資源簡介

高考生物一輪專題知識梳理
第34講　基因工程
課標解讀 核心素養
1.概述基因工程的誕生 2.闡明基因工程的原理及技術(含PCR技術) 3.舉例說明基因工程的應用 4.概述蛋白質工程的原理及應用 5.活動:DNA的粗提取與鑒定 6.活動:利用PCR擴增DNA片段并完成電泳鑒定,或運用軟件進行虛擬PCR實驗 生命觀念 基因的結構決定其功能
科學思維 建立基因工程的操作流程模型
科學探究 探究基因工程在生產上的應用和蛋白質工程的應用
社會責任 基因工程和蛋白質工程在生產實踐上的應用
考點一　重組DNA技術的基本工具
1.基因工程的概念。
2.基因工程的基本工具。
(1)限制性內切核酸酶(也稱“限制酶”)。
提醒　①限制酶的識別序列與被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6個核苷酸組成,少數由4個、8個或其他數量的核苷酸組成;后者是雙鏈序列。
②判斷黏性末端是否由同一種限制酶切割形成的方法是將黏性末端旋轉180°,同一種限制酶切割形成的黏性末端應該是完全相同的結構。
③限制酶作用的化學鍵只能是磷酸二酯鍵,而不能是氫鍵。
④在切割含目的基因的DNA分子時,需用限制酶切割兩次此DNA分子,產生4個末端。只有這樣才能使目的基因的兩端都有可連接的黏性末端或平末端。
(2)DNA連接酶。
(3)載體。
提醒　與膜載體的區別:基因工程中的載體是DNA分子,能將目的基因導入受體細胞內,并利用它在宿主細胞內對目的基因進行大量復制;膜載體是蛋白質,與細胞膜的通透性有關。
正誤判斷
(1)限制酶只能用于切割目的基因。 (×)
(2)切割質粒的限制性內切核酸酶均能特異性地識別6個核苷酸序列。 (×)
(3)DNA連接酶能將兩堿基間通過氫鍵連接起來。 (×)
(4)E.coli DNA連接酶既可連接平末端,又可連接黏性末端。 (×)
(5)限制酶也可以識別和切割RNA。 (×)
(6)限制性內切核酸酶、DNA連接酶和質粒是基因工程中常用的三種工具酶。 (×)
(7)載體質粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標記基因。 (×)
(8)每個質粒DNA分子上至少含一個限制酶識別位點。 (√)
(9)質粒是小型環狀DNA分子,是基因工程常用的載體。 (√)
(10)載體的作用是將攜帶的目的基因導入受體細胞中,使之穩定存在并表達。 (√)
(11)只能用一種限制酶分別切割運載體和目的基因,便于兩者連接。 (×)
教材微點
1.(選擇性必修3 P71“旁欄思考”)(1)存在于原核生物中的限制酶的作用是什么
提示　切割外源DNA以保證自身安全,防止外來病原物的危害。
(2)限制酶來源于原核生物,為什么不能切割自身的DNA分子
提示　原核生物的DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾。
2.(選擇性必修3 P72“旁欄思考”)DNA連接酶和DNA聚合酶不是(填“是”或“不是”)一回事。原因是①DNA連接酶連接的是兩個DNA片段,而DNA聚合酶是把單個的脫氧核苷酸連接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用時需要以一條DNA鏈為模板,而DNA連接酶不需要模板。
1.基因工程的理論基礎。
2.限制酶的選擇原則。
(1)根據目的基因兩端的限制酶切割位點確定限制酶的種類。
①應選擇切割位點位于目的基因兩端的限制酶,以便將目的基因“切出”,如圖可選擇PstⅠ。
②不能選擇切割位點位于目的基因內部的限制酶,防止破壞目的基因,如圖不能選擇SmaⅠ。
③為避免目的基因和質粒的自身環化和隨意連接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒,如圖也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質粒上也有這兩種限制酶的切割位點,而且這兩種限制酶切割后不會完全破壞標記基因)。
(2)根據質粒的特點確定限制酶的種類。
(3)根據Ti質粒的T DNA片段選擇限制酶,圖中甲、乙、丁Ti質粒均不宜選取,而丙Ti質粒宜選取(設切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ)。
3.標記基因的作用:可用于檢測目的基因是否導入受體細胞。
4.與DNA有關的幾種酶的比較。
角度一 結合基因工程所需工具酶,考查科學思維能力
1.下表為常用的限制性內切核酸酶(限制酶)及其識別序列和切割位點,由此推斷以下說法中,錯誤的是 (　　)
限制酶名稱 識別序列和 切割位點 限制酶名稱 識別序列和 切割位點
BamHⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoRⅠ C↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
HindⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
注:Y為C或T,R為A或G。
A.HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶切割后形成平末端
B.Sau3AⅠ限制酶的切割位點在識別序列的外部
C.BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種限制酶切割后形成相同的黏性末端
D.一種限制酶一定只能識別一種核苷酸序列
解析　HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶沿著中軸線切口切開,切割后形成平末端,A項正確;Sau3AⅠ限制酶識別GATC序列,切割位點在識別序列的外部,B項正確;BamHⅠ限制酶識別GGATCC序列,Sau3AⅠ限制酶識別GATC序列,切割后形成相同的黏性末端GATC,C項正確;HindⅡ能識別GTCAAC,也能識別GTTAAC,D項錯誤。
答案　D
2.(不定項)DNA疫苗是指將編碼保護性抗原蛋白的基因(如圖甲)插入到適宜的質粒(如圖乙)中得到的重組DNA分子,將其導入人體內,在人體細胞內表達的產物可直接誘導機體免疫應答,且可持續一段時間。限制性內切核酸酶的切點分別是Bgl Ⅱ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析錯誤的是 (　　)
甲　 乙
A.構建DNA疫苗時,可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和質粒
B.圖乙中只用EcoRⅠ切割后的質粒,含有2個游離的磷酸基團
C.用EcoRⅠ切割目的基因和質粒,再用DNA連接酶連接,只產生1種連接產物
D.抗原基因在體內表達時需要解旋酶
解析　從圖甲看出,用EcoRⅠ切割目的基因后兩端各有一個切口,與圖乙中EcoRⅠ切口對接時,可有兩種可能,即可產生兩種重組DNA,C項錯誤;基因表達包括轉錄和翻譯,轉錄時不需要解旋酶,在RNA聚合酶的作用下,DNA即可解旋,D項錯誤。
答案　CD
3.(2021·全國乙卷)用DNA重組技術可以賦予生物以新的遺傳特性,創造出更符合人類需要的生物產品。在此過程中需要使用多種工具酶,其中4種限制性核酸內切酶的切割位點如圖所示。
回答下列問題:
(1)常用的DNA連接酶有E.coli DNA連接酶和T4 DNA連接酶。上圖中　　　　　　　　　　酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA連接酶連接。上圖中　　　　　　　　　　酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA連接酶連接。
(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質粒載體片段之間形成的化學鍵是　　　　　　。
(3)DNA重組技術中所用的質粒載體具有一些特征。如質粒DNA分子上有復制原點,可以保證質粒在受體細胞中能　　　　;質粒DNA分子上有　　　　　,便于外源DNA插入;質粒DNA分子上有標記基因(如某種抗生素抗性基因),利用抗生素可篩選出含質粒載體的宿主細胞,方法是　　　　　　　。
(4)表達載體含有啟動子,啟動子是指　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
解析　(1)由題圖可以看出,EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ切割后分別形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端,E.coli DNA連接酶可用于連接黏性末端,T4 DNA連接酶可用于連接黏性末端和平末端。(2)DNA連接酶催化DNA鏈的5'端與另一DNA鏈的3'端生成磷酸二酯鍵。(3)復制原點是在基因組上復制起始的一段序列,可以保證質粒在宿主細胞中進行復制。質粒上有限制酶切位點,該位點可被限制酶切開并使外源目的基因插入其中。在含有特定抗生素的培養基上進行選擇性培養可以將含質粒載體的細胞篩選出來。(4)啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位,有了它才能驅動基因轉錄出mRNA,最終獲得所需要的蛋白質。
答案　(1)EcoRⅠ、PstⅠ　EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ　(2)磷酸二酯鍵　(3)復制　限制酶切位點　選擇性培養　(4)RNA聚合酶識別和結合的部位
角度二 結合載體的作用及特點,考查科學思維能力
4.如圖為某種質粒的簡圖,小箭頭所指分別為限制性內切核酸酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點,P為轉錄的啟動部位。已知目的基因的兩端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點,受體細胞為無任何抗藥性的原核細胞。下列有關敘述,正確的是 (　　)
A.將含有目的基因的DNA與質粒分別用EcoRⅠ酶切,在DNA連接酶作用下,生成的由兩個DNA片段連接形成的產物有兩種
B.DNA連接酶的作用是將酶切后得到的黏性末端連接起來,形成一個重組質粒時形成兩個磷酸二酯鍵
C.為了防止目的基因反向粘連和質粒自身環化,酶切時可選用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ
D.能在含青霉素的培養基中生長的受體細胞中已成功導入該目的基因
解析　根據題意,目的基因的兩端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點,將含有目的基因的DNA用EcoRⅠ酶切,會得到目的基因片段;根據質粒的簡圖可知,將質粒用EcoRⅠ酶切,會得到與質粒周長等長的鏈狀DNA;因此將含有目的基因的DNA與質粒分別用EcoRⅠ酶切,在DNA連接酶作用下,可生成目的基因—目的基因片段、目的基因—質粒片段、質粒—質粒片段三種產物,A項錯誤;DNA連接酶的作用是將酶切后得到的黏性末端連接起來形成一個重組質粒,該過程形成四個磷酸二酯鍵,B項錯誤;EcoRⅠ和BamHⅠ的識別序列不同,獲取目的基因和切割質粒時,同時選用EcoRⅠ和BamHⅠ切割,目的基因兩端形成的末端不同,切割后的質粒兩端形成的末端不同,再用DNA連接酶連接,可以防止目的基因反向連接和質粒自身環化,C項正確;導入普通質粒的大腸桿菌和導入重組質粒的大腸桿菌都能在含青霉素的培養基中生長,因此能在含青霉素的培養基中生長的受體細胞不一定含有目的基因,D項錯誤。
答案　C
5.(2023·丹東模擬)圖1是某基因工程中構建重組質粒的過程示意圖,載體質粒P0具有四環素抗性基因(TetR)和氨芐青霉素抗性基因(AmpR)。請回答下列問題:
圖1
(1)EcoR Ⅴ酶切位點為↓…GATATC……CTATAG…↑,EcoR Ⅴ酶切出來的線性載體P1為　　　　末端。
(2)用Taq DNA聚合酶進行PCR擴增獲得的目的基因片段,其兩端各自帶有一個腺嘌呤脫氧核苷酸。載體P1用酶處理,在兩端各添加了一個堿基為　　　　的脫氧核苷酸,形成P2;P2和目的基因片段在　　　　酶作用下,形成重組質粒P3。
(3)為篩選出含有重組質粒P3的菌落,采用含有不同抗生素的平板進行篩選,得到A、B、C三類菌落,其生長情況如下表(“+”代表生長,“-”代表不生長)。根據表中結果判斷,應選擇的菌落是　　　　(填表中字母)類,另外兩類菌落質粒導入情況分別是　　　　　　　、　　　　　　　　　　。
平板類型 菌落類型 A B C
無抗生素 + + +
氨芐青霉素 + + -
四環素 + - -
氨芐青霉素+四環素 + - -
(4)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質粒,擬設計引物進行PCR鑒定。圖2所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質粒中的相應位置,PCR鑒定時應選擇的一對引物是　　　　。某學生嘗試用圖中另外一對引物,結果從某一菌落的質粒中擴增出了400 bp片段,原因是　　　　　　　　　　　。
圖2
解析　(1)從圖中可以看出,EcoRⅤ酶切出來的載體質粒為平末端。(2)從圖中可以看出,目的基因的兩端各有一個游離的腺嘌呤脫氧核苷酸,由于載體P1為平末端,所以載體P1的兩端應該各添加一個胸腺嘧啶脫氧核苷酸,這樣在DNA連接酶的作用下才能把目的基因和載體P1連接起來。(3)由題意可知,構建重組質粒時四環素抗性基因被破壞,所以導入目的基因的菌落只能在沒有抗生素或含有氨芐青霉素的培養基中存活,應該選B類菌落。A類菌落能在表中條件下存活,說明導入的是P0質粒。C類菌落只能在無抗生素的培養基中存活,說明C類菌落沒有導入質粒。(4)據圖分析,目的基因的外側鏈只能用丙作引物,內側鏈可用甲、乙作引物,如果用甲、丙作引物,則無論目的基因是否插入正確,都能通過PCR擴增大量目的基因,如果用乙、丙作為引物,當目的基因插入不正確(反向插入)時,則乙、丙兩引物都結合在外側,PCR不能正常進行,因此選用乙、丙作為引物可以進行RCR鑒定。若擴增出的DNA片段為400 bp,則正好是目的基因反向連接后,外側鏈用乙作引物,內側鏈用甲作引物擴增出的片段。
答案　(1)平　(2)胸腺嘧啶(T)　DNA連接
(3)B　A類菌落含有P0　C類菌落未轉入質粒
(4)乙、丙　目的基因反向連接
考點二　基因工程的基本操作程序
1.目的基因的篩選與獲取。
(1)篩選合適的目的基因。
①目的基因:在基因工程的設計和操作中,用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因。主要是指編碼蛋白質的基因。
②篩選目的基因的方法:從相關的已知結構和功能清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。
(2)利用PCR獲取和擴增目的基因。
提醒　①在PCR過程中實際加入的為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作為合成DNA子鏈的原料,又可為DNA的合成提供能量。
②引物是一小段單鏈的DNA或RNA,作為新子鏈的合成起點,只能結合在母鏈的3'端,使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸。
③真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR反應緩沖溶液中一般要添加Mg2+。
2.基因表達載體的構建——核心。
(1)目的。
使目的基因在受體細胞中穩定存在,并且遺傳給下一代,同時使目的基因能夠表達和發揮作用。
(2)組成。
提醒　啟動子≠起始密碼子,終止子≠終止密碼子
①啟動子:一段有特殊序列結構的DNA片段,位于基因的上游,它是RNA聚合酶識別、結合的部位。
②終止子:一段有特殊序列結構的DNA片段,位于基因的下游,作用是使轉錄在所需要的地方停止。
③起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上,分別控制翻譯過程的啟動和終止。
(3)構建過程。
3.將目的基因導入受體細胞。
受體細胞 導入方法 內容
植物細胞 花粉管通道法 用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中等
農桿菌轉化法 農桿菌細胞內的Ti質粒上的T DNA可攜帶目的基因整合到受體細胞的染色體DNA上
動物細胞 顯微注射技術 常用受體細胞:受精卵
原核細胞 Ca2+處理法 用Ca2+處理細胞,使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態
提醒　①農桿菌轉化法中的兩次拼接和兩次導入。
第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的T DNA上,第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T DNA拼接到受體細胞的染色體DNA上;第一次導入是將含目的基因的Ti質粒導入農桿菌,第二次導入(非人工操作)是指含目的基因的T DNA導入受體細胞。
②導入的目的基因,可能存在于細胞質中,也可能整合到染色體DNA上。存在于染色體DNA上的目的基因有可能通過花粉傳播進入雜草或其他作物中,造成“基因污染”。
4.目的基因的檢測與鑒定。
提醒　分子水平檢測是否插入了目的基因和是否轉錄出了mRNA時,①都遵循堿基互補配對原則;②都使用基因探針,探針是放射性同位素或熒光標記的含目的基因的單鏈DNA片段。
教材微點
1.(選擇性必修3 P79 “旁欄思考題”)PCR不可以擴增mRNA的原因是PCR是以DNA雙鏈作模板的,不能直接用單鏈RNA做PCR,必須把mRNA逆轉錄成單鏈cDNA之后再做PCR。
2.(選擇性必修3 P83“到社會中去”)轉基因抗蟲棉培育過程中,檢測目的基因是否成功表達的常見方法有哪兩種 抗原—抗體雜交法、用棉葉飼喂棉鈴蟲。
長句突破
1.(事實概述)[全國卷Ⅱ,T38(2)改編]以mRNA為材料可以獲得DNA,其原理是在逆轉錄酶的作用下,以mRNA為模板按照堿基互補配對的原則可以合成DNA。
2.(事實概述)[江蘇卷,T33(4)改編]PCR擴增時,復性溫度的設定是成敗的關鍵。復性溫度過高會破壞引物與模板的堿基配對。復性溫度的設定與引物長度、堿基組成有關,長度相同但G、C含量高的引物需要設定更高的復性溫度。
3.(事實概述)[全國卷Ⅰ,T40(2)]從受體細胞中分離純化出目的蛋白,該蛋白作為抗原注入機體后,刺激機體產生的可與此蛋白結合的相應分泌蛋白是抗體,該分泌蛋白可用于檢測受試者血清中的HIV,檢測的原理是抗原、抗體特異性結合。
4.(科學思維)[全國卷Ⅰ,T38(2)]若用家蠶作為表達基因A的受體,在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中,不選用噬菌體作為載體,其原因是噬菌體的宿主是細菌,而不是家蠶。
5.(科學思維)[全國卷Ⅱ,T38(3)]若要使目的基因在受體細胞中表達,需要通過質粒載體而不能直接將目的基因導入受體細胞,原因是目的基因無復制原點;目的基因無表達所需的啟動子(答出兩點即可)。
6.(科學思維)目前在PCR反應中使用耐高溫的DNA聚合酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是耐高溫的DNA聚合酶熱穩定性高,而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活。
1.目的基因的獲取方法。
(1)利用PCR獲取和擴增目的基因。
(2)人工合成目的基因。
①逆轉錄法:主要用于相對分子質量較大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA為模板,借助逆轉錄酶合成雙鏈DNA,其過程如下:
目的基因的mRNA雙鏈DNA(目的基因)
化學合成法:依據某一蛋白質的氨基酸序列,推測出其基因序列,然后直接合成目的基因,其過程如下:
(3)從基因文庫中獲取目的基因。
根據目的基因的有關信息,例如,根據基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉錄產物——mRNA,以及基因的表達產物——蛋白質等特性來獲取目的基因。
2.PCR技術的過程。
(1)
(2)循環圖示與規律。
循環次數 1 2 3 n
DNA分子數 2 4 8 2n
含引物A(或B) 的DNA分子數 1 3 7 2n-1
同時含引物A、B 的DNA分子數 0 2 6 2n-2
共消耗的引物數量 2 6 14 2n+1-2
注:第三輪循環后,開始出現雙鏈等長的目的基因片段。
角度一 結合PCR技術的操作和應用,考查科學思維能力
1.錦鯉皰疹病毒是一種雙鏈DNA病毒。如圖為TaqMan熒光探針技術的原理示意圖,探針完整時,報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時該探針被Taq酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監測系統可接收到熒光信號,即每擴增1個DNA分子,就有一個熒光分子形成,實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。下列有關敘述不正確的是 (　　)
A.在基因工程中,目前獲取目的基因的常用方法有從基因文庫中獲取、PCR技術擴增等
B.引物的化學本質是DNA單鏈
C.引物中的GC含量比探針中的略高,這有利于保證退火時引物先與模板DNA結合
D.若最初該反應體系中只有一個病毒DNA分子,經n次循環后,需要消耗TaqMan熒光探針2n-1個
解析　在基因工程中,目前獲取目的基因的常用方法有從基因文庫中獲取、PCR技術擴增、利用化學方法人工合成,A項正確;引物是根據目的基因合成的,一般是一段短的DNA單鏈,B項正確;GC之間形成3個氫鍵,GC含量高的DNA更穩定,更難變性,但是對復性過程影響不大,C項錯誤;由于每擴增1個DNA分子,就有一個熒光分子形成,經n次循環后共有2n個DNA,跟初始相比,新增2n-1個DNA,所以需要TaqMan熒光探針2n-1個,D項正確。
答案　C
2.(2020·江蘇卷)如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,簡捷地分析出已知序列兩側的序列,具體流程如下圖(以EcoRⅠ酶切為例):
請據圖回答問題:
(1)步驟Ⅰ用的EcoRⅠ是一種　　　　酶,它通過識別特定的　　　　切割特定位點。
(2)步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3' 羥基與5' 磷酸間形成　　　　　　　　　　;PCR循環中,升溫到95 ℃是為了獲得　　　　;Taq DNA聚合酶的作用是催化　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)若下表所列為已知的DNA序列和設計的一些PCR引物,步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是　　　　(從引物①②③④中選擇,填編號)。
DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)
已知 序列
PCR 引物 ①5' AACTATGCGCTCATGA 3' ②5' GCAATGCGTAGCCTCT 3' ③5' AGAGGCTACGCATTGC 3' ④5' TCATGAGCGCATAGTT 3'
(4)對PCR產物測序,經分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列),結果正確的是　　　　。
A.5' AACTATGCGAGCCCTT 3'
B.5' AATTCCATGCTGAATT 3'
C.5' GCAATGCGTTCGGGAA 3'
D.5' TTGATACGCCGAGTAC 3'
解析　(1)步驟Ⅰ用的EcoRⅠ是一種限制性內切核酸酶,它通過識別特定的核苷酸序列來進行切割。(2)步驟Ⅱ中用DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3' 羥基與5' 磷酸間形成磷酸二酯鍵。PCR循環中,升溫到95 ℃是為了解開DNA雙鏈獲得DNA單鏈,Taq DNA聚合酶的作用是催化以DNA為模板延伸形成子鏈的過程。(3)PCR過程中,根據已知的DNA序列合成兩個引物,要注意模板鏈和引物的方向是相反的,引物的核苷酸序列要能夠和相應模板的核苷酸序列發生堿基互補配對,環狀DNA圖中顯示PCR過程是從已知DNA序列的兩端分別向相反方向形成子鏈,一個引物是與已知DNA序列的第一條鏈的左端互補結合,向左側方向延伸形成子鏈,該引物是④,另一個引物是與已知DNA序列的第二條鏈的右端互補結合,向右側方向延伸形成子鏈,該引物是②。(4)圖中由片段F形成的環狀DNA的未知序列中有一個EcoRⅠ限制酶的切割位點,而EcoRⅠ識別的位點是,因此片段F的單鏈中的一端應含有“AATT”序列,另一端應含有“TTAA”序列,只有B項符合題意。
答案　(1)限制性內切核酸(或限制)　核苷酸序列　(2)磷酸二酯鍵　DNA單鏈　以DNA為模板的DNA子鏈的延伸　(3)②④　(4)B
(1)細胞膜上的載體與基因工程中的載體化學本質不同:細胞膜上的載體化學成分是蛋白質;基因工程中的載體可能是物質,如質粒(DNA),也可能是生物,如噬菌體、動植物病毒等。
(2)PCR中的復性不一定均為引物與DNA模板結合。復性時,引物與DNA模板的結合是隨機的,也存在DNA解開的兩條鏈的結合。
(3)PCR反應的結果不都是所需的DNA片段。因為第一次循環得到的DNA片段只有一種引物,比所需的DNA片段要長,從第二次循環才出現所需的DNA片段,這樣的片段存在兩種引物。
(4)任何一種天然蛋白質都是由基因編碼的,利用蛋白質工程改造了基因即對蛋白質進行了改造,而且改造過的蛋白質可以遺傳下去。
角度二 以基因工程的操作程序為載體,考查科學探究能力
3.某質粒上有Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ三種限制酶切割位點,同時還含有抗四環素基因和抗氨芐青霉素基因。利用此質粒獲得轉基因抗鹽煙草的過程,如圖所示。請回答下列問題:
(1)將目的基因導入植物細胞,采用最多的方法是農桿菌轉化法。其中用到的質粒是　　　　;該質粒含有一段特殊的DNA片段,稱為　　　　。該方法中農桿菌的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)在構建重組質粒時,和只用一種酶切割目的基因的兩端及質粒相比,選用HindⅢ和SalⅠ兩種酶的好處是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)含有目的基因的農桿菌可根據標記基因進行篩選。若農桿菌在含有氨芐青霉素和四環素的培養基上都可以生長繁殖,農桿菌中是否已含有目的基因 　　　　(填“是”或“否”)。為什么 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)將已經轉化的農桿菌進行如下操作,篩選出符合要求的農桿菌。先把轉化的農桿菌接種到A培養基中培養,長出菌落后,用無菌牙簽挑取A上的單個菌落,分別接種到B(含氨芐青霉素)和C(含四環素和氨芐青霉素)兩個培養基的相同位置上,一段時間后,菌落的生長狀況如圖所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中 請在圖中相應的位置上圈出來。
答案　(1)Ti質粒　T DNA　感染煙草細胞,把目的基因插入到煙草細胞的染色體DNA上　(2)防止目的基因自連和質粒自連,以提高帶有目的基因的重組質粒的合成效率;防止目的基因與質粒反向連接
(3)否　含有目的基因的質粒中抗四環素基因被破壞
(4)
如何篩選出含有目的基因的受體細胞
(1)原理:將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時,如果插入某種抗生素抗性基因內部,則會導致該抗生素抗性基因失活。如下圖,目的基因插入四環素抗性基因內部,則四環素抗性基因失活。
(2)被轉化的細菌有三種:含環狀目的基因的細菌、含重組質粒的細菌、含自身環化質粒的細菌。
(3)篩選方法:將混合處理后的細菌先放在含氨芐青霉素的培養基上培養,能生長的是含重組質粒的細菌和含自身環化質粒的細菌,如圖1、2、3、4、5菌落,再利用無菌的絨布影印到含有四環素的培養基上,如圖能生長的菌落為2、3、4,則在含四環素培養基上不生長的即為含有目的基因的菌落,如圖1、5菌落。最后,可在含氨芐青霉素的培養基上挑取1、5菌落進行培養。
4.(2021·遼寧卷)PHB2蛋白具有抑制細胞增殖的作用。為初步探究某動物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細胞增殖的原因,研究者從基因數據庫中獲取了該蛋白的基因編碼序列(簡稱phb2基因),大小為0.9 kb(1 kb=1 000堿基對),利用大腸桿菌表達該蛋白。回答下列問題:
(1)圖1為所用載體圖譜示意圖,圖中限制酶的識別序列及切割位點如表。為使phb2基因(該基因序列不含圖1中限制酶的識別序列)與載體正確連接,在擴增的phb2基因兩端分別引入　　　　　和　　　　　兩種不同限制酶的識別序列。經過這兩種酶酶切的phb2基因和載體進行連接時,可選用　　　　　(填“E.coli DNA連接酶”或“T4 DNA連接酶”)。
圖1
相關限制酶的識別序列及切割位點
名稱 識別序列 及切割位點 名稱 識別序列 及切割位點
HindⅢ EcoRⅠ
PvitⅡ PstⅠ
KpnⅠ BamH Ⅰ
注:箭頭表示切割位點。
(2)轉化前需用CaCl2處理大腸桿菌細胞,使其處于　　　　　的生理狀態,以提高轉化效率。
(3)將轉化后的大腸桿菌接種在含氨芐青霉素的培養基上進行培養,隨機挑取菌落(分別編號為1、2、3、4)培養并提取質粒,用(2)中選用的兩種限制酶進行酶切,酶切產物經電泳分離,結果如圖2,　　　　號菌落的質粒很可能是含目的基因的重組質粒。
圖2
注:M為指示分子大小的標準參照物;小于0.2 kb的DNA分子條帶未出現在圖中。
(4)將純化得到的PHB2蛋白以一定濃度添加到人宮頸癌細胞培養液中,培養24小時后,檢測處于細胞周期(如圖3)不同時期的細胞數量,統計結果如圖4。分析該蛋白抑制人宮頸癌細胞增殖可能的原因是將細胞阻滯在細胞周期的　　　　　(填“G1”“S”或“G2/M”)期。
圖3
注:分裂間期包括G1期、S期和G2期。
圖4
注:G2/M表示G2和M。
解析　(1)根據啟動子和終止子的生理作用可知,目的基因應導入啟動子和終止子之間。由圖1可知,兩者之間存在三種限制酶切點,但是由于KpnⅠ在質粒上不止一個酶切位點,所以應該選擇EcoRⅠ和PvitⅡ兩種不同限制酶的識別序列;根據PvitⅡ的酶切序列,切出了平末端,所以構建基因表達載體時,應該用T4 DNA連接酶連接質粒和目的基因。(2)轉化時用CaCl2處理大腸桿菌細胞,使其處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態,以提高轉化效率。(3)由于這些菌落都可以生長在含有氨芐青霉素的培養基中,因此都含有質粒,重組質粒包含了目的基因和質粒,如果用EcoRⅠ和PvitⅡ兩種酶切割重組質粒,電泳后將獲得含有質粒和目的基因兩條條帶,由于phb2基因大小為0.9 kb,所以對應電泳圖是3號菌落。(4)圖4中G1期和S期細胞減少,而G2期細胞數目明顯增多,說明G1期和S期細胞可以進入G2期,而G2期的細胞沒有能夠完成分裂進入M期,因此PHB2蛋白應該作用于G2/M期。
答案　(1)EcoRⅠ　PvitⅡ　T4 DNA連接酶
(2)一種能吸收周圍環境中DNA分子
(3)3　(4)G2/M
考點三　基因工程的應用與蛋白質工程
1.基因工程的應用。
提醒　乳腺生物反應器與膀胱生物反應器。
①乳腺生物反應器是利用轉基因動物的乳汁生產藥用蛋白,而膀胱生物反應器是利用轉基因動物的尿液生產藥用蛋白,二者的優點是產量高、質量好、成本低、易提取,且不必對動物造成傷害。
②乳腺生物反應器需是處于生殖期的雌性動物才可生產藥用蛋白,而膀胱生物反應器則是任何生長時期的雌、雄動物均可生產。
2.蛋白質工程的原理和應用。
(1)蛋白質工程的概念。
(2)蛋白質工程的基本原理。
(3)蛋白質工程的應用。
①醫藥工業方面:研發藥物,如延長干擾素的保存時間;降低小鼠單克隆抗體誘發免疫反應的強度。
②其他工業方面:改進酶的性能或開發新的工業用酶。
③農業方面:通過改造某些參與調控光合作用的酶,增加糧食產量;改造微生物蛋白質的結構,設計優良微生物農藥,防治病蟲害。
提醒　基因工程不會導致受體細胞或生物產生“新基因”或“新蛋白質”。
正誤判斷
(1)轉基因抗病農作物不需要使用農藥。 (×)
(2)利用乳腺生物反應器能夠獲得一些重要的醫藥產品,如人的血清白蛋白,這是因為將人的血清白蛋白基因導入了動物的乳腺細胞中。 (×)
(3)由大腸桿菌工程菌獲得人的干擾素后可直接應用。 (×)
(4)蛋白質工程的目的是改造或合成人類需要的蛋白質。 (√)
(5)蛋白質工程可以合成自然界中不存在的蛋白質。 (√)
(6)蛋白質工程是在分子水平上對蛋白質分子直接進行操作,定向改變分子的結構。 (×)
教材微點
(選擇性必修3 P90 “正文信息”)利用轉基因技術獲得的已整合藥用蛋白基因的轉基因小鼠分泌的乳汁中檢測不到藥用蛋白,根據中心法則分析,其可能的原因是藥用蛋白基因沒有轉錄或翻譯。
角度一 借助基因工程的應用,考查科學思維和社會責任
1.(2023·山東威海模擬)下列生物技術操作對遺傳物質的改造,不能遺傳給子代的是 (　　)
A.將含胰島素基因的表達載體轉入大腸桿菌,篩選獲得的基因工程菌
B.通過植物體細胞雜交獲得的番茄—馬鈴薯雜種植株
C.將腺苷酸脫氨酶基因轉入淋巴細胞后回輸患者,進行基因治療
D.將生長激素基因導入奶牛受精卵,培育出能分泌含生長激素乳汁的奶牛
解析　將含胰島素基因的表達載體轉入大腸桿菌,篩選獲得的基因工程菌可以通過二分裂的方式遺傳給子代,A項不符合題意;通過植物體細胞雜交獲得的番茄—馬鈴薯雜種植株,遺傳物質發生改變,可以通過無性繁殖遺傳給子代,B項不符合題意;將腺苷酸脫氨酶基因轉入淋巴細胞,只是淋巴細胞含有這個基因,其生殖細胞沒有該基因,因此不能遺傳給子代,C項符合題意;將生長激素基因導入奶牛受精卵,受精卵含有生長激素基因,受精卵培育成的奶牛含有該基因,因此可以遺傳給子代,D項不符合題意。
答案　C
2.(2022·廣東卷)“綠水逶迤去,青山相向開”。大力發展低碳經濟已成為全社會的共識。基于某些梭菌的特殊代謝能力,有研究者以某些工業廢氣(含CO2等一碳溫室氣體,多來自高污染排放企業)為原料,通過厭氧發酵生產丙酮,構建一種生產高附加值化工產品的新技術。
回答下列問題:
(1)研究者針對每個需要擴增的酶基因(如圖)設計一對　　　　,利用PCR技術,在優化反應條件后擴增得到目標酶基因。
(2)研究者構建了一種表達載體pMTL80k,用于在梭菌中建立多基因組合表達庫,經篩選后提高丙酮的合成量。該載體包括了啟動子、終止子及抗生素抗性基因等,其中抗生素抗性基因的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,終止子的作用是　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)培養過程中發現重組梭菌大量表達上述酶蛋白時,出現了生長遲緩的現象,推測其原因可能是　　　　　　　　　　　　　　,此外丙酮的積累會傷害細胞,需要進一步優化菌株和工藝才能擴大應用規模。
(4)這種生產高附加值化工產品的新技術,實現了　　　　　　,體現了循環經濟特點。從“碳中和”的角度看,該技術的優勢在于　　　　　　　　　　　　　　　　　　,具有廣泛的應用前景和良好的社會效益。
解析　(1)利用PCR技術擴增目標酶基因,首先需要根據目標酶基因兩端的堿基序列設計一對引物,引物與模板鏈結合后,Taq酶才能從引物的3'端延伸子鏈。(2)基因表達載體中,抗生素抗性基因作為標記基因,可用于篩選含有基因表達載體的受體細胞,終止子可終止轉錄,使轉錄在需要的地方停下來。(3)重組梭菌大量表達上述酶蛋白時,在這些酶蛋白的作用下,二氧化碳等氣體大量用于合成丙酮,而不是用于重組梭菌的生長,所以會導致生長遲緩。(4)由題意可知,這種生產高附加值化工產品的新技術,以高污染企業排放的二氧化碳等一碳溫室氣體為原料,實現了廢物的資源化,體現了循環經濟特點。從“碳中和”的角度看,該技術生產丙酮的過程不僅不排放二氧化碳,而且還可以消耗工業廢氣中的二氧化碳,有利于減緩溫室效應,并實現較高的經濟效益,所以具有廣泛的應用前景和良好的社會效益。
答案　(1)引物　(2)作為標記基因,篩選含有基因表達載體的受體細胞　終止轉錄,使轉錄在需要的地方停下來　(3)二氧化碳等氣體用于大量合成丙酮,而不是用于重組梭菌的生長　(4)廢物的資源化　不僅不排放二氧化碳,而且還可以消耗工業廢氣中的二氧化碳
角度二 圍繞蛋白質工程,考查科學思維能力
3.人體內的t PA蛋白能高效降解由血纖維蛋白凝聚而成的血栓,然而為心梗患者注射大劑量的基因工程t PA會誘發顱內出血,其原因是t PA與血纖維蛋白結合的特異性不高。研究證實,通過某技術,將t PA第84位的半胱氨酸換成絲氨酸,可制造出性能優異的改良t PA蛋白,進而顯著降低出血副作用。下列敘述正確的是 (　　)
A.該技術的關鍵是知道t PA蛋白基因的分子結構
B.該技術生產改良t PA蛋白的過程遵循中心法則
C.該技術是在蛋白質分子水平上直接改造蛋白質
D.該技術制造出的蛋白質在自然界早已存在
解析　將t PA第84位的半胱氨酸換成絲氨酸需要采用蛋白質工程技術,該技術的關鍵工作是了解t PA蛋白質的分子結構,A項錯誤;該技術生產改良t PA蛋白的過程遵循中心法則,B項正確;該技術是在基因分子水平上通過改造基因來實現對蛋白質的改造,C項錯誤;該技術制造出的蛋白質是自然界不存在的蛋白質,D項錯誤。
答案　B
4.(2022·湖南卷)水蛭是我國的傳統中藥材,主要藥理成分水蛭素為水蛭蛋白中重要成分之一,具有良好的抗凝血作用。擬通過蛋白質工程改造水蛭素結構,提高其抗凝血活性。回答下列問題:
(1)蛋白質工程流程如圖所示,物質a是　　　　　　,物質b是　　　　。在生產過程中,物質a可能不同,合成的蛋白質空間構象卻相同,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)蛋白質工程是基因工程的延伸,基因工程中獲取目的基因的常用方法有　　　　　　　　　　、　　　　　　　　　　　　　和利用 PCR 技術擴增。PCR 技術遵循的基本原理是　　　　　　　　　　。
(3)將提取的水蛭蛋白經甲、乙兩種蛋白酶水解后,分析水解產物中的肽含量及其抗凝血活性,結果如圖所示。推測兩種處理后酶解產物的抗凝血活性差異主要與肽的　　　　(填“種類”或“含量”)有關,導致其活性不同的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)若要比較蛋白質工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產物和天然水蛭素的抗凝血活性差異,簡要寫出實驗設計思路:　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
解析　 (1)蛋白質工程的流程一般為預期蛋白質功能→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到對應的脫氧核苷酸序列(基因)。密碼子的簡并性指的是同一種氨基酸可以由幾種不同的密碼子決定。(2)獲得目的基因的常用方法有從基因文庫中獲取、化學合成法和利用PCR技術擴增等。(3)由題圖可知,將提取的水蛭蛋白經甲、乙兩種蛋白酶水解后,水解產物中的肽含量差別不大,但抗凝血活性差別較大,推測兩種處理后酶解產物的抗凝血活性差異主要與肽的種類有關。不同肽的功能不同主要與氨基酸的數目、排列順序不同有關。
答案　(1)mRNA　多肽鏈　密碼子具有簡并性(一種氨基酸對應多個密碼子)
(2)從基因文庫中獲取　化學方法合成　DNA雙鏈復制
(3)種類　不同肽鏈的氨基酸數目、排列順序不同導致功能出現差異
(4)取四支試管,分別加入等量的生理鹽水、蛋白質工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解產物和天然水蛭素,再向四支試管中各加入等量的新鮮血液,觀察四支試管中血液的凝血情況
基因工程與蛋白質工程的比較
(1)區別。
項目 基因工程 蛋白質工程
過程 篩選和獲取目的基因→基因表達載體的構建→將目的基因導入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定 預期蛋白質功能→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到并改變相對應的脫氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→獲得所需要的蛋白質
續表
項目 基因工程 蛋白質工程
實質 定向改造生物的遺傳特性,以獲得人類所需的生物類型和生物產品 定向改造或生產人類所需的蛋白質
結果 只能生產自然界已存在的蛋白質 可生產自然界沒有的蛋白質
(2)聯系。
①蛋白質工程是在基因工程的基礎上延伸出來的第二代基因工程。
②基因工程中所利用的某些酶需要通過蛋白質工程進行改造。
考點四　DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴增及電泳鑒定
1.DNA的粗提取與鑒定。
(1)實驗原理。
(2)方法步驟(以洋蔥為例)。
2.DNA片段的擴增及電泳鑒定。
(1)原理。
①PCR原理:DNA的熱變性原理,即通過調節溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合。
②電泳。
(2)方法步驟。
①PCR擴增。
準備移液混合離心反應
②鑒定PCR產物→瓊脂糖凝膠電泳法→配制瓊脂糖溶液→制備瓊脂糖凝膠→將電泳緩沖液加入電泳槽中→加樣→電泳→取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。
教材微點
1.(選擇性必修3 P84~85 “探究·實踐”)DNA的電泳鑒定實驗中,影響DNA分子遷移速率的因素有哪些
提示　電泳時,DNA分子的相對分子質量越大,受到的阻力越大,遷移速率越慢,DNA分子的相對分子質量越小,受到的阻力越小,遷移速率越快。
2.(選擇性必修3 P84~85 “探究·實踐”)你進行電泳鑒定的結果是幾條條帶 如果不止一條條帶,請分析產生這個結果的可能原因。
提示　多條條帶。不止一條條帶的原因:操作過程中混入限制酶將DNA片段切割成片段或還有其他DNA片段,以此為模板,進行了擴增。
1.DNA的粗提取與鑒定的注意事項。
(1)加入酒精和用玻璃棒攪拌時,動作要輕緩,以免加劇DNA分子的斷裂,導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。
(2)本實驗不能用哺乳動物成熟的紅細胞作為實驗材料,原因是哺乳動物成熟的紅細胞無細胞核(無DNA)。可選用雞血細胞作為材料。
(3)鑒定DNA時,一支試管為對照組,另一支試管為實驗組。兩支試管中都先加物質的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液;在實驗組試管中加DNA絲狀物,對照組不加;加入二苯胺試劑后沸水浴加熱。結果可以看到加DNA絲狀物的試管呈現藍色,對照組無色。如果實驗組藍色較淺,說明提取出的DNA量太少。
2.DNA片段的擴增及電泳鑒定。
(1)為避免外源DNA等因素的污染,PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。
(2)該實驗所需材料可以直接從公司購買,緩沖液和酶應分裝成小份,并在-20 ℃儲存。使用前,將所需試劑從冰箱拿出,放在冰塊上緩慢融化。
(3)在向微量離心管中添加反應組分時,每吸取一種試劑后,移液器上的槍頭都必須更換,避免試劑的污染。
(4)在進行操作時,一定要戴好一次性手套。
(5)觀察DNA帶的分布及粗細程度來評價擴增的效果。
角度一 圍繞DNA的粗提取與鑒定,考查實驗探究能力
1.下列關于DNA粗提取與鑒定的敘述,錯誤的是 (　　)
A.用同樣方法從等體積兔血和雞血中提取的DNA量相近
B.DNA析出過程中,攪拌操作要輕柔以防DNA斷裂
C.預冷的乙醇可用來進一步純化粗提的DNA
D.用二苯胺試劑鑒定DNA需要進行水浴加熱
解析　哺乳動物(如兔)成熟的紅細胞無細胞核,細胞內基本不含DNA,故兔血不宜作為該實驗的實驗材料,A項錯誤;DNA析出過程中,攪拌要輕柔,以防DNA斷裂,B項正確;DNA不溶于冷乙醇,向DNA提取液中加入適量預冷的乙醇溶液,會使DNA析出,從而進一步提純DNA,C項正確;向溶有DNA的溶液中加入二苯胺試劑,沸水浴加熱數分鐘,溶液出現藍色,D項正確。
答案　A
2.(2023·貴州遵義聯考)如圖是“DNA的粗提取與鑒定”實驗中的兩個操作步驟示意圖,相關敘述正確的是 (　　)
圖1　 圖2
A.圖1中溶液a是物質的量濃度為0.14 mol/L的NaCl溶液
B.圖2所示實驗操作中有一處明顯錯誤,可能導致試管2中藍色變化不明顯
C.圖1所示操作的原理是DNA能溶于酒精,而蛋白質等雜質不溶酒精
D.圖2試管1的作用是證明物質的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺出現藍色
解析　圖1中溶液a是NaCl溶液,其目的是溶解DNA,DNA在物質的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液中的溶解度較高,在物質的量濃度為0.14 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最低,A項錯誤;圖2所示實驗的試管中,溶液的液面高于燒杯中的液面,可能導致加熱不充分,試管2中藍色變化不明顯,B項正確;圖1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精,而蛋白質等雜質能溶于酒精,C項錯誤;圖2試管1起對照作用,目的是證明沸水浴條件下,物質的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺不會出現藍色,而DNA遇二苯胺出現藍色,D項錯誤。
答案　B
角度二 圍繞DNA片段的擴增及電泳鑒定,考查科學探究能力
3.下列關于PCR操作過程的敘述,錯誤的是 (　　)
A.PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌
B.PCR利用了DNA的熱變性原理
C.PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后,迅速融化
D.在向微量離心管中添加反應組分時,每吸取一種試劑后,移液器上的槍頭都必須更換
解析　為避免外源DNA等因素的污染,PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌,A項正確;PCR利用了DNA的熱變性原理,B項正確;緩沖液和酶應分裝成小份,在-20 ℃儲存,使用前,將所需試劑從冰箱取出,放在冰塊上緩慢融化,C項錯誤;在向微量離心管中添加反應組分時,每吸取一種試劑后,移液器上的槍頭都必須更換,以免其他成分的污染,D項正確。
答案　C
4.(不定項)在基因工程操作過程中,科研人員利用識別兩種不同序列的限制酶(R1和R2)處理基因載體,進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果如圖所示。以下相關敘述中,不正確的是 (　　)
A.該載體最可能為鏈狀DNA分子
B.兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點
C.限制酶R1與R2的切點最短相距約200 bp
D.限制酶作用位點會導致氫鍵和肽鍵斷裂
解析　當僅用一種限制酶切割載體時,僅產生一種長度的DNA片段,因此該載體最有可能為環狀DNA分子,A項錯誤;當僅用一種限制酶切割載體時,兩種限制酶切割產生的DNA片段等長,而兩種限制酶同時切割時則產生兩種長度的DNA片段,所以兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點,B項正確;兩種限制酶同時切割時則產生600 bp和200 bp兩種長度的DNA片段,所以兩種限制酶的酶切位點至少相距200 bp,C項正確;限制酶切割DNA分子,破壞的是作用位點上兩個脫氧核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵,D項錯誤。
答案　AD
1.(2021·遼寧卷)腈水合酶(N0)廣泛應用于環境保護和醫藥原料生產等領域,但不耐高溫。利用蛋白質工程技術在N0的α和β亞基之間加入一段連接肽,可獲得熱穩定的融合型腈水合酶(N1)。下列有關敘述錯誤的是 (　　)
A.N1與N0氨基酸序列的差異是影響其熱穩定性的原因之一
B.加入連接肽需要通過改造基因實現
C.獲得N1的過程需要進行轉錄和翻譯
D.檢測N1的活性時先將N1與底物充分混合,再置于高溫環境
解析　在N0的α和β亞基之間加入一段連接肽,可獲得熱穩定的融合型腈水合酶(N1),則N1與N0氨基酸序列有所不同,這可能是影響其熱穩定性的原因之一,A項正確;蛋白質工程的作用對象是基因,即加入連接肽需要通過改造基因實現,B項正確;N1為蛋白質,蛋白質的合成需要經過轉錄和翻譯兩個過程,C項正確;酶具有高效性,檢測N1的活性需先將其置于高溫環境,再與底物充分混合,D項錯誤。
答案　D
2.(2020·北京卷)為了對重金屬污染的土壤進行生物修復,研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉運蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動子連接,導入楊樹基因組中(如圖)。
為檢測獲得的轉基因楊樹苗中是否含有導入的HMA3基因,同時避免內源HMA3基因的干擾,在進行PCR擴增時,應選擇的引物組合是 (　　)
A.①+③ B.①+②
C.③+② D.③+④
解析　為了檢測轉基因楊樹苗中是否含有導入的HMA3基因,并避免內源HMA3基因的干擾,在擴增時則不能包括HMA3基因,可通過檢測是否含有外源高效啟動子基因,因此選擇的引物組合為①+②,B項正確;①+③只有一條鏈的引物,不能完成兩條鏈的擴增,A項錯誤;③+②、③+④擴增的片段中均含有HMA3基因,C、D兩項錯誤。
答案　B
3.(2021·山東卷)人類γ基因啟動子上游的調控序列中含有BCL11A蛋白結合位點,該位點結合BCL11A蛋白后,γ基因的表達被抑制。通過改變該結合位點的序列,解除對γ基因表達的抑制,可對某種地中海貧血癥進行基因治療。科研人員擴增了γ基因上游不同長度的片段,將這些片段分別插入表達載體中進行轉化和熒光檢測,以確定BCL11A蛋白結合位點的具體位置。相關信息如圖所示。
注:F1~F7、R:引物
P:雌激素誘導下發揮作用的啟動子。
(1)為將擴增后的產物定向插入載體指導熒光蛋白基因表達,需在引物末端添加限制酶識別序列。據圖可知,在F1~F7末端添加的序列所對應的限制酶是　　　　,在R末端添加的序列所對應的限制酶是　　　　。本實驗中,從產物擴增到載體構建完成的整個過程共需要　　　　種酶。
(2)將構建的載體導入除去BCL11A基因的受體細胞,成功轉化后,含F1~F6與R擴增產物的載體表達熒光蛋白,受體細胞有熒光,含F7與R擴增產物的受體細胞無熒光。含F7與R擴增產物的受體細胞無熒光的原因是
　　　　　　　　　　　　　　。
(3)向培養液中添加適量的雌激素,含F1~F4與R擴增產物的受體細胞不再有熒光,而含F5~F6與R擴增產物的受體細胞仍有熒光。若γ基因上游調控序列上與引物序列所對應的位置不含有BCL11A蛋白的結合位點序列,據此結果可推測,BCL11A蛋白結合位點位于　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　,理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
解析　(1)觀察含載體的部分結構的圖示,熒光蛋白基因的左側為終止子,為了將擴增后的產物定向插入載體指導熒光蛋白基因表達,擴增后的產物的插入點應在熒光蛋白基因的右側,而熒光蛋白基因的右側有三個限制酶切點,分別是MunⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ限制酶的切點,但因為用EcoRⅠ會破壞熒光蛋白基因,所以只能用MunⅠ和XhoⅠ切割,切割后的載體圖示如圖:
擴增后的產物的兩端添加限制酶后得到的DNA片段能夠替換上圖載體中位于MunⅠ和XhoⅠ限制酶切割位點之間的片段,并能與左側的熒光蛋白基因片段及右側的P片段連接起來。由于F1~F7中有XhoⅠ限制酶切割位點,所以需尋找能代替XhoⅠ限制酶,且切割后的產物能與XhoⅠ限制酶切割后的產物連接的限制酶,而SalⅠ就符合這一要求,所以在F1~F7末端添加的序列所對應的限制酶是SalⅠ;而調控序列及啟動子中含有MunⅠ的切割位點,所以需尋找能代替MunⅠ的限制酶,且切割后的產物能與MunⅠ限制酶切割后的產物連接,而EcoRⅠ就符合這一要求;所以在R末端添加的序列所對應的限制酶是EcoRⅠ,擴增后的產物的兩端添加的限制酶識別序列如圖所示:
即用EcoRⅠ和SalⅠ切割調控序列及啟動子,用MunⅠ和XhoⅠ切割載體。本實驗中,從產物擴增到載體構建完成的整個過程共需要Taq酶、SalⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ、MunⅠ、DNA連接酶共6種酶。(2)將構建的載體導入除去BCL11A基因的受體細胞,成功轉化后,含F1~F6與R擴增產物的載體表達熒光蛋白,受體細胞有熒光,說明F1~F6與R擴增產物含完整的啟動子,熒光蛋白基因表達;含F7與R擴增產物的受體細胞無熒光,說明F7與R擴增產物不含完整的啟動子,熒光蛋白基因不表達。(3)向培養液中添加適量的雌激素,雌激素能誘導啟動子發揮作用。構建的載體含有BCL11A基因,導入構建載體的受體細胞能合成BCL11A蛋白。含F1~F4與R擴增產物的受體細胞不再有熒光,說明F1~F4與R擴增產物上均有BCL11A蛋白的結合位點(調控啟動子,熒光蛋白基因不表達),因此結合位點位于F4所對應調控序列的下游(右側);而含F5~F6與R擴增產物的受體細胞仍有熒光,說明F5~F6與R擴增產物上均無結合位點(啟動子完整,熒光蛋白基因能表達),可知結合位點位于F5所對應調控序列的上游(左側),所以結合位點位于引物F4與F5在調控序列上所對應序列之間的區段上。
答案　(1)SalⅠ　EcoRⅠ　6　(2)F7與R擴增產物不含完整的啟動子,熒光蛋白基因不表達　(3)引物F4與F5在調控序列上所對應序列之間的區段上　根據有無熒光情況判斷,F1~F4與R擴增產物上均有結合位點,因此結合位點位于F4所對應調控序列的下游(右側);F5~F6與R擴增產物上均無結合位點,可知結合位點位于F5所對應調控序列的上游(左側),所以結合位點位于引物F4與F5在調控序列上所對應序列之間的區段上
4.(2021·河北卷)采礦污染和不當使用化肥導致重金屬鎘(Cd)在土壤中過量積累。利用植物修復技術將土壤中的Cd富集到植物體內,進行后續處理(例如,收集植物組織器官異地妥善儲存),可降低土壤中Cd的含量。為提高植物對Cd污染土壤的修復能力,研究者將酵母液泡Cd轉運蛋白(YCF1)基因導入受試植物,并檢測了相關指標。
回答下列問題:
(1)為獲取YCF1基因,將酵母細胞的全部DNA提取、切割后與載體連接,導入受體菌的群體中儲存,這個群體稱為　　　　　　。
(2)將DNA序列插入Ti質粒構建重組載體時,所需要的兩種酶是　　　　　　　　。構建的重組基因表達載體中必須含有標記基因,其作用是　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)進行前期研究時,將含有YCF1基因的重組載體導入受試雙子葉植物印度芥菜,采用最多的方法是　　　　　　　　　　　　。
研究者進一步獲得了轉YCF1基因的不育楊樹株系,采用不育株系作為實驗材料的目的是　　　　　　　。
(4)將長勢一致的野生型和轉基因楊樹苗移栽到Cd污染的土壤中,半年后測定植株干重(圖1)及不同器官中Cd含量(圖2)。據圖1可知,與野生型比,轉基因植株對Cd具有更強的　　　　(填“耐性”或“富集能力”);據圖2可知,對轉基因植株的　　　　進行后續處理對于緩解土壤Cd污染最為方便有效。
　
圖1 圖2
(5)已知YCF1特異定位于轉基因植物細胞的液泡膜上。據此分析,轉基因楊樹比野生型能更好地適應高Cd環境的原因是　　　　　　　　　　　　　　。
相較于草本植物,采用楊樹這種喬木作為Cd污染土壤修復植物的優勢在于　　　　　　　 (寫出兩點即可)。
解析　(1)為獲取YCF1基因,將酵母細胞的全部DNA提取、切割后與載體連接,導入受體菌的群體中儲存,這個群體含有酵母菌的全部基因,稱為基因組文庫。(2)將DNA序列插入Ti質粒構建重組載體時,需要用限制酶切割供體DNA和質粒,以產生相同的黏性末端,然后用DNA連接酶進行連接。基因表達載體中的標記基因可用于目的基因的篩選和鑒定。(3)農桿菌容易侵染雙子葉植物,其質粒中的T DNA可轉移并插入到受體細胞DNA中,將含有YCF1基因的重組載體導入受試雙子葉植物印度芥菜,采用最多的方法是農桿菌轉化法。考慮轉基因技術的安全性,采用不育株系作為實驗材料,可避免目的基因在自然界中的擴散。(4)根據分析可知,與野生型比,轉基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加,說明轉基因植株在Cd污染的土壤中生長較好,即對Cd具有更強的耐性;據圖2分析,轉基因植株的莖、葉中Cd含量高于野生型,因此對轉基因植株的莖、葉進行后續處理,可使轉基因植株持續發揮富集Cd的作用,對于緩解土壤Cd污染最為方便有效。(5)YCF1特異定位于轉基因植物細胞的液泡,可通過主動運輸將Cd離子運到液泡中,提高了細胞液的濃度,有利于植株吸水,所以轉基因楊樹比野生型能更好地適應高Cd環境。相較于草本植物,楊樹具有發達的根系和高大的樹冠,更適應污染礦區等不良環境,同時可充分吸收土壤中的Cd,木材也方便運輸、利用,作為Cd污染土壤修復植物更具有優勢。
答案　(1)基因組文庫　(2)限制酶和DNA連接酶　便于目的基因的檢測和鑒定　(3)農桿菌轉化法　避免目的基因在自然界中的擴散　(4)耐性　莖、葉
(5)YCF1可通過主動運輸將Cd離子運到液泡中,提高了細胞液的濃度,有利于植株吸水　楊樹具有發達的根系和高大樹冠,更適應污染礦區等不良環境,同時可充分吸收土壤中的Cd,木材也方便運輸、利用

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