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選擇性必修三 第2章 基因工程的基本操作程序
一、你從教材上找到的關鍵性語句：
（一）目的基因的篩選與獲取
1.目的基因概念
在基因工程的設計和操作中，用于__改變受體細胞性狀__或__獲得預期表達產物_等的基因就是目的基因（根據不同的需要，目的基因是不同的，主要是指__編碼蛋白質的基因___）。
2.篩選目的基因的方法
（1）從相關的__已知結構__和__功能清晰__的基因中進行篩選。
（2）獲取方法
3.利用PCR獲取和擴增目的基因
（1）PCR的概：PCR是__聚合酶鏈式反應__的縮寫，是一項根據_DNA半保留復制_的原理，在_體外_提供參與DNA復制的__各種組分__與_反應條件_，對_目的基因的核苷酸序列_進行__大量復制__的技術。
①全稱：__聚合酶鏈式反應___
②原理：___DNA半保留復制___
③操作環境：__體外（PCR擴增儀/PCR儀）___
④目的：__對目的基因的核苷酸序列進行大量復制___
⑤優點：___可以在短時間內大量擴增目的基因___
（2）DNA體內復制的條件
參與的組分 在DNA復制中的作用
DNA母鏈 提供DNA復制的模板
4種脫氧核苷酸 合成DNA子鏈的原料
解旋酶 打開DNA雙鏈
DNA聚合酶 催化合成DNA子鏈
引物 使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸
注：引物是一小段能與_DNA母鏈__的一段堿基序列__互補配對_的_短單鏈核酸__。
（3）DNA體外復制（PCR）的條件
參與的組分 在DNA復制中的作用
DNA母鏈 提供DNA復制的模板
4種脫氧核苷酸 合成DNA子鏈的原料
引物 使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸
90℃以上高溫 打開DNA雙鏈（變性溫度）
耐高溫的DNA聚合酶 催化合成DNA子鏈
緩沖液（含Mg2+ ) 激活真核細胞和細菌的DNA聚合酶
其他不同的溫度 變性、復性和延伸 需要不同溫度
（4）過程
目的基因DNA__受熱變性__后_解為單鏈_，_引物 與單鏈相應_互補序列_結合；然后以__單鏈DNA__為模板在_DNA聚合酶_作用下進行_延伸__，即將4種_脫氧核苷酸__加到__引物的3’__，如此__重復循環多次__， 每次循環一般可以分為_變性、復性和延伸_三步。
變性 溫度上升到90 ℃左右，雙鏈DNA解聚為單鏈
復性 溫度下降到55 ℃左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合
延伸 溫度上升到72 ℃左右，Taq酶從引物起始合成互補鏈，可使新鏈由5′端向3′端延伸
4.獲取目的基因的其他方法
（1）構建基因文庫來獲取目的基因：將含有某種生物不同基因的許多DNA 片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。
①基因組文庫：包含一種生物所有的基因。
②部分基因文庫：只包含一種生物一部分基因，如cDNA文庫。
（2）利用化學方法人工合成：用DNA合成儀，要獲取的基因比較小，核苷酸序列又已知，不需要模板。
（二）基因表達載體的構建（核心）
1.基因表達載體的組成
基因表達載體必須包括_目的基因_、__標記基因_、_啟動子_、_終止子_等（若需要能完成自主復制，還應有_復制原點_）。
（1）啟動子
①本質：一段有特殊序列結構的_DNA_片段。
②位置：位于基因的_上游_，緊挨__轉錄的起始位點__。
③功能：RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA___。
④特殊類型：_誘導型啟動子___。
⑤誘導型啟動子的特點：當誘導物存在時，可以激活或抑制目的基因的表達__。
（2）終止子
①本質：一段有特殊序列結構的_DNA__片段。
②位置：位于基因的_下游_。
③功能：使轉錄在所需要的地方停下來__。
（3）標記基因
①作用：_便于重組DNA分子的篩選_
②常見類型：抗生素抗性基因、熒光蛋白基因等
（4）基因表達載體的構建過程
一般用同種或能產生相同末端的限制酶分別切割載體和含有目的基因的DNA片段，再利用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體的切口處(如圖所示)。
（三）將目的基因導入受體細胞
1.將目的基因導入植物細胞—花粉管通道法
（1）操作方式
①用__微量注射器_將__含目的基因的DNA溶液_直接注入_子房_中。
②在_植物受粉后_的一定時間內，_剪去柱頭_，將__DNA溶液___滴加在_花粉管通道__上，使目的基因借助_花柱切面__進入_胚囊_。
（2）受體細胞：_受精卵__。
2.將目的基因導入植物細胞—農桿菌轉化法
（1）轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程__。
注：此處“轉化”與肺炎鏈球菌轉化實驗中的“轉化”含義相同，實質都是、、、、。
（2）農桿菌特點：
①能在自然條件下侵染__雙子葉植物_和_裸子植物__，而對大多數__單子葉植物_沒有侵染能力。
②農桿菌細胞內含有__Ti質粒_，當它侵染植物細胞后，能將_Ti質粒_上的_T-DNA_（ 可轉移的DNA ）轉移_到被侵染的細胞，并且將其__整合到該細胞的染色體DNA上__。
（3）農桿菌轉化法的過程：將目的基因插入_Ti質粒的T-DNA__中，通過農桿菌的_轉化_作用，就可以使目的基因_進入植物細胞_，并___整合到受體細胞的染色體DNA上__，使目的基因能夠_維持穩定和表達__。
3.將目的基因導入動物細胞—顯微注射法
（1）受體細胞：_受精卵_
（2）過程：
4.將目的基因導入微生物細胞—Ca2+處理法
（1）受體細胞：常用__原核生物__作為受體細胞，其中以__大腸桿菌_最廣泛
（2）原核生物的優點：_繁殖快、單細胞、遺傳物質相對較少、易于培養__
（3）Ca2+處理法（感受態細胞法）的一般過程：
（四）目的基因的檢測與鑒定
檢測目的 檢測方法 判斷標準
目的基因是否插入轉基因生物的DNA DNA分子雜交技術 是否出現雜交帶
目的基因是否轉錄出了mRNA 分子雜交技術 是否出現雜交帶
目的基因是否翻譯出蛋白質 抗原—抗體雜交技術 是否出現雜交帶
個體水平的檢測 如抗蟲、抗病的接種實驗 是否表現出相應的特性
（五）DNA片段的電泳鑒定
（1）實驗原理：DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。帶電粒子在電場作用下，向與其攜帶電荷相反 的電極移動。
（2）影響DNA分子的遷移率的因素：DNA的分子大小，DNA分子的構象，凝膠的濃度。
（3）電泳出現位置不等的幾條條帶，說明存在長短不一的DNA片段，鑒定的PCR產物不純凈。
二、判斷訓練：
目的基因的獲取的方法通常的兩種：目的基因的序列未知的，可以用化學方法合成目的基因，如胰島素基因，或者用PCR技術擴增目的基因；目的基因的序列已知的，可以先建立基因文庫，然后從中找到需要的目的基因 (　　)
在形成重組DNA分子時，通常用相同的限制酶切割目的基因和載體DNA (　　)
用質粒作為載體，宿主細胞應該選擇大腸桿菌，要用氯化鈣處理大腸桿菌，增加大腸桿菌細胞膜的通透性 (　　)
將目的基因導入植物細胞，最常用的方法是農桿菌轉化法，此方法的受體細胞大多是體細胞(　　)
將目的基因導入動物細胞，最常用的方法是顯微注射技術，此方法的受體細胞大多是體細胞(　　)
轉基因植物與轉基因動物體內的目的基因通常是不遵循孟德爾定律的(　　)
篩選含目的基因的受體細胞的通常依據是受體細胞是否具有載體特有的“標記基因”所控制的性狀，常用的標記基因是抗性基因(　　)
通常用抗原－抗體特異性反應的方法，檢測多細胞生物中目的基因是否表達；單細胞生物中目的基因是否表達，常檢測相應性狀是否出現(　　)
轉入人的胰島素原基因的大腸桿菌，可通過檢測大腸桿菌是否產生胰島素，來判斷目的基因是否表達 (　　)
基因工程的受體細胞主要有：大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌、植物細胞和動物細胞(　　)
利用顯微注射的方法將目的基因直接導入受體細胞，而不需要DNA載體。(　　)
用同種生物的不同細胞構建的cDNA文庫都是相同的。(　　)
如果要將人生長激素基因導入大腸桿菌，應從cDNA文庫中獲取目的基因，或用人工化學合成的方法獲取。(　　)
用限制性內切酶切割得到的人胰島素原基因，導入大腸桿菌細胞后不能得到有效的表達。(　　)
成功導入外源基因就標志著基因工程的成功。(　　)
檢測受體細胞是否導入了目的基因，以及受體細胞中導入的目的基因是否轉錄出mRNA，可用相同的目的基因探針進行診斷。(　　)
為檢測胰島素基因轉錄的mRNA是否翻譯成胰島素原，常用抗原-抗體雜交技術。(　　)
載體上的抗性基因有利于篩選含重組DNA的細胞和促進目的基因的表達(　　)
利用基因工程技術使大腸桿菌合成人的蛋白質的過程中常用同種的限制性內切酶處理目的基因和質粒(　　)
基因工程的四個操作步驟中都需要遵循堿基互補配對的原則(　　)
啟動子和終止密碼子均在胰島素基因的轉錄過程中起作用。(　　)
檢測目的基因是否成功表達可用抗原—抗體雜交技術。(　　)
轉基因抗蟲棉植株抗蟲效果的鑒定要通過分子檢測才能達到目的。(　　)
目的基因導入雙子葉植物必須用花粉管通道法。(　　)
外源DNA必須位于重組質粒的啟動子和終止子之間才能進行復制。( )
用PCR方法擴增目的基因時需要設計兩種引物。( )
用PCR方法擴增目的基因時不必知道基因的全部序列。( )
目的基因導入雙子葉植物也常采用農桿菌轉化法。( )
為培育抗除草劑的作物新品種，導入抗除草劑基因時只能以受精卵為受體細胞。( )
轉基因抗蟲棉植株抗蟲效果的鑒定是通過PCR等技術來檢測。( )
檢測目的基因是否導入受體細胞可用抗原—抗體雜交技術。( )
一個表達載體的組成包括目的基因、標記基因、啟動子、終止子等。( )
只要目的基因進入受體細胞就能實現表達。( )
PCR擴增中加熱到50 ℃左右的目的是在Taq DNA聚合酶作用下合成子鏈。( )
復性溫度過高可能導致PCR反應得不到任何擴增產物。( )
凝膠中的DNA分子通過染色，可在波長為300 nm的紫外燈下被檢測出來。( )
電泳時，應有一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物。( )
生物體內DNA分子的解旋一定需要解旋酶，在體外則只需要高溫。(　　)
耐高溫的DNA聚合酶是用PCR儀對DNA分子擴增過程中必須加入的物質之一。(　　)
三、邊練邊講
練習1：基因工程的基本操作程序
1、如圖是利用基因工程技術培育轉基因植物，生產可食用疫苗的部分過程示意圖，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ為四種限制性內切核酸酶。下列說法錯誤的是(　　)
A．圖示過程是基因工程的核心步驟
B．表達載體構建時需要用到限制酶SmaⅠ
C．卡那霉素抗性基因的存在有利于將含有抗原基因的細胞篩選出來
D．除圖示組成外，表達載體中還應該含有啟動子和終止子等結構
2、某科研小組利用質粒(圖甲)和目的基因(圖乙)構建重組DNA。下列分析錯誤的是(　　)
A．用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割質粒，可得到2條DNA片段
B．不能用AluⅠ酶切割質粒和外源DNA的原因是AluⅠ會破壞目的基因
C．構建重組DNA時，需選擇SmaⅠ和PstⅠ同時切割質粒和外源DNA
D．導入了重組DNA的細菌能在含四環素的培養基上生長而不能在含氯霉素的培養基上生長
3、第三代疫苗——DNA疫苗是指將編碼保護性抗原蛋白的基因插入適宜的質粒中得到的重組DNA分子，將其導入人體內，在人體細胞內表達的產物可直接誘導機體產生免疫反應，且可持續一段時間。下列有關DNA疫苗的敘述，正確的是(　　)
A．DNA疫苗的表達產物不是抗原
B．DNA疫苗生產過程不需要解旋酶和限制酶
C．抗原基因在體內表達時不需要RNA聚合酶
D．DNA疫苗的特異性與堿基種類無關
4、科研人員先分別PCR擴增尿酸酶基因和原核生物胞外蛋白信號肽基因(編碼的肽鏈能引導新合成的蛋白質轉移、分泌)，再將它們拼接形成融合基因，并導入大腸桿菌生產尿酸酶。下列相關敘述錯誤的是(　　)
A．擴增兩類基因時可以通過設計引物來控制兩類基因的拼接方向
B．構建融合基因的目的是使大腸桿菌能合成尿酸酶并分泌到細胞外
C．融合基因導入大腸桿菌前需構建基因表達載體，以保證目的基因正常表達和遺傳
D．在導入融合基因前，應先用NaCl溶液處理大腸桿菌，使其處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態
5、為了增加油菜種子的含油量，研究人員嘗試將酶D基因與轉運肽基因相連，一起導入油菜細胞并獲得了轉基因油菜品種。
(1)研究人員采用________技術快速擴增從陸地棉基因文庫中獲取的酶D基因和從擬南芥基因文庫中獲取的轉運肽基因。所含三種限制酶(ClaⅠ、SacⅠ、XbaⅠ)的切點如圖所示，則用____________酶處理兩個基因后，可得到________(填圖中字母)端相連的融合基因。
(2)將上述融合基因插入如圖所示Ti質粒的T－DNA中，構建____________并導入農桿菌中。將獲得的農桿菌接種在含________的固體平板上培養得到含融合基因的單菌落，再利用液體培養基振蕩培養，可以得到用于轉化的侵染液。
(3)剪取油菜的葉片放入侵染液中一段時間，此過程的目的是_____ _________________________，進一步篩選后獲得轉基因油菜細胞，該細胞通過____________技術，可培育成轉基因油菜植株。
(4)用______________法可檢測轉基因油菜植株中的融合基因是否表達。
講解1：基因工程的基本操作程序
一、目的基因的篩選與獲取
1、利用PCR技術擴增目的基因：
2、從構建的____________中獲取目的基因。
3、通過____________的方法獲得目的基因。
二、基因表達載體的構建
1．基因工程表達載體的理解
2．啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比
比較項目 啟動子 終止子 起始密碼子 終止密碼子
本質 DNA片段 DNA片段 mRNA上三個相鄰的堿基 mRNA上三個相鄰的堿基
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA 使轉錄在所需要的地方停下來 翻譯的起始信號（編碼氨基酸） 翻譯的結束信號（不編碼氨基酸）
3．構建基因表達載體時限制酶的選擇(以下圖為例)
(1)根據目的基因兩端的限制酶切點以及是否破壞目的基因來確定限制酶的種類：
①應選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。
②不能選擇切點位于目的基因內部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。
③為避免目的基因和質粒的自身環化和目的基因與質粒的反向連接，可使用兩種切割后能產生不同末端的限制酶切割目的基因所在片段和質粒，如圖甲可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質粒上也有這兩種限制酶的切點)。
(2)根據質粒的特點確定限制酶的種類：
①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶一致，以確保切割后能產生相同的末端。
②質粒作為載體必須具備標記基因等，所以要考慮所選擇的限制酶對這些標記基因等是否有破壞作用，如圖乙中限制酶SmaⅠ會破壞標記基因；如果所選限制酶的切點不止一個，則切割重組后可能丟失某些片段，若丟失的片段含復制原點，則切割重組后的片段進入受體細胞后不能自主復制。
三、將目的基因導入受體細胞
1．不同受體細胞的常用導入方法
項目 植物細胞 動物細胞 大腸桿菌等微生物細胞
常用方法 農桿菌轉化法 顯微注射法 Ca2＋處理法
受體細胞 體細胞 受精卵 大腸桿菌等
轉化 過程 將目的基因插入Ti質粒的T－DNA上→轉入農桿菌→導入植物細胞→整合到受體細胞的染色體DNA上→目的基因表達 將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發育→胚胎移植→獲得具有新性狀的動物 Ca2＋處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態→表達載體與Ca2＋處理過的細胞混合→受體細胞吸收DNA分子，完成轉化過程
2．農桿菌轉化法中的兩次拼接和兩次導入
(1)拼接：
第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的T－DNA上；第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA被拼接到受體細胞的染色體DNA上。
(2)導入：
第一次導入是將含目的基因的Ti質粒導入農桿菌；第二次導入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA導入受體細胞。
3．植物體細胞的全能性較高，可經植物組織培養形成完整植物體，因此受體細胞可以是體細胞；動物體細胞的全能性受到嚴格限制，但受精卵全能性高，因此動物基因工程中的受體細胞一般只用受精卵。
四、目的基因的檢測與鑒定
1．目的基因檢測與鑒定的“兩個水平”
2．常見不同轉基因生物在個體生物學水平上的鑒定方法：個體水平的鑒定實際上是檢測目的基因是否表達出所控制的性狀。
轉基因生物 鑒定方法 觀察目標
抗蟲植物 害蟲吞食 害蟲是否死亡
抗病毒(菌)植物 病毒(菌)感染 是否未出現病斑
抗鹽植物 鹽水澆灌 是否正常生長
抗除草劑植物 噴灑除草劑 是否正常生長
獲取目的基因產物的轉基因生物 提取細胞產物與天然產品進行功能活性比較 細胞產物功能活性是否正常
練習2：PCR技術和DNA片段的電泳鑒定
1、利用PCR技術將某小段DNA分子擴增n代，正確的是(　　)(多選)
A．測定DNA分子兩端的核苷酸序列，以便設計引物對
B．要求引物的序列是互補的
C．2n對引物參與子代DNA分子的合成
D．向反應體系中加入解旋酶、DNA聚合酶等
E．保持反應體系溫度恒定，確保擴增的正常進行
2．下列關于DNA片段的擴增及電泳鑒定原理的說法，錯誤的是(　　)(多選)
A．PCR是一項在生物體外復制特定的DNA片段的核酸合成技術
B．DNA分子在凝膠中的遷移速率與DNA分子大小、構象和凝膠的濃度有關
C．凝膠中的DNA分子經染色后可在波長為300 nm的紫外燈下檢測
D．PCR擴增中需要解旋酶解開雙鏈DNA
E．PCR中引物的作用是使DNA連接酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸
F．電泳的原理是在電場的作用下，帶電的DNA分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動
3．在基因工程操作中，科研人員利用兩種限制酶(R1和R2)處理基因載體，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結果如圖所示。下列相關敘述不正確的是(　　)
A．該載體最可能為環形DNA分子
B．兩種限制酶在載體上識別的序列不同
C．限制酶R1與R2的酶切位點最短相距約200 bp
D．限制酶切割時會導致作用位點的氫鍵和肽鍵斷裂
4．某實驗利用PCR技術獲取目的基因，實驗結果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對)外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。為了減少反應非特異條帶的產生，以下措施中有效的是(　　)
A．增加模板DNA的量 B．延長熱變性的時間 C．延長延伸的時間 D．提高復性的溫度
講解2：PCR技術和DNA片段的電泳鑒定
1．PCR技術和DNA復制的比較
⑴復性時不一定均為引物與DNA模板結合，也存在DNA解開的兩條單鏈的結合，因此一般在PCR實驗中引物的投入量遠大于產物量。
⑵一次PCR一般要經歷30次循環。
二、PCR技術和電泳鑒定
1．實驗原理
(1)DNA片段的擴增：
①利用PCR可以在體外進行DNA片段的擴增。
②PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調節溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合。
(2)DNA片段的電泳鑒定：
①帶電粒子：DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基因可以帶上正電荷或負電荷。
②遷移動力與方向：在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。
③遷移速率：在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關。
④檢測：凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300 nm的紫外燈下被檢測出來。
2．相關計算
⑴第____代出現完整的目的基因
⑵n代后，含引物的DNA分子有_2n__個
⑶n代后，共消耗_2n+1-2_個引物
⑷第n代復制，消耗了_2n_個引物
⑸n代后，完整的目的基因有_2n-2n_個

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