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解惑練5
CRISPR/Cas9技術(shù)
1.CRISPR/Cas9技術(shù)敲除掉部分基因原理
(1)CRISPR/Cas9是細(xì)菌的一種后天免疫防御機(jī)制——CRISPR序列示意圖如下(其中，菱形框表示高度可變的間隔序列，正方形表示相對(duì)保守的重復(fù)序列)，其中的“間隔序列”來源于病毒或外源質(zhì)粒的一小段DNA，是細(xì)菌對(duì)這些外來入侵者的“記錄”。
(2)病毒或外源質(zhì)粒上存在“原間隔序列”，“間隔序列”正是與它們互相對(duì)應(yīng)?！霸g隔序列”的選取并不是隨機(jī)的，這些原間隔序列的兩端向外延伸的幾個(gè)堿基往往都很保守，我們稱為PAM(原間隔序列臨近基序)。
(3)當(dāng)病毒或外源質(zhì)粒DNA首次入侵到細(xì)菌體內(nèi)時(shí)，細(xì)菌會(huì)對(duì)外源DNA潛在的PAM序列進(jìn)行掃描識(shí)別，將臨近PAM的序列作為候選的“原間隔序列”，將其整合到細(xì)菌基因組上CRISPR序列中的兩個(gè)“重復(fù)序列”之間。這就是“間隔序列”產(chǎn)生的過程。
(4)當(dāng)外源質(zhì)?；虿《驹俅稳肭炙拗骶鷷r(shí)，會(huì)誘導(dǎo)CRISPR序列的表達(dá)。同時(shí)，在CRISPR序列附近還有一組保守的蛋白編碼基因，稱為Cas基因。CRISPR序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物CRISPR RNA和Cas基因的表達(dá)產(chǎn)物等一起合作，通過對(duì)PAM序列的識(shí)別，以及“間隔序列”與外源DNA的堿基互補(bǔ)配對(duì)，來找到外源DNA上的靶序列，并對(duì)其切割，降解外源DNA。這也就實(shí)現(xiàn)了對(duì)病毒或外源質(zhì)粒再次入侵的免疫應(yīng)答。
2.CRISPR/Cas9技術(shù)的運(yùn)用和發(fā)展
(1)具體運(yùn)用如右圖所示，在待敲除基因的上下游各設(shè)計(jì)一條向?qū)NA(指導(dǎo)RNA)，將其與含有Cas9蛋白編碼基因的質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，向?qū)NA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)可以靶向PAM附近的目標(biāo)序列，Cas9蛋白會(huì)使該基因上下游的DNA雙鏈斷裂。對(duì)于DNA雙鏈的斷裂這一生物事件，生物體自身存在著DNA損傷修復(fù)的應(yīng)答機(jī)制，會(huì)將斷裂上下游兩端的序列連接起來，從而實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞中目標(biāo)基因的敲除。
(2)CRISPR/Cas9基因魔剪：當(dāng)研究人員要用基因魔剪來編輯一個(gè)基因組時(shí)，他們會(huì)人工構(gòu)建一個(gè)指導(dǎo)RNA，它與將要被切割的DNA代碼相匹配。魔剪蛋白Cas9與指導(dǎo)RNA形成復(fù)合物，將魔剪帶到基因組中將要進(jìn)行切割的地方。
(3)原始的CRISPR/Cas9會(huì)由于RNA定位偏差而出現(xiàn)脫靶效應(yīng)，現(xiàn)在通過改進(jìn)，可以大幅降低脫靶效應(yīng)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了一些新的系統(tǒng)，除了最開始的Cas9，后面又找到了Cas12的一系列酶，機(jī)理上有一定不同，但還是用以切割DNA；還有Cas13則用于切割RNA。基于Cas12和Cas13的開發(fā)以及機(jī)制研究，又發(fā)展出了新的工具用于快速檢測病毒，效率可以達(dá)到幾分鐘檢測一個(gè)樣品，并且用到了現(xiàn)在的新冠病毒檢測中。
1.CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)源于細(xì)菌抵御噬菌體的機(jī)理研究。細(xì)菌被特定噬菌體感染后，細(xì)菌Cas2會(huì)隨機(jī)切斷入侵的噬菌體DNA雙鏈，并將切下的一個(gè)DNA片段(原型間隔序列)插入CRISPR位點(diǎn)(由間隔序列和重復(fù)序列交替排列組成的基因序列)的重復(fù)序列中，構(gòu)成新的間隔序列，形成“免疫記憶”。當(dāng)同種噬菌體再次入侵時(shí)，由CRISPR位點(diǎn)的新的間隔序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的crRNA便會(huì)將另一種蛋白質(zhì)(如Cas9)準(zhǔn)確帶入到入侵者的原間隔序列DNA處，并將之切斷，即“免疫滅殺”。
跟蹤訓(xùn)練
CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)中，sgRNA(單向?qū)NA)是根據(jù)靶基因設(shè)計(jì)的引導(dǎo)RNA，準(zhǔn)確引導(dǎo)Cas9切割與sgRNA配對(duì)的靶基因DNA序列，CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯時(shí)，對(duì)DNA序列中的原型間隔序列相鄰基序具有較高的編輯效率，如圖所示。回答下列問題：
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(1)細(xì)菌Cas2基因表達(dá)Cas2的過程需要細(xì)菌提供_________________
____等原料，Cas2和Cas9在功能上都屬于_____________________酶，可催化_________鍵水解。
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核糖核苷酸和氨基
酸
限制性內(nèi)切核酸(或限制)
磷酸二酯
基因表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)過程，因此細(xì)菌Cas2基因表達(dá)Cas2的過程需要細(xì)菌提供核糖核苷酸和氨基酸等原料。由題意可知，Cas2和Cas9都能切割DNA，屬于限制性內(nèi)切核酸酶(或限制酶)。限制酶能切割DNA分子，催化磷酸二酯鍵水解。
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宿主菌，原因可能是_____________________________________________
__________________________________________。
(2)CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的sgRNA與細(xì)菌體內(nèi)的________功能相同，都可以與相應(yīng)靶基因序列發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)。細(xì)菌利用該防御機(jī)制可以有效抵抗噬菌體的二次入侵，但是仍然會(huì)有部分噬菌體能夠繼續(xù)侵染已經(jīng)獲得免疫能力的
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crRNA
致CRISPR位點(diǎn)形成的crRNA無法對(duì)其進(jìn)行識(shí)別
噬菌體DNA中的原型間隔序列發(fā)生基因突變，導(dǎo)
分析題意可知，CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的sgRNA能夠與DNA雜交，其功能與細(xì)菌體內(nèi)的crRNA相似。細(xì)菌“免疫記憶”能夠切割噬菌體的DNA，若其功能失效，可能是細(xì)菌體內(nèi)的crRNA不能正確識(shí)別噬菌體的DNA，即噬菌體的DNA中的原型
間隔序列發(fā)生基因突變，導(dǎo)致CRISPR位點(diǎn)形成的crRNA無法對(duì)其進(jìn)行識(shí)別，進(jìn)而導(dǎo)致Cas9不能切割噬菌體的DNA。
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(3)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)存在一定的脫靶效應(yīng)：正常情況下，sgRNA通過20個(gè)核苷酸長度的引導(dǎo)序列與目標(biāo)DNA序列發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)準(zhǔn)確識(shí)別需要編輯的位點(diǎn)，然而有時(shí)會(huì)發(fā)生第18～20個(gè)堿基不匹配的情況，此時(shí)，Cas9可通過一個(gè)手指狀
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的結(jié)構(gòu)緊緊抓住錯(cuò)配區(qū)穩(wěn)定住RNA－DNA雙鏈，從而為Cas9切割DNA鋪平道路，但這可能會(huì)導(dǎo)致Cas9在錯(cuò)誤的基因位點(diǎn)切割雙鏈DNA，從而引發(fā)潛在風(fēng)險(xiǎn)。請(qǐng)就如何降低脫靶效應(yīng)，提出可能的思路：______________________________。
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答案　設(shè)計(jì)Cas9酶，讓其手指狀結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)離DNA序列，從而在sgRNA和DNA錯(cuò)配時(shí)，不會(huì)用來穩(wěn)定錯(cuò)配結(jié)構(gòu)(合理即可)
由題意可知，sgRNA通過20個(gè)核苷酸長度的引導(dǎo)序列與目標(biāo)DNA序列發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)準(zhǔn)確識(shí)別時(shí)，由于第18～20個(gè)堿基不匹配，Cas9可通過一個(gè)手指狀的結(jié)構(gòu)緊緊抓住錯(cuò)配區(qū)穩(wěn)定住RNA－DNA
雙鏈，導(dǎo)致錯(cuò)誤切割，故可設(shè)計(jì)Cas9酶，讓其手指狀結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)離DNA序列，從而在sgRNA和DNA錯(cuò)配時(shí)，不會(huì)用來穩(wěn)定錯(cuò)配結(jié)構(gòu)。
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2.(2023·河北唐山高三模擬)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可以按照人們的意愿精準(zhǔn)剪切、改變?nèi)我獍谢虻倪z傳信息，其原理是由一條單鏈向?qū)NA(sgRNA)引導(dǎo)Cas9蛋白到一個(gè)特定的基因位點(diǎn)進(jìn)行切割，從而達(dá)到基因定點(diǎn)敲除、敲入、突變的目的。通過設(shè)計(jì)向?qū)NA中20個(gè)堿基的識(shí)別序列，可人為選擇DNA上的目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行切割(如圖所示)。請(qǐng)據(jù)圖分析回答下列問題：
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(1)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)中，sgRNA是根據(jù)靶基因設(shè)計(jì)的向?qū)NA，準(zhǔn)確引導(dǎo)Cas9切割與sgRNA配對(duì)的靶基因DNA序列。Cas9借助
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向?qū)NA對(duì)目標(biāo)DNA分子進(jìn)行精準(zhǔn)定位，依賴于____________________
____________________________；Cas9蛋白能對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確切割，是因?yàn)開________________________________________________________
_____________________。
向?qū)NA識(shí)別序列與目標(biāo)DNA之間的堿基互補(bǔ)配對(duì)
Cas9蛋白能識(shí)別特定核苷酸序列并在特定位點(diǎn)斷開磷酸二酯鍵(Cas9蛋白具有專一性)
CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)中，sgRNA是根據(jù)靶基因設(shè)計(jì)的向?qū)NA，能準(zhǔn)確引導(dǎo)Cas9切割與sgRNA配對(duì)的靶基因DNA序列。 Cas9能借助向?qū)NA與
目標(biāo)DNA進(jìn)行精確定位的原因在于向?qū)NA上的堿基序列與目標(biāo)DNA分子上的堿基序列可以通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則實(shí)現(xiàn)向?qū)NA與目標(biāo)DNA分子特定序列的特定識(shí)別，進(jìn)而定位；對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)的切割則依賴于Cas9蛋白的專一識(shí)別，Cas9蛋白能識(shí)別特定核苷酸序列并在特定位點(diǎn)剪切特定的堿基序列，使磷酸二酯鍵斷裂。
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(2)在使用Cas9對(duì)不同目標(biāo)DNA進(jìn)行編輯時(shí)，應(yīng)使用Cas9蛋白和____
(填“相同”或“不同”)的向?qū)NA進(jìn)行基因編輯。在設(shè)計(jì)向?qū)?br/>跟蹤訓(xùn)練
RNA識(shí)別序列時(shí)，若目標(biāo)DNA的α鏈切點(diǎn)附近序列為…GAATCTCCA…，則向?qū)NA上識(shí)別序列為___________________。
不同
…GAAUCUCCA…
(3)已知玉米中賴氨酸含量較低，原因是與賴氨酸合成過程中的兩個(gè)關(guān)鍵酶——天冬氨酸激酶和二氫吡啶二羧酸合成酶的活性，受細(xì)胞內(nèi)賴
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氨酸濃度影響較大。當(dāng)賴氨酸濃度達(dá)到一定量時(shí)就影響這兩種酶的活性，從而使賴氨酸含量很難提高，不能滿足需求?，F(xiàn)使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)天冬氨酸激酶和二氫吡啶二羧酸合成酶基因進(jìn)行改造，
首先需要構(gòu)建由啟動(dòng)子、________
__________________(目的基因)、標(biāo)記基因、終止子等組成的基因表達(dá)載體，然后使用____________法
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導(dǎo)入玉米細(xì)胞，完成轉(zhuǎn)化后CRISPR/Cas9系統(tǒng)可在玉米體細(xì)胞中特定的基因位點(diǎn)改寫遺傳信息，再經(jīng)______________技術(shù)培育成賴氨酸高產(chǎn)的玉米植株。
Cas9蛋白
基因和sgRNA基因
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
植物組織培養(yǎng)解惑練5　CRISPR/Cas9技術(shù)
1．CRISPR/Cas9技術(shù)敲除掉部分基因原理
(1)CRISPR/Cas9是細(xì)菌的一種后天免疫防御機(jī)制——CRISPR序列示意圖如下(其中，菱形框表示高度可變的間隔序列，正方形表示相對(duì)保守的重復(fù)序列)，其中的“間隔序列”來源于病毒或外源質(zhì)粒的一小段DNA，是細(xì)菌對(duì)這些外來入侵者的“記錄”。
(2)病毒或外源質(zhì)粒上存在“原間隔序列”，“間隔序列”正是與它們互相對(duì)應(yīng)?！霸g隔序列”的選取并不是隨機(jī)的，這些原間隔序列的兩端向外延伸的幾個(gè)堿基往往都很保守，我們稱為PAM(原間隔序列臨近基序)。
(3)當(dāng)病毒或外源質(zhì)粒DNA首次入侵到細(xì)菌體內(nèi)時(shí)，細(xì)菌會(huì)對(duì)外源DNA潛在的PAM序列進(jìn)行掃描識(shí)別，將臨近PAM的序列作為候選的“原間隔序列”，將其整合到細(xì)菌基因組上CRISPR序列中的兩個(gè)“重復(fù)序列”之間。這就是“間隔序列”產(chǎn)生的過程。
(4)當(dāng)外源質(zhì)粒或病毒再次入侵宿主菌時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)CRISPR序列的表達(dá)。同時(shí)，在CRISPR序列附近還有一組保守的蛋白編碼基因，稱為Cas基因。CRISPR序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物CRISPR RNA和Cas基因的表達(dá)產(chǎn)物等一起合作，通過對(duì)PAM序列的識(shí)別，以及“間隔序列”與外源DNA的堿基互補(bǔ)配對(duì)，來找到外源DNA上的靶序列，并對(duì)其切割，降解外源DNA。這也就實(shí)現(xiàn)了對(duì)病毒或外源質(zhì)粒再次入侵的免疫應(yīng)答。
2．CRISPR/Cas9技術(shù)的運(yùn)用和發(fā)展
(1)具體運(yùn)用如下圖所示，在待敲除基因的上下游各設(shè)計(jì)一條向?qū)NA(指導(dǎo)RNA)，將其與含有Cas9蛋白編碼基因的質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，向?qū)NA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)可以靶向PAM附近的目標(biāo)序列，Cas9蛋白會(huì)使該基因上下游的DNA雙鏈斷裂。對(duì)于DNA雙鏈的斷裂這一生物事件，生物體自身存在著DNA損傷修復(fù)的應(yīng)答機(jī)制，會(huì)將斷裂上下游兩端的序列連接起來，從而實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞中目標(biāo)基因的敲除。
(2)CRISPR/Cas9基因魔剪：當(dāng)研究人員要用基因魔剪來編輯一個(gè)基因組時(shí)，他們會(huì)人工構(gòu)建一個(gè)指導(dǎo)RNA，它與將要被切割的DNA代碼相匹配。魔剪蛋白Cas9與指導(dǎo)RNA形成復(fù)合物，將魔剪帶到基因組中將要進(jìn)行切割的地方。
(3)原始的CRISPR/Cas9會(huì)由于RNA定位偏差而出現(xiàn)脫靶效應(yīng)，現(xiàn)在通過改進(jìn)，可以大幅降低脫靶效應(yīng)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了一些新的系統(tǒng)，除了最開始的Cas9，后面又找到了Cas12的一系列酶，機(jī)理上有一定不同，但還是用以切割DNA；還有Cas13則用于切割RNA?；贑as12和Cas13的開發(fā)以及機(jī)制研究，又發(fā)展出了新的工具用于快速檢測病毒，效率可以達(dá)到幾分鐘檢測一個(gè)樣品，并且用到了現(xiàn)在的新冠病毒檢測中。
跟蹤訓(xùn)練
1．CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)源于細(xì)菌抵御噬菌體的機(jī)理研究。細(xì)菌被特定噬菌體感染后，細(xì)菌Cas2會(huì)隨機(jī)切斷入侵的噬菌體DNA雙鏈，并將切下的一個(gè)DNA片段(原型間隔序列)插入CRISPR位點(diǎn)(由間隔序列和重復(fù)序列交替排列組成的基因序列)的重復(fù)序列中，構(gòu)成新的間隔序列，形成“免疫記憶”。當(dāng)同種噬菌體再次入侵時(shí)，由CRISPR位點(diǎn)的新的間隔序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的crRNA便會(huì)將另一種蛋白質(zhì)(如Cas9)準(zhǔn)確帶入到入侵者的原間隔序列DNA處，并將之切斷，即“免疫滅殺”。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)中，sgRNA(單向?qū)NA)是根據(jù)靶基因設(shè)計(jì)的引導(dǎo)RNA，準(zhǔn)確引導(dǎo)Cas9切割與sgRNA配對(duì)的靶基因DNA序列，CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯時(shí)，對(duì)DNA序列中的原型間隔序列相鄰基序具有較高的編輯效率，如圖所示?；卮鹣铝袉栴}：
(1)細(xì)菌Cas2基因表達(dá)Cas2的過程需要細(xì)菌提供______________________等原料，Cas2和Cas9在功能上都屬于__________酶，可催化____________鍵水解。
(2)CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的sgRNA與細(xì)菌體內(nèi)的____________功能相同，都可以與相應(yīng)靶基因序列發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)。細(xì)菌利用該防御機(jī)制可以有效抵抗噬菌體的二次入侵，但是仍然會(huì)有部分噬菌體能夠繼續(xù)侵染已經(jīng)獲得免疫能力的宿主菌，原因可能是_________________
_______________________________________________________________________________。
(3)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)存在一定的脫靶效應(yīng)：正常情況下，sgRNA通過20個(gè)核苷酸長度的引導(dǎo)序列與目標(biāo)DNA序列發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)準(zhǔn)確識(shí)別需要編輯的位點(diǎn)，然而有時(shí)會(huì)發(fā)生第18～20個(gè)堿基不匹配的情況，此時(shí)，Cas9可通過一個(gè)手指狀的結(jié)構(gòu)緊緊抓住錯(cuò)配區(qū)穩(wěn)定住RNA－DNA雙鏈，從而為Cas9切割DNA鋪平道路，但這可能會(huì)導(dǎo)致Cas9在錯(cuò)誤的基因位點(diǎn)切割雙鏈DNA，從而引發(fā)潛在風(fēng)險(xiǎn)。請(qǐng)就如何降低脫靶效應(yīng)，提出可能的思路：________________________________________________________________________
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答案　(1)核糖核苷酸和氨基酸　限制性內(nèi)切核酸(或限制)　磷酸二酯　(2)crRNA　噬菌體DNA中的原型間隔序列發(fā)生基因突變，導(dǎo)致CRISPR位點(diǎn)形成的crRNA無法對(duì)其進(jìn)行識(shí)別　(3)設(shè)計(jì)Cas9酶，讓其手指狀結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)離DNA序列，從而在sgRNA和DNA錯(cuò)配時(shí)，不會(huì)用來穩(wěn)定錯(cuò)配結(jié)構(gòu)(合理即可)
解析　(1)基因表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)過程，因此細(xì)菌Cas2基因表達(dá)Cas2的過程需要細(xì)菌提供核糖核苷酸和氨基酸等原料。由題意可知，Cas2和Cas9都能切割DNA，屬于限制性內(nèi)切核酸酶(或限制酶)。限制酶能切割DNA分子，催化磷酸二酯鍵水解。(2)分析題意可知，CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的sgRNA能夠與DNA雜交，其功能與細(xì)菌體內(nèi)的crRNA相似。細(xì)菌“免疫記憶”能夠切割噬菌體的DNA，若其功能失效，可能是細(xì)菌體內(nèi)的crRNA不能正確識(shí)別噬菌體的DNA，即噬菌體的DNA中的原型間隔序列發(fā)生基因突變，導(dǎo)致CRISPR位點(diǎn)形成的crRNA無法對(duì)其進(jìn)行識(shí)別，進(jìn)而導(dǎo)致Cas9不能切割噬菌體的DNA。(3)由題意可知，sgRNA通過20個(gè)核苷酸長度的引導(dǎo)序列與目標(biāo)DNA序列發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)準(zhǔn)確識(shí)別時(shí)，由于第18～20個(gè)堿基不匹配，Cas9可通過一個(gè)手指狀的結(jié)構(gòu)緊緊抓住錯(cuò)配區(qū)穩(wěn)定住RNA－DNA雙鏈，導(dǎo)致錯(cuò)誤切割，故可設(shè)計(jì)Cas9酶，讓其手指狀結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)離DNA序列，從而在sgRNA和DNA錯(cuò)配時(shí)，不會(huì)用來穩(wěn)定錯(cuò)配結(jié)構(gòu)。
2．(2023·河北唐山高三模擬)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可以按照人們的意愿精準(zhǔn)剪切、改變?nèi)我獍谢虻倪z傳信息，其原理是由一條單鏈向?qū)NA(sgRNA)引導(dǎo)Cas9蛋白到一個(gè)特定的基因位點(diǎn)進(jìn)行切割，從而達(dá)到基因定點(diǎn)敲除、敲入、突變的目的。通過設(shè)計(jì)向?qū)NA中20個(gè)堿基的識(shí)別序列，可人為選擇DNA上的目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行切割(如圖所示)。請(qǐng)據(jù)圖分析回答下列問題：
(1)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)中，sgRNA是根據(jù)靶基因設(shè)計(jì)的向?qū)NA，準(zhǔn)確引導(dǎo)Cas9切割與sgRNA配對(duì)的靶基因DNA序列。Cas9借助向?qū)NA對(duì)目標(biāo)DNA分子進(jìn)行精準(zhǔn)定位，依賴于________________________________________________________________________
________________________________________________________________________；Cas9蛋白能對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確切割，是因?yàn)開____________________________________________
_______________________________________________________________________________
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(2)在使用Cas9對(duì)不同目標(biāo)DNA進(jìn)行編輯時(shí)，應(yīng)使用Cas9蛋白和__________(填“相同”或“不同”)的向?qū)NA進(jìn)行基因編輯。在設(shè)計(jì)向?qū)NA識(shí)別序列時(shí)，若目標(biāo)DNA的α鏈切點(diǎn)附近序列為…GAATCTCCA…，則向?qū)NA上識(shí)別序列為__________________________
_______________________________________________________________________________。
(3)已知玉米中賴氨酸含量較低，原因是與賴氨酸合成過程中的兩個(gè)關(guān)鍵酶——天冬氨酸激酶和二氫吡啶二羧酸合成酶的活性，受細(xì)胞內(nèi)賴氨酸濃度影響較大。當(dāng)賴氨酸濃度達(dá)到一定量時(shí)就影響這兩種酶的活性，從而使賴氨酸含量很難提高，不能滿足需求。現(xiàn)使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)天冬氨酸激酶和二氫吡啶二羧酸合成酶基因進(jìn)行改造，首先需要構(gòu)建由啟動(dòng)子、__________________________________(目的基因)、標(biāo)記基因、終止子等組成的基因表達(dá)載體，然后使用____________法導(dǎo)入玉米細(xì)胞，完成轉(zhuǎn)化后CRISPR/Cas9系統(tǒng)可在玉米體細(xì)胞中特定的基因位點(diǎn)改寫遺傳信息，再經(jīng)______________________技術(shù)培育成賴氨酸高產(chǎn)的玉米植株。
答案　(1)向?qū)NA識(shí)別序列與目標(biāo)DNA之間的堿基互補(bǔ)配對(duì)　Cas9蛋白能識(shí)別特定核苷酸序列并在特定位點(diǎn)斷開磷酸二酯鍵(Cas9蛋白具有專一性)　(2)不同　…GAAUCUCCA…　(3)Cas9蛋白基因和sgRNA基因　農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化　植物組織培養(yǎng)
解析　(1)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)中，sgRNA是根據(jù)靶基因設(shè)計(jì)的向?qū)NA，能準(zhǔn)確引導(dǎo)Cas9切割與sgRNA配對(duì)的靶基因DNA序列。Cas9能借助向?qū)NA與目標(biāo)DNA進(jìn)行精確定位的原因在于向?qū)NA上的堿基序列與目標(biāo)DNA分子上的堿基序列可以通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則實(shí)現(xiàn)向?qū)NA與目標(biāo)DNA分子特定序列的特定識(shí)別，進(jìn)而定位；對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)的切割則依賴于Cas9蛋白的專一識(shí)別，Cas9蛋白能識(shí)別特定核苷酸序列并在特定位點(diǎn)剪切特定的堿基序列，使磷酸二酯鍵斷裂。

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