哪些？
提示　(1)為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。(2)在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換，避免試劑的污染。(3)在進行操作時，一定要戴好一次性手套。
2．如何來評價擴增的效果？
提示　觀察DNA帶的分布及粗細程度來評價擴增的效果。
5．(2023·山東濟南高三期末)下列以洋蔥為實驗材料進行“DNA的粗提取與鑒定”實驗的敘述，正確的是(　　)
A．洋蔥研磨液需要用濾紙過濾，以保證提取的DNA量
B．濾液中加入冷酒精后，用玻璃棒攪拌會使DNA的提取量增加
C．向含DNA的濾液中加入2 mol/L的NaCl溶液有利于去除雜質
D．用二苯胺試劑鑒定DNA時，需沸水浴加熱冷卻后再觀察顏色變化
答案　D
解析　洋蔥研磨液要用紗布過濾，A錯誤；DNA在冷酒精中的溶解度很低，蛋白質在冷酒精中的溶解度較高，故可以利用DNA不溶于冷酒精的原理，提純DNA，但提取量不變，B錯誤；向含DNA的濾液中加入預冷的酒精溶液有利于去除雜質，加入2 mol/L的NaCl溶液是溶解粗提取的DNA，C錯誤；在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺會被染成藍色，用二苯胺試劑鑒定DNA時，需沸水浴加熱，冷卻后再觀察顏色變化，D正確。
6．(不定項)下圖是“DNA的粗提取與鑒定”實驗中的兩個操作步驟示意圖。下列相關敘述正確的是(　　)
A．選用植物細胞提取DNA時需先研磨破碎細胞
B．圖2所示實驗操作中有一處明顯錯誤，可能導致試管2中藍色變化不明顯
C．圖1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白質等雜質不溶
D．圖2試管1的作用是證明物質的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺試劑出現藍色
答案　AB
解析　圖2所示實驗的試管中溶液的液面高于燒杯中的液面，可能導致加熱不充分，試管2中藍色變化不明顯，B正確；圖2試管1起對照作用，目的是證明沸水浴下物質的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺試劑不會出現藍色，而DNA遇二苯胺試劑出現藍色，D錯誤。
1．(2021·湖北，16)某實驗利用PCR技術獲取目的基因，實驗結果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對)外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。為了減少反應非特異條帶的產生，以下措施中有效的是(　　)
A．增加模板DNA的量 B．延長熱變性的時間
C．延長延伸的時間 D．提高復性的溫度
答案　D
解析　增加模板DNA的量可以提高反應速度，但不能有效減少非特異性條帶，A錯誤；延長熱變性的時間和延長延伸的時間會影響變性、延伸過程，但對于延伸中的配對影響不大，故不能有效減少反應非特異性條帶的產生，B、C錯誤。
2．(2021·山東，13)粗提取DNA時，向雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，過濾后所得濾液進行下列處理后再進行過濾，在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物的處理方式是(　　)
A．加入適量的木瓜蛋白酶
B．37～40 ℃的水浴箱中保溫10～15分鐘
C．加入與濾液體積相等的、體積分數為95%的冷卻的酒精
D．加入NaCl調節(jié)濃度至2 mol/L→過濾→調節(jié)濾液中NaCl濃度至0.14 mol/L
答案　A
解析　木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白質類雜質，由于酶具有專一性，不能水解DNA，過濾后在得到的濾液中加入木瓜蛋白酶后容易提取出 DNA相對含量較高的白色絲狀物，A正確；37～40 ℃的水浴箱中保溫 10～15 分鐘不能去除濾液中的雜質，應該放在60～75 ℃的水浴箱中保溫10～15分鐘，使蛋白質變性析出，B錯誤；向雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，過濾后在得到的濾液中加入與濾液體積相等的、體積分數為 95%的冷卻的酒精，此時DNA析出，不會進入濾液中，C錯誤；加入 NaCl 調節(jié)濃度至 2 mol/L→過濾→調節(jié)濾液中 NaCl 濃度至 0.14 mol/L，DNA在0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度小，DNA析出，不會進入濾液中，D錯誤。故選A。
3．(2020·北京，12)為了對重金屬污染的土壤進行生物修復，研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉運蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動子連接，導入楊樹基因組中(如圖)。為檢測獲得的轉基因楊樹苗中是否含有導入的HMA3基因，同時避免內源HMA3基因的干擾，在進行PCR擴增時，應選擇的引物組合是(　　)
A．①＋③ B．①＋②
C．③＋② D．③＋④
答案　B
解析　引物①擴增的片段含有啟動子和HMA3基因，引物③擴增的片段不含啟動子，引物②擴增的片段既含有啟動子，又含有HMA3基因序列。圖示中克隆的重金屬轉運蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動子連接，導入楊樹基因組中，若要檢測獲得的轉基因楊樹苗中是否含有導入的HMA3基因和高效啟動子，需要檢測是否含有高效啟動子序列和HMA3基因序列，應選擇的引物組合是①＋②，B正確。
4.(2022·江蘇，24)纖毛是廣泛存在的細胞表面結構，功能異常可引起多種疾病。因此，研究纖毛形成的作用機制具有重要意義。請回答下列問題：
(1)纖毛結構如圖Ⅰ所示，由細胞膜延伸形成的纖毛膜主要由________________組成。基體由中心體轉變而來，中心體在有絲分裂中的功能是______________________________________
_______________________________________________________________________________。
(2)某病人腎小管上皮細胞纖毛異常，為了分析纖毛相關基因X是否發(fā)生了變異，對基因X進行了PCR擴增與產物測序。從細胞樣品中分離DNA時，可通過交替調節(jié)鹽濃度將與核蛋白結合的DNA分離出來，溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是_______________________。PCR擴增時，需在______________催化下，在引物__________端進行DNA鏈的延伸，獲得擴增產物用于測序。
(3)為研究蛋白質X在細胞中的定位，構建綠色熒光蛋白GFP與X的融合蛋白，融合蛋白具有綠色熒光，可示其在細胞內位置。將X－GFP基因融合片段M導入如圖Ⅱ所示載體質粒Y，構建Y－M重組質粒(在EcoRV位點插入片段)。請完成下表。
分步實驗目標 簡易操作、結果、分析
PCR鑒定正向重組質粒Y－M(圖Ⅱ中融合片段M中有白色的箭頭，代表方向) ①選擇圖Ⅱ引物__________； ②PCR目的產物約為__________bp
確保M及連接處序列正確，Y－M的連接處上游含有Hind Ⅲ＋EcoR V的識別序列，下游含有EcoR V＋BamH Ⅰ的識別序列 ③質粒測序，圖Ⅲ中正確的是__________(選填序列編號)
檢測融合蛋白定位 ④對照質粒Y－GFP(僅表達GFP)與實驗質粒Y－M分別導入細胞，發(fā)現對照組整個細胞均有綠色熒光，而實驗組熒光集中在纖毛基部，說明________________________________________________________________________
(4)為研究另一纖毛病相關基因Z表達的變化，采用熒光定量PCR法檢測健康人與病人基因Z的轉錄水平。采集樣本、提取總RNA，經____________形成cDNA作為模板，PCR擴增結果顯示，在總cDNA模板量相等的條件下，健康人Ct值為15，而病人Ct值為20(Ct值是產物熒光強度達到設定閾值時的PCR循環(huán)數)。從理論上估算，在PCR擴增20個循環(huán)的產物中，健康人樣品的目的產物大約是病人的__________倍。
答案　(1)磷脂、蛋白質　發(fā)出星射線，形成紡錘體　(2)溶解DNA　耐高溫DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)　3′　(3)a、b　1 100　Q3　X蛋白參與中心體的形成　(4)逆轉錄　32
解析　(2)從細胞樣品中分離DNA時，可通過交替調節(jié)鹽濃度將與核蛋白結合的DNA分離出來，DNA在2.0 mol/L的NaCl溶液中的溶解最大，高于或低于這一濃度，DNA的溶解度均會下降，因此實驗過程中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是溶解DNA。PCR擴增時，需在TaqDNA聚合酶的催化下，在引物的3′端進行DNA鏈的延伸，獲得擴增產物用于測序。(3)PCR擴增目的DNA片段時，在引物的3′端進行DNA鏈的延伸，據圖可知，應選擇圖Ⅱ中的引物a和引物b，PCR目的產物約為300＋800＝1 100(bp)。為確保M及連接處序列正確，Y－M的連接處上游含有Hind Ⅲ＋EcoR V的識別序列，下游含有EcoR V＋BamH Ⅰ的識別序列，根據題干信息構建Y－M重組質粒(在EcoRV位點插入片段)，Y－M的連接處測序后部分序列應含有Hind Ⅲ和BamH Ⅰ識別位點，根據各限制酶識別位點，應選擇序列Q3。對照質粒Y－GFP(僅表達GFP)與實驗質粒Y－M分別導入細胞，發(fā)現對照組整個細胞均有綠色熒光，而實驗組熒光集中在纖毛基部，說明蛋白質X參與中心體的組成。(4)研究另一纖毛病相關基因Z表達的變化，采用熒光定量PCR法檢測健康人與病人基因Z的轉錄水平。采集樣本、提取總RNA，經逆轉錄形成cDNA作為模板，PCR擴增結果顯示，在總cDNA模板量相等的條件下，健康人Ct值為15，而病人Ct值為20(Ct值是產物熒光強度達到設定閾值時的PCR循環(huán)數)，說明病人基因Z表達較弱，設健康人Z基因的cDNA數為x，病人Z基因的cDNA數為y，則有x×215＝y(tǒng)×220，從理論上估算，在PCR擴增20個循環(huán)的產物中，健康人樣品的目的產物大約是病人的25＝32(倍)。
1．判斷關于基因工程的基本工具的敘述
(1)限制酶只能用于切割目的基因(　×　)
(2)切割質粒的限制性內切核酸酶均能特異性地識別6個核苷酸序列(　×　)
(3)限制性內切核酸酶、DNA連接酶和質粒是基因工程中常用的三種工具酶(　×　)
(4)載體質粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標記基因(　×　)
2．判斷關于基因工程的基本操作程序的敘述
(1)根據不同的需要，目的基因是不同的，但都是能編碼蛋白質的基因(　×　)
(2)外源DNA必須位于重組質粒的啟動子和終止子之間才能進行復制(　×　)
(3)表達載體的復制和胰島素基因的表達均啟動于復制原點(　×　)
(4)PCR反應中溫度的周期性改變是為了使DNA聚合酶催化不同的反應(　×　)
3．判斷關于DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴增與電泳鑒定的敘述
(1)進行DNA片段的擴增及電泳鑒定實驗所需的緩沖液和酶應分裝成小份，并在20 ℃條件下儲存(　×　)
(2)在凝膠中DNA分子的遷移速率只與DNA分子的大小相關(　×　)
(3)為了節(jié)約資源，移液器上的槍頭在實驗過程中不必更換(　×　)
(4)DNA遇二苯胺試劑會呈現藍色，遇甲紫會呈現紅色(　×　)
4．填空默寫
(1)(選擇性必修3 P67)基因工程：按照人們的愿望，通過轉基因等技術，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。
(2)(選擇性必修3 P71)限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。
(3)(選擇性必修3 P72)載體上有特殊的標記基因，便于重組DNA分子的篩選。
(4)(選擇性必修3 P77)PCR反應需要在一定的緩沖溶液中才能進行，需提供DNA模板、2種引物、4種脫氧核苷酸和耐高溫的DNA聚合酶。
(5)(選擇性必修3 P80)基因表達載體是載體的一種，除目的基因、標記基因外，還必須含有啟動子、終止子等。
(6)(選擇性必修3 P81)轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程。
課時精練
一、選擇題：每小題給出的四個選項中只有一個符合題目要求。
1．(2023·湖南常德高三質檢)如圖表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相關的酶作用位點。下列敘述錯誤的是(　　)
A．甲、乙、丙都屬于黏性末端
B．甲、乙片段可形成重組DNA分子，但甲、丙不能
C．DNA連接酶的作用位點在圖乙中b處
D．切割甲的限制酶不能識別由甲、乙片段形成的重組DNA分子
答案　C
解析　甲、乙的黏性末端相同，因此可在DNA連接酶的作用下形成重組DNA分子，但甲、丙的黏性末端不同，它們之間不能形成重組DNA分子，B正確；DNA連接酶將兩個DNA片段連接為一個DNA分子，作用部位是磷酸二酯鍵，即圖乙中a處，C錯誤；切割甲的限制酶的識別序列為GAATTC∥CTTAAG，而甲、乙片段形成的重組DNA分子序列為GAATTG∥CTTAAC，因此切割甲的限制酶不能識別由甲、乙片段形成的重組DNA分子，D正確。
2．T4 DNA連接酶可將任意2個具有相同黏性末端的DNA片段連接在一起。該反應過程需消耗ATP，其水解產生的腺苷一磷酸(AMP)通過共價鍵與酶相連，隨后AMP轉移至DNA片段，進而完成連接反應。下列敘述正確的是(　　)
A．T4 DNA連接酶的底物種類較多，故其無專一性
B．T4 DNA連接酶催化反應后，其組成成分已改變
C．ATP在該反應過程中可能打開兩個特殊的化學鍵
D．T4 DNA連接酶需保存于最適溫度和pH條件下
答案　C
解析　T4 DNA連接酶有專一性，A錯誤；酶在催化反應前后性質不變，故T4 DNA連接酶催化反應后，其組成成分不變，B錯誤；ATP水解產生AMP需要打開兩個特殊的化學鍵，結合題干信息“該反應過程需消耗ATP，其水解產生的腺苷一磷酸(AMP)通過共價鍵與酶相連”可推測，ATP在該反應過程中可能打開兩個特殊的化學鍵，C正確；T4 DNA連接酶需在低溫和最適pH條件下保存，D錯誤。
3．(2023·山東日照高三檢測)基因工程利用某目的基因(圖甲)和P1噬菌體載體(圖乙)構建重組DNA。限制性內切核酸酶BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ的酶切位點分別如圖所示。下列分析錯誤的是(　　)
A．構建重組DNA時，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體
B．構建重組DNA時，可用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體
C．圖乙中的P1噬菌體載體只用EcoRⅠ切割后，含有兩個游離的磷酸基團
D．用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體，再用DNA連接酶連接，只能產生一種重組DNA
答案　D
解析　P1噬菌體載體為環(huán)狀DNA，其上只含有一個EcoRⅠ的酶切位點，因此用EcoRⅠ切割后，該環(huán)狀DNA分子變?yōu)殡p鏈DNA分子，因每條鏈各含有一個游離的磷酸基團，故切割后含有兩個游離的磷酸基團，C正確；由圖甲可知，用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體后形成的黏性末端相同，可任意連接，不止產生一種重組DNA，D錯誤。
4．下列有關獲取目的基因的敘述，錯誤的是(　　)
A．目的基因就是編碼蛋白質的基因
B．篩選和獲取目的基因是基因工程的第一步
C．來自蘇云金桿菌的Bt基因可作為轉基因抗蟲棉的目的基因
D．序列比對工具的應用為科學家找到合適的目的基因提供了更多的機會
答案　A
解析　目的基因主要是指編碼蛋白質的基因，A錯誤；目的基因的篩選與獲取是實施基因工程的第一步，B正確；來自蘇云金桿菌的Bt基因是培育轉基因抗蟲棉較為合適的目的基因，C正確；隨著測序技術的發(fā)展，以及序列數據庫和序列比對工具等的應用，越來越多的基因的結構和功能為人們所知，這為科學家找到合適的目的基因提供了更多的機會和可能，D正確。
5．(2023·河北石家莊高三模擬)如圖是快速RT－PCR過程示意圖，①和②為逆轉錄酶催化的逆轉錄過程，③是PCR過程。據圖分析，下列敘述錯誤的是(　　)
A．逆轉錄酶具有DNA聚合酶的能力
B．③PCR過程只需要引物b
C．RT－PCR可檢測基因表達水平
D．RT－PCR可檢測新冠病毒等RNA病毒
答案　B
解析　③PCR過程需要引物a、b，因為后續(xù)的模板鏈序列既有與靶RNA一致的，也有與cDNA一致的，B錯誤。
6．(2022·山東，13)關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法錯誤的是(　　)
A．過濾液沉淀過程在4 ℃冰箱中進行是為了防止DNA降解
B．離心研磨液是為了加速DNA的沉淀
C．在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現藍色
D．粗提取的DNA中可能含有蛋白質
答案　B
解析　離心研磨液是為了使細胞碎片沉淀，B錯誤；在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑呈現藍色，C正確；細胞中的某些蛋白質可以溶解于酒精，故粗提取的DNA中可能含有蛋白質，D正確。
7．(2023·遼寧沈陽高三調研)引物的設計是影響PCR擴增反應的效率和特異性的關鍵因素，下列相關敘述正確的是(　　)
A．引物的堿基數量越少則退火溫度越低、目標DNA獲得率越高
B．根據需要可在引物的5′端添加限制酶識別序列、點突變序列等
C．兩種引物的退火溫度差異較大，可減少引物與模板的非特異性結合
D．引物的GC含量越高，結合特異性越強，越利于目標DNA的擴增
答案　B
解析　退火溫度與時間取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，引物的堿基數量越少，變性時破開的氫鍵越少，則退火溫度越低，但能與引物發(fā)生配對的片段就越多，目標DNA獲得率越低，A錯誤；根據需要可在引物的5′端添加限制酶識別序列、點突變序列等，以便更加準確地獲得目的基因，B正確；兩種引物的退火溫度差異較大，導致不能同時退火，甚至一條鏈在延伸，一條鏈在退火，可增加引物與模板的非特異性結合，C錯誤；引物的GC含量越高，結合特異性越強，但GC含量過高，氫鍵越多，不利于退火，從而阻礙目標DNA的擴增，D錯誤。
8．DNA瓊脂糖凝膠電泳是指利用在溶液中帶負電荷的DNA分子在電場中向正極移動的原理，分離、純化或分析PCR擴增后的待檢DNA片段的生物化學技術。下列說法錯誤的是(　　)
A．DNA片段相對分子質量越大，遷移就越慢
B．凝膠制備中加入的核酸染料能與DNA分子結合，用于分離后DNA片段的檢測
C．擬回收的DNA區(qū)帶融化后可先用DNA抽取劑抽提，再用70%的冷酒精沉淀抽提DNA片段，從而提高回收率
D．新冠病毒核酸檢測出現假陽性的原因可能是陽性對照中模板核酸與樣品交叉污染
答案　C
解析　擬回收的DNA區(qū)帶融化后可先用DNA抽取劑抽提，再體積分數為用95%的冷酒精沉淀抽提DNA片段，從而提高回收率，C錯誤。
二、選擇題：每小題給出的四個選項中有一個或多個符合題目要求。
9．(2023·遼寧錦州高三質檢)實時熒光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸檢測，其原理：在PCR復性過程中探針和引物一起與模板結合，探針兩側分別帶有熒光基團和抑制熒光發(fā)出的淬滅基團，新鏈延伸過程中，DNA聚合酶會破壞探針，導致熒光基團與淬滅基團分離而發(fā)出熒光。利用RT－PCR進行核酸檢測的相關過程如圖所示。下列說法不正確的是(　　)
A．做RT－PCR之前，需要先根據cDNA的核苷酸序列合成引物和探針
B．RNA不能作為PCR擴增的模板，故需要將樣本中的RNA逆轉錄為DNA后再進行擴增
C．若檢測結果有強烈熒光信號發(fā)出，說明被檢測者沒有感染病毒
D．病毒的檢測還可以檢測病毒表面的物質或病毒引發(fā)產生的抗體，其原理都是抗原—抗體雜交
答案　C
解析　PCR擴增必須以DNA為模板，RNA不能作為PCR擴增的模板，所以需要將樣本中的RNA逆轉錄為DNA后再進行擴增，B正確；若檢測結果有強烈熒光信號發(fā)出，說明被檢測者極有可能感染了病毒，C錯誤。
10．(2023·江蘇淮安高三模擬)下圖表示pBR322質粒和人生長激素基因所在片段的結構信息，將二者構建的重組質粒導入受體菌并進行篩選。下列敘述錯誤的是(　　)
注：AmpR：氨芐青霉素抗性基因；TetR：四環(huán)素抗性基因。
A．應選擇的限制酶組合是酶F和酶G
B．所選用的受體菌含有AmpR和TetR基因
C．用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選出的是含重組質粒的受體菌
D．同時用三種限制酶處理圖中質粒，電泳后可得到4個條帶
答案　BC
解析　為避免切割后DNA片段的自身環(huán)化，又保留質粒上的標記基因，切割時應選擇的限制酶組合是酶F和酶G，A正確；所選用的受體菌不能含有AmpR和TetR基因，以便于對含有目的基因的受體菌進行選擇，B錯誤；用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選出的有導入重組質粒的受體菌和導入原質粒的受體菌，C錯誤；據題圖分析可知，同時用三種限制酶處理圖中質粒，因酶E有兩個作用位點，故將質粒切割成了4個DNA片段，電泳后可得到4個條帶，D正確。
11．(2023·遼寧沈陽高三質量監(jiān)測)科研人員通過PCR技術獲得白蛋白啟動子，將該啟動子與Cre重組酶基因結合構建基因表達載體，培育出在肝細胞中特異性表達Cre重組酶的轉基因小鼠。下列相關敘述正確的是(　　)
A．將基因表達載體導入肝細胞經培育獲得轉基因小鼠
B．利用PCR技術獲得白蛋白啟動子需要兩種引物
C．通過抗原－抗體雜交技術可檢測Cre基因是否完成表達
D．將發(fā)育到原腸胚時期的重構胚向受體進行移植
答案　BC
解析　將該表達載體導入受精卵以獲得轉基因小鼠，A錯誤；DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從引物的3′端(子鏈的5′端)開始延伸DNA，因此PCR過程中需要添加引物才能完成復制過程，要合成兩條子鏈，需要兩種引物，B正確；Cre基因完成表達的產物是蛋白質，故可通過抗原－抗體雜交技術進行檢測，C正確；胚胎移植需要胚胎發(fā)育至桑葚胚或囊胚階段，D錯誤。
三、非選擇題
12．如圖pIJ702是一種常用質粒，其中tsr為硫鏈絲菌素(一種抗生素)抗性基因；mel為黑色素合成基因，其表達能使白色的鏈霉菌菌落變成黑色菌落；而三種限制酶SacⅠ、SphⅠ、BglⅡ在pIJ702上分別只有一處識別序列。回答下列問題：
項目 pIJ702 pZHZ8
BglⅡ 5.7 kb 6.7 kb
表1
固體培養(yǎng)基中硫鏈絲菌素濃度(μg/mL) 0 1 2 5 10
不含質粒的鏈霉菌生長狀況 ＋＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋ － －
注：“＋”表示生長；“－”表示不生長。
表2
(1)限制酶可以識別雙鏈DNA中特定核苷酸序列，并使每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的________________斷裂，切割形成的末端有______________________兩種。
(2)以SacⅠ和SphⅠ切取目的基因，與質粒pIJ702上長度為0.4 kb的SacⅠ/SphⅠ片段進行置換，構建重組質粒pZHZ8。上述兩種質粒經限制酶BglⅡ酶切后所得片段長度見表1。由此判斷目的基因的片段長度為____________kb，判定目的基因中含有一個BglⅡ切割位點的理由是____________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
(3)導入目的基因時，首先用Ca2＋處理鏈霉菌使其成為感受態(tài)(能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài))細胞，再將重組質粒pZHZ8溶于緩沖液中與感受態(tài)細胞混合，在一定的溫度下可以促進鏈霉菌完成________________過程。
(4)不含質粒的鏈霉菌在含硫鏈絲菌素的固體培養(yǎng)基上生長狀況如表2所示。若要篩選導入pZHZ8的鏈霉菌細胞，所需硫鏈絲菌素濃度至少應在________μg/mL以上，挑選成功導入pZHZ8的鏈霉菌的具體方法是_____________________________________________________
_______________________________________________________________________________。若要檢測整合到染色體DNA上的目的基因是否發(fā)揮功能作用，第一步需檢測受體細胞的__________(填“DNA”或“RNA”)。
答案　(1)磷酸二酯鍵　黏性末端和平末端　(2)1.4　pIJ702上的原有BglⅡ切割位點被目的基因置換得到的環(huán)狀pZHZ8，仍能被BglⅡ切割成一條線段　(3)轉化　(4)5　根據導入pIJ702的鏈霉菌菌落呈黑色、導入pZHZ8的鏈霉菌菌落呈白色的特點，通過觀察菌落的顏色進行挑選　RNA
解析　(2)質粒pIJ702的長度為5.7 kb，而重組質粒pZHZ8的長度為6.7 kb，又已知構建基因表達載體時，目的基因置換了pIJ702上0.4 kb的片段，由此判斷目的基因的片段長度為6.7－5.7＋0.4＝1.4(kb)。(4)從不含質粒的鏈霉菌在含硫鏈絲菌素固體培養(yǎng)基上的生長狀況表格可以看出，硫鏈絲菌素濃度低于5 μg/mL時，鏈霉菌能夠生長，因此所需的硫鏈絲菌素最小濃度應為5 μg/mL。檢測目的基因是否發(fā)揮功能作用的第一步是目的基因是否能轉錄形成mRNA。
13．(2021·江蘇，23)某小組為研究真菌基因m的功能，構建了融合表達蛋白M和tag標簽的質粒，請結合實驗流程回答下列問題：
(1)目的基因的擴增
①提取真菌細胞__________________，經逆轉錄獲得cDNA，進一步獲得基因m片段。
②為了獲得融合tag標簽的蛋白M，設計引物P2時，不能包含基因m終止密碼子的編碼序列，否則將導致__________________。
③熱啟動PCR可提高擴增效率，方法之一是：先將除Taq DNA聚合酶以外的各成分混合后，加熱到80 ℃以上再混入酶，然后直接從94 ℃開始PCR擴增。下列敘述正確的有__________。
A．TaqDNA聚合酶最適催化溫度范圍為50～60 ℃
B．與常規(guī)PCR相比，熱啟動PCR可減少反應起始時引物錯配形成的產物
C．兩條子鏈的合成一定都是從5′端向3′端延伸
D．PCR產物DNA堿基序列的特異性體現了TaqDNA聚合酶的特異性
(2)重組質粒的構建
①將SmaⅠ切開的載體A與添加同源序列的m混合，用特定DNA酶處理形成黏性末端，然后降溫以促進____________________，形成A－m結合體。將A－m結合體導入大腸桿菌，利用大腸桿菌中的DNA聚合酶及________酶等，完成質粒的環(huán)化。
②若正確構建的重組質粒A－m仍能被SmaⅠ切開，則SmaⅠ的酶切位點可能在__________
_______________________________________________________________________________。
(3)融合蛋白的表達
①用含有尿嘧啶的培養(yǎng)基培養(yǎng)URA3基因缺失型酵母，將其作為受體菌，導入質粒A－m，然后涂布于無尿嘧啶的培養(yǎng)基上，篩選獲得目的菌株，其機理是________________________
________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
②若通過抗原－抗體雜交實驗檢測到酵母蛋白中含tag標簽，說明_____________________，后續(xù)實驗可借助tag標簽進行蛋白M的分離純化。
答案　(1)①RNA　②蛋白M上不含tag標簽
③BC　(2)①黏性末端堿基互補配對　DNA連接　②基因m的連接處、基因m的內部　(3)①受體菌在無尿嘧啶的培養(yǎng)基上無法生長，導入重組質粒的受體菌含有URA3基因，可以長成菌落　②融合基因表達(或重組質粒A－m構建成功)
解析　(1)①以逆轉錄獲得cDNA的方式，要先從真菌細胞中提取基因m轉錄出來的mRNA。②從構建好的重組質粒上看，tag序列位于目的基因下游，若基因m的轉錄產物mRNA上有終止密碼子，核糖體移動到終止密碼子多肽鏈就斷開，則不會對tag序列的轉錄產物繼續(xù)進行翻譯，蛋白M上就不含tag標簽。③從題干信息可知，“80 ℃以上再混入酶，然后直接從94 ℃開始PCR擴增”，故TaqDNA聚合酶最適催化溫度范圍為94 ℃左右，A錯誤；PCR反應的最初加熱過程中，樣品溫度上升到70 ℃之前，在較低的溫度下引物可能與部分單鏈模板形成非特異性結合，并在Taq DNA聚合酶的作用下延伸，結果會導致引物錯配形成的產物的擴增，影響反應的特異性，熱啟動可減少引物錯配形成的產物的擴增，提高反應的特異性，B正確；DNA分子復制具有方向性，都是從5′端向3′端延伸，C正確；TaqDNA聚合酶沒有特異性，與普通的DNA聚合酶相比，TaqDNA聚合酶更耐高溫，D錯誤。故選BC。(2)①從圖上看，載體A只有一個SmaⅠ的酶切位點，故被SmaⅠ切開后，載體由環(huán)狀變?yōu)殒湢頓NA，將SmaⅠ切開的載體A與添加同源序列的m混合，用特定DNA酶處理形成黏性末端，然后降溫以促進載體A與添加同源序列的m的黏性末端堿基互補配對。將A－m結合體導入大腸桿菌，利用大腸桿菌中的DNA聚合酶及DNA連接酶等，完成質粒的環(huán)化。②重組質粒中，載體A被SmaⅠ切開的位置已經與基因m相連，原來的酶切位點已不存在，若正確構建的重組質粒A－m仍能被SmaⅠ切開，則SmaⅠ的酶切位點可能在基因m的連接處或基因m內部。(3)①篩選目的菌株的機理：導入了質粒A－m的目的菌株由于含有URA3基因，能在無尿嘧啶的培養(yǎng)基上存活，而URA3基因缺失型酵母則不能存活。②若通過抗原－抗體雜交實驗檢測到酵母蛋白中含tag標簽，位于tag標簽上游的基因m應該正常表達，說明融合基因表達(或重組質粒A－m構建成功)。
14．如圖是利用工程菌(大腸桿菌)生產人生長激素的實驗流程。所用的pBR322質粒含有限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和Hind Ⅲ的切點各一個，且三種酶切割形成的末端各不相同，而AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，TetR表示四環(huán)素抗性基因。請回答以下相關問題：
(1)目的基因主要是指編碼蛋白質的基因，也可以是一些具有________的因子。過程①所用到的組織細胞是________________________________________________________，③過程的目的是________________________，⑤過程常用____________________________________處理大腸桿菌。
(2)如果用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ對圖中質粒進行切割，形成的DNA片段種類有________種，這些種類的DNA片段中含有完整氨芐青霉素抗性基因的DNA片段和四環(huán)素抗性基因的DNA片段分別有______種和________種。
(3)如果只用限制酶PstⅠ切割目的基因和質粒，完成過程④、⑤后(受體大腸桿菌不含AmpR、TetR)，將三角瓶內的大腸桿菌先接種到甲培養(yǎng)基上，形成菌落后用無菌牙簽挑取甲培養(yǎng)基上的單個菌落，分別接種到乙和丙兩個培養(yǎng)基的相同位置上，一段時間后，菌落的生長狀況如圖乙、丙所示。接種到甲培養(yǎng)基上的目的是篩選______________________的大腸桿菌；接種到乙培養(yǎng)基上的大腸桿菌菌落，能存活的大腸桿菌體內導入的是_______________________。含有目的基因的大腸桿菌在培養(yǎng)基乙和丙上的生存情況是______________________________
_______________________________________________________________________________。
答案　(1)調控作用　人垂體組織細胞　將平末端處理為黏性末端　Ca2＋　(2)9　3　3　(3)含四環(huán)素抗性基因　完整的pBR322質粒(或含有AmpR、TetR的質粒)　在丙中能存活，在乙中不能存活
解析　(2)假設PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ三種酶的切點分別用1、2、3表示(后面的→均按照順時針方向)。一種酶分別酶切時，一共可以得到3種片段1→1、2→2、3→3；任意兩種酶分別同時酶切時，可得到1→2、2→1、2→3、3→2、1→3、3→1六種片段；三種酶同時酶切時，可得到1→2、2→3、3→1三種片段。綜上所述，共計9種不同的片段(1→1、1→2、1→3、2→1、2→2、2→3、3→1、3→2、3→3)。其中片段3→2、2→2、3→3共3種含有完整氨芐青霉素抗性基因，片段2→1、2→2、1→1共3種含有完整四環(huán)素抗性基因。第6課時　基因工程的基本工具和基本操作程序
課標要求　1.闡明DNA重組技術的實現需要利用限制性內切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。2.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞和目的基因的檢測與鑒定等步驟。3.按照實驗操作步驟，進行DNA的粗提取與鑒定實驗。4.利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增DNA片段并完成電泳鑒定，或運用軟件進行虛擬PCR實驗。
考點一　重組DNA技術的基本工具
1．基因工程的概念
別名 ________技術
操作環(huán)境 生物體外
操作對象
操作水平 ________水平
結果 創(chuàng)造出更符合人們需要的新的________________和________________
2.基因工程的誕生和發(fā)展
(1)肺炎鏈球菌轉化實驗不僅證明DNA是遺傳物質，還證明了DNA可在同種生物不同個體之間________。
(2)DNA雙螺旋結構的提出和______________的證明。
(3)中心法則的確立。
(4)________________的破譯。
(5)基因轉移載體和________________________________的發(fā)現為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。
(6)________體外重組的實現。
(7)重組DNA表達實驗的成功。
(8)DNA測序和合成技術的發(fā)明。
(9)________技術的發(fā)明。
(10)________________技術可以實現對特定基因的定點插入、敲除或替換。
3．重組DNA技術的基本工具
(1)限制性內切核酸酶(也稱“限制酶”)
(2)DNA連接酶
(3)載體
(1)源于選擇性必修3 P71“旁欄思考”：①原核生物中存在限制酶的意義是什么？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
②限制酶來源于原核生物，為什么不能切割自己的DNA分子？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
(2)源于選擇性必修3 P72“旁欄思考”：DNA連接酶和DNA聚合酶________(填“是”或“不是”)一回事。原因是①DNA連接酶連接的是________________，而DNA聚合酶是把單個的______________連接到已有的DNA片段上。②________________起作用時需要以一條DNA鏈為模板，而________________不需要模板。
延伸應用　圖解限制酶的選擇原則
(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。
(2)保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點原則：質粒作為載體必須具備標記基因，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中不選擇SmaⅠ。
(3)確保出現相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶，如圖甲中PstⅠ；為避免目的基因和質粒自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。
構建基因表達載體時，需要選擇合適的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和載體。
已知限制性內切核酸酶Ⅰ的識別序列和切點是，限制性內切核酸酶Ⅱ的識別序列和切點是，根據圖示分析回答下列問題：
(1)請用圖示法寫出限制性內切核酸酶Ⅰ和限制性內切核酸酶Ⅱ切割后形成黏性末端的過程。
(2)切割圖示中的目的基因和質粒應選用哪類限制酶？請說明理由。
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
1．下表為常用的限制性內切核酸酶(限制酶)及其識別序列和切割位點，由此推斷，下列說法錯誤的是(　　)
限制酶名稱 識別序列和切割位點 限制酶名稱 識別序列和切割位點
BamHⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoRⅠ C↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
HindⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
注：Y為C或T，R為A或G。
A．HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶切割后形成平末端
B．Sau3AⅠ限制酶的切割位點在識別序列的外部
C．BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種限制酶切割后形成相同的黏性末端
D．一種限制酶一定只能識別一種核苷酸序列
2．(不定項)質粒是基因工程中最常用的目的基因運載工具。下列有關敘述正確的是(　　)
A．質粒是只存在于細菌細胞質中能自主復制的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子
B．在所有的質粒上都能找到一個或多個限制酶切割位點
C．攜帶目的基因的重組質粒只有整合到宿主細胞的染色體DNA上才會隨后者的復制而復制
D．質粒上的抗性基因常作為標記基因供重組DNA的鑒定和選擇
歸納提升　與DNA有關的幾種酶的比較
考點二　基因工程的基本操作程序
1．目的基因的篩選與獲取
(1)目的基因：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞_______________或獲得預期________________等的基因。
(2)篩選合適的目的基因
①從相關的已知________________________的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。
②利用________________和序列比對工具進行篩選。
(3)目的基因的獲取
①人工合成目的基因。
②PCR________和擴增目的基因
a．PCR(聚合酶鏈式反應)：是一項根據________________的原理，在體外提供參與DNA復制的各種________與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行________________的技術。
b．PCR反應的條件：一定的______________、DNA模板、2種______________、4種________________、________________DNA聚合酶，以及能自動調控__________的儀器。
c．PCR擴增的過程
d．PCR產物的鑒定：常采用________________來鑒定。
③通過構建____________來獲取目的基因。
(1)源于選擇性必修3 P77“相關信息”：Bt抗蟲蛋白基因產生的Bt抗蟲蛋白只在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現出毒性，而人和牲畜的胃液呈________，腸道細胞也無特異性受體。因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產生危害。
(2)源于選擇性必修3 P77“相關信息”： 真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應緩沖溶液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的________________。
2．基因表達載體的構建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因________________________________，同時，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。
(2)基因表達載體的組成及作用
(3)構建過程
提醒　啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比
項目 啟動子 終止子 起始密碼子 終止密碼子
本質 DNA DNA mRNA mRNA
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA 使轉錄在所需要的地方停下來 翻譯的起始信號(編碼氨基酸) 翻譯的結束信號(不編碼氨基酸)
3.將目的基因導入受體細胞
生物種類 植物 動物 微生物
常用方法 農桿菌轉化法、___________ 顯微注射法 ____處理法
受體細胞 原核細胞
轉化過程 將目的基因插入Ti質粒的T－DNA中→農桿菌→導入植物細胞→整合到受體細胞的染色體DNA上→表達 將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物 Ca2＋處理細胞→細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)→基因表達載體導入
辨析　(1)轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程。此處“轉化”與肺炎鏈球菌轉化實驗中的“轉化”含義相同，實質都是基因重組。
(2)農桿菌轉化法中的兩次拼接和兩次導入
第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受體細胞的染色體DNA上；第一次導入是將含目的基因的Ti質粒導入農桿菌，第二次導入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA導入受體細胞。
4．目的基因的檢測與鑒定
PCR是一項根據DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。在該過程中，引物非常關鍵，回答下列有關引物的問題：
(1)什么是引物？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
(2)PCR技術為什么需要引物？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
(3)利用PCR技術擴增目的基因時需要兩種引物，原因是什么？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
(4)在PCR擴增目的基因之前，需先設計引物，對設計的兩種引物之間的堿基序列的要求是什么？
_______________________________________________________________________________
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(5)為檢測胚乳細胞中Wx基因是否表達，科研人員提取胚乳中的總RNA，經逆轉錄過程獲得總cDNA，通過PCR技術可在總cDNA中專一性地擴增出Wx基因的cDNA，原因是什么？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
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(6)若一個DNA分子在PCR中經過n輪循環(huán)，理論上需要消耗多少個引物？第n輪循環(huán)需要消耗多少個引物數？
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_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
3．(不定項)(2023·湖南懷化高三模擬)大引物PCR定點突變常用來研究蛋白質結構改變導致的功能變化。單核苷酸的定點誘變僅需進行兩輪PCR反應即可獲得，第一輪加誘變引物和側翼引物，第一輪產物作第二輪PCR擴增的大引物，過程如圖所示。下列有關敘述錯誤的是(　　)
A．PCR擴增的定點誘變產物通常需要連接到載體分子上才能表達出相應的性狀，需具備啟動子、終止子等結構才能進行轉錄和翻譯
B．單核苷酸的定點誘變所屬變異類型為基因重組
C．第二輪PCR所用的引物都是第一輪PCR產物DNA的兩條鏈
D．利用該技術將某功能蛋白的結構改變屬于蛋白質工程
4．下圖表示培育轉基因抗植物病毒番茄的過程示意圖。下列敘述正確的是(　　)
A．過程A需要限制酶和DNA聚合酶的參與
B．過程B需要用CaCl2處理，以提高番茄細胞細胞壁的通透性
C．抗植物病毒基因一旦整合到番茄細胞的染色體上，就能正常表達
D．轉基因抗植物病毒番茄是否培育成功可通過抗病毒接種實驗進行鑒定
歸納提升　(1)PCR技術和DNA復制的比較
(2)PCR擴增過程中的循環(huán)圖示與規(guī)律
循環(huán)次數 1 2 3 n
DNA分子數 2 4 8 2n
含引物A(或B)的DNA分子數 1 3 7 2n－1
同時含引物A、B的DNA分子數 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗的引物數量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1－2 2n＋1－2
考點三　DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴增與電泳鑒定
1．DNA的粗提取與鑒定
(1)基本原理
(2)操作流程
注意　加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。
2．DNA片段的擴增及電泳鑒定
(1)實驗基礎
①PCR原理：利用了________________原理。
②電泳：DNA分子具有可解離的基團，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷______的電極移動，這個過程就是電泳。
③PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的________________等有關。
(2)PCR實驗操作步驟
(3)DNA的電泳鑒定：凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為______的紫外燈下被檢測出來。
1．在“DNA片段的擴增及電泳鑒定”實驗中，防止DNA被污染的操作有哪些？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
2．如何來評價擴增的效果？
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
5．(2023·山東濟南高三期末)下列以洋蔥為實驗材料進行“DNA的粗提取與鑒定”實驗的敘述，正確的是(　　)
A．洋蔥研磨液需要用濾紙過濾，以保證提取的DNA量
B．濾液中加入冷酒精后，用玻璃棒攪拌會使DNA的提取量增加
C．向含DNA的濾液中加入2 mol/L的NaCl溶液有利于去除雜質
D．用二苯胺試劑鑒定DNA時，需沸水浴加熱冷卻后再觀察顏色變化
6．(不定項)下圖是“DNA的粗提取與鑒定”實驗中的兩個操作步驟示意圖。下列相關敘述正確的是(　　)
A．選用植物細胞提取DNA時需先研磨破碎細胞
B．圖2所示實驗操作中有一處明顯錯誤，可能導致試管2中藍色變化不明顯
C．圖1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白質等雜質不溶
D．圖2試管1的作用是證明物質的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺試劑出現藍色
1．(2021·湖北，16)某實驗利用PCR技術獲取目的基因，實驗結果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對)外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。為了減少反應非特異條帶的產生，以下措施中有效的是(　　)
A．增加模板DNA的量 B．延長熱變性的時間
C．延長延伸的時間 D．提高復性的溫度
2．(2021·山東，13)粗提取DNA時，向雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，過濾后所得濾液進行下列處理后再進行過濾，在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物的處理方式是(　　)
A．加入適量的木瓜蛋白酶
B．37～40 ℃的水浴箱中保溫10～15分鐘
C．加入與濾液體積相等的、體積分數為95%的冷卻的酒精
D．加入NaCl調節(jié)濃度至2 mol/L→過濾→調節(jié)濾液中NaCl濃度至0.14 mol/L
3．(2020·北京，12)為了對重金屬污染的土壤進行生物修復，研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉運蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動子連接，導入楊樹基因組中(如圖)。為檢測獲得的轉基因楊樹苗中是否含有導入的HMA3基因，同時避免內源HMA3基因的干擾，在進行PCR擴增時，應選擇的引物組合是(　　)
A．①＋③ B．①＋②
C．③＋② D．③＋④
4. (2022·江蘇，24)纖毛是廣泛存在的細胞表面結構，功能異常可引起多種疾病。因此，研究纖毛形成的作用機制具有重要意義。請回答下列問題：
(1)纖毛結構如圖Ⅰ所示，由細胞膜延伸形成的纖毛膜主要由________________組成。基體由中心體轉變而來，中心體在有絲分裂中的功能是_____________________________________
_______________________________________________________________________________。
(2)某病人腎小管上皮細胞纖毛異常，為了分析纖毛相關基因X是否發(fā)生了變異，對基因X進行了PCR擴增與產物測序。從細胞樣品中分離DNA時，可通過交替調節(jié)鹽濃度將與核蛋白結合的DNA分離出來，溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是______________________
_______________________________________________________________________________。
PCR擴增時，需在____________________催化下，在引物__________端進行DNA鏈的延伸，獲得擴增產物用于測序。
(3)為研究蛋白質X在細胞中的定位，構建綠色熒光蛋白GFP與X的融合蛋白，融合蛋白具有綠色熒光，可示其在細胞內位置。將X－GFP基因融合片段M導入如圖Ⅱ所示載體質粒Y，構建Y－M重組質粒(在EcoRV位點插入片段)。請完成下表。
分步實驗目標 簡易操作、結果、分析
PCR鑒定正向重組質粒Y－M(圖Ⅱ中融合片段M中有白色的箭頭，代表方向) ①選擇圖Ⅱ引物__________； ②PCR目的產物約為__________bp
確保M及連接處序列正確，Y－M的連接處上游含有Hind Ⅲ＋EcoR V的識別序列，下游含有EcoR V＋BamH Ⅰ的識別序列 ③質粒測序，圖Ⅲ中正確的是__________(選填序列編號)
檢測融合蛋白定位 ④對照質粒Y－GFP(僅表達GFP)與實驗質粒Y－M分別導入細胞，發(fā)現對照組整個細胞均有綠色熒光，而實驗組熒光集中在纖毛基部，說明__________________________________ ______________________________________
(4)為研究另一纖毛病相關基因Z表達的變化，采用熒光定量PCR法檢測健康人與病人基因Z的轉錄水平。采集樣本、提取總RNA，經______________形成cDNA作為模板，PCR擴增結果顯示，在總cDNA模板量相等的條件下，健康人Ct值為15，而病人Ct值為20(Ct值是產物熒光強度達到設定閾值時的PCR循環(huán)數)。從理論上估算，在PCR擴增20個循環(huán)的產物中，健康人樣品的目的產物大約是病人的__________倍。
1．判斷關于基因工程的基本工具的敘述
(1)限制酶只能用于切割目的基因(　　)
(2)切割質粒的限制性內切核酸酶均能特異性地識別6個核苷酸序列(　　)
(3)限制性內切核酸酶、DNA連接酶和質粒是基因工程中常用的三種工具酶(　　)
(4)載體質粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標記基因(　　)
2．判斷關于基因工程的基本操作程序的敘述
(1)根據不同的需要，目的基因是不同的，但都是能編碼蛋白質的基因(　　)
(2)外源DNA必須位于重組質粒的啟動子和終止子之間才能進行復制(　　)
(3)表達載體的復制和胰島素基因的表達均啟動于復制原點(　　)
(4)PCR反應中溫度的周期性改變是為了使DNA聚合酶催化不同的反應(　　)
3．判斷關于DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴增與電泳鑒定的敘述
(1)進行DNA片段的擴增及電泳鑒定實驗所需的緩沖液和酶應分裝成小份，并在20 ℃條件下儲存(　　)
(2)在凝膠中DNA分子的遷移速率只與DNA分子的大小相關(　　)
(3)為了節(jié)約資源，移液器上的槍頭在實驗過程中不必更換(　　)
(4)DNA遇二苯胺試劑會呈現藍色，遇甲紫會呈現紅色(　　)
4．填空默寫
(1)(選擇性必修3 P67)基因工程：___________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
(2)(選擇性必修3 P71)限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的________________序列，并且使每一條鏈中特定部位的______________________斷開。
(3)(選擇性必修3 P72)載體上有特殊的標記基因，便于________________________________。
(4)(選擇性必修3 P77)PCR反應需要在一定的緩沖溶液中才能進行，需提供______________、________________、4種________________和耐高溫的________________。
(5)(選擇性必修3 P80)基因表達載體是載體的一種，除目的基因、標記基因外，還必須含有________________等。
(6)(選擇性必修3 P81)轉化：_______________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。

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