資源簡介

1.2 微生物的培養技術及應用
班級： 姓名：
學習目標：
概述培養基的配制方法和微生物純培養的基本操作要求，進行酵母菌的純培養。
闡明微生物選擇培養基的原理。
進行土壤中分解尿素的細菌的分離和計數。
基礎學習
一、微生物的基本培養技術
微生物的類群：病毒、 、真核生物。
1.培養基的配制
（1）培養基概念：人們按照微生物對 的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養基質。
（2）培養基作用：用以培養、分離、 、 微生物或積累其 。
（3）培養基類型：
培養基：含凝固劑（如瓊脂），用于微生物的分離、計數、鑒定等。
培養基：不含凝固劑，用于微生物的擴大培養、工業生產。
（4）培養基成分： 、 、 、 （大量元素、微量元素）。
組分組分 含量含量 提供的主要營養提供的主要營養
牛肉膏 5g 碳源、氮源、 和維生素等
蛋白胨 10g 碳源、氮源和維生素等
NaCl 5g 無機鹽
H2O 定容至1000mL 水
在主要營養物質的基礎上，培養基還需要滿足微生物生長的條件有：對pH、特殊營養物質以及O2的需求。
例如，培養乳酸桿菌需添加 ；培養霉菌需調至 ；
培養細菌需調至中性或 性；培養厭氧微生物需提供 環境。
2.無菌技術
（1）獲得純凈的微生物培養物的關鍵是防止 。
（2）無菌的范圍
①實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和 。
②培養的器皿、接種用具和培養基等進行 。
③實驗操作時應避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸
注意：為避免周圍環境中微生物的污染，實驗操作應在 上，并在
附近進行。
（3）消毒：使用較為 的物理、化學或生物等方法，殺死物體表面或內部 微生物。
類型 適用范圍 操作方法
日常生活 100℃煮沸5～6min
不耐高溫的液體 62～65℃煮30min或80-90℃煮30s-1min
生物活體、水源等 擦拭等,如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源
接種室、接種箱，超凈工作臺 紫外線照射30 min
（4）滅菌：指使用 的理化方法殺死物體內外 微生物，包括芽孢和孢子。
類型 適用范圍 操作方法
接種的金屬工具、接種時用的試管口或瓶口等 直接在酒精燈火焰的 灼燒
耐高溫、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金屬用具等 物品放入干熱滅菌箱,160～170 ℃加熱2～3h
培養基等,生產和實驗室常用 高壓蒸汽滅菌鍋內,100kPa，溫度121℃， 15～30min
3.微生物的純培養
(1)純培養物：由單一個體繁殖所獲得的微生物群體。
(2)純培養：獲得純培養物的過程。
具體過程：
(3)酵母菌的純培養
菌落
定義：單個或少數同種菌體在固體培養基上大量繁殖，形成肉眼可見的子細胞群體。
特征：大小、形狀、顏色、光澤度、透明度、隆起程度等。
功能：不同菌落所具有的特征不同，是鑒定 的重要依據。
方法步驟：
①配置培養基：
倒平板注意事項：
ａ．溫度：50℃左右（過高：燙手；過低：瓊脂會凝固）。
ｂ．操作：在酒精燈火焰附近（防止雜菌污染）。
ｃ．冷凝后平板 （既可以避免培養基中的水分過快蒸發又可防止皿蓋上的冷凝水落入培養基，造成污染）。
②接種和分離酵母菌
接種方法： ， 。
平板劃線法注意事項:
①接種環只蘸一次菌液，但要在培養基不同位置連續劃線多次。
②劃線首尾不能相接。
③每次劃線前接種環進行灼燒滅菌，待冷卻后再開始畫線。
④劃線后，培養皿 培養。
③培養酵母菌
為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環嗎？為什么？
灼燒時期 目的
取菌種前 殺死接種環上原有微生物。
每次劃線前 殺死上次劃線時殘留菌種，使下一次劃線的菌種直接來源上次劃線的末端，從而使每次劃線時菌種數目逐漸減少，直至得到 個細胞。
接種結束后 殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者。
結果分析與評價：
1.在未接種的培養基表面是否有菌落生長？如果有，說明了什么？
在未接種的培養基表面若沒有菌落生長，則說明培養基未被污染且已徹底滅菌，培養基可以使用；
如果有，說明培養基被雜菌污染或滅菌不徹底。
2.在接種酵母菌的培養基上，你是否觀察到了單菌落？這些菌落的顏色、形狀和大小是否一致？如果你觀察到了不同形態的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的嗎？
在接種酵母菌的培養基上可觀察到單菌落。
如果培養基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特點，則說明純化酵母菌的操作成功。如果培養基上出現了其他形態的菌落，則說明在純化過程中，無菌操作還未達到要求，可能所用菌種不純，或者實驗操作操作不規范，被雜菌污染。
二、微生物的選擇培養和計數
1.選擇培養基
（1）實例：尋找耐高溫的DNA聚合酶
（2）概念：在微生物學中，將 特定種類的微生物生長，同時 其他種類微生物生長的培養基稱為選擇培養基。
（3）類型
類型 條件 分離得到的菌種
改變培養條件 70～80℃的高溫 水生棲熱菌
添加某種化學物質 加入青霉素 酵母菌、霉菌等真菌
高濃度食鹽 金黃色葡萄球菌
營養缺陷 不加碳源 自養型微生物
不加氮源 固氮菌
思考·討論 選擇培養基配方的設計
1.如果讓你配制一種培養基，將土壤稀釋液中能分解尿素的細菌分離出來，培養基的配方該如何設計？
在選擇培養基中，以 作為唯一氮源，只有能合成脲酶的細菌才能生長發育繁殖。
2.該培養基與普通培養基有哪些共同點和不同點？
除以尿素作為唯一氮源外，該培養基的其他營養成分與普通培養基基本相同。
2.微生物的選擇培養
由于土壤細菌的數量龐大，要想得到特定微生物的純培養物，必須要對土壤進行充分 ，然后再將菌液涂布到制備好的 上。
（1）方法：
（2）基本操作：梯度稀釋和涂布平板
（3）操作過程
①鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中。
②將10g土樣加入盛有90mL 的錐形瓶中，充分搖勻，制成菌液。
取1mL上清液加入盛有 無菌水的試管中，依次等比稀釋。
③取0.1mL菌液，滴加到培養基表面。
④將 浸在盛有酒精的燒杯中。
⑤將 放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器 后，再進行涂布。
⑥用 將菌液均勻地涂布在培養基表面。涂布時可 培養皿，使涂布均勻。
待涂布的菌液被培養基吸收后，將平板 培養。
平板劃線法 稀釋涂布平板法
純化原理 通過連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散 將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋程度的菌液分別涂布到固體培養基的表面，進行培養，以得到單菌落
接種工具
單菌落的獲得 從最后劃線的區域挑取 稀釋度合適，整個平板上都可找到單菌落
用途 純化菌種，獲得單菌落 ① 純化菌種，獲得單菌落②用于
相同點 ①都能分離純化菌種；②都是在固體培養基上進行的。
3.稀釋涂布平板法—間接計數法
（1）原理：
當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的 單菌落，來源于樣品稀釋液中的 活菌；通過計數平板上的菌落數，就能 出樣品中大約含有多少活菌。
（2）計數原則：
①選擇菌落數為 的平板計數。
②同一稀釋度下，應至少對 個平板進行重復計數，然后求出平均值。
（3）結果分析：
①統計的菌落數往往比活菌的實際數目 。
原因：當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。
②統計結果一般用 數而不是用活菌數來表示。
（4）計算公式：
每g樣品中的菌落數＝(C÷V)×M
C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數
V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)
M代表稀釋倍數
例：某同學在稀釋倍數為106 的培養基中測得平板上菌落數的平均數為234，那么每g樣品中的菌落數是（涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1mL) 。
4.顯微鏡直接計數—直接計數法
（1）方法：利用特定的 或 在顯微鏡下觀察、計數，然后再計算一定體積的樣品中微生物的數量；
細菌計數板可對細菌等較 的細胞進行觀察和計數；
血細胞計數板常用于相對較 的酵母菌細胞、霉菌孢子等的計數。
（2）優點： 。
（3）缺點：
①統計的結果一般是活菌數和死菌數的總和，不能區分死菌與活菌。
(統計結果比實際結果要 ）
②個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察。
探究·實踐 土壤中分解尿素的細菌的分離和計數
1.提出問題:如何分離土壤中分解尿素的細菌 每克土壤樣品中含有多少分解尿素的細菌
2.培養基
組分 含量
KH2PO4 1.4 g
Na2HPO4 2.1 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
葡萄糖 10.0 g
尿素 1.0 g
瓊脂 15.0 g
H2O 定容至1000mL
3.實驗設計:
(1)土壤取樣:先鏟去表層土,取距地表 cm的土壤層,將樣品裝入紙袋中。
(2)樣品稀釋:一般選用1×104、1×105、1×106倍的稀釋液進行平板培養。
(3)微生物的培養與觀察：一般在 的溫度下培養1～2天，每隔24h統計一次
數目，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果。
4.鑒定原理:
分解尿素的細菌合成的脲酶將尿素分解為NH3，使培養基的堿性 ，pH 。在選擇培養基中加入 指示劑,培養某種細菌,若指示劑 ,可初步鑒定該種細菌能夠分解尿素。
5.操作提示（教材P19）：
（1）將涂布器從酒精中取出時，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后再放在火焰上灼燒。不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃酒精。
（2）要按照前面學習過的無菌操作的方法，進行規范操作。取土樣時用的鐵鏟和取樣紙袋在使用前都需要 。操作完成后，一定要洗手。
（3）本實驗使用的平板和試管較多，為了避免混淆，最好在使用前做好標記。
（4）本實驗耗時較長，需要事先規劃時間，以便提高實驗效率，在操作時有條不紊。
6.結果分析與評價
（1）結合對照組，分析培養物中是否有雜菌污染以及選擇培養基是否篩選出一些菌落。
如果沒有接種的培養基上沒有菌落生長，說明培養基沒有被雜菌污染。
如果接種后的完全培養基上的菌落數明顯多于選擇培養基上的菌落數，說明選擇培養基篩選出了一些尿素分解菌。
（2）你是否獲得了某一稀釋度下菌落數目在30-300的平板？在這一稀釋度下，是否至少有2個平板的菌落數接近？
如果得到了兩個或多個菌落數為30～300的平板，說明稀釋度合適，操作比較成功，能夠進行菌落的計數。
（3）你統計的每克土樣中能分解尿素的細菌的菌落數是多少？
如果是用同一土樣進行的操作，數據應該比較接近。
如果差異很大，就需要從操作是否規范、培養基配制是否合理等方面查找原因。

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