資源簡介

新人教生物一輪復習學案
第39講 基因工程
【素養目標】　1.結合生活或生產實例，舉例說出基因工程的基本原理。(生命觀念)　2.運用比較、歸納與概括的方法，理解限制酶和DNA連接酶的作用特點，運用結構與功能觀，理解載體的結構特點及作用。(生命觀念　科學思維)　3.按照實驗操作步驟，進行DNA的粗提取與鑒定實驗，寫出實驗報告并與他人進行必要的交流。(科學思維　科學探究)　4.運用演繹與推理、模型與建模，理解基因工程基本操作程序，進行簡單的設計。(生命觀念　科學思維)
考點一　重組DNA技術的基本工具
1．基因工程的概念
基因工程是指按照人們的愿望，通過轉基因等技術，賦予生物新的遺傳特性，創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫作重組DNA技術。
2．基本工具
(1)限制性內切核酸酶
【特別提醒】　將一個基因從DNA分子上切割下來需要切兩處，同時產生四個黏性末端或平末端。
【拾遺補缺】　源于選擇性必修3 P71“旁欄思考”
①原核生物中存在限制酶的意義是什么？
提示　原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保證自身安全，防止外來病原物的危害。
②限制酶來源于原核生物，為什么不能切割自己的DNA分子？
②提示　限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾。
(2)DNA連接酶
①作用：將限制酶切割下來的DNA片段拼接成新的DNA分子，恢復被限制酶切開的兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵。
②類型
常用類型 E.coli DNA連接酶 T4 DNA連接酶
來源 大腸桿菌 T4噬菌體
特點 只縫合黏性末端 縫合黏性末端和平末端
【拾遺補缺】　源于選擇性必修3 P72“旁欄思考”：DNA連接酶和DNA聚合酶不是(填“是”或“不是”)一回事。原因是：①DNA連接酶連接的是兩個DNA片段，而DNA聚合酶是把單個的脫氧核苷酸連接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用時需要以一條DNA鏈為模板，而DNA連接酶不需要模板。
(3)載體
(1)切割質粒的限制性內切核酸酶均能特異性地識別6個核苷酸序列(　　)
(2)限制酶只能用于切割目的基因(　　)
(3)限制酶也可以識別和切割RNA(　　)
(4)E.coli DNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端(　　)
(5)載體質粒通常采用抗生素合成基因作為篩選的標記基因(　　)
答案　(1)×　(2)×　(3)×　(4)×　(5)×
1．與DNA有關的酶的比較
名稱 作用部位 作用底物 作用結果
限制酶 磷酸二酯鍵 DNA 將DNA切成兩個片段
DNA連接酶 磷酸二酯鍵 DNA片段 將兩個DNA片段連接為一個DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯鍵 脫氧核苷酸 將單個脫氧核苷酸依次連接到DNA單鏈末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯鍵 DNA 將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸
解旋酶 堿基對之間的氫鍵 DNA 將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈
RNA聚合酶 磷酸二酯鍵 核糖核苷酸 將單個核糖核苷酸依次連接到RNA單鏈末端
2.圖解限制酶的選擇原則
(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。
(2)保留標記基因原則：質粒作為載體必須具備標記基因，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中不選擇SmaⅠ。
(3)確保出現相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶切割質粒，如圖甲中PstⅠ；為避免目的基因和質粒自身環化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。
[典例剖析]
(多選)(2022·遼寧卷，12)抗蟲和耐除草劑玉米雙抗12－5是我國自主研發的轉基因品種。為給監管轉基因生物安全提供依據，采用PCR方法進行目的基因監測，反應程序如圖所示。下列敘述正確的是(　　)
A．預變性過程可促進模板DNA邊解旋邊復制
B．后延伸過程可使目的基因的擴增更加充分
C．延伸過程無需引物參與即可完成半保留復制
D．轉基因品種經檢測含有目的基因后即可上市
B　[預變性是使引物完全變性解開，A錯誤；后延伸是為了讓引物延伸完全并讓單鏈產物完全退火形成雙鏈結構，可使目的基因的擴增更加充分，B正確；延伸過程需引物參與，C錯誤；轉基因品種不只需要檢測是否含有目的基因，還要檢測是否表達，還有安全性問題，D錯誤。]
【名師點撥】　掌握信息轉化能力
信息提取 信息1：PCR方法進行目的基因監測
信息2：預變性
信息3：延伸
信息轉化 1.目的基因擴增
2.使引物完全變性解開
3.子鏈合成，需引物
素養考查 生命觀念：結構與功能觀 科學思維：邏輯思維能力
【角度轉換】　提升語言表達能力
PCR技術的條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對引物、熱穩定DNA聚合酶(Taq酶)。
考向一　基因工程工具酶的應用
1．(2023·北京大興高三期中)基因S與作物甜度相關，可用于培育轉S基因作物新品系。如下圖，為使S基因按正確方向與質粒連接，選用的限制酶組合是(　　)
A．XbaⅠ和SalⅠ B．EcoRⅠ和HindⅢ
C．BamHⅠ和HindⅢ D．XbaⅠ和HindⅢ
D　[質粒中SalⅠ的酶切位點沒有位于啟動子和終止子之間，不能選用，A錯誤；基因兩側都有酶切位點，不能定向連在質粒上，限制酶EcoRⅠ在目的，B錯誤；BamHⅠ會破壞目的基因，C錯誤；為了成功構建重組表達載體，不破壞載體關鍵結構和目的基因，確保目的基因插入載體中方向正確，最好選用XbaⅠ、Hind Ⅲ酶切割S基因的cDNA和載體，D正確。]
2．(2023·泉州高三模擬)像BclⅠ(－T↓GATCA－)、BglⅡ(－A↓GATCT－)、MboⅠ(－↓GATC－)這樣，識別序列不同，但能產生相同的黏性末端的一類限制酶被稱為同尾酶。如圖表示目的基因及質粒上的酶切位點。選用不同的限制酶對質粒和目的基因進行切割，并用DNA連接酶進行連接。下列分析錯誤的是(　　)
選項 切割質粒 切割目的基因 結果分析
A． Bcl Ⅰ和Bgl Ⅱ Bcl Ⅰ和Bgl Ⅱ 形成的重組質粒的堿基排列順序不一定相同
B． Bcl Ⅰ和Bgl Ⅱ Mbo Ⅰ 切割后的質粒不可自我環化，切割后的目的基因可以自我環化
C． Mbo Ⅰ Bcl Ⅰ和Bgl Ⅱ 形成的重組質粒可被Mbo Ⅰ再次切開，但可能無法被Bcl Ⅰ和Bgl Ⅱ再次切開
D． Mbo Ⅰ Mbo Ⅰ 切割后的質粒可以自我環化，切割后的目的基因也可以自我環化
B　[切割質粒和切割目的基因均用Bcl Ⅰ和Bgl Ⅱ，由于兩種酶切割后產生的黏性末端相同，形成的重組質粒時目的基因可能反向連接，形成的堿基排列順序不一定相同，A正確；切割質粒用Bcl Ⅰ和Bgl Ⅱ，切割后產生的黏性末端相同，切割后的質粒可能自我環化；切割目的基因用Mbo Ⅰ，切割后產生黏性末端，切割后的目的基因可以自我環化，B錯誤；切割質粒用Mbo Ⅰ，產生黏性末端，切割目的基因用Bcl Ⅰ和Bgl Ⅱ，產生黏性末端，形成的重組質粒中原來的Bcl Ⅰ和Bgl Ⅱ的切割位點的序列發生改變，不能再被這兩種酶切割，但不影響Mbo Ⅰ的作用，C正確；切割質粒用Mbo Ⅰ，切割目的基因用MboⅠ，產生的均為黏末端，切割后的質?？勺晕噎h化，切割后的目的基因也可以自我環化，D正確。]
考向二　基因工程載體的應用
3．(2023·石嘴山高三檢測)在重組DNA技術中，將外源基因導入受體細胞，通常是利用質粒作為載體。下列關于質粒的敘述，正確的是(　　)
A．質粒是一種只存在于原核細胞中的結構簡單的環狀DNA分子
B．質粒的復制和表達過程都遵循中心法則和堿基互補配對原則
C．目的基因只有通過質粒整合到受體細胞的DNA中才能表達
D．大多數天然質粒都不需要人工改造，可以直接作為載體使用
B　[質粒是存在于許多細菌以及酵母菌(真核細胞)中的有自主復制能力的小型環狀DNA分子，A錯誤；質粒的復制和表達都遵循中心法則，也遵循堿基互補配對原則，B正確；只需要將含有目的基因的質粒導入受體細胞，無需整合到受體細胞的DNA中也能表達，C錯誤；天然的質粒不能直接作為載體，基因工程中用到的質粒都是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的，D錯誤。]
4．(多選)(2023·東營高三檢測)酵母菌的轉錄因子GAL4由DNA結合域(BD)和轉錄激活域(AD)構成，BD和AD結構上分開、功能上獨立。一般情況下，BD能與GAL4效應基因上游的特定DNA區段(UAS)相結合，AD則推動了轉錄的起始。若用基因工程的方法，將GAL4的AD和BD基因分別克隆到不同的載體上，將兩個載體一起導入酵母菌，無法推動相應基因的表達。以下說法錯誤的是(　　)
A．在正常酵母菌細胞內，BD和AD能結合在一起
B．利用這項技術，可以用來驗證兩種蛋白質之間是否有相互作用
C．AD通過囊泡的形式釋放到酵母菌外
D．BD能依據堿基互補配對原則與啟動子結合
CD　[在正常酵母菌細胞內，BD和AD能結合在一起，形成轉錄因子，激活基因轉錄，A正確；利用這項技術，將兩種蛋白X、Y分別與AD、BD融合，蛋白質X、Y有相互作用時，兩結構域能重新呈現完整轉錄因子活性，故可驗證兩種蛋白質之間是否有相互作用，B正確；AD在酵母菌細胞內發揮作用，不釋放到細胞外，C錯誤；BD是蛋白質，不能依據堿基互補配對原則與啟動子結合，D錯誤。]
考點二　基因工程的基本操作程序
1．目的基因的篩選與獲取
(1)目的基因：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因。
(2)篩選合適的目的基因
①根據已知結構和功能進行篩選。
②利用序列數據庫和序列比對工具進行篩選。
(3)目的基因的獲取
①構建基因文庫獲取目的基因。
②利用PCR獲取和擴增目的基因
2．基因表達載體的構建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發揮作用。
(2)基因表達載體的組成及作用
(3)構建過程
3．將目的基因導入受體細胞
生物種類 植物 動物 微生物
常用方法 農桿菌轉化法、花粉管通道法 顯微注射法 Ca2＋處理法
受體細胞 體細胞或受精卵 受精卵 原核細胞
轉化過程 將目的基因插入Ti質粒的T－DNA中→農桿菌→導入植物細胞→整合到受體細胞的染色體DNA上→表達 將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發育→獲得具有新性狀的動物 Ca2＋處理細胞→細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態→基因表達載體導入
4.目的基因的檢測與鑒定
檢測水平 檢測目的 檢測方法
分子水平 目的基因是否插入到轉基因生物染色體DNA上 PCR技術、核酸分子雜交技術
目的基因是否轉錄出了mRNA
目的基因是否翻譯出蛋白質 抗原—抗體雜交
個體水平 轉基因生物是否表現出相應的特性 如抗蟲、抗病的接種實驗
(1)目的基因就是指編碼蛋白質的基因(　　)
(2)用PCR方法擴增目的基因時需要設計兩種引物(　　)
(3)用PCR方法擴增目的基因時不必知道基因的全部序列(　　)
(4)抗蟲基因即使成功地插入植物細胞染色體DNA上也未必能正常表達(　　)
(5)應用PCR技術，可以檢測轉基因抗凍番茄植株中目的基因的存在及其是否完成表達(　　)
答案　(1)×　(2)√　(3)√　(4)√　(5)×
1．PCR技術相關分析
(1)PCR技術的過程
關于引物的2點提醒：①引物是一小段單鏈的DNA或RNA，作為新子鏈的合成起點，只能結合在母鏈的3′端；②只有通過引物，DNA才可以開始進行復制。
(2)PCR技術和DNA復制的比較
2．基因表達載體構建過程
如果用同一種限制酶切割，若考慮兩兩相連，則DNA連接酶連接DNA片段會出現三種情況：目的基因與目的基因的連接、目的基因與質粒的連接、質粒與質粒的連接，需篩選出重組質粒。
[典例剖析]
(2022·河北卷，24)蛋白酶抑制劑基因轉化是作物抗蟲育種的新途徑。某研究團隊將胰蛋白酶抑制劑(NaPI)和胰凝乳蛋白酶抑制劑(StPinlA)的基因單獨或共同轉化棉花，獲得了轉基因植株?；卮鹣铝袉栴}：
(1)蛋白酶抑制劑的抗蟲機制是______________________________________________。
(2)________________________________是實施基因工程的核心。
(3)利用農桿菌轉化法時，必須將目的基因插入到質粒的________________上，此方法的不足之處是________________________________________________________________________。
(4)為檢測目的基因在受體細胞基因組中的整合及其轉錄和翻譯，可采用的檢測技術有____________________________________________________________________(寫出兩點即可)。
(5)確認抗蟲基因在受體細胞中穩定表達后，還需進一步做抗蟲的________________以鑒定其抗性程度。下圖為三種不同遺傳操作產生的轉基因棉花抗蟲實驗結果，據結果分析____________(填“NaPI”或“StPinlA”或“NaPI＋StPinlA”)轉基因棉花的抗蟲效果最佳，其原因是________________________________________________________________________。
(6)基因突變可產生新的等位基因，在自然選擇的作用下，昆蟲種群的基因頻率會發生____________。導致昆蟲朝著一定的方向不斷進化。據此推測，胰蛋白酶抑制劑轉基因作物長期選擇后，某些害蟲具有了抗胰蛋白酶抑制劑的能力，其分子機制可能是_________________(寫出兩點即可)。
答案　(1)調節害蟲胰蛋白酶活性，從而使害蟲不能正常消化食物達到抗蟲的目的　(2)基因表達載體的構建/表達載體的構建
(3)T DNA　該方法不適用于單子葉植物　(4)基因－DNA分子雜交技術、mRNA－分子雜交技術、抗原－抗體雜交技術　(5)效果　 NaPI　飼喂NaPI轉基因的蟲體質量較對照組差，且每株棉鈴數較對照組少　(6)定向改變　由于害蟲發生基因突變后，在胰蛋白酶抑制劑的選擇下，抗性基因頻率逐漸增高，從而提升了其抗胰蛋白酶抑制劑的能力，或胰蛋白酶抑制劑基因發生突變后不能編碼出胰蛋白酶抑制劑
解析　(1)蛋白酶抑制劑的抗蟲機制是調節害蟲胰蛋白酶活性，從而使害蟲不能正常消化食物達到抗蟲的目的。
(2)基因工程的核心是基因表達載體的構建。
(3)將目的基因插入到Ti質粒的T DNA上，通過農桿菌的轉化作用，把目的基因整合到植物細胞中染色體的DNA上。其不足之處是該方法不適用于單子葉植物。
(4)目的基因是否整合的檢測，在分子水平上可通過檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因、是否能轉錄出目的基因對應的mRNA、是否能合成目的基因所控制合成的蛋白質等；在個體水平可檢測抗蟲性、抗病性、活性等。即可利用基因－DNA分子雜交技術、mRNA—分子雜交技術、抗原－抗體雜交技術等。
(5)確認抗蟲基因在受體細胞中穩定表達后，還需進一步做抗蟲的效果以鑒定其抗性程度。由圖可知，NaPI轉基因棉花的抗蟲效果最佳，因為飼喂NaPI轉基因的蟲體質量較對照組差，且每株棉鈴數較對照組少。
(6)在自然選擇的作用下，種群的基因頻率會發生定向改變，導致生物朝一定方向不斷進化。由于害蟲發生基因突變后，在胰蛋白酶抑制劑的選擇下，抗性基因頻率逐漸增高，從而提升了其抗胰蛋白酶抑制劑的能力，或胰蛋白酶抑制劑基因發生突變后不能編碼出胰蛋白酶抑制劑。
【名師點撥】　掌握信息轉化能力
信息提取 信息1：蛋白酶抑制劑的抗蟲
信息2：農桿菌轉化法
信息轉化 1.抑制胰蛋白酶活性
2.農桿菌中的Ti質粒上的T DNA可轉移至受體細胞，并且整合到受體細胞染色體的DNA上
素養考查 生命觀念：結構與功能觀 科學思維：分析與綜合能力
【角度轉換】　提升語言表達能力
在構建含目的基因的重組Ti質粒載體過程中，目的基因序列中不能含有用到的限制酶的識別序列，原因是如果目的基因序列中含有用到的限制酶的識別序列，限制酶可能將它切斷。
考向一　目的基因的獲取
5．(2023·天津高三檢測)科學家擬培育轉人溶菌酶基因山羊以大規模生產人溶菌酶(從乳汁中提取)，部分過程如圖所示。質粒S中的標記基因Leu控制合成亮氨酸，標記基因GFP控制合成綠色熒光蛋白；四種限制酶的識別序列及切割位點見下表。
限制酶 BamHⅠ BglⅡ HindⅢ XbaⅠ
識別字列和切割位點 G↓GATCC A↓GATCT A↓AGCTT T↓CTAGA
依據題目信息，下列能成功篩選出含重組質粒T的成纖維細胞的說法是(　　)
A．培養基中不加亮氨酸，培養一段時間后觀察，細胞不顯示出綠色熒光
B．培養基中加入亮氨酸，培養一段時間后觀察，細胞不顯示出綠色熒光
C．培養基中加入亮氨酸，培養一段時間后觀察，細胞顯示出綠色熒光
D．培養基中不加亮氨酸，培養一段時間后觀察，細胞顯示出綠色熒光
A　[用限制酶BamHⅠ、HindⅢ切割質粒S和目的基因，形成的重組質粒 T含有標記基因Leu和GFP基因，但BamHⅠ將GFP基因切割開，使得該基因失去遺傳效應，而標記基因Leu控制合成亮氨酸，故培養基中不加亮氨酸，培養一段時間后觀察，細胞不顯示出綠色熒光的成纖維細胞是含有重組質粒T的細胞，B、C、D錯誤，A正確。]
6．(多選)(2022·日照高三檢測)PCR中使用的聚合酶具有末端轉移的活性，通常在3′端加上多聚A。PCR擴增過程中，由于不清楚目的基因的完整DNA序列，獲得的目的片段通常需要重組到T－載體中，通過測序了解DNA序列。LacZ基因在IPTG誘導下的表達產物能夠水解X gal使菌落呈藍色，否則呈白色。目的基因插入LacZ中會導致該基因失活，因此可采用藍白斑法篩選含有重組質粒的大腸桿菌。下圖為T 載體的結構示意圖(Ampr為氨芐青霉素抗性基因)。下列說法正確的是(　　)
A．為高效連接PCR擴增產物，T－載體用EcoR Ⅴ酶切后再在3′端添加多聚T突出端
B．通過設計特定的引物借助PCR技術可檢測PCR擴增產物在T－載體中的插入方向
C．選擇BamH Ⅰ和Hind Ⅲ進行雙酶切并構建基因表達載體以保證擴增產物正向插入
D．轉化后，應選擇在含X gal和氨芐青霉素培養基上生長的白色單菌落進行測序
AB　[結合題意可知，PCR中使用的聚合酶具有末端轉移的活性，通常在3′端加上多聚A，則經PCR擴增出的片段含有A的黏性末端，故T－載體用EcoR Ⅴ酶切后再在3′端添加多聚T突出端，A與T配對，可高效連接PCR擴增產物，A正確；通過設計特定的引物(如目的基因和目的基因外部的一對引物)借助PCR技術可檢測PCR擴增產物在T－載體中的插入方向，B正確；據圖可知，BamH Ⅰ和Hind Ⅲ的識別序列均在引物2中，不符合PCR擴增要求，應選擇Pst Ⅰ和BamH Ⅰ進行酶切，以保證擴增產物正向插入，C錯誤；結合題意“LacZ基因在IPTG誘導下的表達產物能夠水解X gal使菌落呈藍色，否則呈白色”可知，轉化后，應選擇在含X gal和氨芐青霉素及IPTG的培養基上進行篩選，D錯誤。]
考向二　基因工程的基本操作程序
7．(2023·重慶高三檢測下)圖為科研人員制備能合成干擾素的人參愈傷組織細胞的流程，①～④表示相關的操作。若限制酶EcoR Ⅰ識別G↓AATTC，BamH Ⅰ識別G↓CATCC。下列選項正確的是(　　)
A．利用PCR技術擴增基因時，反應緩沖溶液中要添加Ca2＋來激活DNA聚合酶
B．構建基因表達載體時可使用E.coli DNA連接酶將DNA片段連接起來
C．農桿菌侵染人參細胞后Ti質粒整合到受體細胞的染色體DNA上
D．檢測干擾素基因是否導入人參愈傷組織細胞需要利用抗原—抗體雜交
B　[PCR需要在一定的緩沖溶液中才能進行，反應體系中一般要添加Mg2＋來激活耐高溫的DNA聚合酶，A錯誤；根據圖示，用EcoRⅠ和BamHⅠ對目的基因和Ti質粒進行切割，產生黏性末端，而后可使用E．coliDNA連接酶將DNA片段連接起來，B正確；農桿菌侵染人參細胞后Ti質粒上的T DNA整合到受體細胞的染色體DNA上，C錯誤；檢測目的基因是否導入受體細胞常用DNA分子雜交技術，D錯誤。]
8．(2023·重慶高三檢測)慢病毒載體可以將外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達目的序列的效果。地中海貧血癥是一種在我國長江以南各省高發的單基因遺傳病，研究者利用慢病毒載體建立相應轉化系統，將患者的體細胞轉化為多能干細胞，以獲得用于自體移植的細胞。過程如下圖所示，下列說法錯誤的是(　　)
A．基因表達載體中除了目的基因外，還有啟動子、終止子和標記基因等
B．表達載體和包裝載體轉染包裝細胞后得到的慢病毒具有侵染性
C．多能干細胞需要置于含有95%氧氣和5%二氧化碳的培養箱中培養
D．培養成功轉化的多能干細胞還需要誘導分化為造血干細胞用于治療疾病
C　[基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子、標記基因等，A正確；圖中將表達載體和包裝載體導入包裝細胞，一段時間后可以獲得能夠轉化患者多能干細胞的慢病毒顆粒，具有侵染性，B正確；多能干細胞需要置于含有95%空氣和5%二氧化碳的培養箱中培養，C錯誤；獲得成功轉化的多能干細胞后，誘導其定向分化為造血干細胞，然后植入患者骨髓，用于治療地中海貧血癥，D正確。]
考點三　基因工程的應用和蛋白質工程
1．基因工程的應用
表現方面 具體內容
在農牧業方面的應用 ①轉基因抗蟲植物；②轉基因抗病植物；③轉基因抗除草劑植物；④改良植物的品質；⑤提高動物的生長速率；⑥改善畜產品的品質
在醫藥衛生領域的應用 ①對微生物或動植物的細胞進行基因改造來生產藥物；②利用基因工程技術，讓哺乳動物批量生產藥物；③用轉基因動物作器官移植供體
在食品工業方面的應用 利用基因工程菌生產食品工業用酶、氨基酸和維生素等
【特別提醒】　(1)青霉素是青霉菌產生的，不是通過基因工程產生的。
(2)動物基因工程主要是為了改善畜產品的品質，而不是為了產生體型巨大的個體。
(3)原核生物的基因(如抗蟲基因)可以作為真核生物(棉花)的目的基因。
(4)Bt抗蟲蛋白基因產生的Bt抗蟲蛋白只在某類昆蟲腸道的堿性環境中才能表現出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細胞也無特異性受體，因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產生危害。
2．蛋白質工程
(1)概念
①基礎：蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系。
②手段：改造或合成基因。
③結果：對現有蛋白質進行改造或制造出新的蛋白質。
(2)過程：從預期的蛋白質功能出發→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到并改變相對應的脫氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→獲得所需要的蛋白質。
(3)蛋白質工程的應用
①利用蛋白質工程研發藥物。
②利用蛋白質工程改進或開發新的工業酶。
③在農業方面，改造光合作用相關的酶。
(1)轉基因抗病農作物不需要使用農藥(　　)
(2)利用乳腺生物反應器能夠獲得一些重要的醫藥產品，如人的血清白蛋白，這是因為將人的血清白蛋白基因導入了動物的乳腺細胞中(　　)
(3)由大腸桿菌工程菌獲得人的干擾素后可直接應用(　　)
(4)蛋白質工程可以合成自然界中不存在的蛋白質(　　)
(5)蛋白質工程是在分子水平上對蛋白質分子直接進行操作，定向改變分子的結構(　　)
答案　(1)×　(2)×　(3)×　(4)√　(5)×
1．乳腺生物反應器
(1)外源基因：藥用蛋白基因。
(2)表達條件：藥用蛋白基因＋乳腺中特異表達的基因的啟動子。
(3)受體細胞：哺乳動物的受精卵。
2．工程菌
(1)概念：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達的菌類。
(2)外源基因：控制合成抗體、疫苗、激素等的基因。
(3)受體細胞：微生物細胞。
(4)特點：細菌內沒有內質網、高爾基體等，產生的藥物可能沒有活性。
(5)藥物提取：從微生物細胞中提取。
3．蛋白質工程與基因工程的異同
項目 蛋白質工程 基因工程
過程 從預期的蛋白質功能出發→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到并改變相對應的脫氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→獲得所需要的蛋白質 篩選與獲取目的基因→基因表達載體的構建→將目的基因導入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定
實質 定向改造或生產人類所需要的蛋白質 定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的生物類型或生物產品
結果 可生產自然界中不存在的蛋白質 只能生產自然界中已存在的蛋白質
聯系 蛋白質工程是在基因工程的基礎上，延伸出來的第二代基因工程
[典例剖析]
(2022·湖南卷，22)水蛭是我國的傳統中藥材，主要藥理成分水蛭素為水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。擬通過蛋白質工程改造水蛭素結構，提高其抗凝血活性。回答下列問題：
(1)蛋白質工程流程如圖所示，物質a是____________________，物質b是_______________。在生產過程中，物質b可能不同，合成的蛋白質空間構象卻相同，原因是________________________________________________________________________。
(2)蛋白質工程是基因工程的延伸，基因工程中獲取目的基因的常用方法有______________、________________和利用PCR技術擴增。PCR技術遵循的基本原理是__________________。
(3)將提取的水蛭蛋白經甲、乙兩種蛋白酶水解后，分析水解產物中的肽含量及其抗凝血活性，結果如圖所示。推測兩種處理后酶解產物的抗凝血活性差異主要與肽的________(填“種類”或“含量”)有關，導致其活性不同的原因是___________________________________________。
(4)若要比較蛋白質工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產物和天然水蛭素的抗凝血活性差異，簡要寫出實驗設計思路
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案　(1)氨基酸序列(多肽鏈)　mRNA　密碼子的簡并性　(2)從基因文庫中獲取目的基因　通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成　DNA雙鏈復制　(3)種類　提取的水蛭蛋白的酶解時間和處理的酶的種類不同，導致水蛭蛋白空間結構有不同程度破壞　(4)取3支試管，分別加入等量的蛋白質工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一種動物(如家兔)血液，立即將等量的血液加入1、2、3號三支試管中，靜置相同時間，統計三支試管中血液凝固時間
解析　(1)據材料分析可知，物質a是氨基酸序列多肽鏈，物質b是mRNA。在生產過程中，物質b可能不同，合成的蛋白質空間構象卻相同，原因是密碼子的簡并性，即一種氨基酸可能有幾個密碼子。
(2)蛋白質工程是基因工程的延伸，基因工程中獲取目的基因的常用方法有從基因文庫中獲取目的基因、通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成和利用PCR技術擴增。PCR技術遵循的基本原理是DNA雙鏈復制。
(3)將提取的水蛭蛋白經甲、乙兩種蛋白酶水解后，據圖可知，水解產物中的肽含量隨著酶解時間的延長均上升，且差別不大；而水解產物中抗凝血活性有差異，經酶甲處理后，隨著酶解時間的延長，抗凝血活性先上升后相對穩定，經酶乙處理后，隨著酶解時間的延長，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲處理后的酶解產物的抗凝血活性最終高于經酶乙處理后的酶解產物的抗凝血活性，差異明顯，據此推測兩種處理后酶解產物的抗凝血活性差異主要與肽的種類有關，導致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解時間和酶的種類不同，導致水蛭蛋白空間結構有不同程度破壞。
(4)若要比較蛋白質工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產物和天然水蛭素的抗凝血活性差異，實驗設計思路為：取3支試管，分別加入等量的蛋白質工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一種動物(如家兔)血液，立即將等量的血液加入1、2、3號三支試管中，靜置相同時間，統計三支試管中血液凝固時間。
【名師點撥】掌握信息轉化能力
信息提取 信息1：蛋白質工程
信息2：抗凝血活性差異
信息轉化 1.通過基因修飾或基因合成，對現有蛋白質進行改造，或制造一種新的蛋白質
2.結構決定功能，抗凝血活性差異與空間結構有關
素養考查 生命觀念：結構與功能觀 科學思維：分析與綜合能力
【角度轉換】　提升語言表達能力
蛋白質工程基本途徑是從預期的蛋白質功能出發，設計預期的蛋白質結構，推測應有的氨基酸序列，找到相對應的脫氧核苷酸序列(基因)以上是蛋白質工程特有的途徑。
考向一　基因工程的應用
9．(2023·閬中高三檢測)1988年，美國默克公司以僅700萬美元的價格，向我國全部轉讓當時最先進的重組乙肝疫苗的生產技術。該技術利用釀酒酵母來表達乙肝病毒的表面抗原(HBsAg)，然后將表面抗原(HBsAg)純化后混合佐劑制成乙肝疫苗。下列相關說法錯誤的是(　　)
A．傳統乙肝疫苗的生產方式是在培養液中培養乙肝病毒，再對乙肝病毒進行減毒或滅活處理
B．HBsAg基因能導入酵母中仍能成功表達，是由于酵母和乙肝病毒共用一套遺傳密碼
C．科學家不選大腸桿菌作受體，可能是因為HBsAg需要依賴內質網和高爾基體進行后期加工和包裝
D．該技術的原理是基因重組，通過該技術生產出的疫苗化學本質是蛋白質
A　[病毒營寄生生活，不能獨立代謝，只有寄生在宿主活細胞內才能生存和繁殖，所以乙肝病毒不能在培養液中直接培養，而是通過宿主活細胞才能培養，A錯誤；幾乎所有生物體都共用一套密碼子，所以HBsAg基因能導入酵母中仍能成功表達，B正確；大腸桿菌是原核生物，只含有核糖體這一種細胞器，而HBsAg的表達，需要核糖體的合成、內質網和高爾基體進行后期加工和包裝，所以不能使用大腸桿菌作為受體，C正確；由題干分析可知，該技術是以乙肝病毒的表面抗原(HBsAg)對應的基因為目的基因，與釀酒酵母進行DNA重組，后通過基因表達，表達出乙肝病毒的表面抗原(HBsAg)，所以該技術的原理是基因重組，通過該技術生產出的疫苗化學本質是蛋白質，D正確。]
10．(多選)(2023·南京高三檢測)研究人員仿照制備乳腺生物反應器的思路，制備了一種膀胱生物反應器，用其獲得人體特殊功能蛋白A的基本過程如下圖所示。下列有關敘述錯誤的是(　　)
A．步驟①和②所代表的操作分別是顯微注射、體外受精
B．誘導雌性動物超數排卵所飼喂的激素只能作用于特定細胞
C．通過超數排卵獲得的卵子可直接與獲能的精子進行體外受精
D．早期胚胎培養過程中通常在培養液中通入5%的CO2刺激細胞呼吸
ABD　[受精卵的全能性最大，利用受精卵作為重組表達載體的宿主細胞常采用①顯微注射的方法將載體注入，繼而對受精卵進行早期胚胎的培養(②)，A錯誤；誘導雌性動物超數排卵的激素是促性腺激素，該激素是由垂體分泌的，屬于蛋白質(多肽類)激素，不能飼喂，只能注射，否則會被分解，B錯誤；通過超數排卵獲得的卵子可直接與獲能的精子進行體外受精，原因是卵子已在輸卵管中發育至MⅡ期(卵子已具備受精能力)，C正確；早期胚胎培養過程中通常在培養液中通入5%的CO2的作用是維持培養液的pH，D錯誤。]
考向二　蛋白質工程
11．(2021·遼寧卷，14)腈水合酶(N0)廣泛應用于環境保護和醫藥原料生產等領域，但不耐高溫。利用蛋白質工程技術在N0的α和β亞基之間加入一段連接肽，可獲得熱穩定的融合型腈水合酶(N1)。下列有關敘述錯誤的是(　　)
A．N1與N0氨基酸序列的差異是影響其熱穩定性的原因之一
B．加入連接肽需要通過改造基因實現
C．獲得N1的過程需要進行轉錄和翻譯
D．檢測N1的活性時先將N1與底物充分混合，再置于高溫環境
D　[在N0的α和β亞基之間加入一段連接肽，可獲得熱穩定的融合型腈水合酶(N1)，則N1與N0氨基酸序列有所不同，這可能是影響其熱穩定性的原因之一，A正確；蛋白質工程的作用對象是基因，即加入連接肽需要通過改造基因實現，B正確；N1為蛋白質，蛋白質的合成需要經過轉錄和翻譯兩個過程，C正確；酶具有高效性，檢測N1的活性需先將其置于高溫環境，再與底物充分混合，D錯誤。]
12．(2023·重慶高三檢測)T4溶菌酶在溫度較高時易失去活性。研究人員通過蛋白質工程對T4溶菌酶第3位上的異亮氨酸改成半胱氨酸，該處半胱氨酸可與第97位半胱氨酸之間形成一個二硫鍵，獲得了熱穩定性高的T4溶菌酶。下列說法正確的是(　　)
A．蛋白質工程與中心法則的流程方向一致，即DNA→mRNA→蛋白質
B．不能利用抗原—抗體雜交的方法對該酶進行檢測
C．蛋白質工程和基因工程的根本區別是操作對象的差異
D．上述改造過程會使基因發生定向改變，產生一種全新的基因
D　[蛋白質工程與中心法則的流程方向相反，A錯誤；T4溶菌酶本質為蛋白質，可利用抗原—抗體特異性結合的特點對該酶進行檢測，B錯誤；蛋白質工程和基因工程都要對基因進行操作，其操作對象相同，C錯誤；獲得T4溶酶菌的過程需要對基因進行改造，進而表達出不一樣的蛋白質，該過程使基因發生定向改變，產生一種全新的基因，D正確。]
考點四　DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴增及電泳鑒定
1．DNA的粗提取與鑒定
(1)基本原理
①原理：利用DNA、RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面的差異，提取DNA，去除其他成分。
②DNA的性質：DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精；DNA能溶于2 mol·L－1的NaCl溶液。
③DNA的鑒定：在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現藍色。
(2)操作流程
2．DNA片段的擴增及電泳鑒定
(1)實驗基礎
①PCR原理：利用了DNA的熱變性原理，通過調節溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合。
②電泳：DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。
③PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關。
(2)PCR實驗操作步驟
(3)DNA的測定：凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300__nm的紫外燈下被檢測出來。
【注意事項】　(1)為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。
(2)每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。
(1)在溶有DNA的NaCl溶液中，加入二苯胺試劑即呈藍色(　　)
(2)DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精(　　)
(3)進行DNA片段的擴增及電泳鑒定實驗所需的緩沖液和酶應分裝成小份，并在20 ℃儲存(　　)
(4)在凝膠中DNA分子的遷移速率只與DNA分子的大小相關(　　)
(5)為了節約資源，移液器上的槍頭在實驗過程中不必更換(　　)
答案　(1)×　(2)√　(3)×　(4)×　(5)×
考向一　DNA的粗提取與鑒定
13．(2022·山東卷，13)關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法錯誤的是(　　)
A．過濾液沉淀過程在4 ℃冰箱中進行是為了防止DNA降解
B．離心研磨液是為了加速DNA的沉淀
C．在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現藍色
D．粗提取的DNA中可能含有蛋白質
B　[低溫時DNA酶的活性較低，過濾液沉淀過程在4 ℃冰箱中進行是為了防止DNA降解，A正確；第一次離心研磨液是為了使細胞碎片沉淀，B錯誤；在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑呈現藍色，C正確；細胞中的某些蛋白質可以溶解于酒精，可能有些蛋白質不溶于酒精，在95%的冷酒精中與DNA一塊兒析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白質，D正確。]
14．(2021·山東卷，13)粗提取 DNA 時，向雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，過濾后所得濾液進行下列處理后再進行過濾，在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出 DNA相對含量較高的白色絲狀物的處理方式是(　　)
A．加入適量的木瓜蛋白酶
B．37～40 ℃的水浴箱中保溫10～15分鐘
C．加入與濾液體積相等的、體積分數為 95%的冷卻的酒精
D．加入NaCl調節濃度至2 mol/L→過濾→調節濾液中NaCl濃度至0.14 mol/L
A　[木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白質類雜質，由于酶具有專一性，不能水解DNA，過濾后在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物，A正確；37～40 ℃的水浴箱中保溫10～15分鐘不能去除濾液中的雜質，應該放在60～75 ℃的水浴箱中保溫10～15分鐘，使蛋白質變性析出，B錯誤；向雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，過濾后在得到的濾液中加入與濾液體積相等的、體積分數為95%的冷卻的酒精，此時DNA析出，不會進入濾液中，C錯誤；加入NaCl調節濃度至2 mol/L→過濾→調節濾液中NaCl濃度至0.14 mol/L，DNA在0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度小，DNA析出，不會進入濾液中，D錯誤。]
考向二　DNA片段的擴增及電泳鑒定
15．(2021·湖北卷，16)某實驗利用PCR技術獲取目的基因，實驗結果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對)外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。為了減少反應非特異條帶的產生，以下措施中有效的是(　　)
A．增加模板DNA的量 B．延長熱變性的時間
C．延長延伸的時間 D．提高復性的溫度
D　[增加模板DNA的量可以提高反應速度，但不能有效減少非特異性條帶，A錯誤；延長熱變性的時間和延長延伸的時間會影響變性延伸過程，但對于延伸中的配對影響不大，故不能有效減少反應非特異性條帶，B、C錯誤；非特異性產物增加的原因可能是復性溫度過低而造成引物與模板的結合位點增加，故可通過提高復性的溫度來減少反應非特異性條帶的產生，D正確。]
16．(2023·南通高三檢測)PCR引物的3′端為結合模板DNA的關鍵堿基，5′端無嚴格限制，可用于添加限制酶切點等序列。下列敘述正確的是(　　)
A．該圖表示PCR循環中的變性環節
B．PCR第四次循環要消耗15對引物
C．Taq酶催化相鄰的兩個游離dNTP之間形成磷酸二酯鍵
D．用圖中引物擴增兩個循環后即可獲得添加限制酶切點的產物
D　[圖中引物與模板鏈堿基互補配對，該圖表示PCR循環中的復性環節，A錯誤；PCR三次循環共消耗7(23－1)對引物，PCR四次循環共消耗15(24－1)對引物，第四次循環要消耗8對引物，B錯誤；dNMP只有一個磷酸基團，為脫氧核苷酸，dNTP有三個磷酸基團，延伸時，在Taq酶催化下，dNMP作為擴增的原料會依次連接到3′端，相鄰的dNMP間形成磷酸二酯鍵，C錯誤；由于一個引物不在該片段的端點，因此第一輪循環后，得到的一個DNA片段中兩條脫氧核苷酸鏈都不等長，通過繪圖可推知，再經過一次循環，產物中開始出現脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段，所以擴增兩個循環后即可獲得添加限制酶切點的產物，D正確。]
(三十九)基因定點突變技術
1．基因定點突變技術概念：基因定點突變的目的是通過定向地改變基因內一個或少數幾個堿基來改變多肽鏈上一個或幾個氨基酸。
2．基因定點突變技術的類型：
(1)PCR定點突變技術
PCR定點突變技術是最常用的基因定點突變技術，通過設計含有非特異性配對堿基的引物，再通過PCR將突變位點引入產物中。PCR定點突變技術具有突變回收率高、可在任何位點引入突變、材料和試劑容易獲得、操作簡單等優點，它又可以分為重疊延伸PCR、大引物PCR等。
①重疊延伸PCR
重疊延伸PCR是發展最早的PCR定點突變技術。如圖所示，該技術要使用四條引物。其中引物2和3的突起處代表與模板鏈不能互補的突變位點，而這兩條引物有部分堿基(包括突變位點)是可以互補的。因此，分別利用引物1和2，引物3和4進行PCR后，得到的DNA片段可以通過引物2和3互補的堿基雜交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成為一條完整的DNA片段。最后，用引物1和4進行擴增得到含有突變位點的DNA片段。通過測序可以檢驗定點突變是否成功。
②大引物PCR
大引物PCR需要用到三條引物進行兩輪PCR，這三條引物分別是突變上游引物、常規上游引物和常規下游引物。該技術的流程如圖所示。第一輪PCR利用突變上游引物和常規下游引物進行擴增，得到不完整的含有突變位點的DNA片段；第二輪PCR利用第一輪擴增產物中的一條DNA鏈作為下游大引物，它與常規上游引物一起擴增得到完整的含有突變位點的DNA片段。
(2)不依賴PCR的定點突變技術
不依賴PCR的定點突變技術的核心是人工合成帶有突變位點的寡核苷酸片段，再借助在宿主細胞內的復制過程來實現定點突變。這類技術中比較成熟的有盒式突變、寡核苷酸引導的突變等。盒式突變的原理是，利用一段人工合成的含有突變位點的雙鏈寡核苷酸片段來替換目的基因中相應的片段，從而在目的基因中引入突變位點。寡核苷酸引導的突變的技術流程如圖所示。
首先人工合成一段含有特定突變位點的單鏈寡核苷酸片段(除突變位點外，該片段的其他部分可以與目的基因互補配對)；然后將該寡核苷酸片段與帶有目的基因的單鏈載體(通常由M13噬菌體衍生而來)進行雜交；繼而在DNA聚合酶和DNA連接酶的作用下分別進行DNA鏈的合成和連接反應，得到含有突變位點的雙鏈載體；最后將雙鏈載體引入宿主細胞進行復制，并進行篩選和鑒定。
[對點訓練]
1．(2023·南京高三檢測)大引物PCR定點突變常用來研究蛋白質結構改變導致的功能變化。單核苷酸的定點誘變僅需進行兩輪PCR反應即可獲得，第一輪加誘變引物和側翼引物，第一輪產物作第二輪PCR擴增的大引物，過程如圖所示。下列有關敘述正確的是(　　)
A．兩輪PCR過程中退火時的溫度一樣
B．單核苷酸的定點誘變所屬變異類型為基因重組
C．第二輪PCR所用的引物都是第一輪PCR的產物DNA的兩條鏈
D．利用該技術將某功能蛋白的結構改變屬于蛋白質工程
D　[為了使引物與模板鏈準確配對，引物設計時應考慮不同的退火溫度，第二輪PCR的退火溫度應該比第一輪高，A錯誤；單核苷酸的定點誘變所屬變異類型為基因突變，B錯誤；除第一輪產物作第二輪PCR擴增的大引物外，第二輪PCR仍需加入的引物是另一種側翼引物，以便進行另一條鏈的延伸，C錯誤；蛋白質工程是指通過基因改造或基因合成，對現有蛋白質進行改造，或制造一種新的蛋白質，利用該技術將某功能蛋白的結構改變屬于蛋白質工程，D正確。]
2．(2022·河南六市重點高中高三聯考)定點突變技術是按照預定設計，對某個已知基因的特定堿基進行定點增刪或轉換，最終改變對應的氨基酸序列和蛋白質結構。其中一種方法是利用寡核苷酸鏈介導的定點突變，過程如圖所示。下列關于利用寡核苷酸鏈介導的定點突變技術的敘述，錯誤的是(　　)
A．該技術的原理是基因發生堿基對的替換
B．過程①需要模板、原料、能量、酶等基本條件
C．過程②以寡核苷酸鏈延伸后的單鏈為模板
D．過程①②均遵循堿基互補配對原則
A　[定點突變改變特定位點的核苷酸，先是誘變寡核苷酸引物上的堿基對發生取代、插入或缺失，隨后經過延伸和復制，產生新的突變基因，A錯誤；該延伸過程屬于DNA復制過程，需要模板、原料、能量、酶等基本條件，B正確；題圖顯示過程②以寡核苷酸鏈延伸后的單鏈為模板合成互補DNA鏈的過程，C正確；延伸過程遵循堿基互補配對的原則，需要DNA聚合酶和四種脫氧核糖核苷酸，D正確。]
1．(2021·浙江6月選考，20)采用CRISPR/Cas9基因編輯技術可將增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因定點插入到受精卵的Y染色體上，獲得轉基因雄性小鼠。該轉基因小鼠與野生型雌性小鼠交配，通過觀察熒光可確定早期胚胎的性別。下列操作錯誤的是(　　)
A．基因編輯處理的受精卵在體外培養時，不同發育階段的胚胎需用不同成分的培養液
B．基因編輯處理的受精卵經體外培養至2細胞期，須將其植入同期發情小鼠的子官，才可獲得表達EGFP的小鼠
C．分離能表達EGFP的胚胎干細胞，通過核移植等技術可獲得大量的轉基因小鼠
D．通過觀察早期胚胎的熒光，能表達EGFP的即為雄性小鼠胚胎
B　[依據胚胎在不同發育階段對培養條件的特定需要，受精卵在體外培養時，不同發育階段的胚胎需用不同成分的培養液，A正確；基因編輯處理的受精卵一般經體外培養至桑葚胚或囊胚階段，進行胚胎移植，可獲得表達EGFP的小鼠，B錯誤；分離能表達EGFP的胚胎干細胞，通過核移植、早期胚胎培養、胚胎移植等技術，可獲得大量的轉基因小鼠，C正確；由題意分析可知，通過基因編輯技術將Y染色體用綠色熒光蛋白基因標記，通過觀察早期胚胎的熒光，能表達EGFP的個體含有Y染色體，即為雄性小鼠胚胎，D正確。]
2．(2021·湖北卷，7)限制性內切酶EcoRⅠ識別并切割雙鏈DNA，用EcoRⅠ完全酶切果蠅基因組DNA，理論上得到DNA片段的平均長度(堿基對)約為(　　)
A．6 B．250
C．4 000 D．24 000
C　[據圖可知，EcoRⅠ的酶切位點有6個堿基對，由于DNA分子的堿基組成為A、T、G、C，則某一位點出現該序列的概率為1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4＝1/4 096，即4 096≈4 000個堿基對可能出現一個限制酶EcoRⅠ的酶切位點，故理論上得到DNA片段的平均長度(堿基對)約為4 000。C符合題意。]
3．(2022·山東卷，25)某種類型的白血病由蛋白P引發，蛋白UBC可使P被蛋白酶識別并降解，藥物A可通過影響這一過程對該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機理，需構建重組載體以獲得融合蛋白FLAG P和FLAG PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一種短肽，連接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質結合，但不影響P或PΔ的功能。
(1)為構建重組載體，需先設計引物，通過PCR特異性擴增P基因。用于擴增P基因的引物需滿足的條件是__________________________________________________________________。為使PCR產物能被限制酶切割，需在引物上添加相應的限制酶識別序列，該限制酶識別序列應添加在引物的______(填“3′端”或“5′端”)。
(2)PCR擴增得到的P基因經酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個融合基因，如圖甲所示，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導入細胞后，融合基因轉錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因對應的氨基酸序列與P不同。據圖甲分析，出現該問題的原因是__________________________________。
修改擴增P基因時使用的帶有EcoR Ⅰ識別序列的引物來解決該問題，具體修改方案是________________________________________________________________________。
(3)融合蛋白表達成功后，將FLAG P、FLAG PΔ、藥物A和UBC按照圖乙中的組合方式分成5組。各組樣品混勻后分別流經含FLAG抗體的介質，分離出與介質結合的物質并用UBC抗體檢測，檢測結果如圖丙所示。已知FLAG P和FLAG PΔ不能降解UBC，由①②③組結果的差異推測，藥物A的作用是__________________________________________；由②④組或③⑤組的差異推測，PΔ中缺失的特定序列的作用是_____________________________________________。
注：DNA編碼鏈為轉錄時所用模板鏈的互補鏈
(4)根據以上結果推測，藥物A治療該病的機理是_______________________________。
答案　(1)兩種引物分別與兩條模板鏈3′端的堿基序列互補配對　5′端　(2)EcoR Ⅰ的插入導致轉錄形成的mRNA中P基因的密碼子讀取順序發生改變　擴增P基因時引物除含有EcoR Ⅰ序列外再添加一個核苷酸
(3)促進UBC與FLAG P的結合　與UBC相結合　(4)藥物A促進UBC與FLAG P的結合，從而促進蛋白P被蛋白酶識別并降解，達到治療的目的。
解析　(1)引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核苷酸，因此設計擴增P基因的引物，需要兩種引物分別與兩條模板鏈3′端的堿基序列互補。DNA聚合酶延伸時，是將脫氧核苷酸加到引物的3′端，為了不破壞目的基因，該限制酶識別序列應添加在引物的5′端。
(2)據圖中信息分析，P基因編碼鏈起始序列“ATGTGCA”中的第一個堿基A與EcoR Ⅰ識別序列最右側的兩個堿基在轉錄后編碼氨基酸時構成了一個密碼子，導致P基因的密碼子讀取順序發生改變，從而導致P基因對應的氨基酸序列與P不同。擴增P基因時引物除含有EcoR Ⅰ識別序列外再添加一個核苷酸，可以使P基因轉錄形成的mRNA正常翻譯出正確的氨基酸序列。
(3)由①②③組結果的差異可以看出，加入藥物A后檢測出的UBC與其抗體結合的條帶更寬，因此可以推測，藥物A的作用是促進UBC與P蛋白的結合；由②④組和③⑤組的比較可以看出，PΔ不能與UBC結合，由此推測，PΔ中缺失的特定序列的作用是與UBC相結合。
(4)根據(3)的分析推測，藥物A促進UBC與FLAG P的結合，從而促進蛋白P被蛋白酶識別并降解，達到治療的目的。
4．(2021·福建卷，21)微生物吸附是重金屬廢水的處理方法之一。金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在于動植物中的金屬結合蛋白，具有吸附重金屬的作用。科研人員將棗樹的MT基因導入大腸桿菌構建工程菌。回答下列問題：
(1)根據棗樹的MT cDNA的核苷酸序列設計了相應的引物(圖1甲)，通過PCR擴增MT基因。已知A位點和B位點分別是起始密碼子和終止密碼子對應的基因位置。選用的引物組合應為________________。
(2)本實驗中，PCR所用的DNA聚合酶擴增出的MT基因的末端為平末端。由于載體E只有能產生黏性末端的酶切位點，需借助中間載體P將MT基因接入載體E。載體P和載體E的酶切位點及相應的酶切序列如圖1乙所示。
①選用__________酶將載體P切開，再用__________(填“T4DNA(T4DNA)或“E.coli81DNA”)連接酶將MT基因與載體P相連，構成重組載體P′。
②載體P′不具有表達MT基因的__________和__________，選用__________酶組合對載體P′和載體E進行酶切，將切下的MT基因和載體E用DNA連接酶進行連接，將得到的混合物導入到用____離子處理的大腸桿菌，篩出MT工程菌。
(3)MT基因在工程菌的表達量如圖2所示。結果仍無法說明已經成功構建能較強吸附廢水中重金屬的MT工程菌，理由是____________________________________________________。
答案　(1)引物1和引物4　(2)①EcoR Ⅴ　T4DNA(T4DNA)　②啟動子　終止子　Xho Ⅰ和Pst Ⅰ　鈣
(3)尚未在個體生物學水平上對MT工程菌吸附重金屬的能力進行鑒定
解析　(1)密碼子位于mRNA上，是決定氨基酸的三個相鄰堿基，起始密碼子分別控制翻譯的開始和結束，故為保證基因的正常表達，一對引物應分別位于位點A和位點B的兩側，故選擇引物1和引物4。
(2)①為得到平末端，可用EcoRⅤ酶將載體P切開；由于E.coli81DNA連接酶只能連接黏性末端，而T4DNA(T4DNA)連接酶可以連接平末端，結合題意可知，MT基因的末端為平末端，故需要用T4DNA連接酶將MT基因與載體P相連，構成重組載體P′。②載體P′是重組質粒，故不含有表達MT基因的啟動子和終止子；為避免自身環化和反向連接，可選用兩種酶切割兩種載體，據圖可知，載體P′和載體E均含有Xho I和Pst I酶，故可選用Xho I和Pst I酶進行酶切；將目的基因導入大腸桿菌的方法是鈣離子處理法。
(3)由于尚未在個體生物學水平上對MT工程菌吸附重金屬的能力進行鑒定，故即使MT工程菌的MT蛋白相對含量較高，也無法說明已經成功構建能較強吸附廢水中重金屬的MT工程菌。

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