資源簡(jiǎn)介

選擇性必修三 第3章 重組DNA技術(shù)的基本工具
一、你從教材上找到的關(guān)鍵性語(yǔ)句：
（一）、基因工程的概念
1. 基因工程的概念
操作環(huán)境 生物體外
操作對(duì)象 基因
操作水平 DNA分子水平
操作原理 基因重組
操作結(jié)果 按照人類的需要定向改造生物的遺傳特性
2．基因重組的類型
（1）真核生物有性生殖過(guò)程中，減數(shù)分裂時(shí)發(fā)生的基因重組：①交換型；②自由組合型。
（2）肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中發(fā)生的基因重組。
（3）基因工程中人工操作導(dǎo)致的基因重組。
3．幾乎所有生物的DNA分子都是由4種脫氧核苷酸形成的規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)。
4．所有生物都共用一套遺傳密碼。
5．目的基因可在受體細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立表達(dá)的原因是基因是控制生物性狀的結(jié)構(gòu)和功能單位，具有相對(duì)獨(dú)立性。
（二）、分子手術(shù)刀—限制性內(nèi)切核酸酶
1.全稱和簡(jiǎn)稱
全稱：_限制性內(nèi)切核酸酶_
簡(jiǎn)稱：__限制酶_
2.來(lái)源：主要是從_原核生物__中分離純化出來(lái)的
3.作用：
①能夠識(shí)別_雙鏈_DNA分子的某種_特定核苷酸序列 。
②使_每一條_鏈中_特定部位_的_磷酸二酯鍵__斷開(kāi)。
4.作用部位：_磷酸二酯鍵__
5.識(shí)別序列：大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由_6_個(gè)核苷酸組成，也有少數(shù)限制酶的識(shí)別序列由_4_個(gè)、_8_個(gè)或__其他數(shù)量_的核苷酸組成。
6.切割結(jié)果：DNA分子經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式__黏性末端_和__平末端__。
（1）EcoRⅠ限制酶切割
EcoRⅠ識(shí)別序列為GAATTC
EcoRⅠ切割部位為GA之間的磷酸二酯鍵
（2）SmaⅠ限制酶切割
SmaⅠ識(shí)別序列為CCCGGG
SmaⅠ切割部位為CG之間的磷酸二酯鍵
（三）、分子縫合針—DNA連接酶
1.功能：將__兩個(gè)DNA片段連接起來(lái)_，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的_磷酸二酯鍵__。
2.分類和對(duì)比
種類 E·coli DNA連接酶 T4DNA連接酶
來(lái)源 大腸桿菌 T4噬菌體
特點(diǎn) 只縫合 黏性 末端 縫合 黏性 末端 平 末端
作用 恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵
（四）、分子運(yùn)輸車——載體
1．種類：質(zhì)粒、噬菌體、動(dòng)植物病毒等。
2．常用載體——質(zhì)粒
（1）本質(zhì)：質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。
（2）質(zhì)粒作為載體所具備的條件及原因
條件 原因
穩(wěn)定存在并能自我復(fù)制或整合到受體DNA上 能使目的基因穩(wěn)定存在且數(shù)量可擴(kuò)增
有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn) 可攜帶多個(gè)或多種外源基因
具有特殊的標(biāo)記基因 便于重組DNA分子的篩選
無(wú)毒害作用 對(duì)受體細(xì)胞無(wú)毒害作用，避免受體細(xì)胞受到損傷
（3）作用
①作為運(yùn)輸工具，將外源基因?qū)爰?xì)胞。
②質(zhì)粒攜帶外源基因在細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制。
（五）探究.實(shí)踐：DNA的粗提取與鑒定
1.提取思路：利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在酒酒酒酒酒酒性質(zhì)方面存在的差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法對(duì)他們進(jìn)行提取。
2.提取原理：
①DNA不溶于酒精 ，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精，利用這一原理，可以初步分離DNA與蛋白質(zhì)；
②DNA在不同濃度的NaCl溶液 中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。
3.鑒定原理：在一定溫度下（沸水浴），DNA遇二苯胺試劑 會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色，因此二苯胺試劑 可以作為鑒定DNA的試劑。
4.比較DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同
溶解規(guī)律 2 mol/L NaCl溶液 0.14 mol/L NaCl溶液
DNA 溶解 析出
5．DNA粗提取中的注意事項(xiàng)
（1）本實(shí)驗(yàn)不能用哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料，原因是哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞 無(wú)細(xì)胞核(無(wú)DNA)。可選用雞血細(xì)胞作材料。
（2）加入洗滌劑后，動(dòng)作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫。加入酒精 和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀 。
（3）二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用 ，否則會(huì)影響鑒定的效果。
（4）提取植物細(xì)胞的DNA時(shí)，加入的洗滌劑能溶解細(xì)胞膜 ，有利于DNA的釋放；加入食鹽(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。
（5）在DNA進(jìn)一步提純時(shí)，選用冷卻的95%的酒精 的作用是溶解雜質(zhì)和析出DNA。
二、判斷訓(xùn)練：
一種生物的基因能“嫁接”到另一種生物的DNA上，是因?yàn)樯锝绲闹饕z傳物質(zhì)是DNA，且它們有共同的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)(　　)
外源（目的）基因在受體細(xì)胞內(nèi)得以表達(dá)的主要原因是生物界共用一套遺傳密碼(　　)
基因工程育種的突出優(yōu)點(diǎn)是能定向改造生物的性狀，目的性強(qiáng)(　　)
因?yàn)镈NA連接酶對(duì)所催化連接的DNA分子片段的堿基序列無(wú)特異性要求，所以其無(wú)專一性 (　　)
解旋酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶都能作用于DNA分子，它們的作用部位都是相同的。(　　)
用相同的限制性內(nèi)切酶切割DNA留下的黏性末端是一定相同的；用不同的限制性內(nèi)切酶切割DNA留下的黏性末端一定是不相同的。(　　)
DNA連接酶與DNA聚合酶都是催化磷酸二酯鍵的形成，但前者只催化游離脫氧核苷酸連接到已有脫氧核苷酸鏈上，后者催化兩個(gè)DNA片段的連接。(　　)
質(zhì)粒作為“分子運(yùn)輸車”的條件是①能夠自我復(fù)制　②雙鏈環(huán)狀DNA分子③有多個(gè)限制酶切點(diǎn)④有標(biāo)記基因　⑤真核細(xì)胞中沒(méi)有(　　)
限制酶在原來(lái)的原核細(xì)胞內(nèi)對(duì)細(xì)胞自身有害。(　　)
不同DNA分子用同一種限制酶切割形成的末端相同。(　　)
所有DNA連接酶都既能連接黏性末端，又能連接平末端。(　　)
載體的種類有質(zhì)粒、噬菌體、動(dòng)植物病毒等，其中動(dòng)植物病毒必須是DNA病毒。(　　)
DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度相同。(　　)
限制酶只能用于切割目的基因。( )
切割目的基因的限制酶可以是兩種。( )
限制酶也可以識(shí)別和切割RNA。( )
限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和質(zhì)粒是基因工程中常用的三種工具酶。( )
載體質(zhì)粒的抗生素合成基因常作為標(biāo)記基因。( )
載體質(zhì)粒的標(biāo)記基因可以有一個(gè)或多個(gè)。( )
載體的作用是將攜帶的目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞中，使之穩(wěn)定存在并表達(dá)。( )
用95%的冷酒精粗提取DNA是因?yàn)?5%的冷酒精使DNA變性。( )
用二苯胺試劑鑒定DNA時(shí)，溶液藍(lán)色深淺反映DNA含量多少。( )
用二苯胺試劑進(jìn)行鑒定，原因是DNA溶液中加入二苯胺試劑即呈藍(lán)色。( )
三、邊練邊講
練習(xí)1：重組DNA技術(shù)的基本工具
1．如圖表示DNA分子在不同酶的作用下所發(fā)生的變化，下列選項(xiàng)中，表示限制酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、解旋酶作用圖解的正確順序是(　　)
A．①②③④　 B．②①④③ C．①④②③ D．①④③②
2．如表為常用的限制酶及其識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，據(jù)表分析以下說(shuō)法正確的是(　　)
限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ HindⅡ KpnⅠ Sau3AⅠ SmaⅠ
識(shí)別序列和切割位點(diǎn) G↓GATCC G↓AATTC GTY↓RAC GGTAC↓C ↓GATC CCC↓GGG
注：Y表示C或T，R表示A或G。
A．一種限制酶只能識(shí)別一種脫氧核苷酸序列
B．限制酶的切割位點(diǎn)一定位于識(shí)別序列的內(nèi)部
C．不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端
D．限制酶切割后形成的不一定都是黏性末端
3．下列有關(guān)基因工程的工具的敘述，正確的是(　　)
A．基因工程的載體都是質(zhì)粒
B．限制酶和其他酶一樣具有專一性，只能識(shí)別特定的核苷酸序列
C．噬菌體可以作為動(dòng)物基因工程的載體
D．天然質(zhì)粒均可以直接用作載體將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
4．圖甲、乙中的箭頭表示三種限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)，Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A．在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，可用PstⅠ和HindⅢ切割質(zhì)粒和外源DNA
B．在酶切過(guò)程中，不能破壞質(zhì)粒中全部的標(biāo)記基因
C．若只用PstⅠ處理質(zhì)粒和外源DNA分子片段，無(wú)法避免自身環(huán)化和反向連接
D．導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌可以在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)
5．一環(huán)狀DNA分子，設(shè)其長(zhǎng)度為1，限制酶A在其上的切點(diǎn)位于0.0處；限制酶B在其上的切點(diǎn)位于0.3處；限制酶C的切點(diǎn)未知，但C單獨(dú)切割或與A或與B同時(shí)切割的結(jié)果如表所示，C在該環(huán)狀DNA分子上的切點(diǎn)應(yīng)位于圖中的(　　)
A．0.2和0.4處　　B．0.4和0.6處 C．0.5和0.7處 D．0.6和0.9處
6．某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入Ampr或Tetr中會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因)。有人將此質(zhì)粒載體用BamHⅠ酶切后，與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。回答下列問(wèn)題：
(1)質(zhì)粒載體作為基因工程的工具，應(yīng)具備的基本條件有_______________， ___________________________________(答出兩點(diǎn)即可)，而作為基因表達(dá)載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動(dòng)子和終止子。
(2)如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在上述四種大腸桿菌細(xì)胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細(xì)胞是不能區(qū)分的，其原因是____________________；并且____
________和_______________的細(xì)胞也是不能區(qū)分的，其原因是________________
__________________________。在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有________的固體培養(yǎng)基。
(3)基因工程中，某些噬菌體經(jīng)改造后可以作為載體，其DNA復(fù)制所需的原料來(lái)自________。
講解1：重組DNA技術(shù)的基本工具
1．基因工程的原理：基因重組
2．基因工程的理論基礎(chǔ)
(1)拼接的基礎(chǔ)：
①基本組成單位相同：不同生物的DNA分子都是由脫氧核苷酸構(gòu)成的。
②空間結(jié)構(gòu)相同：不同生物的DNA分子一般都是由兩條反向平行的脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈形成的規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)。
③堿基配對(duì)方式相同：與T配對(duì)、G與C配對(duì)。
(2)導(dǎo)入的基礎(chǔ)：DNA可以在同種生物的不同個(gè)體間轉(zhuǎn)移。
(3)表達(dá)的基礎(chǔ)：生物界共用一套遺傳密碼，相同的遺傳信息在不同生物體內(nèi)可表達(dá)出相同的蛋白質(zhì)。
3．基因工程操作導(dǎo)致的基因重組與有性生殖中的基因重組的主要區(qū)別是什么？
有性生殖中的基因重組是隨機(jī)的，并且只能在同一物種間進(jìn)行；基因工程可以在不同物種間進(jìn)行基因重組，并且方向性強(qiáng)，可以定向地改變生物的性狀。
4．圖解限制酶的選擇原則
(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。
(2)保留標(biāo)記基因原則：載體必須具備標(biāo)記基因，所以選擇的限制酶不能將標(biāo)記基因全部破壞，如圖乙中不選擇SmaⅠ。
(3)確保出現(xiàn)相同末端原則：切割載體時(shí)通常選擇與切割目的基因相同的限制酶，如選擇PstⅠ；為避免目的基因和載體自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和載體，即可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。
(4)為了避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化及目的基因與質(zhì)粒的反向連接，目的基因和質(zhì)粒均可使用不同限制酶切割。
5．比較與DNA有關(guān)的六種酶
名稱 作用部位 作用底物 作用結(jié)果
限制酶 磷酸二酯鍵 DNA 將DNA切成兩個(gè)片段
DNA連接酶 磷酸二酯鍵 DNA片段 將兩個(gè)DNA片段連接為一個(gè)DNA分子
DNA聚合酶或熱穩(wěn)定DNA聚合酶 磷酸二酯鍵 脫氧核苷酸 將單個(gè)脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯鍵 DNA 將DNA片段水解為單個(gè)脫氧核苷酸
解旋酶 堿基對(duì)之間的氫 DNA 將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長(zhǎng)鏈
RNA聚合酶 磷酸二酯鍵 核糖核苷 將單個(gè)核糖核苷酸依次連接到單鏈末端
6．目的基因的載體
⑴標(biāo)記基因的作用：載體上的標(biāo)記基因一般是一些抗生素的抗性基因。在受體細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可以篩選出轉(zhuǎn)入載體并穩(wěn)定表達(dá)的受體細(xì)胞，原理如圖所示。
說(shuō)明：目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細(xì)胞沒(méi)有抵抗相關(guān)抗生素的能力。
⑵質(zhì)粒中的每個(gè)標(biāo)記基因都一定要避免被限制酶切割嗎？否
⑶病毒為什么可以作為基因工程的載體？
因病毒能夠侵染正常細(xì)胞，有的病毒還能將自己的核酸整合到宿主細(xì)胞的染色體上，所以病毒也可作為基因工程的載體。
⑷為什么在基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過(guò)人工改造的？
天然質(zhì)粒往往不能滿足載體必須具備的條件，如無(wú)可利用的標(biāo)記基因、無(wú)特定限制酶的識(shí)別序列等。
⑸基因工程中的載體≠細(xì)胞膜上的載體
練習(xí)2：DNA的粗提取與鑒定
1、DNA粗提取過(guò)程中利用的溶液為(　　)
A．體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精 B．體積分?jǐn)?shù)為75%的冷酒精
C．2 mol/L的NaCl溶液 D．0.14 mol/L的NaCl溶液
2、下列關(guān)于DNA粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)的有關(guān)敘述中，不正確的是(　　)
A．在析出DNA黏稠物時(shí)，應(yīng)用玻璃棒輕緩攪拌，以保證DNA分子的完整性
B．將豬的成熟紅細(xì)胞破碎后離心，取上清液，加入冷酒精再攪拌后，應(yīng)再保留上清液
C．在提取液中加入體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精后DNA會(huì)與蛋白質(zhì)分離并析出
D．提取的絲狀物溶解后加入二苯胺溶液，水浴加熱后溶液變?yōu)樗{(lán)色
3、DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中，A、B、C三個(gè)小組除下表中所列處理方法不同外，其他操作步驟均相同，而且正確，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻不同。
組別 實(shí)驗(yàn)材料 提取核物質(zhì)時(shí)加入的溶液 去除雜質(zhì)時(shí)加入的溶液 DNA鑒定時(shí)加入的試劑
A 菜花 蒸餾水 95%的酒精(冷卻) 雙縮脲
B 人血漿 蒸餾水 95%的酒精(冷卻) 二苯胺
C 雞血 蒸餾水 95%的酒精(冷卻) 二苯胺
(1) 實(shí)驗(yàn)材料選擇錯(cuò)誤的組別是 ，其原因是 。
(2)實(shí)驗(yàn)中DNA鑒定試劑選擇錯(cuò)誤的組別是 。
(3) 沸水浴中試管顏色變藍(lán)的組別是 。
(4) A組實(shí)驗(yàn)不成功的最主要原因是 。
講解2：DNA的粗提取與鑒定
1．實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
(1)實(shí)驗(yàn)材料的選取：選用DNA含量相對(duì)較高的生物組織。不能用哺乳動(dòng)物成熟紅細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料，原因是哺乳動(dòng)物成熟紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核。
(2)DNA的粗提取：可利用DNA不溶于____________這一原理，可從溶液中析出DNA；也可將溶液在10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min，___________即為粗提取的DNA。
2.提取和鑒定中的問(wèn)題分析
(1)加入研磨液后，必須充分研磨，否則細(xì)胞核不會(huì)充分破碎，釋放出的DNA量就會(huì)減少。
(2)為減少DNA的損失：
①過(guò)濾過(guò)程一般使用紗布過(guò)濾
②因DNA容易被玻璃容器吸附，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中最好使用塑料的燒杯和試管。
(3)粗提取的DNA中可能含有少量的蛋白質(zhì)等。
(4)析出DNA時(shí)必須用“冷酒精”。預(yù)冷的酒精具有以下優(yōu)點(diǎn)：①可抑制核酸水解酶的活性，進(jìn)而抑制DNA降解；②抑制分子運(yùn)動(dòng)，使DNA易形成沉淀析出；③低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂。
(5)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的絲狀物的主要成分是DNA，實(shí)際上每一根“絲”都是由許多DNA分子聚集在一起形成的，應(yīng)用玻璃棒沿一個(gè)方向緩慢攪拌，避免破壞DNA。
(6)二苯胺試劑要現(xiàn)用現(xiàn)配，鑒定時(shí)，需沸水浴加熱，溶液藍(lán)色的深淺與溶液中DNA含量的多少有關(guān)。
3．提取純度較高的DNA的方法——苯酚—氯仿抽提法
(1)苯酚—氯仿抽提法原理
苯酚是蛋白質(zhì)的變性劑，反復(fù)抽提可使蛋白質(zhì)變性，SDS(十二烷基硫酸鈉)將細(xì)胞裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白質(zhì)或多肽等，核蛋白變性降解，使DNA從核蛋白中游離出來(lái)。DNA易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑。蛋白質(zhì)分子表面帶有親水基團(tuán)，容易進(jìn)行水合作用，并在表面形成一層水化層，使蛋白質(zhì)分子能順利進(jìn)入水溶液，形成穩(wěn)定的膠體溶液。當(dāng)有機(jī)溶劑存在時(shí)，蛋白質(zhì)的這種膠體穩(wěn)定性遭到破壞，變性沉淀。離心后有機(jī)溶劑在試管底層(有機(jī)相)，DNA存在于上層水相中，蛋白質(zhì)則位于兩相之間。
(2)主要試劑的作用
苯酚—氯仿抽取的作用是除去未消化的蛋白質(zhì)。氯仿有助于水相與有機(jī)相分離和除去DNA溶液中的苯酚。
(3)溶解DNA備用
用2～3倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇在NaCl溶液作用下處理抽提后的DNA溶液，沉淀DNA，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇洗去DNA沉淀中的NaCl，回收DNA，真空干燥，用TE緩沖液溶解DNA備用。

展開(kāi)更多......

收起↑