資源簡介

(共128張PPT)
第6課時
基因工程的基本工具和基本操作程序
課標要求
1.闡明DNA重組技術的實現需要利用限制性內切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。
2.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞和目的基因及其表達產物的檢測鑒定等步驟。
3.按照實驗操作步驟，進行DNA的粗提取與鑒定實驗。
4.利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增DNA片段并完成電泳鑒定，或運用軟件進行虛擬PCR實驗。
考點一　基因工程的基本操作工具
考點二　基因工程的基本操作程序
考點三　PCR技術、電泳鑒定及DNA的粗提取和鑒定
內容索引
重溫高考 真題演練
課時精練
考點一
基因工程的基本操作工具
1.基本工程的概念
(1)供體：提供 。
(2)操作環境： 。
(3)操作水平： 水平。
(4)原理： 。
(5)受體：表達目的基因。
(6)本質：性狀在 體內的表達。
歸納 夯實必備知識
外源目的基因
體外
分子
基因重組
受體
拓展
基因工程的理論基礎
2.重組DNA技術的基本工具
(1)限制性內切核酸酶(也稱“限制酶”)
特定的脫氧核苷酸
序列
磷酸二酯鍵
黏性末端
(2)DNA連接酶
磷酸二酯鍵
大腸桿菌
黏性末端
黏性末端
(3)載體
λ噬菌體的衍生物
復制原點
圖解限制酶的選擇原則
延伸應用
(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。
(2)保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點原則：質粒作為載體必須具備標記基因，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中不選擇SmaⅠ。
圖解限制酶的選擇原則
延伸應用
(3)確保出現相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶，如圖甲中PstⅠ；為避免目的基因和質粒自身環化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。
考向　基因工程的基本工具
1.下表為常用的限制性內切核酸酶(限制酶)及其識別序列和切割位點，由此推斷，下列說法錯誤的是
突破 強化關鍵能力
限制酶名稱 識別序列和切割位點 限制酶名稱 識別序列和切割位點
BamH Ⅰ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoR Ⅰ C↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
Hind Ⅱ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
注：Y為C或T，R為A或G。
限制酶名稱 識別序列和切割位點 限制酶名稱 識別序列和切割位點
BamH Ⅰ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoR Ⅰ C↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
Hind Ⅱ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
A.HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶切割后形成平末端
B.Sau3AⅠ限制酶的切割位點在識別序列的外部
C.BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種限制酶切割后形成相同的黏性末端
D.一種限制酶一定只能識別一種核苷酸序列
√
限制酶名稱 識別序列和切割位點 限制酶名稱 識別序列和切割位點
BamH Ⅰ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoR Ⅰ C↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
Hind Ⅱ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶沿著中軸線切口切開，切割后形成平末端，A正確；
Sau3AⅠ限制酶識別GATC序列，切割位點在識別序列的外部，B正確；
限制酶名稱 識別序列和切割位點 限制酶名稱 識別序列和切割位點
BamH Ⅰ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoR Ⅰ C↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
Hind Ⅱ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
BamHⅠ限制酶識別GGATCC序列，Sau3AⅠ限制酶識別GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC，C正確；
HindⅡ能識別GTCAAC，也能識別GTTAAC，D錯誤。
2.(多選)第三代疫苗——DNA疫苗是指將編碼保護性抗原蛋白的基因(如圖甲)插入到適宜的質粒(如圖乙)中得到的重組DNA分子，將其導入人體內，在人體細胞內表達的產物可直接誘導機體免疫應答，且可持續一段時間。限制性內切核酸酶的切點分別是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析錯誤的是
A.構建DNA疫苗時，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和質粒
B.圖乙中只用EcoRⅠ切割后的質粒，含有1個游離的磷酸基團
C.用EcoRⅠ切割目的基因和質粒，再用DNA連接酶連接，只產生1種連接
產物
D.抗原基因在體內表達時不需要解旋酶
√
√
從圖甲看出，用EcoRⅠ切割目的基因后兩端各有一個切口，與圖乙中EcoRⅠ切口對接時，可有兩種可能，即可產生兩種重組DNA，C項錯誤；
基因表達包括轉錄和翻譯，轉錄時不需要解旋酶，在RNA聚合酶的作用下，DNA即可解旋，D項正確。
3.下列有關基因工程中載體的說法，正確的是
A.在進行基因工程操作中，被用作載體的質粒都是天然質粒
B.所有的質粒都可以作為基因工程中的載體
C.質粒是一種獨立于細菌染色體外的鏈狀DNA分子
D.作為載體的質粒DNA分子上應有對重組DNA進行鑒定和選擇的標記
基因
√
在進行基因工程操作中，被用作載體的質粒是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的，A錯誤；
具有一至多個限制酶切點、具有標記基因的質粒才可以作為基因工程中的載體，B錯誤；
質粒是一種獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外的環狀DNA分子，C錯誤；
作為載體的質粒DNA分子上應有對重組DNA進行鑒定和選擇的標記基因，而且能在受體細胞中復制并穩定保存，D正確。
考點二
基因工程的基本操作程序
歸納 夯實必備知識
1.目的基因的獲取
(1)化學合成法直接人工合成目的基因：一般為比較小的目的基因。
(2)基因文庫獲取目的基因：來源可分為 文庫和 文庫。
①基因組文庫：指含有某種生物體 基因片段的 的克隆群體。從基因組文庫中篩選某種目的基因，一般采用 。
②cDNA文庫：從組織細胞中提取 ，逆轉錄成cDNA，與適當載體連接后轉化宿主，包含著細胞全部 克隆集合稱為該組織細胞的cDNA文庫。
基因組
cDNA
全部
重組DNA
核酸探針雜交法
mRNA
mRNA信息的cDNA
2.基因表達載體的構建
(1)目的：使目的基因進入_____________________________________
。
受體細胞并有效表達，而且要能穩定存在
且遺傳給后代
(2)基因表達載體的組成及作用
RNA聚合酶
標記基因
啟動子
(3)構建過程
易錯提醒
啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比
項目 啟動子 終止子 起始密碼子 終止密碼子
本質 ______ ______ _______ _______
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA 使轉錄在所需要的地方停下來 翻譯的起始信號(編碼氨基酸) 翻譯的結束信號(不編碼氨基酸)
DNA
DNA
mRNA
mRNA
3.將目的基因導入受體細胞
生物種類 植物 哺乳動物 微生物
常用方法 農桿菌轉化法 顯微注射法 處理法
受體細胞 _______________ _______ 原核細胞
轉化過程 將目的基因插入Ti質粒的T－DNA中→農桿菌→導入植物細胞→整合到受體細胞的染色體DNA上→表達 取卵→將含有目的基因的表達載體注入→受精卵發育→獲得具有新性狀的動物 Ca2＋處理細胞→細胞處于一種容易接受外來DNA的生理狀態→基因表達載體導入
體細胞或受精卵
受精卵
Ca2＋
辨析
(1)農桿菌轉化法中的兩次拼接和兩次導入
第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的 上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受體細胞的_______
上；第一次導入是將含目的基因的Ti質粒導入 ，第二次導入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA導入 。
T－DNA
染色體
DNA
農桿菌
受體細胞
辨析
(2)農桿菌特點
①能在自然條件下感染 和 ，而對大多數_____
沒有感染能力。
②農桿菌細胞內含有 ，當它侵染植物細胞后，能將Ti質粒上的T－DNA轉移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色體DNA上。
雙子葉植物
裸子植物
單子
葉植物
Ti質粒
4.目的基因及其表達產物的檢測鑒定
考向　基因工程的基本操作程序
4.戊型肝炎病毒是一種RNA病毒，ORF2基因編碼的結構蛋白(pORF2)位于病毒表面，構成病毒的衣売。我國科研人員利用基因工程技術，在大腸桿菌中表達pORF2，制備戊型肝炎疫苗，過程如圖。下列關于該疫苗的敘述，正確的是
突破 強化關鍵能力
A.過程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是A、U、G、C
B.重組基因表達載體上的啟動子需來源于戊型肝炎病毒
C.過程⑤需要用聚乙二醇處理大腸桿菌使其處于一種能吸收周圍環境中
DNA分子的生理狀態
D.過程⑥大量制備pORF2蛋白前應做相應的檢測與鑒定
√
戊型肝炎病毒是一種RNA病毒，過程①是以病毒RNA為模板合成DNA，獲取目的基因的過程，需要的酶是逆轉錄酶，原料是四種脫氧核苷酸，A項錯誤；
啟動子是一段有特殊結構的DNA片段，其作用是供RNA聚合酶識別結合以驅動目的基因的轉錄，啟動子具有物種或組織特異性，構建在大腸桿菌細胞內特異表達pORF2蛋白的載體時，需要選擇大腸桿菌細胞的啟動子，而不能選擇其他物種和組織細胞的啟動子，B項錯誤；
將目的基因導入微生物細胞的方法是Ca2＋處理法，需要用Ca2＋處理大腸桿菌，細胞質膜對DNA的通透性會發生改變，使其處于一種容易接受外來DNA的生理狀態，C項錯誤。
5.下列有關基因表達載體的敘述，不正確的是
A.具有復制原點，使目的基因能在受體細胞內擴增
B.具有啟動子，作為多肽鏈合成的起始信號
C.具有標記基因，有利于目的基因的初步檢測
D.具有目的基因，以獲得特定的基因表達產物
√
基因表達載體必須使目的基因能夠在受體細胞內進行表達，具有啟動子(啟動轉錄)，作為RNA合成的起始信號，B錯誤。
6.(2021·全國乙，38)用DNA重組技術可以賦予生物以新的遺傳特性，創造出更符合人類需要的生物產品。在此過程中要使用多種工具酶，其中4種限制性內切核酸酶的切割位點如圖所示。
回答下列問題：
(1)常用的DNA連接酶有E.coli DNA連接酶和T4 DNA連接酶，上圖中______________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA連接酶連接，上圖中_______________________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA連接酶連接。
EcoRⅠ、PstⅠ
EcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcoRⅤ
限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，
E.coli DNA連接酶來源于大腸桿菌，只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來，而T4 DNA連接酶來源于T4噬菌體，可用于連接黏性末端和平末端，但連接效率較低。因此圖中EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E.coli DNA連接酶連接，除了這兩種限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割后的DNA片段(平末端)也可以用T4 DNA連接酶連接。
(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質粒載體片段之間形成的化學鍵是____________。
磷酸二酯鍵
(3)DNA重組技術中所用的質粒載體具有一些特征，如質粒DNA分子上有復制原點，可以保證質粒在受體細胞中能___________；質粒DNA分子上有_______________________，便于外源DNA的插入；質粒DNA分子上有標記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質粒載體的宿主細胞，方法是_______________________________________________
___________________________。
自我復制
一至多個限制酶切割位點
用含有該抗生素的培養基培養宿主細胞，能夠存活的
即為含有質粒載體的宿主細胞
質粒是小型環狀的DNA分子，常作為基因表達的載體，首先質粒上含有復制原點，能保證
質粒在受體細胞中自我復制。質粒DNA分子上有一個至多個限制酶的酶切位點，便于目的基因的導入。質粒上的標記基因是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因，具體做法是用含有該抗生素的培養基培養宿主細胞，能夠存活的即為含有質粒載體的宿主細胞。
(4)表達載體含有啟動子，啟動子是指_____________________________
______________________________________________。
位于基因上游的一段DNA片段，
是RNA聚合酶識別、結合的部位，能驅動轉錄過程
考點三
PCR技術、電泳鑒定及DNA的粗提取和鑒定
歸納 夯實必備知識
1.PCR技術
(1)過程
變性：94 ℃條件下受熱 后解鏈為單鏈
↓
退火：55 ℃條件下， 與單鏈相應互補序列結合
↓
延伸：72 ℃條件下在 作用下合成子鏈
變性
引物
Taq酶
思考分析
①在PCR過程中實際加入的為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作為合成 的原料，又可為DNA的合成提供 。
②引物既可以是DNA單鏈，也可以為 。細胞內的DNA進行復制時，也需要 ，一般為RNA片段。
③真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要 激活。因此，PCR反應緩沖溶液中一般要添加 。
DNA子鏈
能量
RNA單鏈
引物
Mg2＋
Mg2＋
思考分析
④PCR擴增過程中的循環圖示與規律
思考分析
循環次數 1 2 3 n
DNA分子數 2 ___ ___ ___
含引物A(或B)的DNA分子數 1 ___ ___ ______
同時含引物A、B的DNA分子數 0＝21－2 _________ _________ ______
共消耗的引物 數量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1－2 2n＋1－2
4
8
2n
3
7
2n－1
2＝22－2
6＝23－2
2n－2
(2)PCR技術和DNA復制的比較
(3)DNA的電泳鑒定
微量取液器
2.DNA的粗提取和鑒定
(1)基本原理
①原理：利用DNA、RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面的差異，提取DNA，去除其他成分。
②DNA的性質：DNA不溶于 ，但某些蛋白質溶于 ；DNA能溶于2 mol·L－1的 。
③DNA的鑒定：在一定溫度下，DNA遇 試劑會呈現藍色。
酒精
酒精
二苯胺
NaCl溶液
(2)過程
蒸餾水
NaCl
同一方向輕輕
沸水浴
考向一　PCR技術及電泳鑒定
7.(多選)(2023·江蘇南京高三模擬)大引物PCR定點突變常用來研究蛋白質結構改變導致的功能變化。單核苷酸的定點誘變僅需進行兩輪PCR反應即可獲得，第一輪加誘變引物和側翼引物，第一輪產物作第二輪PCR擴增的大引物，過程如圖所示。下列有關敘述錯誤的是
突破 強化關鍵能力
A.PCR擴增的定點誘變產物通常需要連接到載體
分子上才能表達出相應的性狀，需具備啟動子、
終止子等結構才能進行轉錄和翻譯
B.單核苷酸的定點誘變所屬變異類型為基因重組
C.第二輪PCR所用的引物都是第一輪PCR產物DNA
的兩條鏈
D.利用該技術將某功能蛋白的結構改變屬于蛋白質工程
√
√
單核苷酸的定點誘變所屬變異類型為基因突變，B錯誤；
除了第一輪產物作第二輪PCR擴增的大引物外，第二輪PCR仍需加入的引物是另一種側翼引物，以便進行另一條鏈的延伸，C錯誤；
蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系作為基礎，通過改造或合成基因，來改造現有蛋白質，或制造一種新的蛋白質，利用該技術將某功能蛋白的結構改變屬于蛋白質工程，D正確。
8.利用PCR可以在體外進行DNA片段的擴增，下列有關“利用PCR技術擴增DNA片段并完成電泳鑒定”實驗的相關敘述，錯誤的是
A.PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行
高壓蒸汽滅菌處理
B.PCR利用了DNA的熱變性原理
C.PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化
D.在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上
的槍頭都必須更換
√
PCR所用緩沖液和酶從冰箱拿出之后，應放在冰塊上緩慢融化，這樣才能不破壞緩沖液中穩定性較差的成分，同樣保護酶的活性不被破壞，C錯誤。
考向二　DNA的粗提取和鑒定
9.下列有關“DNA粗提取和鑒定”實驗的敘述，正確的是
A.新鮮豬血、菜花等動植物材料均可用于DNA的粗提取
B.選用洋蔥作為實驗材料時可以使用吸水漲破法破壞細胞
C.DNA可溶于蒸餾水，也可溶于2 mol/L的NaCl溶液
D.溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺試劑后，顏色呈紫色
√
豬是哺乳動物，其紅細胞沒有細胞核，所以豬血不能用于DNA的粗提取，A錯誤；
植物材料不能使用吸水漲破法破壞細胞，B錯誤；
DNA不溶于95%的冷酒精，可溶于蒸餾水，也可溶于2 mol/L的NaCl溶液，C正確；
溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺試劑，需沸水浴加熱后冷卻，再觀察顏色(呈藍色)，D錯誤。
四
重溫高考 真題演練
1.(2019·江蘇，10)下列關于DNA粗提取和鑒定的敘述，錯誤的是
A.用同樣方法從等體積兔血和雞血中提取的DNA量相近
B.DNA析出過程中，攪拌操作要輕柔以防DNA斷裂
C.預冷的酒精可用來進一步純化粗提的DNA
D.用二苯胺試劑鑒定DNA需要進行水浴加熱
1
2
3
4
√
5
1
2
3
4
哺乳動物(如兔)成熟的紅細胞中無細胞核和眾多細胞器，不能提取到DNA，故兔血不宜作為該實驗的實驗材料，A錯誤；
為防止DNA斷裂，在DNA析出過程中攪拌操作要輕柔且沿著一個方向，B正確；
DNA不溶于酒精溶液，但是細胞中的某些蛋白質溶于酒精溶液，預冷的酒精溶液可用來進一步純化粗提的DNA，C正確；
在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺呈現藍色，因此，用二苯胺試劑鑒定DNA需要進行沸水浴加熱，D正確。
5
2.(2020·北京，12)為了對重金屬污染的土壤進行生物修復，研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉運蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動子連接，導入楊樹基因組中(如圖)。為檢測獲得的轉基因楊樹苗中是否含有導入的HMA3基因，同時避免內源HMA3基因的干擾，在進行PCR擴增時，應選擇的引物組合是
A.①＋③　　　B.①＋②　　　C.③＋②　　　D.③＋④
√
1
2
3
4
5
引物①擴增的片段含有啟動子和HMA3基因，引物③擴增的片段不含啟動子，引物②擴增的片段既含有啟動子，又含有HMA3基因序列。
圖示中克隆的重金屬轉運蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動子連接，導入楊樹基因組中，若要檢測獲得的轉基因楊樹苗中是否含有導入的HMA3基因和高效啟動子，需要檢測是否含有高效啟動子序列和HMA3基因序列，應選擇的引物組合是①＋②，B正確。
1
2
3
4
5
3.(2020·浙江7月選考，24)下列關于基因工程的敘述，正確的是
A.若受體大腸桿菌含有構建重組質粒時用到的限制性內切核酸酶，則一定有利
于該重組質粒進入受體并保持結構穩定
B.抗除草劑基因轉入某抗鹽植物獲得2個穩定遺傳轉基因品系，抗性鑒定為抗除草
劑抗鹽和抗除草劑不抗鹽。表明一定是抗鹽性的改變與抗除草劑基因的轉入無關
C.抗除草劑基因轉入某植物獲得轉基因植株，其DNA檢測均含目的基因，抗性
鑒定為抗除草劑和不抗除草劑。表明一定是前者表達了抗性蛋白而后者只表
達抗性基因RNA
D.已知不同分子量DNA可分開成不同條帶，相同分子量的為一條帶，用某種限
制性內切核酸酶完全酶切環狀質粒后，出現3條帶。表明該質粒上一定至少有
3個被該酶切開的位置
√
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
基因工程中，若受體大腸桿菌含有構建重組質粒時用到的限制性內切核酸酶(簡稱限制酶)，重組質粒進入大腸桿菌體內后，該限制酶可以切割重組質粒，使重組質粒不能保持結構穩定，A項錯誤；
將抗除草劑基因轉入某抗鹽植物獲得2個穩定遺傳轉基因品系，抗性鑒定為抗除草劑抗鹽和抗除草劑不抗鹽，若抗除草劑基因轉入到抗鹽基因的編碼區，破壞了抗鹽基因，則會出現由抗鹽到不抗鹽的改變，可說明抗鹽性的改變與抗除草劑基因的轉入有關，B項錯誤；
抗除草劑基因轉入某植物獲得轉基因植株，其DNA檢測均含目的基因，抗性鑒定為抗除草劑和不抗除草劑，則前者應表達了抗性蛋白，而后者可能表達了抗性基因RNA但不能進行翻譯過程，也可能沒有表達出抗性基因RNA，C項錯誤；
已知不同分子量DNA可分開成不同條帶，相同分子量的為一條帶，用某種限制性內切核酸酶完全酶切環狀質粒后，出現幾條帶則表明該質粒上一定至少有幾個被酶切開的位置，注意若完全酶切鏈狀DNA后，出現3條帶，則表明該DNA上一定至少有3個被酶切開的位置，D項正確。
1
2
3
4
5
4.(2020·江蘇，33)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側的序列，具體流程如右圖(以EcoR Ⅰ酶切為例)：
請據圖回答問題：
(1)步驟Ⅰ用的EcoRⅠ是一種_________
______________酶，它通過識別特定的___________切割特定位點。
限制性內
切核酸(或限制)
核苷酸序列
步驟Ⅰ用的EcoRⅠ是一種限制性內切核酸酶，它通過識別特定的核苷酸序列來進行切割。
1
2
3
4
5
(2)步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′－羥基與5′－磷酸間形成___________；PCR循環中，升溫到94 ℃是為了獲得_________；Taq酶的作用是催化____________________
_________。
磷酸二酯鍵
DNA單鏈
以DNA為模板的DNA
鏈的延伸
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
步驟Ⅱ中用DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′－羥基與5′－磷酸間形成磷酸二酯鍵。PCR循環中，升溫到94 ℃是為了解開DNA雙鏈獲得DNA單鏈，Taq酶的作用是催化以DNA為模板延伸形成子鏈的過程。
(3)若下表所列為已知的DNA序列和設計的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是______(從引物①②③④中選擇，填編號)。
DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)
已知序列

PCR引物 ①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′
②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′
③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′
④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
②④
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
PCR過程中，根據已知的DNA序列合成兩個引物，要注意模板鏈和引物的方向是相反的，引物的核苷酸序列要能夠和相應模板的核苷酸序列發生堿基互補配對，環狀DNA圖中顯示PCR過程是從已知DNA序列的兩端分別向相反方向形成子鏈，一個引物是與已知DNA序列的第一條鏈的左端互補結合，向右側方向延伸形成子鏈，該引物是④，另一個引物是與已知DNA序列的第二條鏈的右端互補結合，向左側方向延伸形成子鏈，該引物是②。
1
2
3
4
5
(4)對PCR產物測序，經分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列)，結果正確的是_____。
A.5′－AACTATGCG……AGCCCTT－3′
B.5′－AATTCCATG……CTGAATT－3′
C.5′－GCAATGCGT……TCGGGAA－3′
D.5′－TTGATACGC……CGAGTAC－3′
B
1
2
3
4
5
圖中由片段F形成的環狀DNA的未知序列中有一個EcoR Ⅰ限制酶的
切割位點，而EcoRⅠ識別的位點是 ，因此片段F的單鏈中
的一端應含有“AATTC……”序列，另一端應含有“TTAAG……”序列，只有B項符合題意。
5.(2022·江蘇，24)纖毛是廣泛存在的細胞表面結構，功能異?？梢鸲喾N疾病。因此，研究纖毛形成的作用機制具有重要意義。請回答下列問題：
(1)纖毛結構如圖Ⅰ所示，由細胞質膜延伸形成的纖毛膜主要由_________
________組成?；w由中心體轉變而來，中心體在有絲分裂中的功能是_______________________。
磷脂、
蛋白質
發出星射線，形成紡錘體
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
(2)某病人腎小管上皮細胞纖毛異常，為了分析纖毛相關基因X是否發生了變異，對基因X進行了PCR擴增與產物測序。從細胞樣品中分離DNA時，可通過交替調節鹽濃度將與核蛋白結合的DNA分離出來，溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是___________。PCR擴增時，需在__________________________催化下，在引物_____端進行DNA鏈的延伸，獲得擴增產物用于測序。
溶解DNA
熱穩定的DNA聚合酶(Taq酶)
3′
1
2
3
4
5
從細胞樣品中分離DNA時，可通過交替調節鹽濃度將與核蛋白結合的DNA分離出來，DNA在2.0 mol/L的NaCl溶液中的溶解最大，高于或低于這一濃度，DNA的溶解度均會下降，因此實驗過程中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是溶解DNA。PCR擴增時，需在Taq酶的催化下，在引物的3′端進行DNA鏈的延伸，獲得擴增產物用于測序。
(3)為研究蛋白質X在細胞中的定位，構建綠色熒光蛋白GFP與X的融合蛋白，融合蛋白具有綠色熒光，可示其在細胞內位置。將X－GFP基因融合片段M導入如圖Ⅱ所示載體質粒Y，構建Y－M重組質粒(在EcoRV位點插入片段)。
1
2
3
4
5
請完成下表。
分步實驗目標 簡易操作、結果、分析
PCR鑒定正向重組質粒Y－M(圖Ⅱ中融合片段M中有白色的箭頭，代表方向) ①選擇圖Ⅱ引物______；
②PCR目的產物約為______bp
確保M及連接處序列正確，Y－M的連接處上游含有Hind Ⅲ＋EcoR V的識別序列，下游含有EcoR V＋BamH Ⅰ的識別序列 ③質粒測序，圖Ⅲ中正確的是____
(選填序列編號)
a、b
1 100
Q3
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
檢測融合蛋白定位 ④對照質粒Y－GFP(僅表達GFP)與實驗質粒Y－M分別導入細胞，發現對照組整個細胞均有綠色熒光，而實驗組熒光集中在纖毛基部，說明_______________________
X蛋白參與中心體的形成
PCR擴增目的DNA片段時，在引物的3′端進行DNA鏈的延伸，據圖可知，應選擇圖Ⅱ中的引物a和引物b，PCR目的產物約為300＋800＝1 100(bp)。為確保M及連接處序列正確，Y－M的連接處上游含有Hind Ⅲ＋EcoR V的識別序列，下游含有EcoR V＋BamH Ⅰ的識別序列，根據題干信息構建Y－M重組質粒(在EcoRV位點插入片段)，Y－M的連接處測序后部分序列應含有Hind Ⅲ和BamH Ⅰ識別位點，
1
2
3
4
5
根據各限制酶識別位點，應選擇序列Q3。對照質粒Y－GFP(僅表達GFP)與實驗質粒Y－M分別導入細胞，發現對照組整個細胞均有綠色熒光，而實驗組熒光集中在纖毛基部，說明蛋白質X參與中心體的組成。
1
2
3
4
5
(4)為研究另一纖毛病相關基因Z表達的變化，采用熒光定量PCR法檢測健康人與病人基因Z的轉錄水平。采集樣本、提取總RNA，經________
形成cDNA作為模板，PCR擴增結果顯示，在總cDNA模板量相等的條件下，健康人Ct值為15，而病人Ct值為20(Ct值是產物熒光強度達到設定閾值時的PCR循環數)。從理論上估算，在PCR擴增20個循環的產物中，健康人樣品的目的產物大約是病人的_____倍。
逆轉錄
32
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
研究另一纖毛病相關基因Z表達的變化，采用熒光定量PCR法檢測健康人與病人基因Z的轉錄水平。采集樣本、提取總RNA，經逆轉錄形成cDNA作為模板，PCR擴增結果顯示，在總cDNA模板量相等的條件下，健康人Ct值為15，而病人Ct值為20(Ct值是產物熒光強度達到設定閾值時的PCR循環數)，說明病人基因Z表達較弱，設健康人Z基因的cDNA數為x，病人Z基因的cDNA數為y，則有x×215＝y×220，從理論上估算，在PCR擴增20個循環的產物中，健康人樣品的目的產物大約是病人的25＝32(倍)。
一、易錯辨析
1.限制酶也可以識別和切割RNA(　　)
2.DNA連接酶能將兩堿基通過氫鍵連接起來(　　)
3.E.coliDNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端(　　)
4.用PCR方法擴增目的基因時需要設計兩種引物(　　)
5.DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精(　　)
6.在凝膠中DNA分子的遷移速率只與DNA分子的大小相關(　　)
五分鐘　查落實
×
×
×
√
√
×
二、填空默寫
1.(選擇性必修3 P87)基因工程：___________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
的技術。
2.(選擇性必修3 P87)限制酶的_____________________________________
______________________________________________________________
。
又稱DNA重組技術，指在體外通過人工
“剪切”和“拼接”等方法，將外源目的基因與載體DNA進行組合形成
重組DNA，然后導入受體細胞，并使其在受體細胞中表達，產生人類
需要的基因產物
特異性很強，能識別DNA分子上特定的脫
氧核苷酸序列，并使每條鏈中特定部位的兩個脫氧核苷酸之間的磷酸
二酯鍵斷開
3.(選擇性必修3 P89)E.coli DNA連接酶，可以用于連接具有 的DNA分子；T4 DNA連接酶，可以用于連接具有 的DNA分子。
4.(選擇性必修3 P90)PCR反應需要在一定的 中才能進行，需提供
、 、4種 和熱穩定的 。
5.(選擇性必修3 P97)基因表達載體除目的基因外，還應該包括__________
等。
6.(選擇性必修3 P98)農桿菌轉化法是________________________________
_______________________________________________________________
。
黏性末端
黏性末端或平末端
緩沖液
DNA模板
引物對
dNTP
DNA聚合酶
復制原點、
啟動子、終止子和標記基因
將目的基因插到農桿菌Ti質粒的T－
DNA特定區段上，再通過T－DNA將其插入受體細胞染色體的DNA上，
使目的基因得到穩定的遺傳和表達
五
課時精練
一、單項選擇題
1.目前研究混雜DNA群體中的特異DNA序列，一般基于兩種不同的方法，即DNA克隆和DNA分子雜交，如圖所示。下列有關敘述錯誤的是
A.方法①需要限制酶和DNA連接酶
B.方法②需要解旋酶和DNA聚合酶
C.方法③需要對探針進行特殊標記
D.方法①②③都遵循堿基互補配對原則
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
方法①中將目的基因與載體切割和連接制成重組DNA，需要限制酶和DNA連接酶，A正確；
方法②體外擴增技術中變性－退火－延伸，不需要解旋酶，B錯誤；
方法③需要對探針進行特殊標記，這樣才能特異性檢測，C正確；
方法①②③都遵循堿基互補配對原則，D正確。
2.(2023·江蘇宿遷高三質檢)如圖表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相關的酶作用位點。下列敘述錯誤的是
A.甲、乙、丙都屬于黏性末端
B.甲、乙片段可形成重組DNA分子，但甲、丙不能
C.DNA連接酶的作用位點在圖乙中b處
D.切割甲的限制酶不能識別由甲、乙片段形成的重組DNA分子
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
甲、乙的黏性末端相同，因此可在DNA連接酶的作用下形成重組DNA分子，但甲、丙的黏性末端不同，它們之間不能形成重組DNA分子，B正確；
DNA連接酶將兩個DNA片段連接為一個DNA分子，作用部位是磷酸二酯鍵，即圖乙中a處，C錯誤；
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
切割甲的限制酶的識別序列為GAATTC∥CTTAAG，而甲、乙片段形成的重組DNA分子序列為GAATTG∥CTTAAC，因此切割甲的限制酶不能識別由甲、乙片段形成的重組DNA分子，D正確。
3.(2023·江蘇南通高三檢測)基因工程利用某目的基因(圖甲)和P1噬菌體載體(圖乙)構建重組DNA。限制性內切核酸酶BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ的酶切位點分別如圖所示。下列分析錯誤的是
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A.構建重組DNA時，可用BglⅡ和
Sau3AⅠ切割目的基因所在片段
和P1噬菌體載體
B.構建重組DNA時，可用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P1
噬菌體載體
C.圖乙中的P1噬菌體載體只用EcoRⅠ切割后，含有兩個游離的磷酸基團
D.用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體，再用DNA連接酶連接，
只能產生一種重組DNA
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
P1噬菌體載體為環狀DNA，其上只含有一個EcoRⅠ的酶切位點，因此用EcoRⅠ切割后，該環狀DNA分子
變為雙鏈DNA分子，因每條鏈各含有一個游離的磷酸基團，故切割后含有兩個游離的磷酸基團，C正確；
由圖甲可知，用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體后形成的黏性末端相同，可任意連接，不止產生一種重組DNA，D錯誤。
4.(2023·江蘇泰州高三調研)引物的設計是影響PCR擴增反應的效率和特異性的關鍵因素，下列相關敘述正確的是
A.引物的堿基數量越少則退火溫度越低、目標DNA獲得率越高
B.根據需要可在引物的5′端添加限制酶識別序列、點突變序列等
C.兩種引物的退火溫度差異較大，可減少引物與模板的非特異性結合
D.引物的GC含量越高，結合特異性越強，越利于目標DNA的擴增
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
退火溫度與時間取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，引物的堿基數量越少，變性時破開的氫鍵越少，則退火溫度越低，但能與引物發生配對的片段就越多，目標DNA獲得率越低，A錯誤；
根據需要可在引物的5′端添加限制酶識別序列、點突變序列等，以便更加準確地獲得目的基因，B正確；
兩種引物的退火溫度差異較大，導致不能同時退火，甚至一條鏈在延伸，一條鏈在退火，可增加引物與模板的非特異性結合，C錯誤；
引物的GC含量越高，結合特異性越強，但GC含量過高，氫鍵越多，不利于退火 ，從而阻礙目標DNA的擴增，D錯誤。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
5.利用PCR技術擴增目的基因，其原理與細胞內DNA復制類似(如下圖所示)。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎。下列敘述錯誤的是
A.用PCR方法擴增目的基因時不必知道
基因的全部序列
B.設計引物時需要避免引物之間形成堿
基互補配對而造成引物自連
C.退火溫度過高可能導致PCR反應得不到任何擴增產物
D.第四輪循環產物中同時含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例為
15/16
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
用PCR方法擴增目的基因時，要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據這一序列合成(兩種)引物，但不必知道基因的全部序列，A正確；
復性的目的是使兩種引物通過堿基互補配對與兩條DNA單鏈結合，因此退火溫度過高可能引起兩種引物不能與兩條DNA單鏈結合，進而導致PCR反應得不到任何擴增產物，C正確；
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
DNA復制為半保留復制，第四輪循環即DNA復制4次，共形成24＝16個DNA分子，其中含有最初模板鏈的2個DNA分子含有引物A或引物B，其余14個DNA分子均含
有引物A和引物B，所以第四輪循環產物中同時含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例為14/16＝7/8，D錯誤。
6.在基因工程操作中，科研人員利用識別兩種不同序列的限制酶(R1和R2)處理基因載體，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結果如圖所示。以下相關敘述中，不正確的是
A.該載體最可能為環形DNA分子
B.兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點
C.限制酶R1與R2的切割位點最短相距200 bp
D.限制酶作用于該載體會導致氫鍵和肽鍵斷裂
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
由題可知，當僅用一種限制酶切割載體時，僅產生一種長度的DNA片段，因此該載體最有可能為環狀DNA分子，A正確；
由題可知，當僅用一種限制酶切割載體時，兩種限制酶切割產生的DNA片段等長，而兩
種限制酶同時切割時則產生兩種長度的DNA片段，所以兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點，B正確；
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
由題可知，兩種限制酶同時切割時則產生600 bp和200 bp兩種長度的DNA片段，所以兩種限制酶的酶切位點至少相距200 bp，C正確；
限制酶切割DNA分子，破壞的是作用位點上兩個脫氧核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵，D錯誤。
7.(2023·江蘇常州高三模擬)如圖是快速RT－PCR過程示意圖，①和②為逆轉錄酶催化的逆轉錄過程，③是PCR過程。據圖分析，下列敘述錯誤的是
A.逆轉錄酶具有DNA聚合酶的能力
B.③PCR過程只需要引物b
C.RT－PCR可檢測基因表達水平
D.RT－PCR可檢測新冠病毒等RNA病毒
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
③PCR過程需要引物a、b，因為后續的模板鏈序列既有與靶RNA一致的，也有與cDNA一致的，B錯誤。
二、多項選擇題
8.ROP蛋白可以參與調節根毛和花粉管的生長。科研人員采用含有GFP (綠色熒光蛋白)基因的載體構建了ROPGFP的質粒，并利用農桿菌轉化法將其轉入植物體內。下列有關敘述正確的是
A.外源基因在植物體中是否表達可通過綠色熒光來檢測
B.GFP基因在植物體中表達說明生物體共用一套密碼子表
C.ROPGFP質粒的構建需用到限制酶、DNA聚合酶和載體等工具
D.利用農桿菌轉化法可以侵染大多數單子葉植物
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
√
√
導入的載體含有GFP(綠色熒光蛋白)基因，可以指導綠色熒光蛋白合成，若在植物體中表達，則可以表現出綠色熒光，A正確；
GFP基因在植物體中表達，GFP基因在受體中也能轉錄、翻譯為綠色熒光蛋白，說明供體和受體都共用一套密碼子表，B正確；
ROPGFP質粒的構建需用到限制酶、DNA連接酶和載體等工具，C錯誤；
由于農桿菌對大多數單子葉植物沒有感染能力，因此將目的基因導入這類植物的時候，一般采用的方法有基因槍法和花粉管通道法，D錯誤。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
9.(2023·江蘇淮安高三模擬)下圖表示pBR322質粒和人生長激素基因所在片段的結構信息，將二者構建的重組質粒導入受體菌并進行篩選。下列敘述錯誤的是
注：AmpR：氨芐青霉素抗性基因；TetR：四環素抗性基因。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A.應選擇的限制酶組合是酶F和酶G
B.所選用的受體菌含有AmpR和TetR基因
C.用含氨芐青霉素的培養基篩選出的是含重組質粒的受體菌
D.同時用三種限制酶處理圖中質粒，電泳后可得到4個條帶
√
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
為避免切割后DNA片段的自身環化，又保留質粒上的標記基因，切割時應選擇的限制酶組合是酶F和酶G，A正確；
所選用的受體菌不能含有AmpR和TetR基因，以便于對含有目的基因的受體菌進行選擇，B錯誤；
用含氨芐青霉素的培養基篩選出的有導入重組質粒的受體菌和導入原質粒的受體菌，C錯誤；
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
據題圖分析可知，同時用三種限制酶處理圖中質粒，因酶E有兩個作用位點，故將質粒切割成了4個DNA片段，電泳后可得到4個條帶，D正確。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
10.某中學生物興趣小組進行DNA的粗提取與鑒定時，選取如下實驗材料：新鮮花椰菜、體積分數為95%的冷酒精、研磨液(含表面活性劑SDS、DNA酶抑制劑EDTA、適量的NaCl)、0.015 mol·L－1的NaCl溶液、二苯胺試劑、蒸餾水以及其他必要實驗器材。下列有關選擇實驗材料的理由，敘述正確的是
A.新鮮的花椰菜DNA含量豐富，易獲取
B.SDS具有瓦解植物細胞質膜的作用
C.DNA溶于冷酒精，而蛋白質等雜質不溶
D.EDTA可減少提取過程DNA的降解
√
√
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
三、非選擇題
11.(2021·江蘇，23)某小組為研究真菌基因m的功能，構建了融合表達蛋白M和tag標簽的質粒，請結合實驗流程回答下列問題：
(1)目的基因的擴增
①提取真菌細胞______，經逆轉錄獲得cDNA，進一步獲得基因m片段。
RNA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
以逆轉錄獲得cDNA的方式，要先從真菌細胞中提取基因m轉錄出來的mRNA。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
②為了獲得融合tag標簽的蛋白M，設計引物P2時，不能包含基因m終止密碼子的編碼序列，否則將導致____________________。
蛋白M上不含tag標簽
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
從構建好的重組質粒上看，tag序列位于目的基因下游，若基因m的轉錄產物mRNA上有終止密碼子，核糖體移動到終止密碼子多肽鏈就斷開，則不會對tag序列的轉錄產物繼續進行翻譯，蛋白M上就不含tag標簽。
③熱啟動PCR可提高擴增效率，方法之一是：先將除Taq酶以外的各成分混合后，加熱到80 ℃以上再混入酶，然后直接從94 ℃開始PCR擴增。下列敘述正確的有______。
A.Taq酶最適催化溫度范圍為50～60 ℃
B.與常規PCR相比，熱啟動PCR可減少反應起始時引物錯配形成的產物
C.兩條子鏈的合成一定都是從5′端向3′端延伸
D.PCR產物DNA堿基序列的特異性體現了Taq酶的特異性
BC
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
從題干信息可知，“80 ℃以上再混入酶，然后直接從94 ℃開始PCR擴增”，故Taq酶最適催化溫度范圍為94 ℃左右，A錯誤；
PCR 反應的最初加熱過程中，樣品溫度上
升到70 ℃之前，在較低的溫度下引物可能與部分單鏈模板形成非特異性結合，并在Taq酶的作用下延伸，結果會導致引物錯配形成的產物的擴增，影響反應的特異性，熱啟動可減少引物錯配形成的產物的擴增，提高反應的特異性，B正確；
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
DNA分子復制具有方向性，都是從5′端向3′端延伸，C正確；
Taq酶沒有特異性，與普通的DNA聚合酶相比，Taq酶更耐高溫，D錯誤。故選BC。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
(2)重組質粒的構建
①將SmaⅠ切開的載體A與添加同源序列的m混合，用特定DNA酶處理形成黏性末端，然后降溫以促進______
__________________，形成A－m結合體。將A－m結合體導入大腸桿菌，利用大腸桿菌中的DNA聚合酶及__________酶等，完成質粒的環化。
黏性
末端堿基互補配對
DNA連接
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
從圖上看，載體A只有一個SmaⅠ的酶切位點，故被SmaⅠ切開后，載體由環狀變為鏈狀DNA，將SmaⅠ切開的載體A與添加同源序列的m混合，用特定DNA酶處理形成黏性末端，然后降
溫以促進載體A與添加同源序列的m的黏性末端堿基互補配對。將A－m結合體導入大腸桿菌，利用大腸桿菌中的DNA聚合酶及DNA連接酶等，完成質粒的環化。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
②若正確構建的重組質粒A－m仍能被SmaⅠ切開，則SmaⅠ的酶切位點可能在_____________________________。
基因m的連接處、基因m的內部
重組質粒中，載體A被SmaⅠ切開的位置已經與基因m相連，原來的酶切位點已不存在，若正確構建的重組質粒A－m仍能被SmaⅠ切開，則SmaⅠ的酶切位點可能在基因m的連接處或基因m內部。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
(3)融合蛋白的表達
①用含有尿嘧啶的培養基培養URA3基因缺失型酵母，將其作為受體菌，導入質粒A－m，然后涂布于無尿嘧啶的培養基上，篩選獲得目的菌株，其機理是________________________
____________________________________________________________。
受體菌在無尿嘧啶的培養基
上無法生長，導入重組質粒的受體菌含有URA3基因，可以長成菌落
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
篩選目的菌株的機理：導入了質粒A－m的目的菌株由于含有URA3基因，能在無尿嘧啶的培養基上存活，而URA3基因缺失型酵母則不能存活。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
②若通過抗原－抗體雜交實驗檢測到酵母蛋白中含tag標簽，說明________________
________________________，后續實驗可借助tag標簽進行蛋白M的分離純化。
若通過抗原－抗體雜交實驗檢測到酵母蛋白中含tag標簽，位于tag標簽上游的基因m應該正常表達，說明融合基因表達(或重組質粒A－m構建成功)。
融合基因表達(或
重組質粒A－m構建成功)
12.下圖是利用工程菌(大腸桿菌)生產人生長激素的實驗流程。所用的pBR322質粒含有限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和Hind Ⅲ的切點各一個，且三種酶切割形成的末端各不相同，而AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，TetR表示四環素抗性基因。請回答以下相關問題：
(1)目的基因主要是指編碼蛋白質的基因，也可以是一些具有__________
的因子。過程①所用到的組織細胞是_______________，③過程的目的是________________________，⑤過程常用______處理大腸桿菌。
調控作用
人垂體組織細胞
將平末端處理為黏性末端
Ca2＋
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
(2)如果用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ對圖中質粒進行切割，形成的DNA片段種類有____種，這些種類的DNA片段中含有完整氨芐青霉素抗性基因的DNA片段和四環素抗性基因的DNA片段分別有____種和_____種。
9
3
3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
(后面的→均按照順時針方向)假設PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ三種酶的切點分別用1、2、3表示。一種酶分別酶切時，一共可以得到3種片段1→1、2→2、3→3；任意兩種酶分別同時酶切時，可得到1→2、
2→1、2→3、3→2、1→3、3→1六種片段；三種酶同時酶切時，可得到1→2、2→3、3→1三種片段。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
綜上所述，共計9種不同的片段(1→1、1→2、1→3、2→1、2→2、2→3、3→1、3→2、3→3)。其中片段3→2、2→2、3→3共3種含有完整氨芐青霉素抗性基因，片段2→1、2→2、1→1共3種含有完整四環素抗性基因。
(3)如果只用限制酶PstⅠ切割目的基因和質粒，完成過程④、⑤后(受體大腸桿菌不含AmpR、TetR)，將三角瓶內的大腸桿菌先接種到甲培養基上，形成菌落后用無菌牙簽挑取甲培養基上的單個菌落，分別接種到乙和丙兩個培養基的相同位置上，一段時間后，
菌落的生長狀況如圖乙、丙所示。接種到甲培養基上的目的是篩選________
___________的大腸桿菌；接種到乙培養基上的大腸桿菌菌落，能存活的大腸桿菌體內導入的是_________________________________________。含有目的基因的大腸桿菌在培養基乙和丙上的生存情況是____________________
___________。
含四環
完整的pBR322質粒(或含有AmpR、TetR的質粒)
在丙中能存活，在乙
素抗性基因
中不能存活
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12第6課時　基因工程的基本工具和基本操作程序
課標要求　1.闡明DNA重組技術的實現需要利用限制性內切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。2.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞和目的基因及其表達產物的檢測鑒定等步驟。3.按照實驗操作步驟，進行DNA的粗提取與鑒定實驗。4.利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增DNA片段并完成電泳鑒定，或運用軟件進行虛擬PCR實驗。
考點一　基因工程的基本操作工具
1．基本工程的概念
(1)供體：提供外源目的基因。
(2)操作環境：體外。
(3)操作水平：分子水平。
(4)原理：基因重組。
(5)受體：表達目的基因。
(6)本質：性狀在受體體內的表達。
拓展　基因工程的理論基礎
2．重組DNA技術的基本工具
(1)限制性內切核酸酶(也稱“限制酶”)
(2)DNA連接酶
(3)載體
延伸應用　圖解限制酶的選擇原則
(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。
(2)保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點原則：質粒作為載體必須具備標記基因，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中不選擇SmaⅠ。
(3)確保出現相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶，如圖甲中PstⅠ；為避免目的基因和質粒自身環化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。
考向　基因工程的基本工具
1．下表為常用的限制性內切核酸酶(限制酶)及其識別序列和切割位點，由此推斷，下列說法錯誤的是(　　)
限制酶名稱 識別序列和切割位點 限制酶名稱 識別序列和切割位點
BamH Ⅰ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoR Ⅰ C↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
Hind Ⅱ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
注：Y為C或T，R為A或G。
A．HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶切割后形成平末端
B．Sau3AⅠ限制酶的切割位點在識別序列的外部
C．BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種限制酶切割后形成相同的黏性末端
D．一種限制酶一定只能識別一種核苷酸序列
答案　D
解析　HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶沿著中軸線切口切開，切割后形成平末端，A正確；Sau3AⅠ限制酶識別GATC序列，切割位點在識別序列的外部，B正確；BamHⅠ限制酶識別GGATCC序列，Sau3AⅠ限制酶識別GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC，C正確；HindⅡ能識別GTCAAC，也能識別GTTAAC，D錯誤。
2．(多選)第三代疫苗——DNA疫苗是指將編碼保護性抗原蛋白的基因(如圖甲)插入到適宜的質粒(如圖乙)中得到的重組DNA分子，將其導入人體內，在人體細胞內表達的產物可直接誘導機體免疫應答，且可持續一段時間。限制性內切核酸酶的切點分別是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析錯誤的是(　　)
A．構建DNA疫苗時，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和質粒
B．圖乙中只用EcoRⅠ切割后的質粒，含有1個游離的磷酸基團
C．用EcoRⅠ切割目的基因和質粒，再用DNA連接酶連接，只產生1種連接產物
D．抗原基因在體內表達時不需要解旋酶
答案　BC
解析　從圖甲看出，用EcoRⅠ切割目的基因后兩端各有一個切口，與圖乙中EcoRⅠ切口對接時，可有兩種可能，即可產生兩種重組DNA，C項錯誤；基因表達包括轉錄和翻譯，轉錄時不需要解旋酶，在RNA聚合酶的作用下，DNA即可解旋，D項正確。
3．下列有關基因工程中載體的說法，正確的是(　　)
A．在進行基因工程操作中，被用作載體的質粒都是天然質粒
B．所有的質粒都可以作為基因工程中的載體
C．質粒是一種獨立于細菌染色體外的鏈狀DNA分子
D．作為載體的質粒DNA分子上應有對重組DNA進行鑒定和選擇的標記基因
答案　D
解析　在進行基因工程操作中，被用作載體的質粒是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的，A錯誤；具有一至多個限制酶切點、具有標記基因的質粒才可以作為基因工程中的載體，B錯誤；質粒是一種獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外的環狀DNA分子，C錯誤；作為載體的質粒DNA分子上應有對重組DNA進行鑒定和選擇的標記基因，而且能在受體細胞中復制并穩定保存，D正確。
考點二　基因工程的基本操作程序
1．目的基因的獲取
(1)化學合成法直接人工合成目的基因：一般為比較小的目的基因。
(2)基因文庫獲取目的基因：來源可分為基因組文庫和cDNA文庫。
①基因組文庫：指含有某種生物體全部基因片段的重組DNA的克隆群體。從基因組文庫中篩選某種目的基因，一般采用核酸探針雜交法。
②cDNA文庫：從組織細胞中提取mRNA，逆轉錄成cDNA，與適當載體連接后轉化宿主，包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細胞的cDNA文庫。
2．基因表達載體的構建
(1)目的：使目的基因進入受體細胞并有效表達，而且要能穩定存在且遺傳給后代。
(2)基因表達載體的組成及作用
(3)構建過程
易錯提醒　啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比
項目 啟動子 終止子 起始密碼子 終止密碼子
本質 DNA DNA mRNA mRNA
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA 使轉錄在所需要的地方停下來 翻譯的起始信號(編碼氨基酸) 翻譯的結束信號(不編碼氨基酸)
3．將目的基因導入受體細胞
生物種類 植物 哺乳動物 微生物
常用方法 農桿菌轉化法 顯微注射法 Ca2＋處理法
受體細胞 體細胞或受精卵 受精卵 原核細胞
轉化過程 將目的基因插入Ti質粒的T－DNA中→農桿菌→導入植物細胞→整合到受體細胞的染色體DNA上→表達 取卵→將含有目的基因的表達載體注入→受精卵發育→獲得具有新性狀的動物 Ca2＋處理細胞→細胞處于一種容易接受外來DNA的生理狀態→基因表達載體導入
辨析　(1)農桿菌轉化法中的兩次拼接和兩次導入
第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受體細胞的染色體DNA上；第一次導入是將含目的基因的Ti質粒導入農桿菌，第二次導入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA導入受體細胞。
(2)農桿菌特點
①能在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數單子葉植物沒有感染能力。
②農桿菌細胞內含有Ti質粒，當它侵染植物細胞后，能將Ti質粒上的T－DNA轉移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色體DNA上。
4．目的基因及其表達產物的檢測鑒定
考向　基因工程的基本操作程序
4．戊型肝炎病毒是一種RNA病毒，ORF2基因編碼的結構蛋白(pORF2)位于病毒表面，構成病毒的衣売。我國科研人員利用基因工程技術，在大腸桿菌中表達pORF2，制備戊型肝炎疫苗，過程如圖。下列關于該疫苗的敘述，正確的是(　　)
A．過程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是A、U、G、C
B．重組基因表達載體上的啟動子需來源于戊型肝炎病毒
C．過程⑤需要用聚乙二醇處理大腸桿菌使其處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態
D．過程⑥大量制備pORF2蛋白前應做相應的檢測與鑒定
答案　D
解析　戊型肝炎病毒是一種RNA病毒，過程①是以病毒RNA為模板合成DNA，獲取目的基因的過程，需要的酶是逆轉錄酶，原料是四種脫氧核苷酸，A項錯誤；啟動子是一段有特殊結構的DNA片段，其作用是供RNA聚合酶識別結合以驅動目的基因的轉錄，啟動子具有物種或組織特異性，構建在大腸桿菌細胞內特異表達pORF2蛋白的載體時，需要選擇大腸桿菌細胞的啟動子，而不能選擇其他物種和組織細胞的啟動子，B項錯誤；將目的基因導入微生物細胞的方法是Ca2＋處理法，需要用Ca2＋處理大腸桿菌，細胞質膜對DNA的通透性會發生改變，使其處于一種容易接受外來DNA的生理狀態，C項錯誤。
5．下列有關基因表達載體的敘述，不正確的是(　　)
A．具有復制原點，使目的基因能在受體細胞內擴增
B．具有啟動子，作為多肽鏈合成的起始信號
C．具有標記基因，有利于目的基因的初步檢測
D．具有目的基因，以獲得特定的基因表達產物
答案　B
解析　基因表達載體必須使目的基因能夠在受體細胞內進行表達，具有啟動子(啟動轉錄)，作為RNA合成的起始信號，B錯誤。
6．(2021·全國乙，38)用DNA重組技術可以賦予生物以新的遺傳特性，創造出更符合人類需要的生物產品。在此過程中要使用多種工具酶，其中4種限制性內切核酸酶的切割位點如圖所示。
回答下列問題：
(1)常用的DNA連接酶有E.coli DNA連接酶和T4 DNA連接酶，上圖中____________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA連接酶連接，上圖中__________________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA連接酶連接。
(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質粒載體片段之間形成的化學鍵是____________。
(3)DNA重組技術中所用的質粒載體具有一些特征，如質粒DNA分子上有復制原點，可以保證質粒在受體細胞中能______________；質粒DNA分子上有_______________________，
便于外源DNA的插入；質粒DNA分子上有標記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質粒載體的宿主細胞，方法是____________________________________
________________________________________________________________________。
(4)表達載體含有啟動子，啟動子是指________________________________________
________________________________________________________________________。
答案　(1)EcoRⅠ、PstⅠ　EcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcoRⅤ　(2)磷酸二酯鍵　(3)自我復制　一至多個限制酶切割位點　用含有該抗生素的培養基培養宿主細胞，能夠存活的即為含有質粒載體的宿主細胞　(4)位于基因上游的一段DNA片段，是RNA聚合酶識別、結合的部位，能驅動轉錄過程
解析　(1)限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coli DNA連接酶來源于大腸桿菌，只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來，而T4 DNA連接酶來源于T4噬菌體，可用于連接黏性末端和平末端，但連接效率較低。因此圖中EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E.coli DNA連接酶連接，除了這兩種限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割后的DNA片段(平末端)也可以用T4 DNA連接酶連接。(3)質粒是小型環狀的DNA分子，常作為基因表達的載體，首先質粒上含有復制原點，能保證質粒在受體細胞中自我復制。質粒DNA分子上有一個至多個限制酶的酶切位點，便于目的基因的導入。質粒上的標記基因是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因，具體做法是用含有該抗生素的培養基培養宿主細胞，能夠存活的即為含有質粒載體的宿主細胞。
考點三　PCR技術、電泳鑒定及DNA的粗提取和鑒定
1．PCR技術
(1)過程
變性：94 ℃條件下受熱變性后解鏈為單鏈
↓
退火：55 ℃條件下，引物與單鏈相應互補序列結合
↓
延伸：72 ℃條件下在Taq酶作用下合成子鏈
思考分析　
①在PCR過程中實際加入的為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。
②引物既可以是DNA單鏈，也可以為RNA單鏈。細胞內的DNA進行復制時，也需要引物，一般為RNA片段。
③真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應緩沖溶液中一般要添加Mg2＋。
④PCR擴增過程中的循環圖示與規律
循環次數 1 2 3 n
DNA分子數 2 4 8 2n
含引物A(或B)的DNA分子數 1 3 7 2n－1
同時含引物A、B的DNA分子數 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗的引物數量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1－2 2n＋1－2
(2)PCR技術和DNA復制的比較
(3)DNA的電泳鑒定
2．DNA的粗提取和鑒定
(1)基本原理
①原理：利用DNA、RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面的差異，提取DNA，去除其他成分。
②DNA的性質：DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精；DNA能溶于2 mol·L－1的NaCl溶液。
③DNA的鑒定：在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現藍色。
(2)過程
考向一　PCR技術及電泳鑒定
7．(多選)(2023·江蘇南京高三模擬)大引物PCR定點突變常用來研究蛋白質結構改變導致的功能變化。單核苷酸的定點誘變僅需進行兩輪PCR反應即可獲得，第一輪加誘變引物和側翼引物，第一輪產物作第二輪PCR擴增的大引物，過程如圖所示。下列有關敘述錯誤的是(　　)
A．PCR擴增的定點誘變產物通常需要連接到載體分子上才能表達出相應的性狀，需具備啟動子、終止子等結構才能進行轉錄和翻譯
B．單核苷酸的定點誘變所屬變異類型為基因重組
C．第二輪PCR所用的引物都是第一輪PCR產物DNA的兩條鏈
D．利用該技術將某功能蛋白的結構改變屬于蛋白質工程
答案　BC
解析　單核苷酸的定點誘變所屬變異類型為基因突變，B錯誤；除了第一輪產物作第二輪PCR擴增的大引物外，第二輪PCR仍需加入的引物是另一種側翼引物，以便進行另一條鏈的延伸，C錯誤；蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系作為基礎，通過改造或合成基因，來改造現有蛋白質，或制造一種新的蛋白質，利用該技術將某功能蛋白的結構改變屬于蛋白質工程，D正確。
8．利用PCR可以在體外進行DNA片段的擴增，下列有關“利用PCR技術擴增DNA片段并完成電泳鑒定”實驗的相關敘述，錯誤的是(　　)
A．PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓蒸汽滅菌處理
B．PCR利用了DNA的熱變性原理
C．PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化
D．在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換
答案　C
解析　PCR所用緩沖液和酶從冰箱拿出之后，應放在冰塊上緩慢融化，這樣才能不破壞緩沖液中穩定性較差的成分，同樣保護酶的活性不被破壞，C錯誤。
考向二　DNA的粗提取和鑒定
9．下列有關“DNA粗提取和鑒定”實驗的敘述，正確的是(　　)
A．新鮮豬血、菜花等動植物材料均可用于DNA的粗提取
B．選用洋蔥作為實驗材料時可以使用吸水漲破法破壞細胞
C．DNA可溶于蒸餾水，也可溶于2 mol/L的NaCl溶液
D．溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺試劑后，顏色呈紫色
答案　C
解析　豬是哺乳動物，其紅細胞沒有細胞核，所以豬血不能用于DNA的粗提取，A錯誤；植物材料不能使用吸水漲破法破壞細胞，B錯誤；DNA不溶于95%的冷酒精，可溶于蒸餾水，也可溶于2 mol/L的NaCl溶液，C正確；溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺試劑，需沸水浴加熱后冷卻，再觀察顏色(呈藍色)，D錯誤。
1．(2019·江蘇，10)下列關于DNA粗提取和鑒定的敘述，錯誤的是(　　)
A．用同樣方法從等體積兔血和雞血中提取的DNA量相近
B．DNA析出過程中，攪拌操作要輕柔以防DNA斷裂
C．預冷的酒精可用來進一步純化粗提的DNA
D．用二苯胺試劑鑒定DNA需要進行水浴加熱
答案　A
解析　哺乳動物(如兔)成熟的紅細胞中無細胞核和眾多細胞器，不能提取到DNA，故兔血不宜作為該實驗的實驗材料，A錯誤；為防止DNA斷裂，在DNA析出過程中攪拌操作要輕柔且沿著一個方向，B正確；DNA不溶于酒精溶液，但是細胞中的某些蛋白質溶于酒精溶液，預冷的酒精溶液可用來進一步純化粗提的DNA，C正確；在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺呈現藍色，因此，用二苯胺試劑鑒定DNA需要進行沸水浴加熱，D正確。
2．(2020·北京，12)為了對重金屬污染的土壤進行生物修復，研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉運蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動子連接，導入楊樹基因組中(如圖)。為檢測獲得的轉基因楊樹苗中是否含有導入的HMA3基因，同時避免內源HMA3基因的干擾，在進行PCR擴增時，應選擇的引物組合是(　　)
A．①＋③ B．①＋②
C．③＋② D．③＋④
答案　B
解析　引物①擴增的片段含有啟動子和HMA3基因，引物③擴增的片段不含啟動子，引物②擴增的片段既含有啟動子，又含有HMA3基因序列。圖示中克隆的重金屬轉運蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動子連接，導入楊樹基因組中，若要檢測獲得的轉基因楊樹苗中是否含有導入的HMA3基因和高效啟動子，需要檢測是否含有高效啟動子序列和HMA3基因序列，應選擇的引物組合是①＋②，B正確。
3．(2020·浙江7月選考，24)下列關于基因工程的敘述，正確的是(　　)
A．若受體大腸桿菌含有構建重組質粒時用到的限制性內切核酸酶，則一定有利于該重組質粒進入受體并保持結構穩定
B．抗除草劑基因轉入某抗鹽植物獲得2個穩定遺傳轉基因品系，抗性鑒定為抗除草劑抗鹽和抗除草劑不抗鹽。表明一定是抗鹽性的改變與抗除草劑基因的轉入無關
C．抗除草劑基因轉入某植物獲得轉基因植株，其DNA檢測均含目的基因，抗性鑒定為抗除草劑和不抗除草劑。表明一定是前者表達了抗性蛋白而后者只表達抗性基因RNA
D．已知不同分子量DNA可分開成不同條帶，相同分子量的為一條帶，用某種限制性內切核酸酶完全酶切環狀質粒后，出現3條帶。表明該質粒上一定至少有3個被該酶切開的位置
答案　D
解析　基因工程中，若受體大腸桿菌含有構建重組質粒時用到的限制性內切核酸酶(簡稱限制酶)，重組質粒進入大腸桿菌體內后，該限制酶可以切割重組質粒，使重組質粒不能保持結構穩定，A項錯誤；將抗除草劑基因轉入某抗鹽植物獲得2個穩定遺傳轉基因品系，抗性鑒定為抗除草劑抗鹽和抗除草劑不抗鹽，若抗除草劑基因轉入到抗鹽基因的編碼區，破壞了抗鹽基因，則會出現由抗鹽到不抗鹽的改變，可說明抗鹽性的改變與抗除草劑基因的轉入有關，B項錯誤；抗除草劑基因轉入某植物獲得轉基因植株，其DNA檢測均含目的基因，抗性鑒定為抗除草劑和不抗除草劑，則前者應表達了抗性蛋白，而后者可能表達了抗性基因RNA但不能進行翻譯過程，也可能沒有表達出抗性基因RNA，C項錯誤；已知不同分子量DNA可分開成不同條帶，相同分子量的為一條帶，用某種限制性內切核酸酶完全酶切環狀質粒后，出現幾條帶則表明該質粒上一定至少有幾個被酶切開的位置，注意若完全酶切鏈狀DNA后，出現3條帶，則表明該DNA上一定至少有3個被酶切開的位置，D項正確。
4．(2020·江蘇，33)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側的序列，具體流程如下圖(以EcoR Ⅰ酶切為例)：
請據圖回答問題：
(1)步驟 Ⅰ 用的EcoRⅠ是一種______________酶，它通過識別特定的______________切割特定位點。
(2)步驟 Ⅱ 用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′－羥基與5′－磷酸間形成________________；PCR循環中，升溫到94 ℃是為了獲得________________；Taq酶的作用是催化________________。
(3)若下表所列為已知的DNA序列和設計的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是________(從引物①②③④中選擇，填編號)。
DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物 ①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′ ②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′ ③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′ ④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
(4)對PCR產物測序，經分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列)，結果正確的是________。
A．5′－AACTATGCG……AGCCCTT－3′
B．5′－AATTCCATG……CTGAATT－3′
C．5′－GCAATGCGT……TCGGGAA－3′
D．5′－TTGATACGC……CGAGTAC－3′
答案　(1)限制性內切核酸(或限制)　核苷酸序列　(2)磷酸二酯鍵　DNA單鏈　以DNA為模板的DNA鏈的延伸　(3)②④　(4)B
解析　(1)步驟Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一種限制性內切核酸酶，它通過識別特定的核苷酸序列來進行切割。(2)步驟Ⅱ中用DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′－羥基與5′－磷酸間形成磷酸二酯鍵。PCR循環中，升溫到94 ℃是為了解開DNA雙鏈獲得DNA單鏈，Taq酶的作用是催化以DNA為模板延伸形成子鏈的過程。(3)PCR過程中，根據已知的DNA序列合成兩個引物，要注意模板鏈和引物的方向是相反的，引物的核苷酸序列要能夠和相應模板的核苷酸序列發生堿基互補配對，環狀DNA圖中顯示PCR過程是從已知DNA序列的兩端分別向相反方向形成子鏈，一個引物是與已知DNA序列的第一條鏈的左端互補結合，向右側方向延伸形成子鏈，該引物是④，另一個引物是與已知DNA序列的第二條鏈的右端互補結合，向左側方向延伸形成子鏈，該引物是②。(4)圖中由片段F形成的環狀DNA的未知序列中有一個EcoR Ⅰ限制酶的切割位點，而EcoRⅠ識別的位點是，因此片段F的單鏈中的一端應含有“AATTC……”序列，另一端應含有“TTAAG……”序列，只有B項符合題意。
5. (2022·江蘇，24)纖毛是廣泛存在的細胞表面結構，功能異常可引起多種疾病。因此，研究纖毛形成的作用機制具有重要意義。請回答下列問題：
(1)纖毛結構如圖Ⅰ所示，由細胞質膜延伸形成的纖毛膜主要由________________組成?；w由中心體轉變而來，中心體在有絲分裂中的功能是____________________________
________________________________________________________________________。
(2)某病人腎小管上皮細胞纖毛異常，為了分析纖毛相關基因X是否發生了變異，對基因X進行了PCR擴增與產物測序。從細胞樣品中分離DNA時，可通過交替調節鹽濃度將與核蛋白結合的DNA分離出來，溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是___________________。
PCR擴增時，需在______________催化下，在引物__________端進行DNA鏈的延伸，獲得擴增產物用于測序。
(3)為研究蛋白質X在細胞中的定位，構建綠色熒光蛋白GFP與X的融合蛋白，融合蛋白具有綠色熒光，可示其在細胞內位置。將X－GFP基因融合片段M導入如圖Ⅱ所示載體質粒Y，構建Y－M重組質粒(在EcoRV位點插入片段)。請完成下表。
分步實驗目標 簡易操作、結果、分析
PCR鑒定正向重組質粒Y－M(圖Ⅱ中融合片段M中有白色的箭頭，代表方向) ①選擇圖Ⅱ引物__________； ②PCR目的產物約為__________bp
確保M及連接處序列正確，Y－M的連接處上游含有Hind Ⅲ＋EcoR V的識別序列，下游含有EcoR V＋BamH Ⅰ的識別序列 ③質粒測序，圖Ⅲ中正確的是__________(選填序列編號)
檢測融合蛋白定位 ④對照質粒Y－GFP(僅表達GFP)與實驗質粒Y－M分別導入細胞，發現對照組整個細胞均有綠色熒光，而實驗組熒光集中在纖毛基部，說明__________________________ ____________________________________
(4)為研究另一纖毛病相關基因Z表達的變化，采用熒光定量PCR法檢測健康人與病人基因Z的轉錄水平。采集樣本、提取總RNA，經____________形成cDNA作為模板，PCR擴增結果顯示，在總cDNA模板量相等的條件下，健康人Ct值為15，而病人Ct值為20(Ct值是產物熒光強度達到設定閾值時的PCR循環數)。從理論上估算，在PCR擴增20個循環的產物中，健康人樣品的目的產物大約是病人的__________倍。
答案　(1)磷脂、蛋白質　發出星射線，形成紡錘體　(2)溶解DNA　熱穩定的DNA聚合酶(Taq酶)　3′　(3)a、b　1 100　Q3　X蛋白參與中心體的形成　(4)逆轉錄　32
解析　(2)從細胞樣品中分離DNA時，可通過交替調節鹽濃度將與核蛋白結合的DNA分離出來，DNA在2.0 mol/L的NaCl溶液中的溶解最大，高于或低于這一濃度，DNA的溶解度均會下降，因此實驗過程中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是溶解DNA。PCR擴增時，需在Taq酶的催化下，在引物的3′端進行DNA鏈的延伸，獲得擴增產物用于測序。(3)PCR擴增目的DNA片段時，在引物的3′端進行DNA鏈的延伸，據圖可知，應選擇圖Ⅱ中的引物a和引物b，PCR目的產物約為300＋800＝1 100(bp)。為確保M及連接處序列正確，Y－M的連接處上游含有Hind Ⅲ＋EcoR V的識別序列，下游含有EcoR V＋BamH Ⅰ的識別序列，根據題干信息構建Y－M重組質粒(在EcoRV位點插入片段)，Y－M的連接處測序后部分序列應含有Hind Ⅲ和BamH Ⅰ識別位點，根據各限制酶識別位點，應選擇序列Q3。對照質粒Y－GFP(僅表達GFP)與實驗質粒Y－M分別導入細胞，發現對照組整個細胞均有綠色熒光，而實驗組熒光集中在纖毛基部，說明蛋白質X參與中心體的組成。(4)研究另一纖毛病相關基因Z表達的變化，采用熒光定量PCR法檢測健康人與病人基因Z的轉錄水平。采集樣本、提取總RNA，經逆轉錄形成cDNA作為模板，PCR擴增結果顯示，在總cDNA模板量相等的條件下，健康人Ct值為15，而病人Ct值為20(Ct值是產物熒光強度達到設定閾值時的PCR循環數)，說明病人基因Z表達較弱，設健康人Z基因的cDNA數為x，病人Z基因的cDNA數為y，則有x×215＝y×220，從理論上估算，在PCR擴增20個循環的產物中，健康人樣品的目的產物大約是病人的25＝32(倍)。
一、易錯辨析
1．限制酶也可以識別和切割RNA(　×　)
2．DNA連接酶能將兩堿基通過氫鍵連接起來(　×　)
3．E.coliDNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端(　×　)
4．用PCR方法擴增目的基因時需要設計兩種引物(　√　)
5．DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精(　√　)
6．在凝膠中DNA分子的遷移速率只與DNA分子的大小相關(　×　)
二、填空默寫
1．(選擇性必修3 P87)基因工程：又稱DNA重組技術，指在體外通過人工“剪切”和“拼接”等方法，將外源目的基因與載體DNA進行組合形成重組DNA，然后導入受體細胞，并使其在受體細胞中表達，產生人類需要的基因產物的技術。
2．(選擇性必修3 P87)限制酶的特異性很強，能識別DNA分子上特定的脫氧核苷酸序列，并使每條鏈中特定部位的兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。
3．(選擇性必修3 P89)E.coli DNA連接酶，可以用于連接具有黏性末端的DNA分子；T4 DNA連接酶，可以用于連接具有黏性末端或平末端的DNA分子。
4．(選擇性必修3 P90)PCR反應需要在一定的緩沖液中才能進行，需提供DNA模板、引物對、4種dNTP和熱穩定的DNA聚合酶。
5．(選擇性必修3 P97)基因表達載體除目的基因外，還應該包括復制原點、啟動子、終止子和標記基因等。
6．(選擇性必修3 P98)農桿菌轉化法是將目的基因插到農桿菌Ti質粒的T－DNA特定區段上，再通過T－DNA將其插入受體細胞染色體的DNA上，使目的基因得到穩定的遺傳和表達。
課時精練
一、單項選擇題
1．目前研究混雜DNA群體中的特異DNA序列，一般基于兩種不同的方法，即DNA克隆和DNA分子雜交，如圖所示。下列有關敘述錯誤的是(　　)
A．方法①需要限制酶和DNA連接酶
B．方法②需要解旋酶和DNA聚合酶
C．方法③需要對探針進行特殊標記
D．方法①②③都遵循堿基互補配對原則
答案　B
解析　方法①中將目的基因與載體切割和連接制成重組DNA，需要限制酶和DNA連接酶，A正確；方法②體外擴增技術中變性－退火－延伸，不需要解旋酶，B錯誤；方法③需要對探針進行特殊標記，這樣才能特異性檢測，C正確；方法①②③都遵循堿基互補配對原則，D正確。
2．(2023·江蘇宿遷高三質檢)如圖表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相關的酶作用位點。下列敘述錯誤的是(　　)
A．甲、乙、丙都屬于黏性末端
B．甲、乙片段可形成重組DNA分子，但甲、丙不能
C．DNA連接酶的作用位點在圖乙中b處
D．切割甲的限制酶不能識別由甲、乙片段形成的重組DNA分子
答案　C
解析　甲、乙的黏性末端相同，因此可在DNA連接酶的作用下形成重組DNA分子，但甲、丙的黏性末端不同，它們之間不能形成重組DNA分子，B正確；DNA連接酶將兩個DNA片段連接為一個DNA分子，作用部位是磷酸二酯鍵，即圖乙中a處，C錯誤；切割甲的限制酶的識別序列為GAATTC∥CTTAAG，而甲、乙片段形成的重組DNA分子序列為GAATTG∥CTTAAC，因此切割甲的限制酶不能識別由甲、乙片段形成的重組DNA分子，D正確。
3．(2023·江蘇南通高三檢測)基因工程利用某目的基因(圖甲)和P1噬菌體載體(圖乙)構建重組DNA。限制性內切核酸酶BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ的酶切位點分別如圖所示。下列分析錯誤的是(　　)
A．構建重組DNA時，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體
B．構建重組DNA時，可用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體
C．圖乙中的P1噬菌體載體只用EcoRⅠ切割后，含有兩個游離的磷酸基團
D．用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體，再用DNA連接酶連接，只能產生一種重組DNA
答案　D
解析　P1噬菌體載體為環狀DNA，其上只含有一個EcoRⅠ的酶切位點，因此用EcoRⅠ切割后，該環狀DNA分子變為雙鏈DNA分子，因每條鏈各含有一個游離的磷酸基團，故切割后含有兩個游離的磷酸基團，C正確；由圖甲可知，用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體后形成的黏性末端相同，可任意連接，不止產生一種重組DNA，D錯誤。
4．(2023·江蘇泰州高三調研)引物的設計是影響PCR擴增反應的效率和特異性的關鍵因素，下列相關敘述正確的是(　　)
A．引物的堿基數量越少則退火溫度越低、目標DNA獲得率越高
B．根據需要可在引物的5′端添加限制酶識別序列、點突變序列等
C．兩種引物的退火溫度差異較大，可減少引物與模板的非特異性結合
D．引物的GC含量越高，結合特異性越強，越利于目標DNA的擴增
答案　B
解析　退火溫度與時間取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，引物的堿基數量越少，變性時破開的氫鍵越少，則退火溫度越低，但能與引物發生配對的片段就越多，目標DNA獲得率越低，A錯誤；根據需要可在引物的5′端添加限制酶識別序列、點突變序列等，以便更加準確地獲得目的基因，B正確；兩種引物的退火溫度差異較大，導致不能同時退火，甚至一條鏈在延伸，一條鏈在退火，可增加引物與模板的非特異性結合，C錯誤；引物的GC含量越高，結合特異性越強，但GC含量過高，氫鍵越多，不利于退火 ，從而阻礙目標DNA的擴增，D錯誤。
5．利用PCR技術擴增目的基因，其原理與細胞內DNA復制類似(如下圖所示)。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎。下列敘述錯誤的是(　　)
A．用PCR方法擴增目的基因時不必知道基因的全部序列
B．設計引物時需要避免引物之間形成堿基互補配對而造成引物自連
C．退火溫度過高可能導致PCR反應得不到任何擴增產物
D．第四輪循環產物中同時含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例為15/16
答案　D
解析　用PCR方法擴增目的基因時，要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據這一序列合成(兩種)引物，但不必知道基因的全部序列，A正確；復性的目的是使兩種引物通過堿基互補配對與兩條DNA單鏈結合，因此退火溫度過高可能引起兩種引物不能與兩條DNA單鏈結合，進而導致PCR反應得不到任何擴增產物，C正確；DNA復制為半保留復制，第四輪循環即DNA復制4次，共形成24＝16個DNA分子，其中含有最初模板鏈的2個DNA分子含有引物A或引物B，其余14個DNA分子均含有引物A和引物B，所以第四輪循環產物中同時含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例為14/16＝7/8，D錯誤。
6．在基因工程操作中，科研人員利用識別兩種不同序列的限制酶(R1和R2)處理基因載體，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結果如圖所示。以下相關敘述中，不正確的是(　　)
A．該載體最可能為環形DNA分子
B．兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點
C．限制酶R1與R2的切割位點最短相距200 bp
D．限制酶作用于該載體會導致氫鍵和肽鍵斷裂
答案　D
解析　由題可知，當僅用一種限制酶切割載體時，僅產生一種長度的DNA片段，因此該載體最有可能為環狀DNA分子，A正確；由題可知，當僅用一種限制酶切割載體時，兩種限制酶切割產生的DNA片段等長，而兩種限制酶同時切割時則產生兩種長度的DNA片段，所以兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點，B正確；由題可知，兩種限制酶同時切割時則產生600 bp和200 bp兩種長度的DNA片段，所以兩種限制酶的酶切位點至少相距200 bp，C正確；限制酶切割DNA分子，破壞的是作用位點上兩個脫氧核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵，D錯誤。
7．(2023·江蘇常州高三模擬)如圖是快速RT－PCR過程示意圖，①和②為逆轉錄酶催化的逆轉錄過程，③是PCR過程。據圖分析，下列敘述錯誤的是(　　)
A．逆轉錄酶具有DNA聚合酶的能力
B．③PCR過程只需要引物b
C．RT－PCR可檢測基因表達水平
D．RT－PCR可檢測新冠病毒等RNA病毒
答案　B
解析?、跴CR過程需要引物a、b，因為后續的模板鏈序列既有與靶RNA一致的，也有與cDNA一致的，B錯誤。
二、多項選擇題
8．ROP蛋白可以參與調節根毛和花粉管的生長。科研人員采用含有GFP(綠色熒光蛋白)基因的載體構建了ROPGFP的質粒，并利用農桿菌轉化法將其轉入植物體內。下列有關敘述正確的是(　　)
A．外源基因在植物體中是否表達可通過綠色熒光來檢測
B．GFP基因在植物體中表達說明生物體共用一套密碼子表
C．ROPGFP質粒的構建需用到限制酶、DNA聚合酶和載體等工具
D．利用農桿菌轉化法可以侵染大多數單子葉植物
答案　AB
解析　導入的載體含有GFP(綠色熒光蛋白)基因，可以指導綠色熒光蛋白合成，若在植物體中表達，則可以表現出綠色熒光，A正確；GFP基因在植物體中表達，GFP基因在受體中也能轉錄、翻譯為綠色熒光蛋白，說明供體和受體都共用一套密碼子表，B正確；ROPGFP質粒的構建需用到限制酶、DNA連接酶和載體等工具，C錯誤；由于農桿菌對大多數單子葉植物沒有感染能力，因此將目的基因導入這類植物的時候，一般采用的方法有基因槍法和花粉管通道法，D錯誤。
9．(2023·江蘇淮安高三模擬)下圖表示pBR322質粒和人生長激素基因所在片段的結構信息，將二者構建的重組質粒導入受體菌并進行篩選。下列敘述錯誤的是(　　)
注：AmpR：氨芐青霉素抗性基因；TetR：四環素抗性基因。
A．應選擇的限制酶組合是酶F和酶G
B．所選用的受體菌含有AmpR和TetR基因
C．用含氨芐青霉素的培養基篩選出的是含重組質粒的受體菌
D．同時用三種限制酶處理圖中質粒，電泳后可得到4個條帶
答案　BC
解析　為避免切割后DNA片段的自身環化，又保留質粒上的標記基因，切割時應選擇的限制酶組合是酶F和酶G，A正確；所選用的受體菌不能含有AmpR和TetR基因，以便于對含有目的基因的受體菌進行選擇，B錯誤；用含氨芐青霉素的培養基篩選出的有導入重組質粒的受體菌和導入原質粒的受體菌，C錯誤；據題圖分析可知，同時用三種限制酶處理圖中質粒，因酶E有兩個作用位點，故將質粒切割成了4個DNA片段，電泳后可得到4個條帶，D正確。
10．某中學生物興趣小組進行DNA的粗提取與鑒定時，選取如下實驗材料：新鮮花椰菜、體積分數為95%的冷酒精、研磨液(含表面活性劑SDS、DNA酶抑制劑EDTA、適量的NaCl)、0.015 mol·L－1的NaCl溶液、二苯胺試劑、蒸餾水以及其他必要實驗器材。下列有關選擇實驗材料的理由，敘述正確的是(　　)
A．新鮮的花椰菜DNA含量豐富，易獲取
B．SDS具有瓦解植物細胞質膜的作用
C．DNA溶于冷酒精，而蛋白質等雜質不溶
D．EDTA可減少提取過程DNA的降解
答案　ABD
三、非選擇題
11．(2021·江蘇，23)某小組為研究真菌基因m的功能，構建了融合表達蛋白M和tag標簽的質粒，請結合實驗流程回答下列問題：
(1)目的基因的擴增
①提取真菌細胞__________________，經逆轉錄獲得cDNA，進一步獲得基因m片段。
②為了獲得融合tag標簽的蛋白M，設計引物P2時，不能包含基因m終止密碼子的編碼序列，否則將導致__________________。
③熱啟動PCR可提高擴增效率，方法之一是：先將除Taq酶以外的各成分混合后，加熱到80 ℃以上再混入酶，然后直接從94 ℃開始PCR擴增。下列敘述正確的有____________。
A．Taq酶最適催化溫度范圍為50～60 ℃
B．與常規PCR相比，熱啟動PCR可減少反應起始時引物錯配形成的產物
C．兩條子鏈的合成一定都是從5′端向3′端延伸
D．PCR產物DNA堿基序列的特異性體現了Taq酶的特異性
(2)重組質粒的構建
①將SmaⅠ切開的載體A與添加同源序列的m混合，用特定DNA酶處理形成黏性末端，然后降溫以促進____________________，形成A－m結合體。將A－m結合體導入大腸桿菌，利用大腸桿菌中的DNA聚合酶及________酶等，完成質粒的環化。
②若正確構建的重組質粒A－m仍能被SmaⅠ切開，則SmaⅠ的酶切位點可能在________________________________________________________________________。
(3)融合蛋白的表達
①用含有尿嘧啶的培養基培養URA3基因缺失型酵母，將其作為受體菌，導入質粒A－m，然后涂布于無尿嘧啶的培養基上，篩選獲得目的菌株，其機理是________________
________________________________________________________________________。
②若通過抗原－抗體雜交實驗檢測到酵母蛋白中含tag標簽，說明_________________，后續實驗可借助tag標簽進行蛋白M的分離純化。
答案　(1)①RNA?、诘鞍譓上不含tag標簽?、跙C　(2)①黏性末端堿基互補配對　DNA連接　②基因m的連接處、基因m的內部　(3)①受體菌在無尿嘧啶的培養基上無法生長，導入重組質粒的受體菌含有URA3基因，可以長成菌落　②融合基因表達(或重組質粒A－m構建成功)
解析　(1)①以逆轉錄獲得cDNA的方式，要先從真菌細胞中提取基因m轉錄出來的mRNA。②從構建好的重組質粒上看，tag序列位于目的基因下游，若基因m的轉錄產物mRNA上有終止密碼子，核糖體移動到終止密碼子多肽鏈就斷開，則不會對tag序列的轉錄產物繼續進行翻譯，蛋白M上就不含tag標簽。③從題干信息可知，“80 ℃以上再混入酶，然后直接從94 ℃開始PCR擴增”，故Taq酶最適催化溫度范圍為94 ℃左右，A錯誤；PCR 反應的最初加熱過程中，樣品溫度上升到70 ℃之前，在較低的溫度下引物可能與部分單鏈模板形成非特異性結合，并在Taq酶的作用下延伸，結果會導致引物錯配形成的產物的擴增，影響反應的特異性，熱啟動可減少引物錯配形成的產物的擴增，提高反應的特異性，B正確；DNA分子復制具有方向性，都是從5′端向3′端延伸，C正確；Taq酶沒有特異性，與普通的DNA聚合酶相比，Taq酶更耐高溫，D錯誤。故選BC。(2)①從圖上看，載體A只有一個SmaⅠ的酶切位點，故被SmaⅠ切開后，載體由環狀變為鏈狀DNA，將SmaⅠ切開的載體A與添加同源序列的m混合，用特定DNA酶處理形成黏性末端，然后降溫以促進載體A與添加同源序列的m的黏性末端堿基互補配對。將A－m結合體導入大腸桿菌，利用大腸桿菌中的DNA聚合酶及DNA連接酶等，完成質粒的環化。②重組質粒中，載體A被Sma Ⅰ切開的位置已經與基因m相連，原來的酶切位點已不存在，若正確構建的重組質粒A－m仍能被Sma Ⅰ切開，則Sma Ⅰ的酶切位點可能在基因m的連接處或基因m內部。
(3)①篩選目的菌株的機理：導入了質粒A－m的目的菌株由于含有URA3基因，能在無尿嘧啶的培養基上存活，而URA3基因缺失型酵母則不能存活。②若通過抗原－抗體雜交實驗檢測到酵母蛋白中含tag標簽，位于tag標簽上游的基因m應該正常表達，說明融合基因表達(或重組質粒A－m構建成功)。
12．下圖是利用工程菌(大腸桿菌)生產人生長激素的實驗流程。所用的pBR322質粒含有限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和Hind Ⅲ的切點各一個，且三種酶切割形成的末端各不相同，而AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，TetR表示四環素抗性基因。請回答以下相關問題：
(1)目的基因主要是指編碼蛋白質的基因，也可以是一些具有________的因子。過程①所用到的組織細胞是________________，③過程的目的是________________________，⑤過程常用________處理大腸桿菌。
(2)如果用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ對圖中質粒進行切割，形成的DNA片段種類有________種，這些種類的DNA片段中含有完整氨芐青霉素抗性基因的DNA片段和四環素抗性基因的DNA片段分別有______種和_______種。
(3)如果只用限制酶PstⅠ切割目的基因和質粒，完成過程④、⑤后(受體大腸桿菌不含AmpR、TetR)，將三角瓶內的大腸桿菌先接種到甲培養基上，形成菌落后用無菌牙簽挑取甲培養基上的單個菌落，分別接種到乙和丙兩個培養基的相同位置上，一段時間后，菌落的生長狀況如圖乙、丙所示。接種到甲培養基上的目的是篩選____________________的大腸桿菌；接種到乙培養基上的大腸桿菌菌落，能存活的大腸桿菌體內導入的是____________________。含有目的基因的大腸桿菌在培養基乙和丙上的生存情況是__________________________。
答案　(1)調控作用　人垂體組織細胞　將平末端處理為黏性末端　Ca2＋　(2)9　3　3　
(3)含四環素抗性基因　完整的pBR322質粒(或含有AmpR、TetR的質粒)　在丙中能存活，在乙中不能存活
解析　(2)(后面的→均按照順時針方向)假設PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ三種酶的切點分別用1、2、3表示。一種酶分別酶切時，一共可以得到3種片段1→1、2→2、3→3；任意兩種酶分別同時酶切時，可得到1→2、2→1、2→3、3→2、1→3、3→1六種片段；三種酶同時酶切時，可得到1→2、2→3、3→1三種片段。綜上所述，共計9種不同的片段(1→1、1→2、1→3、2→1、2→2、2→3、3→1、3→2、3→3)。其中片段3→2、2→2、3→3共3種含有完整氨芐青霉素抗性基因，片段2→1、2→2、1→1共3種含有完整四環素抗性基因。

展開更多......

收起↑