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第四章 基因工程
【課前檢測】
【例1】核移植前應(yīng)增加轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清濃度以提高動(dòng)物克隆成功率（ ）why？
【例2】引物能引導(dǎo)限制酶精準(zhǔn)確定目的基因的位置,其原理是
,限制酶的作用是
【例4】在轉(zhuǎn)基因浮萍的培育過程中,科研人員用 PCR 技術(shù)持異性快速擴(kuò)增了目的基因。已知 PCR 引物序列如圖所示,并在每種引物的5'端設(shè)計(jì)了特定序列
引物1:GGAAGATCTTCCCGCGGATCCATGGACTATA ATGTATGGA
引物2:AAACTGCAGTTAGATTCTAGAGGGAATGA
兩種引物設(shè)計(jì)的依據(jù)是 ,設(shè)計(jì)加下劃線的特定序列的目的是
【基因工程—原理： 】
基因工程的過程：一取二構(gòu)三導(dǎo)入四是表達(dá)與鑒定， 是核心
基因工程的工具：
①限制酶/限制性內(nèi)切核酸酶：主要存在于？
功能？
【例】為什么原核生物的限制酶無法切割自身DNA
【判斷】限制酶只對雙鏈起作用，對單鏈不起作用？
一種限制酶可以識(shí)別多個(gè)序列？
不同的限制酶可以識(shí)別同一序列？ 意義？
【例】目的基因：使用 的限制性內(nèi)切核酸酶切割（注意保證目的基因的完整）——防止
【例】使用 的限制性內(nèi)切核酸酶切割利于目的基因和載體質(zhì)粒的正向連接。
【例】使用 的限制性內(nèi)切核酸酶切割利于目的基因和載體質(zhì)粒的連接。
【例】目的基因利用PCR技術(shù)擴(kuò)增的時(shí)候——為便于能與酶切后的質(zhì)粒連接，引物在設(shè)計(jì)的時(shí)候加入
【例】為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的______端加上限制性酶切位點(diǎn)，且常在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制性酶切位點(diǎn)，主要目的是__________________________ 。
【判斷】限制酶/限制性內(nèi)切核酸酶具有專一性 特異性？
②DNA連接酶——連接DNA片段之間的 鍵——酶具有專一性
種類：T4DNA連接酶——連接
EcoilDNA連接酶——只連接
③載體的種類：
理想載體的特征：
獲取目的基因
——已知目的基因全部序列（適合較短的基因）
基因文庫（未知序列）：（基因組文庫、cDNA文庫）
【例】當(dāng)目的基因序列未知，獲取目的基因時(shí)，可以建立
cDNA文庫：（以抗體基因?yàn)槔┛贵w基因可從 中提取并純化 ，并以此為模板，利用 合成cDNA（單鏈）
——不同組織細(xì)胞的cDNA文庫相同嗎？Why？
【例】胰島素基因的cDNA——只存在于有 細(xì)胞建立的cDNA文庫，
【判斷】胰島素基因只存在于胰島β細(xì)胞嗎 why
【PCR技術(shù)（已知或未知基因序列）——中文： 反應(yīng)】
①PCR技術(shù)原理： ——目的：
②PCR技術(shù)材料：
模板：待擴(kuò)增的 ，
原料：
酶：
引物：
【判斷】2條不同的DNA單鏈——兩個(gè)引物決定擴(kuò)增DNA的起點(diǎn)和終點(diǎn)（ ）why？
【例】一個(gè)基因連續(xù)擴(kuò)增4次，需要幾個(gè)引物？
【例】一個(gè)基因連續(xù)擴(kuò)，第n次時(shí)需要消耗引物Ⅰ_______個(gè)。
若計(jì)劃用1個(gè)目的基因?yàn)槟０瀚@得m（m大于2）個(gè)目的基因，則需要的引物總量是 個(gè)。
【例】目的基因利用PCR技術(shù)擴(kuò)增的時(shí)候——為便于能與酶切后的質(zhì)粒連接，引物在設(shè)計(jì)的時(shí)候加入
③PCR的過程：
：90-95℃高溫—— 鍵斷裂——解旋形成2條DNA單鏈——PCR是否需要解旋酶
：50-60℃降溫——加入 ——與模板堿基配對——形成氫鍵
：72℃適當(dāng)升溫——加入 ——形成 鍵
反復(fù)循環(huán)多次
④PCR的結(jié)果
⑤PCR的應(yīng)用：PCR產(chǎn)物的鑒定—— 技術(shù)——分離、鑒定、純化
【例】若以RNA為模板進(jìn)行PCR，有何優(yōu)勢？如何操作？
【例】在DNA聚合酶的作用下，兩條子鏈的延伸方向都是 。
【例】引物與目的基因模板鏈的 端結(jié)合。
【例】PCR反應(yīng)時(shí)所用引物是人工加入的一小段
體內(nèi)DNA復(fù)制所需引物為RNA聚合酶合成的一小段RNA
基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心
切割目的基因和載體why？
產(chǎn)生 的黏性末端
連接形成重組DNA分子
④可在微生物細(xì)胞中 獲得大量重組質(zhì)粒（建立基因文庫）/PCR技術(shù)體外擴(kuò)增
表達(dá)載體的組成：
①有限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列——利于
②標(biāo)記基因（包括抗性基因/熒光蛋白基因）——便于
③啟動(dòng)子/終止子：轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)/終點(diǎn)——與基因的 有關(guān)
④復(fù)制起點(diǎn)——利于
【例】雙酶切問題 雙標(biāo)記問題 二次酶切問題
【例】雙標(biāo)記問題：與單標(biāo)記相比有什么優(yōu)點(diǎn)？
【雙標(biāo)記問題】
受體細(xì)胞抗抗生素，一定含目的基因？
抗性 插入位置
抗氨芐青霉素不抗四環(huán)素
抗四環(huán)素不抗氨芐青霉素
都抗
【例】使用酶 切割目的基因和質(zhì)粒
導(dǎo)入受體細(xì)胞：
植物： 法
動(dòng)物： 法（導(dǎo)入受精卵/胚胎干細(xì)胞why？）
微生物： 法
①感受態(tài)細(xì)胞法：
處于能吸收周圍環(huán)境中 的狀態(tài)的細(xì)胞(感受態(tài))
原理: 溫， 濃度CaCI2處理大腸桿菌，細(xì)胞體積 。
↓
短暫 處理：使重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞
↓
加入 培養(yǎng)基中（不含抗生素）—— 培養(yǎng)一段時(shí)間why？
②顯微注射法：將 導(dǎo)入 ——經(jīng) 、
培養(yǎng)、 技術(shù)——獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物
③農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：目的基因—— ——導(dǎo)入 的 的
——農(nóng)桿菌 —— 處理的植物細(xì)胞的
——作用完后農(nóng)桿菌要用 殺死（why？）
——（經(jīng)過 培養(yǎng)）——完整植株（原理： ）
轉(zhuǎn)化效率的影響因素？
【例】農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的轉(zhuǎn)化是指？
【例】若植物材料對農(nóng)桿菌不敏感，則可用 的轉(zhuǎn)基因方法。
【例】利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻受體細(xì)胞的過程中，需添加酚類物質(zhì)，其目的是 ______________________。
【例】農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中需將玉米的 Al基因連接到 Ti質(zhì)粒上控制質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移的片段上,原因是___________________________________________________________________________。含有重組DNA的菌體感染植物細(xì)胞的過程中,受 (答出2點(diǎn)即可)的影響。為了便于篩選轉(zhuǎn)基因矮牽牛,Ti質(zhì)粒上還應(yīng)有可表達(dá)
表達(dá)與鑒定
基因表達(dá)——轉(zhuǎn)錄+翻譯：目的基因必需和 部位結(jié)合，構(gòu)建出 載體。
基因剔除——使得被剔除的基因無法表達(dá)
（拓展）完成篩選后，有些需要剔除標(biāo)記基因——防止其流入其他食物導(dǎo)致安全性問題
檢測目的基因是否導(dǎo)入的方法：
檢測目的基因是否表達(dá)的方法：
檢測蛋白質(zhì)—— （使用 作為 探針）
個(gè)體性狀檢測：抗蟲實(shí)驗(yàn)
【例】藥物檢測：如治療新冠的藥物：對經(jīng)治療的個(gè)體進(jìn)行 處理，觀察病癥并測試藥物的
【例】胚胎干細(xì)胞——具有 性——取自 的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)——可以發(fā)育成成體的作用組織和器官
【例】回答與基因工程及植物育種有關(guān)的問題:
Luc基因表達(dá)的熒光素酶能夠催化熒光素產(chǎn)生熒光；啟動(dòng)子和終止子分別是重組質(zhì)粒中啟動(dòng)和終止基因轉(zhuǎn)錄的序列。
若水稻B基因的核苷酸序列已知,可采用化學(xué)合成或 (中文名稱)的方法合成擴(kuò)增目的基因。酶切位點(diǎn)能否選在潮霉素抗性基因中 理由是？
過程①中，應(yīng)在培養(yǎng)基中加人 以篩選含有目的基因的農(nóng)桿菌。
過程②中應(yīng)向培養(yǎng)愈傷組織的培養(yǎng)基中加人 ，以初篩染色體上含有目的基因的愈傷組織。
【例】轉(zhuǎn)入了人胰島素原基因的大腸桿菌，可以合成 ，
轉(zhuǎn)入了人胰島素原基因的酵母菌，可以合成 why？
【例】目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞中不能穩(wěn)定表達(dá)的原因（回答至少3點(diǎn)）
【例】在進(jìn)行基因工程操作時(shí)，若要從植物體中提取幾丁質(zhì)酶的mRNA，常選用嫩葉而不選用老葉作為實(shí)驗(yàn)材料，原因是___________________。提取RNA時(shí)，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是__________________________。
【工程菌和生物反應(yīng)器】
比較項(xiàng)目 工程菌 生物反應(yīng)器
基因結(jié)構(gòu) 必需除去內(nèi)含子 可以不除去內(nèi)含子
基因表達(dá) 無蛋白質(zhì)的加工 有蛋白質(zhì)的加工
受體細(xì)胞 微生物細(xì)胞 動(dòng)物的受精卵
目的方式 感受態(tài)細(xì)胞法 顯微注射法
生產(chǎn)條件 微生物培養(yǎng)環(huán)境 動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境
藥物提取 從微生物細(xì)胞中提取 從動(dòng)物分泌物中提取
【判斷】動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器所用的目的基因的受體細(xì)胞是乳腺細(xì)胞（ ）
膀胱生物反應(yīng)器所用的目的基因的受體細(xì)胞是膀胱細(xì)胞（ ）
【例】與乳腺生物反應(yīng)器相比，用膀胱生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物W的優(yōu)勢在于不受轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的______________（答出2點(diǎn)即可）的限制。
【遷移】以乳腺作為生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)：乳汁可以連續(xù)合成、頻繁采集不會(huì)對動(dòng)物產(chǎn)生危害、乳汁成分相對簡單、明確、便于藥物的提純
【例】由于導(dǎo)入新的外源基因，轉(zhuǎn)基因作物獲得或增強(qiáng) 能力，使其在很多方面都強(qiáng)于親本或野生種。
【基因診斷和基因治療】
基因診斷：判斷患者是否出現(xiàn)了基因異常或攜帶病原體
應(yīng)用：①產(chǎn)前基因診斷——遺傳病
②基因檢測——傳染病
方法:分子雜交技術(shù)
(2)基因治療
①治療疾病:遺傳性疾病
②治療方法:將正常基因?qū)氩∪梭w內(nèi)，使該基因的表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮功能，從而達(dá)到治療疾病的目的。受體細(xì)胞一般為 細(xì)胞導(dǎo)入的載體可以選用？
【例】基因治療過程中，是否需要修復(fù)不正?；?
改良的性狀是否可遺傳給后代
【蛋白質(zhì)工程】
找到相應(yīng)脫氧核苷酸序列←推測氨基酸序列 ←設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)←預(yù)期蛋白質(zhì)功能
【例】（2019江蘇卷·16）下列生物技術(shù)操作對遺傳物質(zhì)的改造，不會(huì)遺傳給子代的是（ ）
A．將胰島素基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，篩選獲得基因工程菌
B．將花青素代謝基因?qū)胫参矬w細(xì)胞，經(jīng)組培獲得花色變異植株
C．將腸乳糖酶基因?qū)肽膛Ｊ芫?，培育出產(chǎn)低乳糖牛乳的奶牛
D．將腺苷酸脫氨酶基因轉(zhuǎn)入淋巴細(xì)胞后回輸患者，進(jìn)行基因治療
【例】煙草DNA分子被“嫁接”上或“切割”掉某個(gè)基因，但并不影響該基因的表達(dá)，從基因功能角度考慮，說明____________________________。
【例】真核生物基因(目的基因)在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，表達(dá)出的蛋白質(zhì)可能會(huì)被降解。為防止蛋白質(zhì)被降解，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選用 的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，在蛋白質(zhì)純化的過程中應(yīng)添加 的抑制劑。
【例】圖1表示某質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有氨芐青霉素抗性基因(Ampr)和LacZ基因，LacZ基因能合成β－半乳糖苷酶，該酶能將白色底物X－Gal轉(zhuǎn)化為藍(lán)色產(chǎn)物。圖2表示含目的基因的DNA片段，實(shí)驗(yàn)小組利用該質(zhì)粒為載體將目的基因?qū)氪竽c桿菌，并篩選成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞(ScaⅠ、ApaⅠ、EcoRⅠ表示限制性核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn))。請回答下列問題：
(1)構(gòu)建重組DNA分子的目的是_____________________________________。在構(gòu)建重組DNA分子時(shí)應(yīng)選用的限制性核酸內(nèi)切酶是_______________________。
(2)將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌時(shí)，應(yīng)用______處理大腸桿菌，制備感受態(tài)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)室選用微生物作為受體細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)是_______________________________________________。
(3)重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌后，應(yīng)將大腸桿菌置于以X－Gal為底物，并添加___________的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑選出______(A.白色　B.藍(lán)色)菌落。
(4)檢測目的基因是否成功導(dǎo)入受體細(xì)胞常用的方法是__________________________，該方法依據(jù)的原理是_________________。
【例】為獲取YCF1基因，將酵母細(xì)胞的全部DNA提取、切割后與載體連接，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，這個(gè)群體稱為______________________。
【例】研究者進(jìn)一步獲得了轉(zhuǎn)YCF1基因的不育楊樹株系，采用不育株系作為實(shí)驗(yàn)材料的目的是________________________________________________
【例】相較于草本植物，采用楊樹這種喬木作為Cd污染土壤修復(fù)植物的優(yōu)勢在于___________（寫出兩點(diǎn)即可）。
【例】與植物組織培養(yǎng)相比，雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)需要特殊的成分，如
【判斷】Taq酶沒有特異性，與普通的DNA聚合酶相比，Taq酶更耐高溫（ ）
【例】對克隆到的C1酶基因測序，與數(shù)據(jù)庫中的C1酶基因編碼序列相比有兩個(gè)堿基對不同，但兩者編碼出的蛋白的氨基酸序列相同，這是因?yàn)開______________。
【例】（1）用生物技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因小鼠的過程中，通常把目的基因轉(zhuǎn)入雄原核而不是雌原核，從兩者形態(tài)差異上分析，原因是______________。
（3）若目的基因的表達(dá)產(chǎn)物是某種特定的蛋白質(zhì)，檢測目的基因在子代轉(zhuǎn)基因小鼠中是否成功表達(dá)，常用的分子檢測方法是______________，檢測的基本思路是_________________。第四章 基因工程
【課前檢測】
【例1】核移植前應(yīng)增加轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清濃度以提高動(dòng)物克隆成功率（ ）why？
答案：（x）why？在移植過程中無需提高血清濃度,動(dòng)物培養(yǎng)液中血清的作用是保證細(xì)胞能夠順利生長和增殖,屬于營養(yǎng)物質(zhì)
【例2】引物能引導(dǎo)限制酶精準(zhǔn)確定目的基因的位置,其原理是
,限制酶的作用是
答案：引物與目的基因能夠進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對，特異性識(shí)別特定的核苷酸序列并在特定位置切割磷酸二酯鍵
【例2】在轉(zhuǎn)基因浮萍的培育過程中,科研人員用 PCR 技術(shù)持異性快速擴(kuò)增了目的基因。已知 PCR 引物序列如圖所示,并在每種引物的5'端設(shè)計(jì)了特定序列
引物1:GGAAGATCTTCCCGCGGATCCATGGACTATA ATGTATGGA
引物2:AAACTGCAGTTAGATTCTAGAGGGAATGA
兩種引物設(shè)計(jì)的依據(jù)是 ,設(shè)計(jì)加下劃線的特定序列的目的是
答案：兩種引物設(shè)計(jì)的依據(jù)是目的基因兩端的部分 DNA 序列,設(shè)計(jì)加下劃線的特定序列的目的是使擴(kuò)增出的目的基因兩端含有相應(yīng)限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)
【基因工程—原理：基因重組，構(gòu)建基因表達(dá)載體——核心】
①限制酶/限制性內(nèi)切核酸酶：主要存在于？細(xì)菌
功能？特異性識(shí)別特定的核苷酸序列并在特定位置切割磷酸二酯鍵
【例】為什么原核生物的限制酶無法切割自身DNA
答案：1.無限制酶識(shí)別的相應(yīng)的核苷酸序列2.DNA經(jīng)化學(xué)修飾
【判斷】限制酶只對雙鏈起作用，對單鏈不起作用？√
一種限制酶可以識(shí)別多個(gè)序列？√
不同的限制酶可以識(shí)別同一序列？√ 意義？適應(yīng)不同的反應(yīng)體系的溫度、pH
【例】目的基因：使用 兩種 的限制性內(nèi)切核酸酶切割（注意保證目的基因的完整）
——防止目的基因自身環(huán)化和反向連接
【例】使用 相同的兩種 的限制性內(nèi)切核酸酶切割利于目的基因和載體質(zhì)粒的正向連接。
【例】使用 相同 的限制性內(nèi)切核酸酶切割利于目的基因和載體質(zhì)粒的連接。
②DNA連接酶——連接DNA片段之間的氫鍵——酶具有專一性
種類：T4DNA連接酶——連接 黏性末端和平末端
EcoilDNA連接酶——只連接 黏性末端
③載體的種類：質(zhì)粒/噬菌體——受體細(xì)胞：細(xì)菌
植物病毒——受體細(xì)胞：植物細(xì)胞
動(dòng)物病毒——受體細(xì)胞：動(dòng)物細(xì)胞
理想載體的特征：1.復(fù)制起點(diǎn)2.有限制酶的識(shí)別序列3.具有篩選作用的目的基因
獲取目的基因
化學(xué)合成法/PCR技術(shù) ——已知目的基因全部序列（適合較短的基因）
基因文庫——未知目的基因序列：（基因組文庫、cDNA文庫）
【例】當(dāng)目的基因序列未知，獲取目的基因時(shí)，可以建立
cDNA文庫：（以抗體基因?yàn)槔┛贵w基因可從B淋巴細(xì)胞/效應(yīng)B淋巴細(xì)胞中提取并純化全部mRNA，并以此為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA（單鏈）
——不同組織細(xì)胞的cDNA文庫是不同的，why？同一組織細(xì)胞在不同的發(fā)育階段，cDNA文庫也會(huì)有差異——原因：基因的選擇性表達(dá)
胰島素基因的cDNA——只存在于有胰島β細(xì)胞建立的cDNA文庫，
【判斷】胰島素基因只存在于胰島β細(xì)胞——x（一般來說，同一個(gè)體所有細(xì)胞的核遺傳信息相同）
3.【PCR技術(shù)（已知或未知基因序列）—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)—體外擴(kuò)增DNA—增加基因含量】
PCR以待擴(kuò)增DNA為模板，原理：dNTP(脫氧核苷三磷酸)，耐高溫的TaqDNA聚合酶
引物：2條不同的DNA單鏈——兩個(gè)引物決定擴(kuò)增DNA的起點(diǎn)和終點(diǎn)（√）
一個(gè)基因連續(xù)擴(kuò)增4次，需要幾個(gè)引物？2*4x2-2=30
【例】一個(gè)基因連續(xù)擴(kuò)，第n次時(shí)需要消耗引物Ⅰ___ 2n-1____個(gè)。
若計(jì)劃用1個(gè)目的基因?yàn)槟０瀚@得m（m大于2）個(gè)目的基因，則需要的引物總量是 2m-2 個(gè)。
【例】（拓展目的基因利用PCR技術(shù)擴(kuò)增的時(shí)候——為便于能與酶切后的質(zhì)粒連接，引物在設(shè)計(jì)的時(shí)候加入 限制酶識(shí)別特定的核苷酸序列 ）
PCR的過程：
變性：90-95℃高溫——?dú)滏I斷裂——解旋形成2條DNA單鏈——PCR不需要解旋酶
退火：50-60℃降溫——加入引物——與模板堿基配對——形成氫鍵
延伸：72℃適當(dāng)升溫——加入TaqDNA聚合酶、dNTP——形成磷酸二酯鍵
反復(fù)循環(huán)多次
④PCR的結(jié)果
PCR產(chǎn)物的鑒定——DNA分子雜交/核酸分子雜交/電泳技術(shù)——分離、鑒定、純化核酸和蛋白質(zhì)
基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心
相同兩種限制酶 切割目的基因和載體
產(chǎn)生 2種 的黏性末端
DNA連接酶 連接形成重組DNA分子
④可在微生物細(xì)胞中擴(kuò)增（無性生殖）獲得大量重組質(zhì)粒（建立基因文庫）/PCR技術(shù)體外擴(kuò)增
表達(dá)載體的組成：
①有限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列——利于限制酶識(shí)別與切割，利于與目的基因的連接
②標(biāo)記基因（包括抗性基因/熒光蛋白基因）——便于篩選
③啟動(dòng)子/終止子：轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)/終點(diǎn)——與基因的表達(dá)有關(guān)
④復(fù)制起點(diǎn)——利于目的基因的擴(kuò)增
雙酶切問題 雙標(biāo)記問題 二次酶切問題
（拓展）雙標(biāo)記問題：——確保目的基因?qū)胭|(zhì)粒
與單標(biāo)記相比，如將目的基因插入抗四環(huán)素抗性基因里面，
該微生物表現(xiàn)抗青霉素，不抗四環(huán)素——導(dǎo)入成功
抗青霉素，抗四環(huán)素——未導(dǎo)入
雙標(biāo)記問題：使用酶I+II (1個(gè)用于標(biāo)記，1個(gè)用于插入目的基因——保證構(gòu)建的重組質(zhì)粒夠利用標(biāo)記基因篩選出來)
導(dǎo)入受體細(xì)胞：植物：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 動(dòng)物：顯微注射法（導(dǎo)入受精卵/胚胎干細(xì)胞——具有發(fā)育的全能性） 微生物：感受態(tài)細(xì)胞法
感受態(tài)細(xì)胞法：
處于能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的狀態(tài)的細(xì)胞(感受態(tài))
原理:低溫，低濃度CaCI2處理大腸桿菌，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞膜通透性變大 。
①低溫，低濃度CaCI2處理：Ca2+幫助DNA吸附在細(xì)胞膜上
↓
②短暫熱刺激處理：使重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞
加入液體培養(yǎng)基中（不含抗生素）——搖床慢速培養(yǎng)一段時(shí)間（恢復(fù)正常狀態(tài)）
顯微注射法：將重組DNA分子導(dǎo)入受精卵——經(jīng)胚激活、胚胎體外培養(yǎng)、胚胎移植技術(shù)——獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：目的基因——經(jīng)感受態(tài)細(xì)胞法——導(dǎo)入農(nóng)桿菌——農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒的T-DNA攜帶目的基因——農(nóng)桿菌侵染——?jiǎng)?chuàng)傷處理的植物細(xì)胞的染色體/基因組DNA中——作用完后農(nóng)桿菌要用抗生素殺死（防止農(nóng)桿菌大量繁殖對植物細(xì)胞的破壞）——處理后的植物細(xì)胞——（經(jīng)過植物組織培養(yǎng)）——完整植株（植物細(xì)胞的全能性）
（拓展）受體細(xì)胞的要求：優(yōu)良性狀、較高的遺傳穩(wěn)定性、全能性表達(dá)充分、易被農(nóng)桿菌侵染
3.對受體細(xì)胞的要求：受體細(xì)胞繁殖快，能表達(dá)轉(zhuǎn)入的基因，最好是一種缺陷型，轉(zhuǎn)入基因后才能存活，方便篩選，安全無污染
【例】若植物材料對農(nóng)桿菌不敏感，則可用 顯微注射法 的轉(zhuǎn)基因方法。
【例】利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻受體細(xì)胞的過程中，需添加酚類物質(zhì)，其目的是____吸引農(nóng)桿菌，利于農(nóng)桿菌入侵植物細(xì)胞______________________。
四、表達(dá)與鑒定
基因表達(dá)——轉(zhuǎn)錄+翻譯：目的基因必需和啟動(dòng)子部位結(jié)合，構(gòu)建出特異性表達(dá)載體。
基因剔除——使得被剔除的基因無法表達(dá)
（拓展）完成篩選后，有些需要剔除標(biāo)記基因——防止其流入其他食物導(dǎo)致安全性問題
檢測目的基因是否導(dǎo)入的方法：PCR技術(shù)/核酸分子雜交
檢測目的基因是否表達(dá)的方法：檢測RNA——核酸分子雜交
檢測蛋白質(zhì)——抗原—抗體雜交（使用單克隆抗體作為特異性探針）
個(gè)體性狀檢測：抗蟲實(shí)驗(yàn)
（藥物檢測）：如治療新冠的藥物：對經(jīng)治療的個(gè)體進(jìn)行感染新型冠狀病毒處理，觀察病癥并測試藥物的活性/敏感性
（胚胎干細(xì)胞）——具有發(fā)育的全能性——取自囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)——可以發(fā)育成成體的作用組織和器官
（胚胎分割）切割針/胰蛋白酶酶解法——處理內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（囊胚期不能使用酶解法）
【例】轉(zhuǎn)入了人胰島素原基因的大腸桿菌，可以合成人胰島素原，
轉(zhuǎn)入了人胰島素原基因的酵母菌，可以合成胰島素why？酵母菌中含有高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，可以對蛋白質(zhì)經(jīng)進(jìn)一步加工后可獲得具有生物活性的胰島素。
【例】目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞中不能穩(wěn)定表達(dá)的原因：
沒有啟動(dòng)子、終止子、沒有復(fù)制原點(diǎn)、沒有拼接到受體細(xì)胞DNA上
【例】在進(jìn)行基因工程操作時(shí)，若要從植物體中提取幾丁質(zhì)酶的mRNA，常選用嫩葉而不選用老葉作為實(shí)驗(yàn)材料，原因是___________________。提取RNA時(shí)，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是__________________________。
【答案】（1）嫩葉組織細(xì)胞易破碎 防止RNA降解
【工程菌和生物反應(yīng)器】
比較項(xiàng)目 工程菌 生物反應(yīng)器
基因結(jié)構(gòu) 必需除去內(nèi)含子 可以不除去內(nèi)含子
基因表達(dá) 無蛋白質(zhì)的加工 有蛋白質(zhì)的加工
受體細(xì)胞 微生物細(xì)胞 動(dòng)物的受精卵
目的方式 感受態(tài)細(xì)胞法 顯微注射法
生產(chǎn)條件 微生物培養(yǎng)環(huán)境 動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境
藥物提取 從微生物細(xì)胞中提取 從動(dòng)物分泌物中提取
【判斷】動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器所用的目的基因的受體細(xì)胞是乳腺細(xì)胞 x
膀胱生物反應(yīng)器所用的目的基因的受體細(xì)胞是膀胱細(xì)胞 x
【例】與乳腺生物反應(yīng)器相比，用膀胱生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物W的優(yōu)勢在于不受轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的______________（答出2點(diǎn)即可）的限制。
答案：性別+發(fā)育時(shí)期
一般來說，在同一動(dòng)物個(gè)體中，乳腺上皮細(xì)胞與膀胱上皮細(xì)胞的細(xì)胞核中染色體DNA所含的遺傳信息________________（填相同或不同），原因是_________。
答案：相同，來源于同一個(gè)受精卵
【例】以乳腺作為生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)：
答案：乳汁可以連續(xù)合成、頻繁采集不會(huì)對動(dòng)物產(chǎn)生危害、乳汁成分相對簡單、明確、便于藥物的提純
【例】由于導(dǎo)入新的外源基因，轉(zhuǎn)基因作物獲得或增強(qiáng)生存競爭和繁殖能力，使其在很多方面都強(qiáng)于親本或野生種。
【基因診斷和基因治療】
基因診斷：判斷患者是否出現(xiàn)了基因異?；驍y帶病原體
應(yīng)用：①產(chǎn)前基因診斷——遺傳病
②基因檢測——傳染病
方法:分子雜交技術(shù)
(2)基因治療
①治療疾病:遺傳性疾病
②治療方法:將正?；?qū)氩∪梭w內(nèi)，使該基因的表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮功能，從而達(dá)到治療疾病的目的。受體細(xì)胞一般為體細(xì)胞而不是受精卵，基因治療后只有一部分細(xì)胞含有正?；颉?dǎo)入的載體可以選用？經(jīng)修飾過的病毒，如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒
【例】基因治療過程中，是否需要修復(fù)不正?；?不能
改良的性狀是否可遺傳給后代 不能
【蛋白質(zhì)工程】
找到相應(yīng)脫氧核苷酸序列←推測氨基酸序列 ←設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)←預(yù)期蛋白質(zhì)功能
【例】（2019江蘇卷·16）下列生物技術(shù)操作對遺傳物質(zhì)的改造，不會(huì)遺傳給子代的是（ ）
A．將胰島素基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，篩選獲得基因工程菌
B．將花青素代謝基因?qū)胫参矬w細(xì)胞，經(jīng)組培獲得花色變異植株
C．將腸乳糖酶基因?qū)肽膛Ｊ芫?，培育出產(chǎn)低乳糖牛乳的奶牛
D．將腺苷酸脫氨酶基因轉(zhuǎn)入淋巴細(xì)胞后回輸患者，進(jìn)行基因治療
【答案】D
【例】煙草DNA分子被“嫁接”上或“切割”掉某個(gè)基因，但并不影響該基因的表達(dá)，從基因功能角度考慮，說明____________________________。
答案：基因時(shí)控制生物性狀的結(jié)構(gòu)和功能單位，具有相對獨(dú)立性
【例】真核生物基因(目的基因)在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，表達(dá)出的蛋白質(zhì)可能會(huì)被降解。為防止蛋白質(zhì)被降解，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選用__蛋白酶缺陷型　____的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，在蛋白質(zhì)純化的過程中應(yīng)添加____蛋白酶__的抑制劑。
17.(2019·嘉善高二檢測)圖1表示某質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有氨芐青霉素抗性基因(Ampr)和LacZ基因，LacZ基因能合成β－半乳糖苷酶，該酶能將白色底物X－Gal轉(zhuǎn)化為藍(lán)色產(chǎn)物。圖2表示含目的基因的DNA片段，實(shí)驗(yàn)小組利用該質(zhì)粒為載體將目的基因?qū)氪竽c桿菌，并篩選成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞(ScaⅠ、ApaⅠ、EcoRⅠ表示限制性核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn))。請回答下列問題：
（1）構(gòu)建重組DNA分子的目的是_______使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定地復(fù)制并表達(dá)_。在構(gòu)建重組DNA分子時(shí)應(yīng)選用的限制性核酸內(nèi)切酶是ApaⅠ和EcoRⅠ__
(2)將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌時(shí)，應(yīng)用_氯化鈣_______處理大腸桿菌，制備感受態(tài)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)室選用微生物作為受體細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)是____繁殖速度快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對較少　
(3)重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌后，應(yīng)將大腸桿菌置于以X－Gal為底物，并添加_____氨芐青霉素　_________的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑選出___A　_____(A.白色　B.藍(lán)色)菌落。
(4)檢測目的基因是否成功導(dǎo)入受體細(xì)胞常用的方法是____DNA分子雜交技術(shù)________________________，該方法依據(jù)的原理是____堿基互補(bǔ)配對__。
【例】為獲取YCF1基因，將酵母細(xì)胞的全部DNA提取、切割后與載體連接，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，這個(gè)群體稱為_______基因組文庫___。
【例】研究者進(jìn)一步獲得了轉(zhuǎn)YCF1基因的不育楊樹株系，采用不育株系作為實(shí)驗(yàn)材料的目的是______ 避免目的基因在自然界中的擴(kuò)散
【例】相較于草本植物，采用楊樹這種喬木作為Cd污染土壤修復(fù)植物的優(yōu)勢在于___________（寫出兩點(diǎn)即可）。
楊樹具有發(fā)達(dá)的根系和高大的樹冠，更適應(yīng)污染礦區(qū)等不良環(huán)境，同時(shí)可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便運(yùn)輸、利用
【例】與植物組織培養(yǎng)相比，雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)需要特殊的成分，如胰島素和動(dòng)物血清。
【判斷】Taq酶沒有特異性，與普通的DNA聚合酶相比，Taq酶更耐高溫（x）
【例】對克隆到的C1酶基因測序，與數(shù)據(jù)庫中的C1酶基因編碼序列相比有兩個(gè)堿基對不同，但兩者編碼出的蛋白的氨基酸序列相同，這是因?yàn)橐环N氨基酸可能對應(yīng)多種密碼子，發(fā)生堿基的改變?nèi)匀痪幋a同一種氨基酸 （基因突變發(fā)生在非編碼區(qū)或密碼子有簡并性）
【例】（1）用生物技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因小鼠的過程中，通常把目的基因轉(zhuǎn)入雄原核而不是雌原核，從兩者形態(tài)差異上分析，原因是雄原核比雌原核略大，在顯微鏡下容易操作_。
（3）若目的基因的表達(dá)產(chǎn)物是某種特定的蛋白質(zhì)，檢測目的基因在子代轉(zhuǎn)基因小鼠中是否成功表達(dá)，常用的分子檢測方法是_______，檢測的基本思路是_________________。
答案：抗原–抗體雜交技術(shù) 從子代轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原–抗體雜交，若有雜交帶出現(xiàn)，表明小鼠內(nèi)存在相應(yīng)的蛋白質(zhì)，即目的基因成功表達(dá)。

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