資源簡介

易錯點28 基因工程
1.有關“啟動子、起始密碼子、終止子、終止密碼子”
位置 作用
啟動子 位于DNA分子上 RNA聚合酶識別和結合位點，啟動轉錄過程
起始 密碼子 位于mRNA分子上 決定翻譯的開始
終止子 位于DNA分子上 決定轉錄的結束
終止 密碼子 位于mRNA分子上 決定翻譯的結束
2.有關“DNA有關的酶”
名稱 作用部位 作用底物 作用結果
限制酶 磷酸二酯鍵 DNA 將DNA切成兩個片段
DNA連接酶 磷酸二酯鍵 DNA片段 將兩個DNA片段連接為一個DNA分子
DNA聚合酶或熱穩定DNA聚合酶(Taq酶) 磷酸二酯鍵 脫氧核苷酸 將單個脫氧核苷酸依次連接到DNA單鏈末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯鍵 DNA 將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸
解旋酶 堿基對之間的氫鍵 DNA 將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈
RNA聚合酶 磷酸二酯鍵 核糖核苷酸 將單個核糖核苷酸依次連接到RNA單鏈末端
3.有關“質粒”
質粒是一種裸露的、結構簡單、獨立于細菌擬核DNA之外，并具有自我復制能力的很小的雙鏈環狀DNA分子。
有關“基因治療”
基因治療：把正常基因導入病人體內，使該基因的表達產物發揮功能，從而達到治療疾病的目的，是治療遺傳病的最有效手段。
　　方法 比較　　 體外基因治療 體內基因治療
不 同點 途徑 從患者體內獲取某種細胞→體外完成基因轉移→篩選、細胞擴增→輸入體內 直接向患者體內組織細胞中轉移基因
特點 操作復雜，但效果可靠 方法較簡單，但效果難以控制
相同點 都是將外源基因導入靶細胞，以糾正缺陷基因，目前兩種方法都處于臨床試驗階段
1．下圖為不同限制性核酸內切膀識別的序列及切割位置（箭頭所指），下列敘述錯誤的是（ ）
A．圖示4種限制性核酸內切酶均不能夠識別和切割RNA分子內的核苷酸序列
B．若DNA上的堿基隨機排列，Not I限制性核酸內切酶切割位點出現頻率較其他三種限制性核酸內切酶高
C．酶切時使用兩種限制酶同時處理是為了防止質粒和含目的基因的外源DNA片段自身環化
D．用酶Bgl II切出的目的基因與酶BamH I切割的質粒重組后，則不能再被這兩種酶切開
【答案】B
【分析】1、常用的運載體：質粒（質粒是一種裸露的、結構簡單、獨立于細菌擬核DNA之外并具有自我復制能力的雙鏈環狀DNA分子）、噬菌體的衍生物、動植物病毒。
2、作為運載體必須具備的條件：①要具有限制酶的切割位點； ②要有標記基因（如抗性基因），以便于重組后重組子的篩選；③能在宿主細胞中穩定存在并復制；④是安全的，對受體細胞無害，而且要易從供體細胞分離出來。
3、天然的質粒不能直接作為載體，基因工程中用到的質粒都是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的。
【詳解】A、酶具有專一性，限制酶是專門切割DNA序列中一定部位的酶，所以圖示4種限制性核酸內切酶均不能夠識別和切割RNA分子內的核苷酸序列，A正確；
B、由于Not I限制性核酸內切酶識別的序列比其他三種酶的序列長，若DNA上的堿基隨機排列，Not I限制性核酸內切酶切割位點出現頻率較其他三種限制性核酸內切酶低，B錯誤；
C、兩種不同的限制酶可產生不同的黏性末端，所以使用兩種限制酶同時處理是為了防止質粒和含目的基因的外源DNA片段自身環化，C正確；
D、用酶BglⅡ切出的目的基因與酶BamHⅠ切割的質粒重組后，重組DNA分子序列為，6個脫氧核苷酸對序列既不能被限制酶BglⅡ識別，也不能被BamHⅠ識別，所以不可能被這兩種酶切開 ，D正確。
故選B。
2．下圖是將人的生長激素基因導入細菌B細胞內制造“工程菌”的示意圖。已知細菌B細胞內不含質粒A，也不含質粒A上的基因。判斷下列說法正確的是（ ）
A．將重組質粒導入細菌B常用的方法是用Ca2+處理細菌
B．將完成導入過程后的細菌涂布在含有四環素的培養基上，能生長的是只導入了質粒A的細菌
C．目的基因成功表達的標志是受體細胞能在含有四環素的培養基上生長
D．工程菌產生的生長激素可以直接使用效果良好
【答案】A
【分析】題圖分析：圖示表示將人的生長激素基因導入細菌B細胞內制造“工程菌”的過程。質粒A上含有四環素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因，構建基因表達載體后，破壞了質粒A的氨芐青霉素抗性基因，但四環素抗性基因正常，所以導入重組質粒或普通質粒的大腸桿菌都能抗四環素，但導入重組質粒的大腸桿菌不能抗氨芐青霉素。
【詳解】A、將重組質粒導入細菌B常用的方法是鈣離子處理法（CaCl2溶液），使細菌處于易于吸收外源DNA的狀態，A正確；
B、因為目的基因插入了氨芐青霉素抗性基因，而四環素抗性基因正常，因此導入了重組質粒的細菌能在含有四環素的培養基上生長，但導入空白質粒的細菌也能在此培養基上生長，B錯誤；
C、目的基因成功表達的標志是合成人的生長激素，而不是在含有四環素的培養基上生長，C錯誤；
D、由于細菌無內質網和高爾基體，對合成的生長激素不能加工、修飾，故工程菌產生的生長激素不能直接使用，D錯誤。
故選A。
3．某種熒光蛋白（GFP）在紫外光或藍光激發下會發出綠色熒光，這一特性可用于檢測細胞中目的基因的表達。某科研團隊將某種病毒的外殼蛋白（L1）基因連接在GFP基因的5’端，獲得了L1-GFP融合基因（簡稱為n），并將其插入質粒P，構建基因表達載體P1，其部分結構和酶切位點的示意圖如下（圖中E1~E4四種限制酶產生的黏性末端各不相同）。
回答下列問題：
(1)據圖推斷，該團隊在將n插入質粒P時，應使用圖示中的_______________進行酶切，這是為了保證_______________。
(2)體外利用PCR技術擴增基因n時，①使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是_______________；②利用PCR技術擴增基因n時，設計的引物之間不能_______________，以避免影響引物與相應單鏈的結合。
(3)將P1轉入大腸桿菌后，若在該大腸桿菌中觀察到了綠色熒光，則說明L1基因在大腸樣菌中依次完成了____________過程。
(4)真核生物基因（目的基因）在大腸桿菌細胞內表達時，表達出的蛋白質可能會被降解。為防止蛋白質被降解，在實驗中應選用____________的大腸桿菌作為受體細胞，在蛋白質純化的過程中應添加__________________的抑制劑。
【答案】(1) E1和E4 保證n（L1-GFP融合基因）的完整性
(2) Taq酶熱穩定性高,而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活 堿基互補配對
(3)轉錄和翻譯
(4) 蛋白酶缺陷型 蛋白酶
【分析】利用PCR技術擴增目的基因時需使用一種特殊的酶，即熱穩定的DNA聚合酶 (或Taq酶) 。利用PCR技術擴增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核甘酸序列，以便據此合成引物，PCR擴增的過程是:目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈，引物與單鏈相應互補序列結合，然后在DNA聚合酶作用下延伸，如此重復循環多次。
【詳解】（1）L1-GFP融合基因（n）將作為目的基因插入質粒P，在將n插入質粒P時，應使用圖示中的E1和E4進行酶切，這是為了保證L1-GFP融合基因（或n）的完整性。
（2）目前在PCR反應中使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是Taq酶熱穩定性高,而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活。
引物通過堿基互補配對形成氫鍵和相應的模板單鏈結合，利用PCR技術擴增基因n時，設計的引物之間不能堿基互補配對，以避免影響引物與相應單鏈的結合。
（3）將P1轉入大腸桿菌后，若在該大腸桿菌中觀察到了綠色熒光，說明有熒光蛋白合成，則說明L1基因在大腸樣菌中依次完成了轉錄和翻譯過程。
（4）真核生物基因(的基因) 在大腸桿菌細胞內表達時，表達出的蛋白質可能會被降解，為防止蛋白質被降解，選擇的大腸桿菌體內應該沒有可以降解蛋白質的酶，所以選擇蛋白酶缺陷型的大腸桿菌作為受體細胞，在蛋白質純化的過程中應添加蛋白酶的抑制劑。
1.限制酶的選擇方法
根據目的基因兩端的限制酶切割位點、質粒上的限制酶切割位點以及是否破壞目的基因和標記基因等來確定限制酶的種類。
（1）應選擇酶切位點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇Pst Ⅰ；不能選擇酶切位點位于目的基因內部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。
（2）為避免目的基因及質粒的自身環化、反向連接，也可使用不同的限制酶（非同尾酶）切割目的基因所在片段和質粒（雙酶切），如圖甲可選擇用Pst Ⅰ和EcoRⅠ兩種限制酶（但要確保質粒上也有這兩種酶的切割位點）。
（3）切割質粒的限制酶不能同時切開質粒上的所有標記基因，即至少要保留一個標記基因，以用于重組DNA的鑒定和篩選，如圖乙中的質粒不能使用Sma Ⅰ切割。
2.標記基因的作用
標記基因可用于檢測目的基因是否導入受體細胞：
3.農桿菌轉化法分析
（1）構建基因表達載體需要兩種工具酶：限制酶和DNA連接酶。
（2）基因表達載體（重組質粒）導入農桿菌細胞時，要用Ca2＋處理農桿菌細胞，使其處于感受態，有利于重組質粒的導入。
（3）將導入目的基因的受體細胞培育成完整的植株要用到植物組織培養技術。
【拓展】如何篩選出含有目的基因的受體細胞
（1）原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，如果插入某種抗生素抗性基因內部，則會導致該抗生素抗性基因失活。如下圖，目的基因插入四環素抗性基因內部，則四環素抗性基因失活。
（2）被轉化的細菌有三種：含環狀目的基因的細菌、含重組質粒的細菌、含自身環化質粒的細菌。
（3）篩選方法：將混合處理后的細菌先放在含氨芐青霉素的培養基上培養，能生長的是含重組質粒的細菌和含自身環化質粒的細菌，如圖1、2、3、4、5菌落，再利用無菌的絨布影印到含有四環素的培養基上，如圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環素培養基上不生長的即為含有目的基因的菌落，如圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養基上挑取1、5菌落進行培養。
4．幾種獲取目的基因方法的比較
項目 從基因文庫中獲取 人工合成
方法 從基因組文庫中獲取 從cDNA文庫中獲取 化學合成法 反轉錄法
過 程 供體細胞中的DNA ↓限制酶 許多DNA片段 ↓插入 載體 ↓導入 受體菌群(基因組文庫) ↓ 外源DNA擴增，產生特定性狀 ↓分離 目的基因 目的基因的 mRNA ↓反轉錄 單鏈DNA ↓合成 雙鏈DNA ↓插入 載體 ↓導入 受體菌群 (cDNA文庫) ↓分離 目的基因 蛋白質的氨 基酸序列 ↓推測 mRNA的核 苷酸序列 ↓推測 基因的核苷 酸序列 ↓化學合成 目的基因 目的基因的mRN A ↓反轉錄 單鏈DNA ↓合成 雙鏈DNA (即目的 基因)
說 明 將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫，包括基因組文庫和cDNA文庫 適用于片段較小，核苷酸序列已知的目的基因；利用DNA合成儀合成 以RNA為模板，需要逆轉錄酶
5.PCR技術相關分析
(1)PCR技術的過程
關于引物的2點提醒：①引物是一小段單鏈的DNA或RNA，作為新子鏈的合成起點，只能結合在母鏈的3′端；②只有通過引物，DNA才可以開始進行復制。
(2)PCR技術和DNA復制的比較
6．基因表達載體構建過程
若考慮兩兩相連，則DNA連接酶連接DNA片段會出現三種情況：目的基因與目的基因的連接、目的基因與質粒的連接、質粒與質粒的連接，需篩選出重組質粒。
7.蛋白質工程與基因工程的比較
項目 蛋白質工程 基因工程
區別 原理 中心法則的逆推、中心法則 基因重組
實質 定向改造或生產人類所需的蛋白質 定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的生物類型或生物產品(基因的異體表達)
結果 可生產自然界沒有的蛋白質 生產自然界已有的蛋白質
聯系 ①蛋白質工程是在基因工程基礎上延伸出來的第二代基因工程，對現有蛋白質的改造或制造新的蛋白質，必須通過基因修飾或基因合成實現；②基因工程所利用的某些酶需要通過蛋白質工程進行修飾、改造
8．DNA的粗提取與鑒定實驗
（1）DNA的粗提取與鑒定實驗中的“2、4、4”
實驗操作 實驗操作的目的
加蒸餾水2次 ①加到雞血細胞液中，使血細胞吸水漲破；②加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物質的量濃度稀釋到0.14 mol/L，使DNA析出
用紗布過濾4次 ①過濾血細胞破裂液，得到含細胞核物質的濾液；②過濾用2 mol/L的NaCl溶液充分溶解的DNA，濾去溶液中的雜質；③濾取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；④過濾溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液
用NaCl溶液4次 ①加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的細胞核物質；②用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出；③用2 mol/L的NaCl溶液，溶解濾取的DNA黏稠物；④用2 mol/L的NaCl溶液，溶解絲狀物用于鑒定DNA
（2）注意事項
(1)本實驗不能用哺乳動物成熟的紅細胞作實驗材料，原因是哺乳動物成熟的紅細胞無細胞核(無DNA)。可選用雞血細胞作材料。
(2)加入洗滌劑后，動作要輕緩、柔和，否則容易產生大量的泡沫，不利于后續步驟的操作。加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。
(3)二苯胺試劑要現配現用，否則會影響鑒定的效果。
(4)提取植物細胞的DNA時，加入的洗滌劑能溶解細胞膜，有利于DNA的釋放；加入食鹽(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。
(5)在DNA進一步提純時，選用冷卻的體積分數為95%的酒精溶液的作用是溶解雜質和析出DNA。
1．下圖表示pBR322質粒和人生長激素基因所在片段的結構信息，將二者構建的重組質粒導入受體菌并進行篩選。下列敘述正確的是（ ）
注：AmpR：氨芐青霉素抗性基因，TetR：四環素抗性基因
A．應選擇的限制酶E組合和酶F
B．所選用的受體菌不能含有AmpR和TetR基因
C．用含氨芐青霉素的培養基只能篩選出含重組質粒的受體菌
D．同時用三種限制酶處理圖中質粒，電泳后可得到3個條帶
【答案】B
【分析】題圖分析，切割目的基因和質粒最好用酶F和酶G，這樣可以獲得不同的黏性末端，而且目的基因的兩端也具有這兩種限制酶的切割位點，既避免切割后DNA片段的自身環化，又保留質粒上的標記基因，由圖可知構建基因表達載體破壞了四環素抗性基因，保留了氨芐青霉素抗性基因。
【詳解】A、酶E會破壞兩種標記基因，為避免切割后DNA片段的自身環化，又保留質粒上的標記基因，切割時應選擇的限制酶組合是酶F和酶G，A錯誤；
B、所選用的受體菌不能含有AmpR和TetR基因，以便于對含有目的基因的受體菌的選擇，B正確；
C、用含氨芐青霉素的培養基篩選出的有導入重組質粒的受體菌和導入原質粒的受體菌，C錯誤；
D、據圖可知同時用三種限制酶處理圖中質粒，因酶E有兩個作用位點，故將質粒切割成了4個DNA片段，電泳后可得到4個條帶，D錯誤。
故選B。
2．下圖為科研人員研發冠狀病毒疫苗的幾種技術思路，請回答：
(1)途徑Ⅰ與途徑Ⅱ相比，疫苗安全性更高的是途徑_____。途徑Ⅲ中，過程①的操作需要_____酶，該途徑涉及技術的核心是_____（用圖中數字作答）。除圖中所示外，常見疫苗類型還有_____。
(2)途徑IV生產的DNA疫苗在動物細胞中表達將引起機體免疫應答。與DNA疫苗相比，mRNA疫苗的安全性更有優勢，因為mRNA不會進入細胞核，無_____的風險，且易被_____水解，不會遺傳給子細胞。
(3)人體在感染新冠病毒后可引發“細胞因子風暴”（機體感染病原體后，體液中多種細胞因子迅速大量產生的現象），進而傷害正常細胞。“細胞因子風暴”引發的免疫功能異常稱為_____。
(4)該病毒表面蛋白A為主要抗原，為進一步獲得更符合治療要求的單克隆抗體，科研人員通過仔細研究，找到既不影響抗體空間結構又降低免疫反應的_____序列，借助基因工程技術對抗體結構進行人源化改造。
(5)科研人員發現利用農桿菌轉化法培育出的抗蟲棉品種自交的后代中，抗蟲植株均有某抗病性狀，原因可能是：
①_____。
②_____。
【答案】(1) Ⅱ 逆轉錄 ③ 減毒的微生物
(2) 整合到宿主細胞染色體基因組中 RNA（水解）酶
(3)自身免疫病
(4)氨基酸
(5) 該抗蟲品種是抗病基因純合子 抗蟲基因與抗病基因位于同一條染色體上
【分析】1.通常的疫苗為滅活或減毒的病原體（抗原），預防接種的原理在于利用對人基本無毒的抗原刺激人體的免疫系統產生對某種病原體的記憶。
2.基因工程的工具有限制酶、DNA連接酶、基因的載體。限制酶識別DNA分子中特定核苷酸序列，在特定的部位將兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。常用的載體有質粒、動植物病毒、λ噬菌體的衍生物等。將目的基因導入植物細胞常用農桿菌轉化法，農桿菌中的Ti質粒上的T-DNA可整合到受體細胞的染色體DNA上。基因表達載體常包括目的基因、啟動子、終止子、標記基因。標記基因是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。
3.蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規律及其生物功能的關系作為基礎，通過基因修飾或基因合成，對現有蛋白質進行改造，或制造一種新的蛋白質，以滿足人類的生產和生活的需求。
【詳解】（1）途徑Ⅱ利用的是裂解病毒提取的抗原蛋白，途徑Ⅰ利用的是滅活病毒，因此兩種途徑制備的疫苗，Ⅱ更安全，途徑Ⅲ中，過程①表示利用病毒RNA合成DNA片段的過程，是逆轉錄，需要逆轉錄酶的參與，基因工程涉及技術的核心是基因表達載體的構建即③；除圖中所示外，常見的疫苗類型還有減毒的微生物等。
（2）因為mRNA不會進入細胞核，無整合到宿主細胞染色體基因組中的風險，且易被RNA（水解）酶水解，不會遺傳給子細胞，因而與DNA疫苗相比，mRNA疫苗的安全性更有優勢。
（3）“細胞因子風暴”是由于機體感染病原體后，體液中多種細胞因子迅速大量產生的現象，免疫機能過強，進而傷害正常細胞，因此屬于自身免疫病。
（4）該病毒表面蛋白A為主要抗原，有可能會引起“細胞因子風暴”，為進一步獲得更符合治療要求的單克隆抗體，可以找到既不影響抗體空間結構又降低免疫反應的氨基酸序列，再借助基因工程技術對抗體結構進行人源化改造。
（5）農桿菌轉化法將抗蟲基因整合到棉花的染色體DNA上，抗蟲棉品種自交的后代中，抗蟲植株均有某抗病性狀，則可能原因有：（1）該受體棉花細胞是抗病基因純合子，自交后代全是抗病純合子。（2）抗蟲基因正好整合到含有抗病基因的染色體上，兩種基因一起遺傳。
【點睛】通過疫苗技術思路情境，考查疫苗的原理、基因工程疫苗的生產步驟、蛋白質工程等知識。
3．戊型肝炎病毒是一種RNA病毒，ORF2基因編碼的結構蛋白（pORF2）位于病毒衣殼表面。我國科研人員利用基因工程技術，在大腸桿菌中表達pORF2，制備戊型肝炎疫苗，過程如下圖。請回答下列問題：
(1)過程①④需要的酶分別是____________、____________。
(2)過程⑤需要用____________處理大腸桿菌使其成為____________細胞，以完成轉化過程。
(3)基因表達載體上ORF2基因的啟動子需來源于____________。表達載體上往往帶有抗性基因，其作用是____________。
(4)生產pORF2的意義主要有兩個：一是開發戊肝疫苗，用于預防戊型肝炎；二是用于戊肝抗體診斷試劑盒的生產。抗體診斷試劑盒所利用的原理是____________。
【答案】(1) 逆轉錄酶（多答限制酶也給分，只答限制酶不給分） DNA連接酶
(2) Ca2+ 感受態
(3) 大腸桿菌 鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來
(4)抗原―抗體雜交（或抗原與抗體特異性結合）
【分析】題圖分析，肝炎病毒的遺傳物質是RNA，因此，圖中①過程表示目的基因的獲取過程，經過逆轉錄過程，用到逆轉錄酶，②表示從大腸桿菌中獲取所需要的質粒，③表示對質粒進行切割，便于和目的基因連接，④表示目的基因表達載體的構建過程，該過程需要DNA連接酶，⑤將目的基因導入到受體細胞中，⑥從轉基因大腸桿菌的培養液中活動結構蛋白。
【詳解】（1）戊型肝炎病毒是一種RNA病毒，過程①是以病毒RNA為模板合成DNA的過程，需要的酶是逆轉錄酶；過程④是將目的基因與質粒連接在一起，需要的酶是DNA連接酶。
（2）⑤過程表示將目的基因導入大腸桿菌的過程，由于受體細胞是大腸桿菌，通常需要用Ca2+處理大腸桿菌，使其成為感受態，增大大腸桿菌細胞壁的透過性，利于吸收周圍環境中DNA，以完成轉化過程。
（3）啟動子是一段有特殊結構的DNA片段，其作用是驅動目的基因的轉錄，啟動子具有物種或組織特異性，構建在大腸桿菌細胞內特異性表達pORF2蛋白的載體時，需要選擇大腸桿菌細胞的啟動子。標記基因的作用是鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。
（4）生產pORF2的意義主要有兩個：一是開發戊肝疫苗，用于預防戊型肝炎；二是用于戊肝抗體診斷試劑盒的生產。戊肝抗體診斷試劑盒利用抗原一抗體雜交原理，即利用了抗原和抗體發生特異性結合的原理實現的，通過檢測是否產生雜交帶來分析被測個體體內是否產生pORF2的特異性抗體。
1．二代乙肝疫苗是將乙肝病毒表面抗原基因進行質粒構建，再將重組質粒導入酵母菌，經發酵、純化制作而成。下列敘述錯誤的是（ ）
A．構建重組質粒需要限制酶和DNA連接酶
B．重組質粒的構建是一種DNA重組技術
C．二代乙肝疫苗是酵母菌細胞產生的抗體
D．該技術定向地改造了生物的遺傳性狀
【答案】C
【分析】疫苗是將病原微生物（如細菌、立克次氏體、病毒等）及其代謝產物，經過人工減毒、滅活或利用轉基因等方法制成的用于預防傳染病的自動免疫制劑。疫苗保留了病原菌刺激動物體免疫系統的特性。當動物體接觸到這種不具傷害力的病原菌后，免疫系統便會產生一定的保護物質，如免疫激素、活性生理物質、特殊抗體等；當動物再次接觸到這種病原菌時，動物體的免疫系統便會依循其原有的記憶，制造更多的保護物質來阻止病原菌的傷害。
【詳解】A、構建重組質粒需要限制酶分別對質粒和目的基因進行切割，再用DNA連接酶進行連接，A正確；
B、質粒是環狀DNA，重組質粒的構建是一種DNA重組技術，B正確；
C、二代乙肝疫苗是酵母菌細胞產生的蛋白質，可以使機體產生記憶細胞和抗體，C錯誤；
D、該技術定向地改造了生物的遺傳性狀，使酵母菌能產生乙肝疫苗，D正確。
故選C。
2．Kampen等科學家為研究脂肪酶突變體對底物專一性的影響，將其蛋白質第356位的絲氨酸替換為纈氨酸，發現其活性降低了12倍，下列敘述錯誤的是（　　）
A．上述過程屬于蛋白質工程
B．蛋白質工程需要構建重組DNA分子
C．該過程的實質是對脂肪酶在分子水平上進行改造
D．常用化學方法直接將脂肪酶第356位的絲氨酸替換為纈氨酸
【答案】D
【分析】蛋白質工程指以蛋白質的結構規律及其與生物功能的關系作為基礎，通過基因修飾或基因合成，對現有蛋白質進行基因改造，或制造一種新的蛋白質，以滿足人類的生產和生活的需要。
蛋白質工程的過程：預期蛋白質功能→設計預期的蛋白質結構→推測應有氨基酸序列→找到對應的脫氧核苷酸序列（基因）→最終還是回到基因工程上來解決蛋白質的合成。
【詳解】A、將蛋白質第356位的絲氨酸替換為纈氨酸， 是以蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系作為基礎，通過改造或合成基因，來改造現有蛋白質，屬于蛋白質工程，A正確；
B、蛋白質工程是對基因進行修飾改造或重新合成，然后進行表達，須構建重組DNA分子，B正確；
C、蛋白質工程是在分子水平上對現有蛋白質的基因分子進行操作，對蛋白質在分子水平上進行改造，C正確；
D、蛋白質工程不是直接對氨基酸進行替換，而是從預期蛋白質功能→設計預期的蛋白質結構→推測應有氨基酸序列→找到對應的脫氧核苷酸序列（基因）→最終還是回到基因工程上來解決蛋白質的合成，D錯誤。
故選D。
3．利用PCR技術擴增目的基因，其原理與細胞內DNA復制類似（如下圖所示）。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎。下列敘述錯誤的是（ ）
A．用PCR方法擴增目的基因時不必知道基因的全部序列
B．設計引物時需要避免引物之間形成堿基互補配對而造成引物自連
C．復性溫度過高可能導致PCR反應得不到任何擴增產物
D．第四輪循環產物中同時含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例為15/16
【答案】D
【分析】1、PCR原理：在高溫的作用下，打開DNA雙鏈，每條DNA單鏈作為母鏈，以4中游離脫氧核苷酸為原料，合成子鏈，在引物作用下，DNA聚合酶從引物3'端開始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5'端向3'端延伸的。實際上就是在體外模擬細胞內DNA的復制過程。DNA的復制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈。
2、PCR反應過程是：變性→復性→延伸。
【詳解】A、用PCR方法擴增目的基因時不必知道基因的全部序列，只需要知道一段已知目的基因的核苷酸序列，從而根據這段序列合成引物，A正確；
B、設計引物時需要避免引物之間形成堿基互補配對而造成引物自連，B正確；
C、復性的目的是引物與模板DNA結合，故復性溫度過高可能導致引物與模板DNA不能結合，因而使得PCR反應得不到任何擴增產物，C正確；
D、DNA復制為半保留復制，DNA復制n次，共形成2n個DNA，其中兩個DNA含有母鏈和子鏈（引物A或引物B），（2n-2）個DNA都含有子鏈（含有引物A和引物B），第四輪循環即DNA復制4次，共形成16個DNA，其中2個DNA含有引物A或引物B，所以第四輪循環產物中同時含有引物A和引物B的DNA片段所占的比率為14/16＝7/8，D錯誤。
故選D。
4．下列利用洋蔥進行“DNA的粗提取與鑒定”實驗的敘述，正確的是（ ）
A．將研磨液加入切碎的洋蔥，充分研磨后過濾，要棄去上清液
B．采用體積分數為95%酒精溶液析出DNA的方法可去除部分雜質
C．用塑料離心管是因為用玻璃離心管容易破損
D．將白色絲狀物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺試劑后振蕩，觀察顏色變化
【答案】B
【分析】DNA粗提取和鑒定的原理：
(1)DNA的溶解性：DNA和蛋白質等其他成分在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但細胞中的某些蛋白質溶于酒精，DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性。
(2)DNA的鑒定：在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會被染成藍色。
【詳解】A、將研磨液加入切碎的洋蔥，充分研磨后過濾要棄去沉淀物，收集上清液，A錯誤；
B、DNA 不溶于酒精溶液，但是細胞中的某些蛋白質溶于酒精，利用這一原理可將 DNA 與蛋白質進一步分離，進行DNA的粗提取，B正確；
C、用塑料離心管可減少提取過程中 DNA的損失，C錯誤；
D、將白色絲狀物溶解在 NaCl溶液中，加入二苯胺試劑后沸水加熱5min，觀察顏色變化，D錯誤。
故選B。
5．下列有關限制酶和DNA連接酶的敘述正確的是（　　）
A．限制酶將DNA雙鏈切割成兩條單鏈
B．同種限制酶既可以切割含目的基因的DNA片段又可以切割質粒，因此不具有專一性
C．序列—CTAG↓—和—G↓GATCC—被限制酶切出的黏性末端相同
D．E．coli DNA連接酶能催化平末端和黏性末端的連接
【答案】C
【分析】限制性核酸內切酶是可以識別并附著特定的核苷酸序列，并對每條鏈中特定部位的兩個脫氧核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵進行切割的一類酶，簡稱限制酶。
【詳解】A、DNA雙鏈之間為氫鍵相連，而限制酶破壞的是磷酸二酯鍵，因此將DNA雙鏈切割成兩段，A錯誤；
B、同種限制酶既可以切割含目的基因的DNA片段又可以切割質粒，是由于目的基因和質粒都具有相同的酶切位點，因此具有專一性，B錯誤；
C、序列—CTAG↓—和—G↓GATCC—被限制酶切出的黏性末端相同，均為GATC—，C正確；
D、E．coli DNA連接酶能催化黏性末端的連接，不能催化平末端連接，D錯誤。
故選C。
6．“試管嬰兒”技術是通過將不孕夫婦的精子和卵細胞取出，在試管中完成受精，并在試管中培養使其發育到如圖所示的時期，再將胚胎植入女性子宮內發育成胎兒，該技術使一部分不能生育的夫婦重新獲得了生育的機會。下列敘述錯誤的是（ ）
A．“試管嬰兒”技術在生物學上所依據的原理是有性生殖
B．試管嬰兒技術中為了某些需要，需要提取③處的細胞DNA進行檢測
C．“試管嬰兒”的形成用到的技術有人工授精、體內培養、核移植
D．設計試管嬰兒與普通試管嬰兒的區別在于前者在植入前需要對胚胎進行遺傳學診斷
【答案】C
【分析】1.試管嬰兒技術是指通過人工操作使卵子和精子在體外條件下成熟和受精，并通過培養發育為早期胚胎后，再經移植后產生后代的技術。
2.設計試管嬰兒技術是通過體外受精獲得許多胚胎，然后從中選擇符合要求的胚胎，再經移植后產生后代的技術。
【詳解】A、“試管嬰兒”技術中存在體外受精，經過兩性生殖細胞的融合，因此屬于有性生殖，A正確；
B、圖示時期是胚胎發育的囊胚期，①代表內細胞團，②代表囊胚腔，③代表滋養層，為了某些需要，需要提取③滋養層處的細胞DNA進行檢測，這樣可避免對胚胎造成傷害，B正確；
C、“試管嬰兒”的形成用到的技術有人工授精、早期胚胎培養、胚胎移植，C錯誤；
D、“設計試管嬰兒”技術可用于治療需要骨髓移植或造血干細胞移植的疾病，因此，在植入前需要對胚胎進行遺傳學診斷，“試管嬰兒”技術用于解決不孕不育問題，二者對人類的作用是不同的，D正確。
故選C。
7．抗蟲和耐除草劑玉米雙抗12-5是我國自主研發的轉基因品種。為給監管轉基因生物安全提供依據，采用PCR方法進行目的基因監測，反應程序如圖所示。下列敘述正確的是（ ）
A．預變性過程可促進模板DNA邊解旋邊復制
B．后延伸過程可使目的基因的擴增更加充分
C．延伸過程無需引物參與即可完成半保留復制
D．轉基因品種經檢測含有目的基因后即可上市
【答案】B
【分析】PCR過程為：①變性，當溫度上升到90℃以上時，氫鍵斷裂，雙鏈DNA解旋為單鏈；②復性，當溫度降低到50℃左右是，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合；③延伸，溫度上升到72℃左右，溶液中的四種脫氧核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。
【詳解】A、預變性是使引物完全變性解開，A錯誤；
B、后延伸過程后延伸是為了讓引物延伸完全并讓單鏈產物完全退火形成雙鏈結構，可使目的基因的擴增更加充分，B正確；
C、延伸過程需引物參與，C錯誤；
D、轉基因品種不只需要檢測是否含有目的基因，還要檢測是否表達，還有安全性問題，D錯誤；
故選B。
8．乙酰膽堿酯酶（AChE）是催化乙酰膽堿分解的水解酶，還能與有機磷農藥發生特異反應，在水質檢測中可用于有機磷農藥污染的快速檢測，乙酰膽堿酯酶對防治人類疾病、保護生態環境等方面的研究具有非常重要的意義。回答下列問題：
(1)AChE的提取與純化：AChE廣泛存在于各種動物組織中，欲從動物肝臟中提取AChE，獲取新鮮肝臟后，必須立即處理或低溫保存，因為______。將豬肝切碎后，加低溫蒸餾水，為了防止血液過快的凝結，可適量加入______，在組織搗碎機中搗碎后離心，取______用于進一步分離和純化。
(2)AChE的基因克隆技術：利用PCR技術或RT－PCR技術（即利用逆轉錄和PCR技術）克隆AChE基因時，反應體系中均需要加入______酶，加入dNTP用于提供______。PCR產物經______技術純化后，可用______酶處理回收的DNA和克隆載體，獲得重組DNA分子，最終達到體內克隆AChE基因的目的。
(3)AChE的基因表達：若構建大腸桿菌表達系統，最好選擇______技術（填“PCR”或“RT－PCR”）獲取AChE基因．與克隆AChE基因相比，表達載體中還需要加入大腸桿菌的______等。在培養大腸桿菌時，常使用______培養基進行擴大培養，用______法接種到平板上，更易獲得相應菌株。
(4)研究人員在進行某地水質檢測時，發現水樣能與AChE發生特異反應，若不及時治理，可能會造成水體______。
【答案】(1) 乙酰膽堿酯酶很有可能失去活性 血液抗凝劑 上清液
(2) 耐高溫的DNA聚合酶##Taq DNA聚合酶##Taq酶##耐高溫的TaqDNA聚合酶 原料和能量 凝膠電泳 限制性內切核酸酶和DNA連接酶
(3) RT－PCR 啟動子和終止子 LB液體 稀釋涂布平板
(4)富營養化
【分析】PCR技術：
（1）概念：PCR全稱為聚合酶鏈式反應，是一項在生物體外復制特定DNA的核酸合成技術。
（2）原理：DNA復制。
（3）前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一對引物。
（4）條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對引物、熱穩定DNA聚合酶（Taq酶）。
（5）過程：①高溫變性：DNA解旋過程；②低溫復性：引物結合到互補鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈。PCR擴增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動解開。
【詳解】（1）從動物肝臟中提取AChE（乙酰膽堿酯酶）時，由于乙酰膽堿酯酶很容易活性，故應在獲取新鮮肝臟后，必須立即處理或低溫保存，為了防止血液過快的凝結，可適量加入血液抗凝劑，在組織搗碎機中搗碎后離心，沉淀物為細胞碎片、細胞器等，上清液中AChE的含量較多，故取上清液用于進一步分離和純化。
（2）利用PCR技術克隆AChE基因時，需要加入熱穩定DNA聚合酶（Taq酶），加入的dNTP既可以作為合成DNA的原料，又可以為反應提供能量，PCR產物可以用凝膠電泳技術進行純化，純化后的目的基因（AChE基因），可用限制性內切核酸酶和DNA連接酶處理回收的DNA和克隆載體，獲得基因表達載體。
（3）反轉錄PCR又稱逆轉錄PCR（RT-PCR），是以mRNA為模板進行的特殊PCR。真核生物的編碼區是不連續的，分為外顯子和內含子，在轉錄過程中會修剪內含子，并拼合外顯子來形成轉錄產物，原核生物的編碼區是連續的，由RT-PCR技術獲得的目的基因不含內含子，故在構建大腸桿菌表達系統，最好選擇RT－PCR技術獲取AChE基因。與克隆AChE基因相比，表達載體中還需要加入大腸桿菌的啟動子和終止子等，實驗中，大腸桿菌在LB液體（培養基）培養基中進行擴大培養，培養液經稀釋后，在LB固體培養基上進行涂布分離，并置于恒溫培養箱中培養，更易獲得相應菌株。
（4）水樣能與AChE發生特異反應，說明水樣中含有有機磷農藥，若不及時治理，可能會造成水體富營養化。
9．下圖表示某種綠色熒光蛋白基因表達載體的構建過程，綠色熒光蛋白基因有720個堿基對（bp），質粒有5369個堿基對（bp）。請據圖回答問題：
(1)質粒中“氨芐青霉素抗性基因”的作用是______________。研究發現復制原點處的A和T特別多，有利于DNA復制時______________過程的發生。
(2)限制酶BamHⅠ的識別序列和切割位點是G↓GATCC，該酶切形成的黏性末端是______________。過程③所需的工具酶是______________。
(3)已知圖中質粒經BamHⅠ、HindⅢ雙酶切后進行電泳，出現了一條長度為5300bp的DNA條帶，則重組質粒的長度為______________的DNA片段條帶。
(4)過程①用兩種限制酶切割質粒，與單一酶切相比，其優勢有______________。過程②通過PCR技術實現，進行PCR時，需要在兩種引物的______________端分別添加BamHⅠ和HindⅢ的識別序列。
(5)將重組質粒導入大腸桿菌前，要用CaCl2處理大腸桿菌，其目的是______________；進行篩選時，大腸桿菌培養基中除需要加入水、無機鹽、C源、N源、瓊脂等物質外，還要分別添加______________。
【答案】(1) 便于篩選目的基因是否導入受體細胞 解旋
(2) —CTAG DNA連接酶
(3)6020bp
(4) 可以避免目的基因自身環化；可使目的基因定向插入到運載體中 5'
(5) 使大腸桿菌處于感受態（或處于容易吸收DNA的狀態） 四環素、氨芐青霉素
【分析】在質粒上存在一個復制原點，兩個抗性基因和三個酶切位點，但是限制酶BamH的切割位點存在于四環素抗性基因中．因此在利用BamHl和Hindlll雙酶切割時，原質粒上將缺少部分片段；而目的基因也用這兩種酶進行切割，能夠保證目的基因和質粒之間定向連接．因此圖中③表示利用DNA連接酶形成重組質粒。PCR技術中，在低溫復性的過程中，引物將結合到DNA的兩條鏈上，并且遵循堿基的互補配對原則。
【詳解】（1）氨芐青霉素抗性基因屬于標記基因，質粒中標記基因的作用都是，便于篩選目的基因是否導入受體細胞；AT堿基對之間形成兩個氫鍵，C和G之間形成三個氫鍵，AT對多便于解旋。
（2）限制酶BamH的識別序列和切割位點是G↓GATCC，則該酶切割DNA后形成的黏性末端是—CTAG，過程③表示切割后的目的基因和質粒發生重組，該過程需要DNA連接酶。
（3） 根據題意可知，綠色熒光蛋白基因有720個堿基對 (bp），質粒有5369個堿基對 (bp)，質粒經BamHⅠ、HindⅢ雙酶切后進行電泳，出現了一條長度為5300bp的DNA條帶，說明5300bp的DNA條帶是原質粒中切去部分片段的質粒；重組質粒的長度=5300+720=6020kb。
（4）用同一種酶切割目的基因和質粒，可形成相同的黏性末端，在質粒和目的基因連接的時候可能出現反向連接，目的基因和質粒也能出現自身環化的可能性；故用兩種限制酶切割質粒，與單一酶切相比，可以避免目的基因自身環化；可使目的基因定向插入到運載體中。
（5）CaCl2處理大腸桿菌后，大腸桿菌會處于容易吸收DNA的狀態，也即是處于感受態。圖中的標記基因有四環素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因，四環素抗性基因已經被破壞，大腸桿菌培養基中除需要加入水、無機鹽、C源、N源、瓊脂等物質外，分別添加四環素、氨芐青霉素，選擇抗氨芐青霉素而不抗四環素的即為需要的目的菌株。
10．大腸桿菌pUC18質粒是基因工程中常用的載體。某限制酶在此質粒上的唯一酶切位點位于LacZ基因中，如果沒有插入外源基因，LacZ基因便可表達出β 半乳糖苷酶。當培養基中含有IPTG和X－gal時，X－gal便會被β 半乳糖苷酶水解成藍色，大腸桿菌將形成藍色菌落。反之，則形成白色菌落。下圖表示利用此質粒實施基因工程的主要流程。請分析并回答下列問題：
(1)基因工程的核心步驟是_______。
(2)目的基因插入質粒構建重組質粒的過程中，需要DNA連接酶恢復____鍵。
(3)將試管Ⅰ中的物質和大腸桿菌共同置于試管Ⅱ的目的是進行______；大腸桿菌需事先用_____進行處理，使大腸桿菌細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態。
(4)將試管Ⅱ中的菌液接種于選擇培養基上培養，培養基中應含有大腸桿菌必需的營養物質_______和生長因子，還應加入IPTG、X－gal以及氨芐青霉素，其中加入_______的作用是篩選出導入pUC18質粒和重組質粒的大腸桿菌。
(5)若觀察到培養基上出現____色菌落，則說明大腸桿菌中已成功導入了重組質粒。如果作為受體細胞的大腸桿菌也含有LacZ基因，則不利于重組質粒的篩選，原因是______。
【答案】(1)基因表達載體的構建
(2)磷酸二酯
(3) 轉化 Ca2＋
(4) 碳源、氮源、無機鹽、水 氨芐青霉素
(5) 白 無論大腸桿菌中是否導入重組質粒，均會呈現藍色菌落
【分析】分析題圖：大腸桿菌pUC18質粒含有氨芐青霉素抗性基因和LacZ基因，但限制酶的切割位點位于LacZ基因上，所以構建成的重組質粒含有氨芐青霉素抗性基因，但LacZ基因被破壞，不能產生β一半乳糖苷酶。試管Ⅰ中是基因表達載體，試管Ⅱ中是大腸桿菌，將試管I中的物質和大腸桿菌共同置于試管Ⅱ的目的是進行轉化，最后用選擇培養基進行篩選。
【詳解】（1）基因工程的核心步驟是構建基因表達載體，其組成必須有目的基因、啟動子、終止子以及標記基因等。
（2）目的基因插入質粒構建重組質粒的過程中，利用DNA連接酶連接載體和目的基因形成磷酸二酯鍵。
（3）將試管Ⅰ中的物質和大腸桿菌共同置于試管Ⅱ的目的是使目的基因進人受體細胞內，并在受體細胞內維持穩定和表達，即進行轉化；大腸桿菌需事先用Ca2+進行處理，增大細胞壁的通透性，使之處于易于吸收周圍環境中DNA分子的感受態。
（4）培養基中應含有大腸桿菌必需的營養物質，包括碳源、氮源、無機鹽、水和生長因子等，還應加入IPTG、X－gal以及氨芐青霉素。由于重組質粒含有氨芐青霉素抗性基因，且沒有被破壞，因此導入重組質粒的大腸桿菌能抗氨芐青霉素，所以培養基中加入氨芐青霉素的作用是篩選出導入pUC18質粒的大腸桿菌。
（5）重組質粒上的LacZ基因被破壞，不能產生β一半乳糖苷酶，若大腸桿菌中已成功導入了重組質粒，則其在含有IPTG和X-gal的培養基中形成白色菌落。如果作為受體細胞的大腸桿菌也含有LacZ基因，則無論大腸桿菌是否導入重組質粒，均會呈現藍色菌落。易錯點28 基因工程
1.有關“啟動子、起始密碼子、終止子、終止密碼子”
位置 作用
啟動子 位于DNA分子上 RNA聚合酶識別和結合位點，啟動轉錄過程
起始 密碼子 位于mRNA分子上 決定翻譯的開始
終止子 位于DNA分子上 決定轉錄的結束
終止 密碼子 位于mRNA分子上 決定翻譯的結束
2.有關“DNA有關的酶”
名稱 作用部位 作用底物 作用結果
限制酶 磷酸二酯鍵 DNA 將DNA切成兩個片段
DNA連接酶 磷酸二酯鍵 DNA片段 將兩個DNA片段連接為一個DNA分子
DNA聚合酶或熱穩定DNA聚合酶(Taq酶) 磷酸二酯鍵 脫氧核苷酸 將單個脫氧核苷酸依次連接到DNA單鏈末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯鍵 DNA 將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸
解旋酶 堿基對之間的氫鍵 DNA 將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈
RNA聚合酶 磷酸二酯鍵 核糖核苷酸 將單個核糖核苷酸依次連接到RNA單鏈末端
3.有關“質粒”
質粒是一種裸露的、結構簡單、獨立于細菌擬核DNA之外，并具有自我復制能力的很小的雙鏈環狀DNA分子。
有關“基因治療”
基因治療：把正常基因導入病人體內，使該基因的表達產物發揮功能，從而達到治療疾病的目的，是治療遺傳病的最有效手段。
　　方法 比較　　 體外基因治療 體內基因治療
不 同點 途徑 從患者體內獲取某種細胞→體外完成基因轉移→篩選、細胞擴增→輸入體內 直接向患者體內組織細胞中轉移基因
特點 操作復雜，但效果可靠 方法較簡單，但效果難以控制
相同點 都是將外源基因導入靶細胞，以糾正缺陷基因，目前兩種方法都處于臨床試驗階段
1．下圖為不同限制性核酸內切膀識別的序列及切割位置（箭頭所指），下列敘述錯誤的是（ ）
A．圖示4種限制性核酸內切酶均不能夠識別和切割RNA分子內的核苷酸序列
B．若DNA上的堿基隨機排列，Not I限制性核酸內切酶切割位點出現頻率較其他三種限制性核酸內切酶高
C．酶切時使用兩種限制酶同時處理是為了防止質粒和含目的基因的外源DNA片段自身環化
D．用酶Bgl II切出的目的基因與酶BamH I切割的質粒重組后，則不能再被這兩種酶切開
2．下圖是將人的生長激素基因導入細菌B細胞內制造“工程菌”的示意圖。已知細菌B細胞內不含質粒A，也不含質粒A上的基因。判斷下列說法正確的是（ ）
A．將重組質粒導入細菌B常用的方法是用Ca2+處理細菌
B．將完成導入過程后的細菌涂布在含有四環素的培養基上，能生長的是只導入了質粒A的細菌
C．目的基因成功表達的標志是受體細胞能在含有四環素的培養基上生長
D．工程菌產生的生長激素可以直接使用效果良好
3．某種熒光蛋白（GFP）在紫外光或藍光激發下會發出綠色熒光，這一特性可用于檢測細胞中目的基因的表達。某科研團隊將某種病毒的外殼蛋白（L1）基因連接在GFP基因的5’端，獲得了L1-GFP融合基因（簡稱為n），并將其插入質粒P，構建基因表達載體P1，其部分結構和酶切位點的示意圖如下（圖中E1~E4四種限制酶產生的黏性末端各不相同）。
回答下列問題：
(1)據圖推斷，該團隊在將n插入質粒P時，應使用圖示中的_______________進行酶切，這是為了保證_______________。
(2)體外利用PCR技術擴增基因n時，①使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是_______________；②利用PCR技術擴增基因n時，設計的引物之間不能_______________，以避免影響引物與相應單鏈的結合。
(3)將P1轉入大腸桿菌后，若在該大腸桿菌中觀察到了綠色熒光，則說明L1基因在大腸樣菌中依次完成了____________過程。
(4)真核生物基因（目的基因）在大腸桿菌細胞內表達時，表達出的蛋白質可能會被降解。為防止蛋白質被降解，在實驗中應選用____________的大腸桿菌作為受體細胞，在蛋白質純化的過程中應添加__________________的抑制劑。
1.限制酶的選擇方法
根據目的基因兩端的限制酶切割位點、質粒上的限制酶切割位點以及是否破壞目的基因和標記基因等來確定限制酶的種類。
（1）應選擇酶切位點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇Pst Ⅰ；不能選擇酶切位點位于目的基因內部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。
（2）為避免目的基因及質粒的自身環化、反向連接，也可使用不同的限制酶（非同尾酶）切割目的基因所在片段和質粒（雙酶切），如圖甲可選擇用Pst Ⅰ和EcoRⅠ兩種限制酶（但要確保質粒上也有這兩種酶的切割位點）。
（3）切割質粒的限制酶不能同時切開質粒上的所有標記基因，即至少要保留一個標記基因，以用于重組DNA的鑒定和篩選，如圖乙中的質粒不能使用Sma Ⅰ切割。
2.標記基因的作用
標記基因可用于檢測目的基因是否導入受體細胞：
3.農桿菌轉化法分析
（1）構建基因表達載體需要兩種工具酶：限制酶和DNA連接酶。
（2）基因表達載體（重組質粒）導入農桿菌細胞時，要用Ca2＋處理農桿菌細胞，使其處于感受態，有利于重組質粒的導入。
（3）將導入目的基因的受體細胞培育成完整的植株要用到植物組織培養技術。
【拓展】如何篩選出含有目的基因的受體細胞
（1）原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，如果插入某種抗生素抗性基因內部，則會導致該抗生素抗性基因失活。如下圖，目的基因插入四環素抗性基因內部，則四環素抗性基因失活。
（2）被轉化的細菌有三種：含環狀目的基因的細菌、含重組質粒的細菌、含自身環化質粒的細菌。
（3）篩選方法：將混合處理后的細菌先放在含氨芐青霉素的培養基上培養，能生長的是含重組質粒的細菌和含自身環化質粒的細菌，如圖1、2、3、4、5菌落，再利用無菌的絨布影印到含有四環素的培養基上，如圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環素培養基上不生長的即為含有目的基因的菌落，如圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養基上挑取1、5菌落進行培養。
4．幾種獲取目的基因方法的比較
項目 從基因文庫中獲取 人工合成
方法 從基因組文庫中獲取 從cDNA文庫中獲取 化學合成法 反轉錄法
過 程 供體細胞中的DNA ↓限制酶 許多DNA片段 ↓插入 載體 ↓導入 受體菌群(基因組文庫) ↓ 外源DNA擴增，產生特定性狀 ↓分離 目的基因 目的基因的 mRNA ↓反轉錄 單鏈DNA ↓合成 雙鏈DNA ↓插入 載體 ↓導入 受體菌群 (cDNA文庫) ↓分離 目的基因 蛋白質的氨 基酸序列 ↓推測 mRNA的核 苷酸序列 ↓推測 基因的核苷 酸序列 ↓化學合成 目的基因 目的基因的mRN A ↓反轉錄 單鏈DNA ↓合成 雙鏈DNA (即目的 基因)
說 明 將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫，包括基因組文庫和cDNA文庫 適用于片段較小，核苷酸序列已知的目的基因；利用DNA合成儀合成 以RNA為模板，需要逆轉錄酶
5.PCR技術相關分析
(1)PCR技術的過程
關于引物的2點提醒：①引物是一小段單鏈的DNA或RNA，作為新子鏈的合成起點，只能結合在母鏈的3′端；②只有通過引物，DNA才可以開始進行復制。
(2)PCR技術和DNA復制的比較
6．基因表達載體構建過程
若考慮兩兩相連，則DNA連接酶連接DNA片段會出現三種情況：目的基因與目的基因的連接、目的基因與質粒的連接、質粒與質粒的連接，需篩選出重組質粒。
7.蛋白質工程與基因工程的比較
項目 蛋白質工程 基因工程
區別 原理 中心法則的逆推、中心法則 基因重組
實質 定向改造或生產人類所需的蛋白質 定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的生物類型或生物產品(基因的異體表達)
結果 可生產自然界沒有的蛋白質 生產自然界已有的蛋白質
聯系 ①蛋白質工程是在基因工程基礎上延伸出來的第二代基因工程，對現有蛋白質的改造或制造新的蛋白質，必須通過基因修飾或基因合成實現；②基因工程所利用的某些酶需要通過蛋白質工程進行修飾、改造
8．DNA的粗提取與鑒定實驗
（1）DNA的粗提取與鑒定實驗中的“2、4、4”
實驗操作 實驗操作的目的
加蒸餾水2次 ①加到雞血細胞液中，使血細胞吸水漲破；②加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物質的量濃度稀釋到0.14 mol/L，使DNA析出
用紗布過濾4次 ①過濾血細胞破裂液，得到含細胞核物質的濾液；②過濾用2 mol/L的NaCl溶液充分溶解的DNA，濾去溶液中的雜質；③濾取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；④過濾溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液
用NaCl溶液4次 ①加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的細胞核物質；②用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出；③用2 mol/L的NaCl溶液，溶解濾取的DNA黏稠物；④用2 mol/L的NaCl溶液，溶解絲狀物用于鑒定DNA
（2）注意事項
(1)本實驗不能用哺乳動物成熟的紅細胞作實驗材料，原因是哺乳動物成熟的紅細胞無細胞核(無DNA)。可選用雞血細胞作材料。
(2)加入洗滌劑后，動作要輕緩、柔和，否則容易產生大量的泡沫，不利于后續步驟的操作。加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。
(3)二苯胺試劑要現配現用，否則會影響鑒定的效果。
(4)提取植物細胞的DNA時，加入的洗滌劑能溶解細胞膜，有利于DNA的釋放；加入食鹽(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。
(5)在DNA進一步提純時，選用冷卻的體積分數為95%的酒精溶液的作用是溶解雜質和析出DNA。
1．下圖表示pBR322質粒和人生長激素基因所在片段的結構信息，將二者構建的重組質粒導入受體菌并進行篩選。下列敘述正確的是（ ）
注：AmpR：氨芐青霉素抗性基因，TetR：四環素抗性基因
A．應選擇的限制酶E組合和酶F
B．所選用的受體菌不能含有AmpR和TetR基因
C．用含氨芐青霉素的培養基只能篩選出含重組質粒的受體菌
D．同時用三種限制酶處理圖中質粒，電泳后可得到3個條帶
2．下圖為科研人員研發冠狀病毒疫苗的幾種技術思路，請回答：
(1)途徑Ⅰ與途徑Ⅱ相比，疫苗安全性更高的是途徑_____。途徑Ⅲ中，過程①的操作需要_____酶，該途徑涉及技術的核心是_____（用圖中數字作答）。除圖中所示外，常見疫苗類型還有_____。
(2)途徑IV生產的DNA疫苗在動物細胞中表達將引起機體免疫應答。與DNA疫苗相比，mRNA疫苗的安全性更有優勢，因為mRNA不會進入細胞核，無_____的風險，且易被_____水解，不會遺傳給子細胞。
(3)人體在感染新冠病毒后可引發“細胞因子風暴”（機體感染病原體后，體液中多種細胞因子迅速大量產生的現象），進而傷害正常細胞。“細胞因子風暴”引發的免疫功能異常稱為_____。
(4)該病毒表面蛋白A為主要抗原，為進一步獲得更符合治療要求的單克隆抗體，科研人員通過仔細研究，找到既不影響抗體空間結構又降低免疫反應的_____序列，借助基因工程技術對抗體結構進行人源化改造。
(5)科研人員發現利用農桿菌轉化法培育出的抗蟲棉品種自交的后代中，抗蟲植株均有某抗病性狀，原因可能是：
①_____。
②_____。
3．戊型肝炎病毒是一種RNA病毒，ORF2基因編碼的結構蛋白（pORF2）位于病毒衣殼表面。我國科研人員利用基因工程技術，在大腸桿菌中表達pORF2，制備戊型肝炎疫苗，過程如下圖。請回答下列問題：
(1)過程①④需要的酶分別是____________、____________。
(2)過程⑤需要用____________處理大腸桿菌使其成為____________細胞，以完成轉化過程。
(3)基因表達載體上ORF2基因的啟動子需來源于____________。表達載體上往往帶有抗性基因，其作用是____________。
(4)生產pORF2的意義主要有兩個：一是開發戊肝疫苗，用于預防戊型肝炎；二是用于戊肝抗體診斷試劑盒的生產。抗體診斷試劑盒所利用的原理是____________。
1．二代乙肝疫苗是將乙肝病毒表面抗原基因進行質粒構建，再將重組質粒導入酵母菌，經發酵、純化制作而成。下列敘述錯誤的是（ ）
A．構建重組質粒需要限制酶和DNA連接酶
B．重組質粒的構建是一種DNA重組技術
C．二代乙肝疫苗是酵母菌細胞產生的抗體
D．該技術定向地改造了生物的遺傳性狀
2．Kampen等科學家為研究脂肪酶突變體對底物專一性的影響，將其蛋白質第356位的絲氨酸替換為纈氨酸，發現其活性降低了12倍，下列敘述錯誤的是（　　）
A．上述過程屬于蛋白質工程
B．蛋白質工程需要構建重組DNA分子
C．該過程的實質是對脂肪酶在分子水平上進行改造
D．常用化學方法直接將脂肪酶第356位的絲氨酸替換為纈氨酸
3．利用PCR技術擴增目的基因，其原理與細胞內DNA復制類似（如下圖所示）。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎。下列敘述錯誤的是（ ）
A．用PCR方法擴增目的基因時不必知道基因的全部序列
B．設計引物時需要避免引物之間形成堿基互補配對而造成引物自連
C．復性溫度過高可能導致PCR反應得不到任何擴增產物
D．第四輪循環產物中同時含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例為15/16
4．下列利用洋蔥進行“DNA的粗提取與鑒定”實驗的敘述，正確的是（ ）
A．將研磨液加入切碎的洋蔥，充分研磨后過濾，要棄去上清液
B．采用體積分數為95%酒精溶液析出DNA的方法可去除部分雜質
C．用塑料離心管是因為用玻璃離心管容易破損
D．將白色絲狀物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺試劑后振蕩，觀察顏色變化
5．下列有關限制酶和DNA連接酶的敘述正確的是（　　）
A．限制酶將DNA雙鏈切割成兩條單鏈
B．同種限制酶既可以切割含目的基因的DNA片段又可以切割質粒，因此不具有專一性
C．序列—CTAG↓—和—G↓GATCC—被限制酶切出的黏性末端相同
D．E．coli DNA連接酶能催化平末端和黏性末端的連接
6．“試管嬰兒”技術是通過將不孕夫婦的精子和卵細胞取出，在試管中完成受精，并在試管中培養使其發育到如圖所示的時期，再將胚胎植入女性子宮內發育成胎兒，該技術使一部分不能生育的夫婦重新獲得了生育的機會。下列敘述錯誤的是（ ）
A．“試管嬰兒”技術在生物學上所依據的原理是有性生殖
B．試管嬰兒技術中為了某些需要，需要提取③處的細胞DNA進行檢測
C．“試管嬰兒”的形成用到的技術有人工授精、體內培養、核移植
D．設計試管嬰兒與普通試管嬰兒的區別在于前者在植入前需要對胚胎進行遺傳學診斷
7．抗蟲和耐除草劑玉米雙抗12-5是我國自主研發的轉基因品種。為給監管轉基因生物安全提供依據，采用PCR方法進行目的基因監測，反應程序如圖所示。下列敘述正確的是（ ）
A．預變性過程可促進模板DNA邊解旋邊復制
B．后延伸過程可使目的基因的擴增更加充分
C．延伸過程無需引物參與即可完成半保留復制
D．轉基因品種經檢測含有目的基因后即可上市
8．乙酰膽堿酯酶（AChE）是催化乙酰膽堿分解的水解酶，還能與有機磷農藥發生特異反應，在水質檢測中可用于有機磷農藥污染的快速檢測，乙酰膽堿酯酶對防治人類疾病、保護生態環境等方面的研究具有非常重要的意義。回答下列問題：
(1)AChE的提取與純化：AChE廣泛存在于各種動物組織中，欲從動物肝臟中提取AChE，獲取新鮮肝臟后，必須立即處理或低溫保存，因為______。將豬肝切碎后，加低溫蒸餾水，為了防止血液過快的凝結，可適量加入______，在組織搗碎機中搗碎后離心，取______用于進一步分離和純化。
(2)AChE的基因克隆技術：利用PCR技術或RT－PCR技術（即利用逆轉錄和PCR技術）克隆AChE基因時，反應體系中均需要加入______酶，加入dNTP用于提供______。PCR產物經______技術純化后，可用______酶處理回收的DNA和克隆載體，獲得重組DNA分子，最終達到體內克隆AChE基因的目的。
(3)AChE的基因表達：若構建大腸桿菌表達系統，最好選擇______技術（填“PCR”或“RT－PCR”）獲取AChE基因．與克隆AChE基因相比，表達載體中還需要加入大腸桿菌的______等。在培養大腸桿菌時，常使用______培養基進行擴大培養，用______法接種到平板上，更易獲得相應菌株。
(4)研究人員在進行某地水質檢測時，發現水樣能與AChE發生特異反應，若不及時治理，可能會造成水體______。
9．下圖表示某種綠色熒光蛋白基因表達載體的構建過程，綠色熒光蛋白基因有720個堿基對（bp），質粒有5369個堿基對（bp）。請據圖回答問題：
(1)質粒中“氨芐青霉素抗性基因”的作用是______________。研究發現復制原點處的A和T特別多，有利于DNA復制時______________過程的發生。
(2)限制酶BamHⅠ的識別序列和切割位點是G↓GATCC，該酶切形成的黏性末端是______________。過程③所需的工具酶是______________。
(3)已知圖中質粒經BamHⅠ、HindⅢ雙酶切后進行電泳，出現了一條長度為5300bp的DNA條帶，則重組質粒的長度為______________的DNA片段條帶。
(4)過程①用兩種限制酶切割質粒，與單一酶切相比，其優勢有______________。過程②通過PCR技術實現，進行PCR時，需要在兩種引物的______________端分別添加BamHⅠ和HindⅢ的識別序列。
(5)將重組質粒導入大腸桿菌前，要用CaCl2處理大腸桿菌，其目的是______________；進行篩選時，大腸桿菌培養基中除需要加入水、無機鹽、C源、N源、瓊脂等物質外，還要分別添加______________。
10．大腸桿菌pUC18質粒是基因工程中常用的載體。某限制酶在此質粒上的唯一酶切位點位于LacZ基因中，如果沒有插入外源基因，LacZ基因便可表達出β 半乳糖苷酶。當培養基中含有IPTG和X－gal時，X－gal便會被β 半乳糖苷酶水解成藍色，大腸桿菌將形成藍色菌落。反之，則形成白色菌落。下圖表示利用此質粒實施基因工程的主要流程。請分析并回答下列問題：
(1)基因工程的核心步驟是_______。
(2)目的基因插入質粒構建重組質粒的過程中，需要DNA連接酶恢復____鍵。
(3)將試管Ⅰ中的物質和大腸桿菌共同置于試管Ⅱ的目的是進行______；大腸桿菌需事先用_____進行處理，使大腸桿菌細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態。
(4)將試管Ⅱ中的菌液接種于選擇培養基上培養，培養基中應含有大腸桿菌必需的營養物質_______和生長因子，還應加入IPTG、X－gal以及氨芐青霉素，其中加入_______的作用是篩選出導入pUC18質粒和重組質粒的大腸桿菌。
(5)若觀察到培養基上出現____色菌落，則說明大腸桿菌中已成功導入了重組質粒。如果作為受體細胞的大腸桿菌也含有LacZ基因，則不利于重組質粒的篩選，原因是______。

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