資源簡介

第2節　微生物的培養技術及應用
第1課時 微生物的基本培養技術
學習目標
1.概述培養基的營養構成，無菌技術的原理、常用設備和方法。
2.概述培養基的配制方法和微生物純培養的基本操作要求。
3.進行酵母菌的純培養。
預學案--教材研讀（自主學習）
培養基的配制
1. 培養基概念和類型
（1） 培養基的概念：人們按照微生物對 的不同需求，配制出供其 的營養基質。
（2）培養基的作用：用以___ __、___ __、___ __、___ __微生物或___ __其代謝物。
（3）培養基的類型
標準 培養基種類 培養基特點 作用
物理性質 加凝固劑，如瓊脂 微生物的分離與鑒定，活菌計數，保藏菌種
容器放倒不致流出，劇烈震動則破散 觀察微生物的運動、分類鑒定
不加凝固劑 常用于工業生產
功能 根據某種微生物的特殊營養要求配置 選擇分離
加入能與目的菌的代謝產物發生顯色反應的指示劑 鑒定
成分來源 含化學成分不明確的天然物質 工業生產
用已知的化學物質配制 分類鑒定
2.培養基的配制
（1）基本成分：水、碳源、氮源、無機鹽。
①碳源:a.無機碳源：CO2、CO32-、HCO3-→______微生物；
b.有機碳源：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等→______微生物。
②氮源：a.無機氮源：NH4＋、NO3-、NH3等。
b.有機氮源：牛肉膏、蛋白胨、______、氨基酸等。
注意：含C、H、O、N的有機物是____ __微生物的碳源、氮源、能源。如____ __等。
【思考】為什么培養基需要氮源？
（2）特殊需求：某些微生物對___ ___、特殊營養物質以及____ __的需求。
①培養乳酸桿菌時，需要在培養基中添加___ ___；②培養霉菌時，需要將培養基調至_ _____；③培養細菌時，需要將培養基調至______或______；④培養厭氧微生物時，需要提供___ ___的條件。
二、無菌技術
1．獲得純凈的微生物培養物的關鍵： 。
2．消毒
（1）概念：指使用____________的物理、化學或生物等方法殺死物體____ __或__ ____一部分微生物。
（2）常用的消毒方法
①煮沸消毒法：100℃煮沸5～6min，可以殺死微生物的____________和一部分___ __。
②巴氏消毒法：62～65℃下消毒30 min或80～90℃處理30s～1min，適合一些___________的液體，如牛奶。可以殺死牛奶中的絕大多數微生物，并且不破壞牛奶的營養成分。
③化學藥劑消毒法：用________擦拭雙手、用______消毒水源等。
④紫外線消毒法：接種室、接種箱或超凈工作臺在使用前可用______照射30min。在照射前，適量噴灑______或______溶液等消毒液，可以加強消毒效果。
3.滅菌
（1）概念：指使用____ __的理化方法殺死物體____________的微生物，包括______和______。
（2）常用的滅菌方法
①濕熱滅菌：利用沸水、流通蒸汽或____________進行滅菌的方法。____________滅菌效果最好，100 kPa、121℃下維持15～30min，常用于______、______等的滅菌。
②干熱滅菌：將滅菌物品放入密閉容器如干熱滅菌箱，在160～170℃的熱空氣中維持2～3h。常用于____________和__________________的物品（如玻璃器皿、金屬用具等）。
③灼燒滅菌：將微生物的接種工具，如涂布器、______、______或其它金屬用具，直接在酒精燈火焰的____________層（外焰）灼燒，可以迅速徹底地滅菌。此外，在接種過程中，試管口、瓶口等容易被污染的部位，也可以通過____________來滅菌。
4.具體操作
（1）對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和___ ___。
（2）將用于微生物培養的器皿、接種用具和培養基等進行___ ___。
注意：避免已經______處理的材料用具與周圍的物品接觸。為了避免周圍環境中微生物的污染，操作都應在超凈工作臺并在____________附近進行。
【思考】無菌技術除用來防止實驗室的培養物被其他外來微生物污染外，還有什么作用？
三、微生物的純培養
1．純培養：在微生物學中，將接種于 內，在合適條件下形成的含 的群體稱為培養物。由 所獲得的微生物群體稱為純培養物，獲得 的過程就是純培養。
2．微生物純培養的步驟：微生物的純培養包括配制培養基、 、 、分離和培養等。
3．酵母菌的純培養
（1）菌落：分散的微生物在適宜的 表面或內部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態結構的 。
（2）獲得單菌落的方法： 法和 法。
【導學案】
一、制備培養基
1．培養基的配制原則
(1)目的要明確：不同的微生物需求不同，根據培養目的進行配制。
(2)營養要協調：營養物質的濃度和比例要適宜。
(3)pH要適宜：為維持pH的相對恒定，可在培養基中加入緩沖劑，常用K2HPO4－KH2PO4。
2．培養基的成分及功能
營養物質 作用 功能 主要來源
碳源 能為微生物代謝提供碳元素 構成生物體的細胞物質和一些代謝產物，有些是異養生物的能源物質 無機碳源：CO2、NaHCO3等；有機碳源：糖類、脂質、蛋白質、有機酸等
氮源 能為微生物的代謝提供氮元素 合成蛋白質、核酸以及含氮的代謝產物 無機化合物：N2、NH3、銨鹽、硝酸鹽等；有機氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等
水 是生命活動所必需的 不僅是優良的溶劑，而且可維持生物大分子結構的穩定 外界攝入
無機鹽 為微生物提供除碳、氮以外的各種重要元素，包括大量元素 細胞內的組成成分，生理調節物質，某些化能自養菌的能源，酶的激活劑 無機化合物
合作探究：
1.能夠利用無機碳源的微生物的同化作用類型是什么？
2.牛肉膏蛋白胨培養基是一種常見的細菌培養基，其中牛肉膏、蛋白胨能夠提供哪些營養成分？
消毒和滅菌
消毒 滅菌
概念 使用較為溫和的物理、化學或生物等方法殺死物體表面或內部一部分微生物(不包括芽孢和孢子) 使用強烈的理化方法殺死物體內外所有的微生物(包括芽孢和孢子)
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化學藥物消毒法、紫外線消毒法 灼燒滅菌、干熱滅菌、濕熱滅菌
適用對象 操作空間、某些液體、雙手等 接種環、接種針、玻璃器皿、培養基等
三、常用滅菌與消毒方法的比較
滅菌和消毒的種類 主要方法 應用范圍
滅菌 濕熱滅菌(高壓蒸汽滅菌法） 100 kPa、121 ℃維持15～30 min 培養基及多種器材、物品
干熱滅菌 干熱滅菌箱160～170 ℃加熱2～3 h 玻璃器皿(如吸管、培養皿等)、金屬用具等凡不適宜用其他方法滅菌而又能耐高溫的物品
灼燒滅菌 酒精燈火焰灼燒 微生物接種工具，如接種環、接種針或其他金屬用具等，接種過程中的試管口或瓶口等
消毒 煮沸消毒法 100 ℃煮沸5～6 min 家庭餐具等生活用品
巴氏消毒法 62～65 ℃煮30 min或80～90 ℃煮30 s～1 min 牛奶、啤酒、果酒和醬油等不宜進行高溫滅菌的液體
紫外線消毒 30 W紫外燈照射30 min 接種室空氣
化學藥物消毒 用體積分數為70%～75%的乙醇、碘酒涂抹，來蘇爾噴灑等 皮膚、傷口、動植物組織表面和空氣、手術器械、塑料或玻璃器皿等
合作探究：
4.無菌技術除了用來防止實驗室的培養物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？
對培養基、培養皿、接種環、實驗者的雙手、空氣和牛奶常采用的滅菌或消毒方法分別是什么？
四、培養基的成分及功能
營養物質 作用 功能 主要來源
碳源 能為微生物代謝提供碳元素 構成生物體的細胞物質和一些代謝產物，有些是異養生物的能源物質 無機碳源：CO2、NaHCO3等；有機碳源：糖類、脂質、蛋白質、有機酸等
氮源 能為微生物的代謝提供氮元素 合成蛋白質、核酸以及含氮的代謝產物 無機化合物：N2、NH3、銨鹽、硝酸鹽等；有機氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等
水 是生命活動所必需的 不僅是優良的溶劑，而且可維持生物大分子結構的穩定 外界攝入
無機鹽 為微生物提供除碳、氮以外的各種重要元素，包括大量元素 細胞內的組成成分，生理調節物質，某些化能自養菌的能源，酶的激活劑 無機化合物
【固學案】達標練習
判斷題
1．液體培養基含有水，而固體培養基不含水。 (　 　)
2．獲得純凈微生物培養物的關鍵是防止雜菌污染。 (　 　)
3．用于微生物培養的器皿、接種用具和培養基都要進行消毒。 (　 　)
4．培養基分裝到培養皿后進行滅菌。 (　 　)
5．平板冷凝后應將平板倒置，防止皿蓋上的冷凝水落入培養基，造成污染。(　 　)
6．轉換劃線角度后需要灼燒接種環再進行劃線。 (　 　)
二、選擇題
1.下列關于培養基的敘述,正確的是 (　 　)
A.培養基可為微生物的生長繁殖提供營養
B.培養微生物的培養基都含有水、碳源、氮源、無機鹽和維生素等
C.牛肉膏蛋白胨培養基屬于固體培養基,營養全面
D.微生物在固體培養基上生長時,可以形成肉眼可見的單個細菌
2.關于培養基中滿足微生物生長對pH、特殊營養物質及O2的需求,下列敘述錯誤的是 ( )
A.培養乳酸桿菌時需要在培養基中添加維生素
B.培養霉菌時一般需將培養基調至堿性
C.培養細菌時一般需將培養基調至中性或弱堿性
D.培養厭氧微生物時需要提供無氧的條件
3.下列關于滅菌和消毒的理解,正確的是 (　 　)
A.醫務人員進入工作區要全身滅菌
B.接種疫苗前要對注射區域進行消毒
C.消毒與滅菌的含義本質是相同的
D.常用的消毒方法有灼燒和高壓蒸汽
4.在生產、生活和科研實踐中,經常通過消毒和滅菌來避免雜菌的污染。下列關于消毒和滅菌的敘述,錯誤的是 (　　)
A.牛奶的消毒常用巴氏消毒法或高溫瞬時消毒法
B.水廠供應的自來水通常是經過高錳酸鉀消毒的
C.用紫外燈對密閉教室消毒前,適量噴灑消毒液可強化消毒效果
D.培養基不能放入干熱滅菌箱中進行干熱滅菌
5.微生物培養過程中,要十分重視無菌操作,現代生物學實驗中的許多方面也要進行無菌操作,防止雜菌污染。下列無菌操作錯誤的是 (　　)
A.接種時培養皿蓋只打開一條縫隙
B.菌種和培養基使用前均需滅菌處理
C.接種前、后都要灼燒斜面菌種試管口
D.高壓蒸汽滅菌既能殺死微生物的營養體,也能殺死芽孢等休眠體
6.下列有關平板劃線操作的敘述,正確的是 (　　)
A.用接種環蘸取菌液后需要立即塞上棉塞
B.待灼燒滅菌的接種環冷卻后再進行劃線
C.劃線結束后要形成首尾相連的環形圈
D.每次劃線都要在菌液中蘸取一環菌液
7.如圖為平板劃線法接種的示意圖。觀察或比較各種細菌菌落形態的最佳區域是 (　　)
A.① B.②
C.③ D.④
8.如圖是倒平板的操作,下列相關敘述錯誤的是 ( )
A.正確的操作順序是丙→乙→甲→丁 B.甲應在酒精燈火焰附近進行
C.此培養基不可能為液體培養基 D.完成甲后應快速進行丁操作
9.研究人員從市售酸奶中分離出一種叫嗜熱鏈球菌(St)的細菌,為了便于培養和純化,首先制備甲酚綠(BCG)牛乳培養基:將脫脂乳粉100 g加入500 mL蒸餾水中,再加入1.6%的BCG乙醇溶液(一種指示劑)1 mL,高壓蒸汽滅菌(80~90 ℃)20 min,即得溶液A。將酵母膏(富含蛋白質和B族維生素等)10 g,瓊脂20 g,蒸餾水500 mL,分別配制成pH為5.5和7.0的溶液,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min,即得溶液B。以無菌操作將A、B兩溶液等體積混合均勻,倒于平板,待冷凝后置于37 ℃恒溫培養箱中倒置培養24 h,若無雜菌生長,即可使用。然后通過平板劃線法進行培養和純化。根據以上材料回答問題:
(1)BCG培養基從物理性質分類屬于　　　　培養基。
(2)加入酵母膏的目的是　。
(3)常用的滅菌方法除了材料中提到的高壓蒸汽滅菌外,還有　　　　　、　　　　　。
(4)下列示意圖中正確的操作順序為　　　　。
(5)每次劃線前灼燒接種環是為了　　　　　　　　　　　　　,在第二次 以及后面的劃線操作時,總是從　　　　　　　　開始劃線,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(6)倒平板中的平板指的是　　　　　　　　。
【課后作業】
1.下列關于培養基的說法,正確的是 (　　)
A.為微生物的生長繁殖提供營養基質的是固體培養基
B.培養基只有兩類:液體培養基和固體培養基
C.固體培養基中加入少量水即可制成液體培養基
D.有的培養基還需要滿足微生物生長對pH、氧氣以及特殊營養物質的需求
2.硝化細菌廣泛存在于通氣性較好的土壤中,其部分代謝反應如圖所示,下列關于硝化細菌的培養條件的描述正確的是 (　　)
A.碳源為葡萄糖 B.培養時需隔絕空氣
C.氮源是氮氣 D.培養時需適宜的溫度
3.無菌技術是在操作過程中,保持無菌物品與無菌區域不被微生物污染的 技術,主要包括消毒和滅菌。下列相關敘述正確的是 (　　)
A.100 ℃煮沸消毒5~6 min,可以殺死微生物的營養細胞和一部分芽孢
B.巴氏消毒法在殺死牛奶中所有微生物的同時并基本不破壞牛奶的營養成分
C.進行動物細胞的傳代培養前,需用紫外線對超凈工作臺進行滅菌處理
D.高壓蒸汽滅菌是濕熱滅菌法中效果最好的,可用于培養皿的滅菌處理
4.無菌操作技術在生產生活中應用廣泛。下列相關敘述錯誤的是 (　　)
A.實驗者雙手用肥皂洗手后還需用酒精棉球擦拭
B.對培養基、接種環等可放入干熱滅菌箱中滅菌
C.使用后的培養基需經過徹底滅菌處理后方可丟棄
D.噴灑石炭酸配合紫外線照射可提高消毒效果
5.(不定項)如圖為實驗室培養和純化酵母菌過程中的部分操作步驟,下列說法不正確的是 (　　)
A.①步驟使用的培養基是已經調節pH并滅菌的培養基
B.①②③步驟操作時需要在酒精燈火焰旁進行
C.③到④的過程中,接種環共灼燒了5次
D.④步驟操作時,需將第1次和第5次的劃線相連
6.菜籽粕含有35%~45%的蛋白質,是畜禽飼料的重要原料,但其中的單寧等抗營養因子限制了菜籽粕的應用。研究者將不同菌種接種到菜籽粕與麩皮制成的固體培養基中發酵48 h,測定菜籽粕中單寧的含量,結果如圖。
下列相關敘述錯誤的是 (　　)
A.菜籽粕與麩皮為微生物提供碳源和氮源
B.接種后需對培養基進行高壓蒸汽滅菌
C.黑曲霉菌對單寧的去除效果最為理想
D.對照組為不接種微生物的固體培養基
7.某同學配制含瓊脂的牛肉膏蛋白胨培養基后,對培養基和培養皿進行高壓蒸汽滅菌,當培養基溫度下降到50 ℃時,在酒精燈火焰附近倒平板,待培養基冷卻至室溫,按如表處理:
組別 處理
A組 打開培養皿蓋,距地面0.3米處暴露15分鐘
B組 打開培養皿蓋,距地面0.6米處暴露15分鐘
C組 打開培養皿蓋,距地面0.9米處暴露15分鐘
D組 打開培養皿蓋,距地面1.2米處暴露15分鐘
E組 不打開培養皿蓋
將處理完畢的培養皿置于適宜溫度下培養2~3天,觀察每個培養皿中的菌落特征和數目。回答下列問題:
(1)上述實驗的實驗目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。若E組的培養基表面有菌落生長,說明　　　　　　　　　　。
(2)培養基中的牛肉膏和蛋白胨主要為微生物生長分別提供　　　　和　　　　　。“在酒精燈火焰附近”進行相關操作是為了　　　　　　　　　　　　　　。
(3)實驗過程特別強調溫度控制,請簡要說明下列溫控措施的目的:
①“待培養基冷卻至室溫”的目的有
。
②“將處理完畢的培養皿置于適宜溫度下培養”的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)培養微生物時將培養皿倒置的目的是　　　　　　　　　　　　　　。實驗結束后,對使用過的培養基應進行　　　　　處理。
8．回答下列與細菌培養相關的問題。
(1)在細菌培養時，培養基中能同時提供碳源、氮源的成分是________(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常，制備培養基時要根據所培養細菌的不同來調節培養基的pH，其原因是________。硝化細菌在沒有碳源的培養基上__________(填“能夠”或“不能”)生長，原因是________________。
(2)用平板培養細菌時一般需要將平板________(填“倒置”或“正置”)。
(3)單個細菌在平板上會形成菌落，研究人員通常可根據菌落的形狀、大小、顏色等特征來初步區分不同種的微生物，原因是___________________________。
(4)有些使用后的培養基在丟棄前需要經過________處理，這種處理可以殺死丟棄物中所有的微生物。
9．下表是培養某微生物的培養基的配方，請回答下列問題：
組分 牛肉膏 蛋白胨 NaCl 瓊脂 水
用量 5 g 10 g 5 g 20 g 1 000 mL
(1)培養基的類型很多，但培養基中一般都含有水、碳源、________和無機鹽。上述培養基配方中能充當碳源的成分是____________________。培養基配制完成以后，一般還要調節pH并對培養基進行________處理。
(2)在配制培養基時，除考慮營養條件外，還要考慮________、________和滲透壓等條件。
(3)在微生物培養操作過程中，為防止雜菌污染，需對培養基和培養器皿進行________(填“消毒”或“滅菌”)；操作者的雙手需進行清洗和________；空氣中的細菌可用紫外線殺滅，其原因是紫外線能使蛋白質________，還能損傷DNA的結構。
(4)分離純化微生物最常使用的接種方法是_____________和____________。
(5)在接種前需要檢測培養基是否被污染。對于固體培養基應采用的檢測方法是____________________________________________。
答案：
預學案
一、1.（1）營養物質 生長繁殖（2）培養 分離 鑒定 保存 積累（3）固體培養基 半固體培養基 液體培養基 選擇培養基 鑒定培養基 天然培養基 合成培養基
2、(1)自養 異養 尿素 異養型 氨基酸 培養基中的氮元素是微生物合成蛋白質、核酸等物質所必需的。
（2）pH O2 維生素 酸性 中性 弱堿性 無氧
二、1. 防止雜菌污染
2.(1) 較為溫和 表面 內部
(2) 營養細胞 芽孢 不耐高溫 70%酒精 氯氣 紫外線 石碳酸 煤酚皂
3、（1）強烈 內外所有 芽孢 孢子
（2）高壓蒸汽 高壓蒸汽 培養基 無菌水 耐高溫的 需要保持干燥 接種環 接種針 充分燃燒 火焰灼燒
4、（1）消毒 （2）滅菌 滅菌 酒精燈火焰 無菌技術還能有效避免操作者被微生物感染
三、1.培養基 特定種類微生物 單一個體繁殖 純培養物
2.滅菌 接種
3.固體培養基 子細胞群體 平板劃線 稀釋涂布平板
導學案
一、
能利用無機碳源的微生物的同化作用類型是自養型微生物。
牛肉膏、蛋白胨能夠提供碳源、氮源、維生素(生長因子)和無機鹽。
無菌技術還能有效避免操作者被微生物感染。
分別為高壓蒸汽滅菌、干熱滅菌、灼燒滅菌、化學藥物消毒、紫外線消毒、巴氏消毒。
固學案：
判斷題
×√× ×√　√ 　
1.A 2.B 3.B 4.B 5.B 6.B 7.D 8.D
　9.(1)固體　(2)為細菌的生長提供蛋白質和維生素　(3)干熱滅菌　灼燒滅菌　(4)ADBEC　(5)殺死接種環上殘留的菌種　上一次劃線的末端　使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐步減少　(6)冷卻凝固后的固體培養基
課后作業
1.D 2.D 3.A 4.B 5.CD 6.B
7. (1)探究不同高度空氣中微生物的種類和數量　平板滅菌不合格(受到雜菌污染)　(2)碳源　氮源　避免周圍環境中微生物的污染　(3)①使培養基凝固,防止培養基溫度過高殺死接種在其上的微生物　②讓微生物在適宜的溫度下生長(繁殖)　(4)防止冷凝后形成的水珠滴落在培養基上(污染培養基和破壞菌落)　滅菌
8. (1)蛋白胨　不同細菌生長繁殖所需的最適pH不同　能夠　硝化細菌可以利用空氣中的CO2作為碳源　(2)倒置　(3)在一定的培養條件下，不同種微生物表現出各自穩定的菌落特征　(4)滅菌
9. (1)氮源　牛肉膏　滅菌　(2)溫度　酸堿度　(3)滅菌　消毒　變性　(4)平板劃線法　稀釋涂布平板法　(5)將未接種的培養基在適宜的溫度下放置適宜的時間，觀察培養基上是否有菌落產生

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