資源簡介

(共35張PPT)
202屆高考生物一輪復習課件
第九單元 生物技術實踐
（5）DNA與蛋白質技術
核心考點
DNA的粗提取與鑒定
多聚酶鏈式反應擴增DNA片段
血紅蛋白的提取和分離
典例1
粗提取DNA時，向雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，過濾后所得濾液進行下列處理后再進行過濾，在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物的處理方式是( )
A.加入適量的木瓜蛋白酶
B.37～40℃的水浴箱中保溫10～15分鐘
C.加入與濾液體積相等的、體積分數(shù)為95%的冷卻的酒精
D.加入NaCl調(diào)節(jié)濃度至2mol/L→過濾→調(diào)節(jié)濾液中NaCl濃度至0.14mol/L
答案：A
解析：本題考查DNA粗提取實驗的相關知識。木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白質類雜質，由于酶具有專一性，不能水解DNA，過濾后在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物，A項正確；37~40℃的水浴箱中保溫10~15分鐘不能去除濾液中的雜質，應該放在60~75℃的水浴箱中保溫10~15分鐘，使蛋白質變性析出，B項錯誤；向濾液中加入等體積、體積分數(shù)為95%冷卻的酒精，此時DNA會析出，不會進入濾液中，C項錯誤；DNA在0.14 mol/L NaCl溶液中溶解度小，DNA會析出，不會進入濾液中，D項錯誤。
考點鏈接
DNA的粗提取與鑒定
一、實驗原理
1.提取思路：利用DNA與RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面的差異，提取DNA，去除其他成分。
2.提取原理
（1）DNA的溶解性：
①DNA和蛋白質等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，利用這一特點，選擇適當?shù)柠}濃度就能使DNA充分溶解，而使雜質沉淀，或者相反，以達到分離的目的。
②DNA不溶于酒精溶液，但是細胞中的某些蛋白質則可溶于其中。
考點鏈接
（2）DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性：
①蛋白酶能水解蛋白質，但對DNA沒有影響。
②大多數(shù)蛋白質不能忍受60～80℃的高溫，發(fā)生變性，而DNA在80℃以上才會變性。
③洗滌劑能夠瓦解細胞膜，但對DNA沒有影響。
3.DNA的鑒定
在沸水浴的條件下，DNA與二苯胺反應呈現(xiàn)藍色。
二、實驗操作
1.實驗材料的選取
選用DNA含量相對較高的生物組織，成功的可能性更大。
考點鏈接
2.破碎細胞，獲取含DNA的濾液
（1）動物細胞的破碎（以雞血為例）：在雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水，同時用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可。
（2）植物細胞的破碎（以洋蔥為例）：先將洋蔥切碎，然后加入一定的洗滌劑和食鹽，進行充分地攪拌和研磨，過濾后收集研磨液。
3.去除濾液中的雜質
（1）方案一：通過控制NaCl溶液的濃度去除雜質。
（2）方案二：直接在濾液中加入嫩肉粉，反應10～15min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能夠分解蛋白質。
（3）方案三：將濾液放在60～75℃的恒溫水浴箱中保溫10～15min，使蛋白質變性而與DNA分離。
考點鏈接
4.DNA的析出
在濾液中加入與濾液體積相等的、冷卻的酒精溶液，靜置2～3min，溶液中會出現(xiàn)白色絲狀物，用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物。
5.DNA的鑒定
將呈白色絲狀的DNA溶解于5mL物質的量濃度為2mol/L的NaCl溶液中，再加入4mL的二苯胺試劑，沸水中加熱5min，冷卻后觀察溶液的顏色，注意要同時設置對照實驗。
三、操作提示
1.以血液為實驗材料時，每100mL血液中需要加入3g檸檬酸鈉，防止血液凝固。
2.加入洗滌劑后，動作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫，不利于后續(xù)步驟的操作。加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。
3.鑒定DNA用的二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會影響鑒定的效果。
例題練習
在“DNA的粗提取與鑒定”實驗中，甲、乙、丙、丁四個小組除表中所列處理方法不同外，其他操作步驟均正確，但實驗結果卻不同。下列有關敘述錯誤的是( )
A.實驗材料選擇錯誤的組別是丙
B.沸水浴后試管中溶液顏色藍色最深的是丁
C.甲組實驗現(xiàn)象差的原因是50℃的酒精對DNA的凝集效果差
D.乙組實驗不成功僅因為在鑒定時加入了雙縮脲試劑
組別 實驗材料 提取核物質時加入的溶液 去除雜質時加入的溶液 DNA鑒定時加入的試劑
甲 雞血 蒸餾水 95%的酒精（50℃） 二苯胺
乙 菜花 蒸餾水 95%的酒精（冷卻） 雙縮脲試劑
丙 豬血 蒸餾水 95%的酒精（冷卻） 二苯胺
丁 雞血 蒸餾水 95%的酒精（冷卻） 二苯胺
例題練習
答案：D
解析：豬血中成熟紅細胞不含細胞核，丙組選擇豬血作為實驗材料，導致提取的DNA過少，A正確；“DNA的粗提取與鑒定”實驗中，所選材料一般為雞血，去雜時一般使用冷卻的95%的酒精溶液，用二苯胺試劑鑒定，綜上所述丁組藍色最深，B正確；50℃的酒精對DNA的凝集效果差，C正確；乙組材料為植物，將植物細胞放入蒸餾水中時，植物細胞不會吸水漲破，且DNA應該用二苯胺鑒定，而不能用雙縮脲試劑鑒定，D錯誤。
典例2
聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用于擴增特定DNA片段的分子生物學技術。下列關于PCR引物的敘述，錯誤的是( )
A.為保證模板鏈與引物結合的效率，兩種引物之間盡量避免存在互補序列
B.為了便于將擴增的DNA片段與運載體連接，可在引物的3′端加上限制酶識別序列
C.在兩種引物上設計加入不同的限制酶識別序列，主要目的是使目的基因定向插入運載體并可避免目的基因自身環(huán)化
D.復性所需的溫度、時長和延伸所需的溫度、時長均與引物有關
答案：B
解析：本題考查PCR相關知識。引物自身不應存在互補序列，否則會出現(xiàn)引物與自身配對、引物和引物配對情況，降低PCR的效率，A正確；引物引導子鏈合成的方向是5′→3′，因此為了便于擴增的DNA片段與運載體連接，需要在引物的5′端加上限制酶識別位點，B錯誤；設計引物時需要避免引物之間堿基互補配對而造成引物自身環(huán)化的現(xiàn)象，為了便于擴增的DNA片段與運載體連接，常在兩條引物上設計加入不同的限制酶識別位點，主要目的是使目的基因能定向插入表達載體，避免目的基因自身環(huán)化，C正確；復性所需的溫度、時長和延伸所需的溫度、時長均與引物有關，如引物中G與C含量高，需要設定更高的復性和延伸溫度，D正確。
考點鏈接
多聚酶鏈式反應擴增DNA片段
一、PCR原理
1.PCR的原理
（1）概念：PCR是多聚酶鏈式反應的簡稱，是一種體外迅速擴增DNA片段的技術，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時內(nèi)復制出上百萬份的DNA拷貝。
（2）擴增方向：總是從子鏈的5′端向3′端延伸。
（3）引物
①本質：引物是一小段DNA或RNA，它能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對。用于PCR的引物長度通常為20～30個核苷酸。
②需要引物的原因：DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3′端延伸DNA鏈，因此，DNA復制需要引物。
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（4）原理
雙螺旋的打開：DNA的熱變性原理，即：
（5）反應條件：①一定的緩沖溶液；②DNA模板；③分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物；④四種脫氧核苷酸；⑤耐熱的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶；⑥能嚴格控制溫度變化的溫控設備。
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2.細胞內(nèi)DNA復制的基本條件
二、PCR的反應過程
（1）過程
①變性：當溫度上升到90℃以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈。
②復性：溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。
③延伸：當溫度上升到72℃左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。
參與的組分 在DNA復制中的作用
解旋酶 打開DNA雙鏈
DNA母鏈 提供DNA復制的模板
4種脫氧核苷酸 合成子鏈的原料
DNA聚合酶 催化合成DNA子鏈
引物 使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸
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（2）結果
①PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)都包括變性、復性、延伸三步。
②兩個引物之間的固定長度的DNA序列呈指數(shù)擴增。
三、PCR的實驗操作
1.實驗用具
（1）PCR儀：該儀器能自動調(diào)控溫度，實現(xiàn)DNA的擴增。如果沒有PCR儀，可用3個恒溫水浴鍋代替，操作時按程序在3個水浴鍋中來回轉移PCR反應的微量離心管。
（2）微量離心管：總容積為0.5mL，實際上是進行PCR反應的場所。
（3）微量移液器：用于向微量離心管中轉移PCR配方中的液體。
考點鏈接
2.實驗步驟
3.注意事項
（1）為避免外源DNA等因素的污染，實驗中使用的一些用具在使用前必須進行高壓滅菌。
考點鏈接
（2）所用的緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存。
（3）在微量離心管中添加反應成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭必須更換。
4.DNA含量的測定
DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA含量有關。可以利用DNA的這一特點進行DNA含量的測定，具體方法如下：
例題練習
PCR一般要經(jīng)過三十多次循環(huán)，從第二次循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應，下列相關敘述正確的是( )
A.由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈作模板時，仍與引物Ⅰ結合進行DNA子鏈的延伸
B.由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈作模板時，無需與引物結合，直接在酶的作用下從頭合成子鏈
C.若只有1個DNA片段作為模板，經(jīng)過5次循環(huán)，會得到32個DNA分子
D.若只有1個DNA片段作為模板，經(jīng)過2次循環(huán)，含引物Ⅰ的DNA單鏈占DNA總鏈數(shù)的1/4
答案：C
解析：當由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈作模板時，此單鏈引物固定端為5'端，因此與它互補的子鏈應從另一端開始合成，即與引物Ⅱ結合延伸DNA子鏈，A、B錯誤；若只有1個DNA片段作為模板，經(jīng)過5次循環(huán)，DNA復制了5次，可以得到的DNA分子數(shù)是25=32(個)，C正確；若只有1個DNA片段作為模板，經(jīng)過2次循環(huán)，會形成4個DNA片段，8條單鏈，其中含有原始模板鏈(不含引物)2條，另外6條單鏈中含有引物Ⅰ的有3條單鏈，含有引物Ⅱ的有3條單鏈，即含有引物Ⅰ的DNA單鏈占DNA總鏈數(shù)的3/8，D錯誤。
在蛋白質的提取和分離中，關于對樣品處理過程中，分析無誤的是( )
A.洗滌紅細胞的目的是去除血漿中的葡萄糖、無機鹽
B.洗滌時離心速度過低，時間過短，白細胞等會沉淀，達不到分離的效果
C.洗滌過程選用0.1%的生理鹽水
D.透析的目的是去除樣品中相對分子質量較小的雜質
典例3
答案：D
解析：洗滌紅細胞的目的是去除雜蛋白，以利于后續(xù)步驟的分離純化；分離時要采用低速短時間離心，以達到分離的效果；洗滌過程選用0.9%的生理鹽水。
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血紅蛋白的提取和分離
一、蛋白質分離的原理和方法
1.蛋白質的分離依據(jù)
根據(jù)蛋白質各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質和多少、溶解度、吸附性質和對其他分子的親和力等，可以用來分離不同種類的蛋白質。
2.凝膠色譜法
（1）凝膠：實際上是一些微小的多孔球體，大多數(shù)是由多糖類化合物構成的，如葡聚糖、瓊脂糖。
（2）原理：凝膠小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，相對分子質量較大的蛋白質分子不能進入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過的路程較短，移動速度較快；相對分子質量較小的蛋白質分子比較容易進入凝膠內(nèi)部的通道，通過的路程較長，移動速度較慢，因此可將各種相對分子質量不同的蛋白質分離。
考點鏈接
（3）分離過程：蛋白質混合物上柱→洗脫→大分子蛋白質移動快、小分子蛋白質移動慢→收集大分子蛋白質→收集小分子蛋白質
3.緩沖溶液
（1）作用：在一定范圍內(nèi)，抑制外界的酸和堿對溶液pH的影響，維持pH基本不變。
（2）配制：由1～2種緩沖劑溶解于水中配制而成，通過調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以得到不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。
4.電泳
（1）概念：指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。
（2）原理：
考點鏈接
①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團會帶上正電或負電。
②在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。
③電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。
④方法：常用的電泳方法有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。
二、血紅蛋白提取和分離的實驗操作
1.樣品處理
（1）紅細胞的洗滌
考點鏈接
①目的：去除雜蛋白，以利于后續(xù)步驟的分離純化。
②過程：
（2）血紅蛋白的釋放
①目的：使紅細胞破裂釋放血紅蛋白。
②過程：
a.將洗滌好的紅細胞倒入燒杯中。
b.加蒸餾水到原血液的體積，其作用是使紅細胞吸水漲破。
考點鏈接
c.加入40%體積的甲苯，其作用是溶解細胞膜。
d.置于磁力攪拌器上充分攪拌10 min，其作用是加速紅細胞破裂。
e.紅細胞破裂，釋放出血紅蛋白。
（3）分離血紅蛋白溶液
考點鏈接
2.粗分離——透析
（1）目的：除去樣品中相對分子質量較小的雜質。
（2）過程：取1 mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300 mL物質的量濃度為20 mmol/L的磷酸緩沖液（pH為7.0）的燒杯中，透析12 h。
3.純化——凝膠色譜操作
（1）凝膠色譜柱的制作
①取長40 cm，內(nèi)徑為1.6 cm的玻璃管，兩端用砂紙磨平。
②柱底制作：打孔→挖凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好。
③柱頂制作：打孔→安裝玻璃管。
考點鏈接
④組裝：將上述三者按相應位置組裝，并在下端出口連接帶開關的尼龍管，尼龍管放入收集器。
（2）凝膠色譜柱的裝填
考點鏈接
（3）樣品的加入和洗脫
4.純度鑒定
在鑒定的方法中，使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。
例題練習
蛋白質的分離與純化技術是蛋白質研究的重要技術。下列有關敘述不正確的是( )
A.根據(jù)蛋白質分子不能透過半透膜的特性，可通過透析將樣品中各種不同的蛋白質分離
B.根據(jù)蛋白質所帶電荷性質的差異及分子大小的不同等，可通過電泳分離蛋白質
C.根據(jù)蛋白質相對分子質量的大小，可通過凝膠色譜法分離蛋白質
D.根據(jù)蛋白質的分子大小、密度不同，可通過離心沉降法分離蛋白質
答案：A
解析：蛋白質分子不能透過半透膜，而溶液中的小分子物質可以透過半透膜，因此透析可以將蛋白質和溶液中的小分子物質分離，故A錯誤。
要點突破
一、DNA提取與鑒定的原理和方法
基本原理 方法 目的
DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同 溶于NaCl溶液中并稀釋 ①NaCl溶液為2mol/L時，DNA溶解，而部分蛋白質發(fā)生鹽析生成沉淀，通過過濾可除去部分蛋白質及不溶于NaCl溶液的雜質；②當NaCl溶液稀釋至0.14mol/L時，DNA析出，過濾可除去溶于NaCl溶液的部分蛋白質和其他雜質
DNA不被蛋白酶所水解 加入嫩肉粉 嫩肉粉中含木瓜蛋白酶，分解蛋白質
DNA不溶于酒精溶液 加入冷卻酒精（95%） DNA析出，除去溶于酒精的蛋白質
DNA可被二苯胺染成藍色 加入二苯胺，并沸水浴加熱 鑒定DNA
要點突破
二、DNA粗提取與鑒定實驗中四個關鍵操作的目的
1.兩次加入蒸餾水
2.三次加NaCl溶液
次數(shù) 目的
第一次 使雞血細胞吸水漲破
第二次 稀釋NaCl溶液，使DNA逐漸析出
次數(shù) 目的
第一次 溶解DNA，析出蛋白質等雜質
第二次 使DNA再溶解，為了獲得含雜質較少的DNA
第三次 溶解DNA，以便DNA與二苯胺反應
要點突破
二、DNA粗提取與鑒定實驗中四個關鍵操作的目的
3.三次過濾
次數(shù) 目的
第一次 單層 除去細胞破碎后的細胞膜、核膜、糖類、蛋白質等，獲得含核物質的濾液
第二次 兩層 除去不溶于2mol/LNaCl溶液中的蛋白質等雜質，獲得含DNA的濾液
第三次 多層 除去溶于0.14mol/LNaCl溶液中的雜質，獲得含DNA的絲狀物
要點突破
二、DNA粗提取與鑒定實驗中四個關鍵操作的目的
4.六次攪拌
次數(shù) 實驗操作 目的
第一次 攪拌加蒸餾水的雞血細胞液 加速細胞破裂
第二次 攪拌含DNA的高濃度鹽溶液 加速DNA的溶解
第三次 攪拌加蒸餾水的NaCl溶液 析出DNA
第四次 攪拌含DNA的高濃度鹽溶液 加速DNA的溶解
第五次 攪拌含DNA的酒精溶液 提取含雜質較少的DNA
第六次 攪拌含DNA的白色絲狀物的鹽溶液 加速DNA的溶解
要點突破
三、直接使用酶、固定化酶和固定化細胞的比較
比較項目 直接使用酶 固定化酶 固定化細胞
酶的種類 一種或幾種 一種 一系列酶
制作方法 － 化學結合固定化、物理吸附固定化 包埋法固定化
是否需要營養(yǎng)物質 否 否 是
催化反應 單一或多種 單一 一系列
反應底物 各種物質（大分子、小分子） 各種物質（大分子、小分子） 小分子物質
優(yōu)點 催化效率高，低耗能、低污染等 ①既能與反應物接觸，又能與產(chǎn)物分離，提高了產(chǎn)品質量；②可重復使用，降低了成本 成本更低，操作更容易
缺點 ①對環(huán)境條件非常敏感，易失活；②酶難回收，成本高，影響產(chǎn)品質量 不利于催化一系列的酶促反應 反應物不易與酶接觸，尤其是大分子物質，可能導致反應效率下降
實例 果膠酶 固定化葡萄糖異構酶 固定化酵母細胞
要點突破
三、PCR擴增與DNA復制的異同
項目 DNA復制 PCR擴增
不同點 時期 有絲分裂間期或減Ⅰ前的間期 任何時期
場所 活細胞內(nèi) 細胞外
酶 解旋酶、DNA聚合酶 耐高溫的TaqDNA聚合酶
引物 有轉錄，產(chǎn)生RNA作引物，無需人工加入 無轉錄，無引物產(chǎn)生，需人工加入兩種DNA引物
特點 邊解旋邊復制 先全部解旋后開始復制
緩沖液 不需緩沖液 配制緩沖液代替細胞核液
設備 無 控制溫度變化的溫控設備
相同點 原理 嚴格遵循堿基互補配對原則
引物 都需要分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物
模板 DNA的兩條鏈為模板
特點 半保留復制
原料 游離的四種脫氧核苷酸
易錯辨析
與PCR原理有關的三個易錯點
（1）酶的作用位點：解旋酶的作用是使DNA兩條鏈之間的氫鍵斷開；DNA聚合酶與DNA連接酶的作用都是催化形成磷酸二酯鍵。不要誤認為解旋酶也作用于磷酸二酯鍵。
（2）DNA聚合酶和DNA連接酶：DNA聚合酶是將單個核苷酸連接到已有的單鏈片段的3′端上，需要模板；而DNA連接酶連接的是兩條DNA片段的缺口，不需要模板。
（3）PCR中的解旋過程：PCR過程中不需要解旋酶，需要升高溫度才能打開氫鍵，但此時的溫度不會破壞磷酸二酯鍵，因此，DNA加熱變性后變?yōu)閱捂?，并未分解成單體。
謝謝觀看（5）DNA與蛋白質技術
1.下面關于多聚酶鏈式反應(PCR)的敘述，錯誤的是( )
A.常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產(chǎn)物
B.PCR的循環(huán)過程分為變性、復性和延伸三步
C.PCR技術利用DNA半保留復制的原理，可在短時間內(nèi)大量擴增目的基因
D.一個目的基因用PCR擴增生成2個目的基因的過程中要消耗2n+1個引物
2.PCR引物的3'端為結合模板DNA的關鍵堿基，5'端無嚴格限制，可用于添加限制酶切割位點等序列。下列敘述正確的是( )
A.該圖表示PCR循環(huán)中的變性環(huán)節(jié)
B.PCR第四次循環(huán)要消耗15對引物
C.Taq酶催化相鄰的兩個游離dNTP之間形成磷酸二酯鍵
D.用圖中引物擴增兩個循環(huán)后即可獲得添加限制酶切割位點的產(chǎn)物
3.用PCR方法檢測轉基因植株是否成功導人目的基因時，得到的電泳圖譜如圖所示，其中1號為DNA標準樣液，10號為蒸餾水。以下分析不合理的是( )
A.PCR產(chǎn)物的分子大小在250bp至500bp之間
B.3號樣品為不含目的基因的載體DNA
C.9號樣品對應的植株不是所需的轉基因植株
D.10號的電泳結果能確定反應體系等對實驗結果沒有干擾
4.研究員利用PCR技術擴增X基因。兩種引物及其與模板鏈的結合位置如圖甲所示。經(jīng)4輪循環(huán)后產(chǎn)物中有5種不同的DNA分子,如圖乙所示。下列敘述正確的是( )
A.利用DNA連接酶才能完成PCR過程
B.一次加入30輪所需的引物1和引物2會干擾PCR進行
C.第⑤種DNA分子最早出現(xiàn)在第三輪復制后，只有一個⑤
D.經(jīng)四輪復制產(chǎn)生的第⑤種DNA分子共有8個
5.下圖甲和乙表示凝膠色譜法的有關實驗操作，圖丙為某同學的分離結果，下列敘述正確的是( )
A.甲裝置中的B一般是用羧甲基纖維素鈉制成的
B.甲裝置中的A通常使用的是檸檬酸鈉溶液
C.圖乙裝置上端洗脫瓶C中是待分離的蛋白質樣液
D.圖丙中的甲蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電冰中遷移速率最慢
6.下列有關“血紅蛋白的提取和分離”實驗中緩沖溶液的說法，錯誤的是( )
A.在一定范圍內(nèi)，緩沖溶液能抵制外界的酸和堿對溶液pH的影響，維持pH基本不變
B.緩沖溶液通常由1～2種緩沖劑溶解于水中配制而成
C.通過調(diào)節(jié)緩沖劑的種類，就可以制得在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液
D.凝膠色譜法、SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳都要用到緩沖溶液
7.PCR定點突變技術是最常用的基因定點突變技術，通過設計含有非特異性配對堿基的引物，再通過PCR將突變位點引入產(chǎn)物中。右圖是PCR定點突變技術流程圖，據(jù)圖分析錯誤的是( )
A.該技術需要使用四條引物
B.引物2和3的突起處代表與模板鏈不能互補的突變位點
C.利用引物1和2需要進行三次PCR才可得到DNA片段A
D.該技術具有突變回收率高、可在任何位點引入突變的優(yōu)點
8.某興趣小組以洋蔥為實驗材料進行DNA的粗提取和鑒定，圖1和圖2表示其中的部分過程。下列敘述正確的是( )
A.將洋蔥研磨后的濾液置于4℃冰箱中放置幾分鐘，取沉淀物離心后進行圖1操作
B.圖1中應選擇體積分數(shù)為75%的預冷酒精溶液進行DNA的粗提取
C.圖2中應將試管置于沸水浴中加熱，待試管冷卻后，可觀察到試管2呈現(xiàn)藍色
D.圖2中試管1含有1mol·L-1的NaCl溶液，以便和試管2作對照
9.融合PCR技術（fusionPCR）采用具有互補末端的引物，形成具有重疊鏈的PCR產(chǎn)物，通過PCR產(chǎn)物重疊鏈的延伸，從而將不同來源的任意DNA片段連接起來，為同源重組片段的構建提供了快速簡捷的途徑。圖1表示融合PCR技術的過程示意圖（P1-P4表示引物），圖2表示融合后產(chǎn)物的電泳圖。
（1）從化學本質上來說，引物是____________________作用是________________________________________________________。
（2）圖1過程設計的P2與P3引物的添加序列必須能夠發(fā)生________________。融合PCR步驟1中，至少進行________循環(huán)才能獲得基因A的PCR產(chǎn)物。
（3）融合PCR步驟2中基因A、B融合形成一個基因的機制是________________________________________________________________________________________________________。
若要對A、B融合基因繼續(xù)進行PCR擴增，則圖1中的M、N處位置所需要的引物分別是________。
（4）圖2中電泳圖中________號條帶最可能表示融合后片段，若PCR反應沒有擴增出任何產(chǎn)物，則可能的原因是________________________________________________（至少兩點）。
10.下列關于DNA粗提取和PCR、電泳技術，敘述錯誤的是( )
A.可利用DNA不溶于酒精的特點來提取DNA
B.可利用洋蔥研磨液離心后的沉淀物來提取DNA
C.PCR中通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚
D.瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物時，需將核酸染料加入瓊脂糖溶液中
11.如下表示“DNA粗提取與鑒定”實驗的基本流程，下列敘述錯誤的是( )
A.本實驗使用的酒精的濃度與“低溫誘導植物細胞染色體數(shù)目的變化”實驗中的相同
B.步驟①中可以使用豬的肝細胞作為實驗材料
C.步驟①中可以使用紗布對研磨液進行過濾，并獲取上清液
D.步驟⑥向試管中加入二苯胺試劑后靜置5min后即可呈現(xiàn)藍色
12.PCR是體外快速大量擴增DNA的一種技術，下列關于PCR技術敘述錯誤的是( )
A.增加模板DNA的量可以提高反應速度
B.復性溫度過低會造成引物與模板的結合位點增加
C.延伸時，DNA聚合酶從引物的5'端連接脫氧核苷酸
D.PCR反應體系中一般需加Mg2+以激活DNA聚合酶
13.我國科研人員在實驗室中通過構建多種酶催化體系的方法,首次實現(xiàn)了在細胞外從CO2固定到合成淀粉的過程。下列有關敘述錯誤的是( )
A. 可采用PCR技術從不同物種的基因組中擴增得到多酶催化體系中的目標酶基因
B. 在多酶催化體系中,可能會因為酶的最適反應條件不同而使反應中斷
C. 該方法可在分子水平上直接改變氨基酸的序列,實現(xiàn)對酶特性的改造和優(yōu)化
D. 若該科研成果成熟后推廣應用,有助于擺脫耕地和自然環(huán)境限制,解決糧食危機
14.水稻根部一般沒有根瘤菌，在種植時常需要施加氮肥?？茖W家想利用基因工程技術將相關基因導入水稻細胞中，建立水稻“小型化肥廠”，讓水稻直接固氮，減少使用氮肥的生產(chǎn)成本以及可能造成的環(huán)境污染。下列相關敘述錯誤的是( )
A.PCR技術可用于固氮基因的獲取和檢測
B.實驗中需將轉基因水稻種子在缺氮培養(yǎng)液中進行篩選
C.為了提高PCR擴增固氮基因的特異性，可適當增加引物長度并降低復性溫度
D.PCR實驗中使用的微量離心管和槍頭等在使用前必須進行高壓蒸汽滅菌處理
15.DNA分子雜交技術的原理是當兩種生物的 DNA單鏈具有互補的堿基序列時，互補的堿基序列就會結合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈，如下圖所示。關于DNA 分子雜交技術的應用，下列相關敘述正確的是( )
A.雜合雙鏈區(qū)的一條鏈的序列是5'-GATACC-3'，那么另一條鏈的序列是5'-CTATGG-3'
B.該技術可用來比較不同物種DNA分子的差異，以分析生物親緣關系的遠近
C.通過設計一種DNA引物與DNA的其中一條鏈結合，經(jīng)PCR技術可大量擴增目的基因
D.通過設計含有目的基因片段的DNA探針，可檢測特定細胞中是否合成了目的蛋白
16.下列有關“血紅蛋白的提取和分離”技術的說法，正確的是（　?。?br/>A.雞血是血紅蛋白提取和分離實驗的理想材料
B.需用蒸餾水對紅細胞進行洗滌以去除雜蛋白
C.為了使凝膠裝填緊密，應使用緩沖液充分洗滌平衡凝膠12小時
D.凝膠色譜法是根據(jù)帶電離子在電場的作用下發(fā)生遷移來分離蛋白質
17.為了研究蛋白質的結構與功能，常需要從生物材料中分離純化蛋白質。某同學用凝膠色譜法從某種生物材料中分離純化得到了甲、乙、丙3種蛋白質，并對純化得到的3種蛋白質進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，結果如圖所示（“+”“-”分別代表電泳槽的陽極和陰極）。已知甲的相對分子質量是乙的2倍，且甲、乙均由一條肽鏈組成?；卮鹣铝袉栴}。
（1）圖中甲、乙、丙在進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳時，遷移的方向是_________（填“從上向下”或“從下向上”）。
（2）圖中丙在凝膠電泳時出現(xiàn)2個條帶，其原因是_________。
（3）凝膠色譜法可以根據(jù)蛋白質_________的差異來分離蛋白質。據(jù)圖判斷，甲、乙、丙3種蛋白質中最先從凝膠色譜柱中洗脫出來的蛋白質是_________，最后從凝膠色譜柱中洗脫出來的蛋白質是_________。
（4）假設甲、乙、丙為3種酶，為了減少保存過程中酶活性的損失，應在_________（答出1點即可）條件下保存。
答案以及解析
1.答案：D
解析：一個DNA分子擴增n次要消耗引物的數(shù)量為2n-2，D錯誤。
2.答案：D
解析：圖中引物與模板鏈堿基互補配對，該圖表示PCR循環(huán)中的復性環(huán)節(jié)，A錯誤；PCR三次循環(huán)共消耗7（23-1）對引物，PCR四次循環(huán)共消耗15（24-1）對引物，第四次循環(huán)要消耗8對引物，B錯誤；dNMP只有一個磷酸基團，為脫氧核苷酸，dNTP有三個磷酸基團，延伸時，在Taq酶催化下，dNMP作為擴增的原料會依次連接到3'端，相鄰的dNMP間形成磷酸二酯鍵，C錯誤；若在引物的5'端添加限制酶切割位點序列，則第一輪循環(huán)后，得到的2個DNA片段中各自的兩條脫氧核苷酸鏈都不等長，通過繪圖可推知，再經(jīng)過一次循環(huán)，產(chǎn)物中開始出現(xiàn)脫氧核苷酸鏈等長的含有上述添加限制酶切割位點的DNA片段，所以擴增兩個循環(huán)后即可獲得添加限制酶切割位點的產(chǎn)物，D正確。
3.答案：B
解析：本題考查PGR和電泳技術的相關知識。
PCR過程中，可以通過設計特定的引物來擴增特定的DNA片段。據(jù)題意知PCR產(chǎn)物是含目的基因的某特定片段，4~9號是轉基因植株，理論上應包含目的基因，結合1號DNA標準樣液的電泳圖譜，推測包含自的基因的片段大小應在250~500bp之間，A正確；據(jù)題意可知，2號樣品（野生型植株DNA）的PCR結果中不包含250~500bp片段，而4號樣品（轉基因植株DNA）的PCR結果中包含250~500bp片段，3號樣品的PCR結果也包含250~500bp片段，故其應為包含目的基因的載體DNA,B錯誤；9號樣品的PCR結果不包含250~500bp片段，所以其對應的植株不是所需的轉基因植株，C正確;10號樣品為蒸餾水，無任何DNA分子片段，故10號的電泳結果能確定反應體系等對實驗結果沒有干擾，D正確。
4.答案：D
解析： PCR過程不需要DNA連接酶，A錯誤；一次加入30輪所需的引物不會干擾正常過程，B錯誤；第⑤種DNA分子最早出現(xiàn)在第三輪復制后，有兩個⑤，C錯誤；X基因第四次復制得到16個、五種DNA分子：①復制得①和③，②復制得②和④，2個③復制得2個③和2個⑤，2個④復制得2個④和2個⑤，2個⑤復制得4個⑤，故經(jīng)四輪復制可產(chǎn)生8個第⑤種DNA分子，D正確。
5.答案：D
解析：A、甲圖是透析過程，甲裝置中的B是透析袋，是一種半透膜，可以用植物膜、玻璃紙等材料制得，用的最多的是纖維素制成的透析膜，A錯誤；
B、甲裝置中的A通常使用的是磷酸緩沖液，抵制外界酸、堿對溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定，B錯誤；
C、圖乙是用凝膠色譜法對蛋白質進行純化操作的示意圖，圖乙裝置上端洗脫瓶中是緩沖液，C錯誤；
D、圖丙為蛋白質的洗脫順序，由于分子質量大的蛋白質先洗脫出來，因此蛋白質分子量依次為甲＞乙＞丙。加入SDS可以使蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移速率完全取決于分子的大小，甲的蛋白質分子量最大，因此圖丙中的甲蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電冰中遷移速率最慢，D正確。
故選D。
6.答案：C
解析：A、在純化洗脫血紅蛋白時為保持體外溶液的pH與體內(nèi)環(huán)境中的pH基本一致，維持蛋白質正常結構和功能，需要加入磷酸緩沖液，A正確；
B、緩沖溶液通常是由一或兩種化合物(緩沖劑)溶解于水中制得，調(diào)節(jié)緩沖劑的配比就可制得不同pH范圍的緩沖液，B正確；
C、緩沖物質指能調(diào)節(jié)溶液的pH值，使溶液的pH值在加入一定量的酸性物質或堿性物質時保持恒定或小范圍變化的一種物質，調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液，C錯誤；
D、凝膠色譜法是加緩沖溶液是為了洗滌平衡，使凝膠裝填均勻緊密，緩沖液在電泳過程中一個作用是維持合適的pH，D正確。
故選C。
7.答案：A
解析：A、據(jù)圖可知，該技術需要使用四種引物，即引物1﹣引物4，而非四條引物（引物的數(shù)量隨PCR擴增次數(shù)增加而增加）,A錯誤。
8.答案：C
解析：A、將洋蔥研磨后的濾液置于4℃冰箱中放置幾分鐘，再取上清液進行圖1操作，A錯誤；B、圖1中應選擇體積分數(shù)為95%的預冷酒精溶液進行DNA的粗提取，B錯誤；C、在沸水浴條件下，DNA與二苯胺試劑發(fā)生反應呈藍色，故圖2中應將試管置于沸水浴中加熱，待試管冷卻后，可觀察到試管2呈現(xiàn)藍色，C正確；D、取兩支20ml的試管，各加入物質的量濃度為2mol/L的NaCl溶液5ml，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解故圖2中試管1含有2mol·L-1的NaCl溶液，以便和試管2作對照，D錯誤。
9.答案：（1）一小段單鏈DNA或RNA；使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸
（2）堿基互補配對；2
（3）引物P2與P3添加序列的互補鏈發(fā)生堿基互補配對，然后在TaqDNA聚合酶的作用下向兩邊延伸，基因A、B完成融合；P1、P4
（4）4；復性溫度太高；引物設計不合理無法與目的基因結合
解析：（1）引物是一小段單鏈DNA或RNA,能與目的基因堿基互補配對,其作用是使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸。
（2）由于A、B基因需要融合,融合依據(jù)的原理是堿基互補配對,因此在引物設計是P2與P3引物對應的序列就要求能堿基互補配對。PCR經(jīng)過兩次循環(huán)才能獲得純的目的基因片段。
（3）由圖可知,引物P2與P3添加序列的互補鏈發(fā)生堿基互補配對,然后在TaqDNA聚合酶的作用下向兩邊延伸,使基因A、B完成融合。根據(jù)引物延伸的方向,N出添加的引物是P4,M處添加的引物是P1。
（4）融合后的片段長度更長,很有可能是4號條帶。PCR技術沒有擴增出目的基因的原因包括:復性溫度太高;引物設計不合理無法與目的基因結合。
10.答案：B
解析：A中DNA不溶于酒精溶液，但細胞中的某些蛋白質溶于酒精，可以根據(jù)該特性來提純DNA,A正確；B中洋蔥加入研磨液后離心后，DNA存在于上清液中，用上清液提取DNA，B錯誤；C中PCR技術包括高溫變性(解鏈)—低溫復性(引物和模板鏈結合)—中溫延伸三個步驟，解旋過程不需要解旋酶的催化，而是利用了DNA在高溫下變性的原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結合，C正確；D中凝膠中的DNA需要與核酸染料結合，在波長為300nm的紫外燈下才被觀察到，核酸染料加入瓊脂糖溶液中，混合均勻，然后將溫熱的瓊脂糖溶液倒入模具，D正確。故選：B。
11.答案：D
解析：本題主要考查DNA粗提取和鑒定實驗，考查學生的實驗探究能力。本實驗和“低溫誘導植物細胞染色體數(shù)目的變化”實驗所用的酒精濃度相同，都是體積分數(shù)為95%的酒精，A項正確。步驟⑥中DNA鑒定時向試管中加入二苯胺試劑后，應將試管置于沸水中加熱5min，待試管冷卻后可觀察到藍色，D項錯誤。
12.答案：C
解析：C.延伸時，DNA聚合酶從引物的3’端連接脫氧核苷酸，C錯誤。
13.答案： C
解析：對酶進行改造,一般在基因水平上進行。
14.答案：C
解析：通過設計相應引物，利用PCR技術可獲得固氮基因，A項正確；若要檢測轉基因水稻是否成功，可將該水稻種于缺氮的培養(yǎng)液，若無缺乏癥，則可證明轉基因成功，B正確；若要提高PCR擴增固氮基因的特異性，因引物延長，與模板特異性結合能力更強，可耐受較高的復性溫度，所以應可適當增加引物長度并提高復性溫度，C項錯誤；為避免雜菌的DNA污染，所用裝置應該嚴格滅菌，D項正確。
15.答案：B
解析：A、由于是DNA分子雜交，所以發(fā)生的堿基互補配對方式是A-T、T-A、G-C、C-G，A錯誤；B、DNA分子中的堿基序列代表遺傳信息，如果兩個DNA分子形成的雜合雙鏈區(qū)越多，則說明兩個DNA分子中的遺傳信息越相似，B正確；C、雙鏈區(qū)是通過堿基對中的氫鍵形成的，C錯誤；D、由于人和大猩猩的親緣關系更近，所以人和大猩猩的DNA雜交形成的雜合雙鏈區(qū)要多于人與羊的DNA雜合雙鏈區(qū)，D錯誤。故選：B。
16.答案：C
解析：A、哺乳動物成熟的紅細胞沒有細胞核和眾多細胞器，含有大量的血紅蛋白，是血紅蛋白提取和分離實驗的理想材料，A錯誤;B、洗滌紅細胞的目的是去除雜蛋白，加入五倍體積的生理鹽水，B錯誤;C、為了使凝膠裝填緊密，應使用緩沖液充分洗滌平衡凝膠12小時，C正確;D、凝膠色譜法是根據(jù)相對分子質量的大小來分離蛋白質的有效方法，D錯誤。故選:C。
17.答案：（1）從上向下
（2）該蛋白質由2條肽鏈組成，在SDS的作用下解聚成2條肽鏈
（3）相對分子質量；丙；乙
（4）低溫
解析：（1）在測定蛋白質相對分子質量時，通常使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。為了消除凈電荷對遷移率的影響，可以在凝膠中加入SDS。SDS能使蛋白質發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質復合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結果只是單條肽鏈的相對分子質量。SDS能與各種蛋白質形成蛋白質-SDS復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種蛋白質間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。已知甲的相對分子質量是乙的2倍，推測甲的移動距離小于乙，因此甲、乙、丙在進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳時，遷移的方向是從上向下。
（2）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定的結果只是單條肽鏈的相對分子質量，圖中丙經(jīng)凝膠電泳后出現(xiàn)2個條帶，原因是該蛋白質由2條肽鏈組成，在SDS的作用下解聚成單條肽鏈。
（3）凝膠色譜法是根據(jù)相對分子質量的大小分離蛋白質的有效方法。當相對分子質量不同的蛋白質通過凝膠時，相對分子質量較小的蛋白質容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動速度較慢，而相對分子質量較大的蛋白質無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。據(jù)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果可知，這3種蛋白質相對分子質量的大小依次為丙>甲>乙，因此最先從凝膠色譜柱中洗脫出來的蛋白質是丙，最后從凝膠色譜柱中洗脫出來的蛋白質是乙。
（4）在低溫條件下，酶的活性很低，但酶的空間結構穩(wěn)定，在適宜的溫度下，酶的活性較高，不易保存。因此，酶制劑適合在低溫條件下保存。
2（5）DNA與蛋白質技術
【考點梳理】
典例1
粗提取DNA時，向雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，過濾后所得濾液進行下列處理后再進行過濾，在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物的處理方式是( )
A.加入適量的木瓜蛋白酶
B.37～40℃的水浴箱中保溫10～15分鐘
C.加入與濾液體積相等的、體積分數(shù)為95%的冷卻的酒精
D.加入NaCl調(diào)節(jié)濃度至2mol/L→過濾→調(diào)節(jié)濾液中NaCl濃度至0.14mol/L
答案：A
解析：本題考查DNA粗提取實驗的相關知識。木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白質類雜質，由于酶具有專一性，不能水解DNA，過濾后在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物，A項正確；37~40℃的水浴箱中保溫10~15分鐘不能去除濾液中的雜質，應該放在60~75℃的水浴箱中保溫10~15分鐘，使蛋白質變性析出，B項錯誤；向濾液中加入等體積、體積分數(shù)為95%冷卻的酒精，此時DNA會析出，不會進入濾液中，C項錯誤；DNA在0.14 mol/L NaCl溶液中溶解度小，DNA會析出，不會進入濾液中，D項錯誤。
考點鏈接
DNA的粗提取與鑒定
一、實驗原理
1.提取思路：利用DNA與RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面的差異，提取DNA，去除其他成分。
2.提取原理
（1）DNA的溶解性：
①DNA和蛋白質等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，利用這一特點，選擇適當?shù)柠}濃度就能使DNA充分溶解，而使雜質沉淀，或者相反，以達到分離的目的。
②DNA不溶于酒精溶液，但是細胞中的某些蛋白質則可溶于其中。
（2）DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性：
①蛋白酶能水解蛋白質，但對DNA沒有影響。
②大多數(shù)蛋白質不能忍受60～80℃的高溫，發(fā)生變性，而DNA在80℃以上才會變性。
③洗滌劑能夠瓦解細胞膜，但對DNA沒有影響。
3.DNA的鑒定
在沸水浴的條件下，DNA與二苯胺反應呈現(xiàn)藍色。
二、實驗操作
1.實驗材料的選取
選用DNA含量相對較高的生物組織，成功的可能性更大。
2.破碎細胞，獲取含DNA的濾液
（1）動物細胞的破碎（以雞血為例）：在雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水，同時用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可。
（2）植物細胞的破碎（以洋蔥為例）：先將洋蔥切碎，然后加入一定的洗滌劑和食鹽，進行充分地攪拌和研磨，過濾后收集研磨液。
3.去除濾液中的雜質
（1）方案一：通過控制NaCl溶液的濃度去除雜質。
（2）方案二：直接在濾液中加入嫩肉粉，反應10～15min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能夠分解蛋白質。
（3）方案三：將濾液放在60～75℃的恒溫水浴箱中保溫10～15min，使蛋白質變性而與DNA分離。
4.DNA的析出
在濾液中加入與濾液體積相等的、冷卻的酒精溶液，靜置2～3min，溶液中會出現(xiàn)白色絲狀物，用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物。
5.DNA的鑒定
將呈白色絲狀的DNA溶解于5mL物質的量濃度為2mol/L的NaCl溶液中，再加入4mL的二苯胺試劑，沸水中加熱5min，冷卻后觀察溶液的顏色，注意要同時設置對照實驗。
三、操作提示
1.以血液為實驗材料時，每100mL血液中需要加入3g檸檬酸鈉，防止血液凝固。
2.加入洗滌劑后，動作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫，不利于后續(xù)步驟的操作。加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。
3.鑒定DNA用的二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會影響鑒定的效果。
例題練習
在“DNA的粗提取與鑒定”實驗中，甲、乙、丙、丁四個小組除表中所列處理方法不同外，其他操作步驟均正確，但實驗結果卻不同。下列有關敘述錯誤的是( )
組別 實驗材料 提取核物質時加入的溶液 去除雜質時加入的溶液 DNA鑒定時加入的試劑
甲 雞血 蒸餾水 95%的酒精（50℃） 二苯胺
乙 菜花 蒸餾水 95%的酒精（冷卻） 雙縮脲試劑
丙 豬血 蒸餾水 95%的酒精（冷卻） 二苯胺
丁 雞血 蒸餾水 95%的酒精（冷卻） 二苯胺
A.實驗材料選擇錯誤的組別是丙
B.沸水浴后試管中溶液顏色藍色最深的是丁
C.甲組實驗現(xiàn)象差的原因是50℃的酒精對DNA的凝集效果差
D.乙組實驗不成功僅因為在鑒定時加入了雙縮脲試劑
答案：D
解析：豬血中成熟紅細胞不含細胞核，丙組選擇豬血作為實驗材料，導致提取的DNA過少，A正確；“DNA的粗提取與鑒定”實驗中，所選材料一般為雞血，去雜時一般使用冷卻的95%的酒精溶液，用二苯胺試劑鑒定，綜上所述丁組藍色最深，B正確；50℃的酒精對DNA的凝集效果差，C正確；乙組材料為植物，將植物細胞放入蒸餾水中時，植物細胞不會吸水漲破，且DNA應該用二苯胺鑒定，而不能用雙縮脲試劑鑒定，D錯誤。
典例2
聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用于擴增特定DNA片段的分子生物學技術。下列關于PCR引物的敘述，錯誤的是( )
A.為保證模板鏈與引物結合的效率，兩種引物之間盡量避免存在互補序列
B.為了便于將擴增的DNA片段與運載體連接，可在引物的3′端加上限制酶識別序列
C.在兩種引物上設計加入不同的限制酶識別序列，主要目的是使目的基因定向插入運載體并可避免目的基因自身環(huán)化
D.復性所需的溫度、時長和延伸所需的溫度、時長均與引物有關
答案：B
解析：本題考查PCR相關知識。引物自身不應存在互補序列，否則會出現(xiàn)引物與自身配對、引物和引物配對情況，降低PCR的效率，A正確；引物引導子鏈合成的方向是5′→3′，因此為了便于擴增的DNA片段與運載體連接，需要在引物的5′端加上限制酶識別位點，B錯誤；設計引物時需要避免引物之間堿基互補配對而造成引物自身環(huán)化的現(xiàn)象，為了便于擴增的DNA片段與運載體連接，常在兩條引物上設計加入不同的限制酶識別位點，主要目的是使目的基因能定向插入表達載體，避免目的基因自身環(huán)化，C正確；復性所需的溫度、時長和延伸所需的溫度、時長均與引物有關，如引物中G與C含量高，需要設定更高的復性和延伸溫度，D正確。
考點鏈接
多聚酶鏈式反應擴增DNA片段
一、PCR原理
1.PCR的原理
（1）概念：PCR是多聚酶鏈式反應的簡稱，是一種體外迅速擴增DNA片段的技術，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時內(nèi)復制出上百萬份的DNA拷貝。
（2）擴增方向：總是從子鏈的5′端向3′端延伸。
（3）引物
①本質：引物是一小段DNA或RNA，它能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對。用于PCR的引物長度通常為20～30個核苷酸。
②需要引物的原因：DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3′端延伸DNA鏈，因此，DNA復制需要引物。
（4）原理
雙螺旋的打開：DNA的熱變性原理，即：
（5）反應條件：①一定的緩沖溶液；②DNA模板；③分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物；④四種脫氧核苷酸；⑤耐熱的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶；⑥能嚴格控制溫度變化的溫控設備。
2.細胞內(nèi)DNA復制的基本條件
參與的組分 在DNA復制中的作用
解旋酶 打開DNA雙鏈
DNA母鏈 提供DNA復制的模板
4種脫氧核苷酸 合成子鏈的原料
DNA聚合酶 催化合成DNA子鏈
引物 使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸
二、PCR的反應過程
（1）過程
①變性：當溫度上升到90℃以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈。
②復性：溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。
③延伸：當溫度上升到72℃左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。
（2）結果
①PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)都包括變性、復性、延伸三步。
②兩個引物之間的固定長度的DNA序列呈指數(shù)擴增。
三、PCR的實驗操作
1.實驗用具
（1）PCR儀：該儀器能自動調(diào)控溫度，實現(xiàn)DNA的擴增。如果沒有PCR儀，可用3個恒溫水浴鍋代替，操作時按程序在3個水浴鍋中來回轉移PCR反應的微量離心管。
（2）微量離心管：總容積為0.5mL，實際上是進行PCR反應的場所。
（3）微量移液器：用于向微量離心管中轉移PCR配方中的液體。
2.實驗步驟
3.注意事項
（1）為避免外源DNA等因素的污染，實驗中使用的一些用具在使用前必須進行高壓滅菌。
（2）所用的緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存。
（3）在微量離心管中添加反應成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭必須更換。
4.DNA含量的測定
DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA含量有關?？梢岳肈NA的這一特點進行DNA含量的測定，具體方法如下：
例題練習
PCR一般要經(jīng)過三十多次循環(huán)，從第二次循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應，下列相關敘述正確的是( )
A.由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈作模板時，仍與引物Ⅰ結合進行DNA子鏈的延伸
B.由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈作模板時，無需與引物結合，直接在酶的作用下從頭合成子鏈
C.若只有1個DNA片段作為模板，經(jīng)過5次循環(huán)，會得到32個DNA分子
D.若只有1個DNA片段作為模板，經(jīng)過2次循環(huán)，含引物Ⅰ的DNA單鏈占DNA總鏈數(shù)的1/4
答案：C
解析：當由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈作模板時，此單鏈引物固定端為5'端，因此與它互補的子鏈應從另一端開始合成，即與引物Ⅱ結合延伸DNA子鏈，A、B錯誤；若只有1個DNA片段作為模板，經(jīng)過5次循環(huán)，DNA復制了5次，可以得到的DNA分子數(shù)是25=32(個)，C正確；若只有1個DNA片段作為模板，經(jīng)過2次循環(huán)，會形成4個DNA片段，8條單鏈，其中含有原始模板鏈(不含引物)2條，另外6條單鏈中含有引物Ⅰ的有3條單鏈，含有引物Ⅱ的有3條單鏈，即含有引物Ⅰ的DNA單鏈占DNA總鏈數(shù)的3/8，D錯誤。
典例3
在蛋白質的提取和分離中，關于對樣品處理過程中，分析無誤的是( )
A.洗滌紅細胞的目的是去除血漿中的葡萄糖、無機鹽
B.洗滌時離心速度過低，時間過短，白細胞等會沉淀，達不到分離的效果
C.洗滌過程選用0.1%的生理鹽水
D.透析的目的是去除樣品中相對分子質量較小的雜質
答案：D
解析：洗滌紅細胞的目的是去除雜蛋白，以利于后續(xù)步驟的分離純化；分離時要采用低速短時間離心，以達到分離的效果；洗滌過程選用0.9%的生理鹽水。
考點鏈接
血紅蛋白的提取和分離
一、蛋白質分離的原理和方法
1.蛋白質的分離依據(jù)
根據(jù)蛋白質各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質和多少、溶解度、吸附性質和對其他分子的親和力等，可以用來分離不同種類的蛋白質。
2.凝膠色譜法
（1）凝膠：實際上是一些微小的多孔球體，大多數(shù)是由多糖類化合物構成的，如葡聚糖、瓊脂糖。
（2）原理：凝膠小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，相對分子質量較大的蛋白質分子不能進入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過的路程較短，移動速度較快；相對分子質量較小的蛋白質分子比較容易進入凝膠內(nèi)部的通道，通過的路程較長，移動速度較慢，因此可將各種相對分子質量不同的蛋白質分離。
（3）分離過程：蛋白質混合物上柱→洗脫→大分子蛋白質移動快、小分子蛋白質移動慢→收集大分子蛋白質→收集小分子蛋白質
3.緩沖溶液
（1）作用：在一定范圍內(nèi)，抑制外界的酸和堿對溶液pH的影響，維持pH基本不變。
（2）配制：由1～2種緩沖劑溶解于水中配制而成，通過調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以得到不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。
4.電泳
（1）概念：指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。
（2）原理：
①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團會帶上正電或負電。
②在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。
③電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。
④方法：常用的電泳方法有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。
二、血紅蛋白提取和分離的實驗操作
1.樣品處理
（1）紅細胞的洗滌
①目的：去除雜蛋白，以利于后續(xù)步驟的分離純化。
②過程：
（2）血紅蛋白的釋放
①目的：使紅細胞破裂釋放血紅蛋白。
②過程：
a.將洗滌好的紅細胞倒入燒杯中。
b.加蒸餾水到原血液的體積，其作用是使紅細胞吸水漲破。
c.加入40%體積的甲苯，其作用是溶解細胞膜。
d.置于磁力攪拌器上充分攪拌10 min，其作用是加速紅細胞破裂。
e.紅細胞破裂，釋放出血紅蛋白。
（3）分離血紅蛋白溶液
2.粗分離——透析
（1）目的：除去樣品中相對分子質量較小的雜質。
（2）過程：取1 mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300 mL物質的量濃度為20 mmol/L的磷酸緩沖液（pH為7.0）的燒杯中，透析12 h。
3.純化——凝膠色譜操作
（1）凝膠色譜柱的制作
①取長40 cm，內(nèi)徑為1.6 cm的玻璃管，兩端用砂紙磨平。
②柱底制作：打孔→挖凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好。
③柱頂制作：打孔→安裝玻璃管。
④組裝：將上述三者按相應位置組裝，并在下端出口連接帶開關的尼龍管，尼龍管放入收集器。
（2）凝膠色譜柱的裝填
（3）樣品的加入和洗脫
4.純度鑒定
在鑒定的方法中，使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。
例題練習
蛋白質的分離與純化技術是蛋白質研究的重要技術。下列有關敘述不正確的是( )
A.根據(jù)蛋白質分子不能透過半透膜的特性，可通過透析將樣品中各種不同的蛋白質分離
B.根據(jù)蛋白質所帶電荷性質的差異及分子大小的不同等，可通過電泳分離蛋白質
C.根據(jù)蛋白質相對分子質量的大小，可通過凝膠色譜法分離蛋白質
D.根據(jù)蛋白質的分子大小、密度不同，可通過離心沉降法分離蛋白質
答案：A
解析：蛋白質分子不能透過半透膜，而溶液中的小分子物質可以透過半透膜，因此透析可以將蛋白質和溶液中的小分子物質分離，故A錯誤。
【要點突破】
一、DNA提取與鑒定的原理和方法
基本原理 方法 目的
DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同 溶于NaCl溶液中并稀釋 ①NaCl溶液為2mol/L時，DNA溶解，而部分蛋白質發(fā)生鹽析生成沉淀，通過過濾可除去部分蛋白質及不溶于NaCl溶液的雜質；②當NaCl溶液稀釋至0.14mol/L時，DNA析出，過濾可除去溶于NaCl溶液的部分蛋白質和其他雜質
DNA不被蛋白酶所水解 加入嫩肉粉 嫩肉粉中含木瓜蛋白酶，分解蛋白質
DNA不溶于酒精溶液 加入冷卻酒精（95%） DNA析出，除去溶于酒精的蛋白質
DNA可被二苯胺染成藍色 加入二苯胺，并沸水浴加熱 鑒定DNA
二、DNA粗提取與鑒定實驗中四個關鍵操作的目的
1.兩次加入蒸餾水
次數(shù) 目的
第一次 使雞血細胞吸水漲破
第二次 稀釋NaCl溶液，使DNA逐漸析出
2.三次加NaCl溶液
次數(shù) 目的
第一次 溶解DNA，析出蛋白質等雜質
第二次 使DNA再溶解，為了獲得含雜質較少的DNA
第三次 溶解DNA，以便DNA與二苯胺反應
3.三次過濾
次數(shù) 目的
第一次 單層 除去細胞破碎后的細胞膜、核膜、糖類、蛋白質等，獲得含核物質的濾液
第二次 兩層 除去不溶于2mol/LNaCl溶液中的蛋白質等雜質，獲得含DNA的濾液
第三次 多層 除去溶于0.14mol/LNaCl溶液中的雜質，獲得含DNA的絲狀物
4.六次攪拌
次數(shù) 實驗操作 目的
第一次 攪拌加蒸餾水的雞血細胞液 加速細胞破裂
第二次 攪拌含DNA的高濃度鹽溶液 加速DNA的溶解
第三次 攪拌加蒸餾水的NaCl溶液 析出DNA
第四次 攪拌含DNA的高濃度鹽溶液 加速DNA的溶解
第五次 攪拌含DNA的酒精溶液 提取含雜質較少的DNA
第六次 攪拌含DNA的白色絲狀物的鹽溶液 加速DNA的溶解
三、PCR擴增與DNA復制的異同
項目 DNA復制 PCR擴增
不同點 時期 有絲分裂間期或減Ⅰ前的間期 任何時期
場所 活細胞內(nèi) 細胞外
酶 解旋酶、DNA聚合酶 耐高溫的TaqDNA聚合酶
引物 有轉錄，產(chǎn)生RNA作引物，無需人工加入 無轉錄，無引物產(chǎn)生，需人工加入兩種DNA引物
特點 邊解旋邊復制 先全部解旋后開始復制
緩沖液 不需緩沖液 配制緩沖液代替細胞核液
設備 無 控制溫度變化的溫控設備
相同點 原理 嚴格遵循堿基互補配對原則
引物 都需要分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物
模板 DNA的兩條鏈為模板
特點 半保留復制
原料 游離的四種脫氧核苷酸
易錯辨析
與PCR原理有關的三個易錯點
（1）酶的作用位點：解旋酶的作用是使DNA兩條鏈之間的氫鍵斷開；DNA聚合酶與DNA連接酶的作用都是催化形成磷酸二酯鍵。不要誤認為解旋酶也作用于磷酸二酯鍵。
（2）DNA聚合酶和DNA連接酶：DNA聚合酶是將單個核苷酸連接到已有的單鏈片段的3′端上，需要模板；而DNA連接酶連接的是兩條DNA片段的缺口，不需要模板。
（3）PCR中的解旋過程：PCR過程中不需要解旋酶，需要升高溫度才能打開氫鍵，但此時的溫度不會破壞磷酸二酯鍵，因此，DNA加熱變性后變?yōu)閱捂湥⑽捶纸獬蓡误w。
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