資源簡介

現代生物科技專題
基因工程的工具及程序
【考點梳理】
典例1
圖1表示某種DNA分子上的多種限制酶切割位點，圖2表示EcoRⅠ、BamHⅠ、Sau3AⅠ三種限制酶識別序列和切割位點，下列相關敘述錯誤的是( )
A.獲取該目的基因可采用EcoRⅠ和BamHⅠ進行酶切
B.限制酶能使特定堿基序列的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開
C.Sau3AⅠ和BamHⅠ酶切該DNA分子，產生不同的黏性末端
D.能被Sau3AⅠ切割的序列不一定能被BamHⅠ切割
答案：C
解析：EcoRⅠ和BamHⅠ的酶切位點位于目的基因的兩側，EcoRⅠ和BamHⅠ的識別序列不同，用EcoRⅠ和BamHⅠ切割目的基因，產生的末端不同，可防止構建基因表達載體時目的基因自連，A正確；限制酶能使特定堿基序列的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，B正確；Sau3AⅠ和BamHⅠ識別的堿基序列不同，但Sau3AⅠ和BamHⅠ酶切目的基因，產生的黏性末端相同，C錯誤；Sau3AⅠ識別的序列BamHⅠ酶不一定能識別，所以能被Sau3AⅠ切割的序列不一定能被BamHⅠ切割，D正確。
考點鏈接
基因工程的原理與工具
一、基因工程的概念
（1）基因工程的概念：基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴格的設計，并通過體外DNA重組和轉基因等技術，賦予生物以新的遺傳特性，從而創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。
（2）對基因工程概念的深度理解
別名 基因拼接技術或DNA重組技術
操作環境 生物體外
操作對象 基因
操作水平 DNA分子水平
基本過程 剪切→拼接→導入→表達
目的 定向改造生物的遺傳性狀
二、基因工程的原理
基因工程的基本原理是讓人們感興趣的基因（目的基因）在宿主細胞中穩定和高效地表達。
具體地說，基因工程就是在DNA分子水平上對基因進行操作的復雜技術，是將外源基因通過體外重組后導入受體細胞，使這個基因能在受體細胞內復制、轉錄、翻譯表達的操作。
三、基因工程的誕生和發展
（1）基礎理論的突破：DNA是遺傳物質的證明；DNA雙螺旋結構和中心法則的確立；遺傳密碼的破譯。
（2）技術的發明：基因轉移載體和工具酶的相繼發現；DNA合成和測序技術的發明；DNA體外重組的實現及重組DNA表達實驗的成功；第一例轉基因動物的問世及PCR技術的發明。
四、DNA重組技術的基本工具
1.限制性核酸內切酶（又稱限制酶）——“分子手術刀”
（1）來源：主要來自原核生物。
（2）功能：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。
（3）結果：產生黏性末端或平末端。
（4）應用：已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ識別的堿基序列和酶切位點分別為G↓AATTC和CCC↓GGG，在圖中寫出兩種限制酶切割DNA后產生的末端并寫出末端的種類。
EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶識別的堿基序列不同，切割位點不同（填“相同”或“不同”），說明限制酶具有專一性。
2.DNA連接酶——“分子縫合針”
（1）作用：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。
（2）種類
種類 E·coli DNA連接酶 T4DNA連接酶
來源 大腸桿菌 T4噬菌體
特點 縫合黏性末端 縫合黏性末端和平末端
作用 縫合雙鏈DNA片段，恢復兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵
3.基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”
（1）種類
①質粒：常存在于原核細胞和酵母菌中，是一種分子質量較小的、環狀的、裸露的DNA分子，獨立于擬核之外。
②λ噬菌體的衍生物和動植物病毒等。
（2）目的
①將目的基因轉運到宿主細胞中去。
②在受體細胞內對目的基因進行大量復制。
（3）必備條件
①在宿主細胞中保存下來并大量復制。
②有多個限制酶切割位點。
③有一定的標記基因，便于篩選。
④對受體細胞無害。
（4）重組DNA分子的模擬操作
①材料用具：剪刀代表EcoRⅠ，透明膠條代表DNA連接酶。
②切割位點：
分別從兩塊硬紙板上的一條DNA鏈上找出—GAATTC—序列，并選G—A之間作切口進行“切割”；再從另一條鏈上互補的堿基之間尋找EcoR Ⅰ相應的切口剪開。
③操作結果：若操作正確，不同顏色的黏性末端應能互補配對；否則，說明操作有誤。
例題練習
1.下列有關限制酶和DNA連接酶的敘述正確的是( )
A.用限制酶剪切獲得一個目的基因時得到兩個切口，有2個磷酸二酯鍵被斷開
B.序列和被限制酶切出的黏性末端堿基數不同
C.限制酶識別序列越短，則該序列在DNA中出現的概率就越大
D.T4DNA連接酶和E.coliDNA連接酶都能催化平末端和黏性末端的連接
答案：C
解析：用限制酶剪切獲得一個目的基因時得到兩個切口，有4個磷酸二酯鍵被水解，A錯誤；和序列被限制酶切出的黏性末端堿基數相同，都是4個，B錯誤；限制性內切核酸酶識別序列越短，則該序列在DNA中出現的概率就越大，C正確；T4DNA連接酶和E.coliDNA連接酶都能催化黏性末端的連接，其中T4DNA連接酶可以連接平末端，D錯誤。
2.用XhoⅠ和SalⅠ兩種限制性核酸內切酶分別處理同一DNA片段，酶切位點及酶切產物分離結果如圖。以下敘述不正確的是( )
A.圖1中兩種酶識別的核苷酸序列不同
B.圖2中酶切產物可用于構建重組DNA
C.泳道①中是用SalⅠ處理得到的酶切產物
D.圖中被酶切的DNA片段是單鏈DNA
答案：D
解析：本題結合電泳圖譜考查基因工程中限制酶的相關知識，包括限制酶的作用特點、功能、作用對象等。不同的限制酶識別序列不同，A項正確；限制酶切割的產物可用于構建重組DNA，B項正確；泳道①顯示四個條帶，是SalⅠ處理后的酶切產物的電泳結果，泳道②顯示三個條帶，是XhoⅠ處理后的酶切產物的電泳結果，C項正確；限制酶的作用特點是識別特定DNA序列，并在DNA兩條鏈特定部位切割產生黏性末端或平末端，D項錯誤。
典例2
關于目的基因獲取過程的敘述中，不正確的是( )
A.人工合成法可合成未知序列的任意大小的DNA片段
B.真核與原核生物的目的基因均可從基因文庫中提取
C.原核生物的目的基因一般不從cDNA文庫中提取
D.若可設計出特定引物，PCR方法也可獲取目的基因
答案：A
解析：當基因比較小，核苷酸序列又已知的情況下，適合用人工合成法合成，A錯誤；真核生物和原核生物的基因都可 以從基因文庫中提取，B正確；原核生物的基因不含內含子，因此不需從cDNA文庫中獲取，C正確；在目的基因的核苷酸序列已知的情況下，可以根據目的基因的核苷酸序列合成特定的引物，進而用PCR技術獲取目的基因，D正確。
考點鏈接
目的基因的獲取
一、目的基因
1.主要是指編碼蛋白質的基因。
2.一些具有調控作用的因子。
二、獲取方法
1.從基因文庫中獲取
（1）基因組文庫：含有一種生物所有的基因。
（2）部分基因文庫：含有一種生物的一部分基因，如cDNA文庫。
2.利用PCR技術擴增目的基因
（1）含義：是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術。
（2）原理：DNA雙鏈復制。
（3）條件：引物、DNA模板、Taq酶、四種脫氧核苷酸。
（4）過程。
①目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈（90～95 ℃）。
②引物與單鏈相應互補序列結合（55～60 ℃）。
③在DNA聚合酶作用下進行延伸（70～75 ℃）。
④重復循環多次。
（5）特點：指數形式擴增。
3.人工合成法
（1）條件：基因比較小，核苷酸序列已知。
（2）方法：通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成。
例題練習
1.如圖表示基因工程中目的基因的獲取示意圖，不正確的是( )
A.③表示PCR技術，用來擴增目的基因
B.某生物的不同器官和組織構建的cDNA文庫不同
C.利用限制酶從基因組文庫中獲取目的基因
D.若基因比較小，序列又已知，則可以直接通過化學方法合成
答案：C
解析：③表示利用DNA或cDNA中的目的基因進行PCR，擴增目的基因；cDNA由mRNA反轉錄形成，由于基因的選擇性表達，不同細胞中mRNA不同，所以cDNA文庫不同；從基因組文庫中獲取目的基因，需要限制酶和DNA連接酶；如果基因比較小，核苷酸序列又已知，可用DNA合成儀通過化學方法直接人工合成。
2.下列有關目的基因篩選與獲取的敘述錯誤的是( )
A.目的基因就是編碼蛋白質的基因
B.篩選和獲取目的基因是基因工程的第一步
C.來自蘇云金桿菌的Bt基因可作為轉基因抗蟲棉的目的基因
D.從相關的已知結構和功能清晰的基因中進行篩選是獲取目的基因較為有效的方法之一
答案：A
解析：目的基因主要指編碼蛋白質的基因，但不是全部，A錯誤；目的基因的篩選與獲取是基因工程的第一步，B正確；來自蘇云金桿菌的Bt基因可作為轉基因抗蟲棉的目的基因，C正確；從相關的已知結構和功能清晰的基因中進行篩選是獲取目的基因較為有效的方法之一，D正確。
典例3
在基因表達載體的構建中，下列說法不正確的是( )
①一個基因表達載體的組成只包括目的基因、啟動子、終止子
②有了啟動子才能驅動基因轉錄出mRNA
③終止子的作用是使轉錄在所需要的地方停止
④所有基因表達載體的構建是完全相同的
⑤必須在細胞內進行
A.②③⑤ B.①④⑤ C.①②⑤ D.③④
答案：B
解析：基因表達載體的構建是基因工程的核心，一個表達載體的組成，除了目的基因外，還必須有啟動子、終止子和標記基因等，①錯誤；啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，②正確；終止子控制著轉錄的結束，③正確；由于受體細胞有植物、動物和微生物之分，以及目的基因導入受體細胞的方法不同，因此基因表達載體的構建是不完全相同的，④錯誤；基因表達載體的構建必須在細胞外進行，⑤錯誤。綜上，②③正確，①④⑤錯誤，故選B。
考點鏈接
基因表達載體的構建與轉化
一、基因表達載體的構建
1.構建基因表達載體的目的
（1）使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代。
（2）使目的基因能夠表達和發揮作用。
2.基因表達載體的組成
兩子啟動和終止；目的基因在中間；標記基因來篩選。
3.基因表達載體的功能
（1）使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代。
（2）使目的基因表達和發揮作用。
二、將目的基因導入受體細胞
1.轉化含義：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。
2.轉化方法
（1）導入植物細胞
①農桿菌轉化法：將目的基因導入雙子葉植物和裸子植物。
②基因槍法：將目的基因導入單子葉植物常用的方法。
③花粉管通道法：我國科學家獨創的一種方法。
（2）導入動物細胞
①常用方法：顯微注射技術。
②常用受體細胞：受精卵。
（3）導入微生物細胞
①方法
a.用Ca2＋處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態（這種細胞稱為感受態細胞）。
b.感受態細胞吸收重組表達載體DNA分子。
②受體細胞：原核細胞（使用最廣泛的是大腸桿菌）。
③原核生物的特點：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對較少等。
例題練習
1.如圖為基因表達載體的模式圖，下列有關說法錯誤的是( )
A.構建基因表達載體需要用到限制酶和DNA連接酶
B.任何基因表達載體的構建都是一樣的，沒有差別
C.圖中啟動子位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結合的部位
D.抗生素抗性基因的作用是作為標記基因，用于鑒別受體細胞中是否導入了目的基因
答案：B
解析：A正確，構建基因表達載體需要用到限制酶和DNA連接酶。B錯誤，用不同種類的載體構建基因表達載體時處理方法是有差別的。C正確，啟動子位于基因的上游，是RNA聚合酶識別和結合的部位。D正確，抗生素抗性基因的作用是作為標記基因，用于檢測受體細胞中是否導入了目的基因。
2.將Bt毒蛋白基因轉入棉花植株體內，可增強其對棉鈴蟲的抗性。下列敘述錯誤的是( )
A.可從蘇云金芽孢桿菌的基因文庫中獲取Bt毒蛋白基因
B.將Bt毒蛋白基因插入Ti質粒的T-DNA上構建表達載體
C.將Bt毒蛋白基因導入經Ca2+處理過的棉花植株受體細胞
D.可用抗蟲接種實驗檢測轉基因棉花對棉鈴蟲的抗性程度
答案：C
解析：獲取目的基因的方法有多種，例如利用PCR技術擴增目的基因、人工合成目的基因等，也可以從蘇云金芽孢桿菌的基因文庫中獲取Bt毒蛋白基因，A正確；因為農桿菌的Ti質粒的T-DNA可以轉移至被侵染的細胞并整合到該細胞染色體DNA上，所以要將Bt毒蛋白基因插入Ti質粒的T-DNA上構建表達載體，B正確；應將含Bt毒蛋白基因的Ti質粒導入經Ca2+處理過的農桿菌細胞，C錯誤；用抗蟲接種實驗檢測轉基因棉花對棉鈴蟲的抗性程度屬于個體生物學水平鑒定，D正確。
典例4
棉花產業在我國國民經濟發展中占有舉足輕重的地位，為了抵抗蟲害，我國育成了擁有自主知識產權的轉基因抗蟲棉，使棉田生態環境得到改善。在判斷抗蟲基因是否成功轉入棉花基因組的方法中，不屬于分子檢測的是( )
A.觀察害蟲吃棉葉是否死亡
B.檢測目的基因片段能否與DNA探針形成雜交帶
C.檢測目的基因轉錄形成的mRNA能否與DNA探針形成雜交帶
D.檢測目的基因表達產物蛋白質能否與特定抗體形成雜交帶
答案：A
解析：檢測轉基因生物的DNA上是否插入了目的基因，方法是DNA分子雜交技術，即將轉基因生物的基因組DNA與DNA探針雜交，檢測是否出現雜交帶；檢測目的基因是否轉錄出了mRNA，方法是分子雜交技術，即從轉基因生物中提取的mRNA與DNA探針雜交，檢測是否出現雜交帶；檢測目的基因是否翻譯成蛋白質，方法是抗原—抗體雜交技術，即從轉基因生物中提取蛋白質與相應的抗體進行雜交，檢測是否出現雜交帶。除了上述分子檢測外，有時還需要進行個體生物學水平的鑒定。例如，檢測抗蟲或抗病基因導入植物細胞后，是否賦予了植物抗蟲或抗病特性，需要做抗蟲或抗病的接種實驗，所以通過觀察害蟲吃棉葉是否死亡屬于個體生物學水平的鑒定，而不是分子檢測，A符合題意。
考點鏈接
目的基因的檢測與鑒定
一、分子水平檢測
1.檢測轉基因生物DNA上是否插入了目的基因。
方法：DNA分子雜交技術。
2.檢測目的基因是否轉錄出mRNA。
方法：分子雜交技術。
3.檢測目的基因是否翻譯成蛋白質。
方法：抗原—抗體雜交技術。
二、個體水平鑒定
包括抗蟲、抗病的接種實驗，以確定是否有抗性及抗性程度。基因工程產品需要與天然產品活性進行比較等。
例題練習
1.下列哪一種方法不能用于檢測目的基因是否成功導入或表達( )
A.在顯微鏡下直接觀察受體細胞中是否含有目的基因
B.利用相應的DNA探針與受體細胞DNA分子進行雜交
C.提取受體細胞合成的相應蛋白質，利用抗原—抗體特異性反應進行檢測
D.抗蟲基因導入植物細胞后，檢測植物是否具有抗蟲特性
答案：A
解析：檢測目的基因是否成功導入或表達的方法有多種：①分子水平上的檢測：檢測轉基因生物的DNA上是否插入了目的基因用DNA分子雜交技術；檢測目的基因是否轉錄出mRNA用mRNA—DNA分子雜交技術；檢測目的基因是否翻譯成蛋白質用抗原一抗體雜交技術。②個體生物學水平的鑒定；檢測是否具有抗性及抗性程度；檢測基因工程產品與天然產品的活性是否相同。在顯微鏡下無法觀察到受體細胞中是否含有目的基因，故選A。
2.我國科學家利用Bt毒蛋白基因培育出轉基因抗蟲棉。可以用做檢測目的基因的探針的是( )
A.用放射性同位素等標記的含有Bt毒蛋白基因的DNA片段
B.Bt毒蛋白的特異性抗體
C.用放射性同位素等標記的Bt毒蛋白的特異性抗體
D.含有Bt毒蛋白基因的DNA片段
答案：A
解析：探針是用放射性同位素等標記的含有目的基因的DNA片段。我國科學家利用Bt毒蛋白基因培育出轉基因抗蟲棉，檢測目的基因的探針是標記的含有Bt毒蛋白基因的DNA片段，A正確，B、C、D錯誤。
【要點突破】
一、DNA連接酶與限制性核酸內切酶的比較
1.區別
作用 應用
限制性核酸內切酶 使特定部位的磷酸二酯鍵斷裂 用于提取目的基因和切割載體
DNA 連接酶 在DNA片段之間重新形成磷酸二酯鍵 用于目的基因和載體的連接
2.聯系
二、DNA連接酶與DNA聚合酶的比較
DNA連接酶 DNA聚合酶
相同點 催化兩個脫氧核苷酸之間形成磷酸二酯鍵
不同點 模板 不需要模板 需要DNA的一條鏈為模板
作用對象 游離的DNA片段 單個的脫氧核苷酸
作用結果 形成完整的DNA分子 形成DNA的一條鏈
用途 基因工程 DNA復制
三、載體上標記基因的標記原理
載體上的標記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉入的受體細胞沒有抵抗相關抗生素的能力。當含有抗生素抗性基因的載體進入受體細胞后，抗性基因在受體細胞內表達，使受體細胞能夠抵抗相應抗生素，所以在受體細胞的培養體系中加入該種抗生素就可以只保留轉入載體的受體細胞，原理如圖所示：
四、目的基因獲取方法的選擇
（1）如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通過構建基因文庫的方法，即通過用受體菌儲存并擴增目的基因后，從基因文庫中去獲取目的基因。
（2）如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比較小，可以通過DNA合成儀利用化學方法人工合成。
（3）如果只知道擴增目的基因的兩端的核苷酸序列，而且基因又比較大，則可以通過PCR技術擴增目的基因。
五、目的基因獲取過程的比較
（1）基因組文庫：
供體生物→全部DNA→DNA片段→受體菌群→目的基因
（2）cDNA文庫：
供體生物→mRNA→cDNA→受體菌群→目的基因
（3）PCR技術：
目的基因→大量目的基因
（4）人工合成：
蛋白質的氨基酸序列→mRNA核苷酸序列→DNA核苷酸序列→目的基因
六、PCR技術與DNA復制的比較
比較項目 DNA復制 PCR技術
區 別 解旋方式 解旋酶催化 DNA在高溫下變性解旋
場所 細胞內（主要在細胞核內） 細胞外（主要在PCR擴增儀中）
酶 解旋酶、DNA聚合酶 耐熱的DNA聚合酶
溫度 細胞內溫和條件 控制溫度，需55 ℃～95 ℃高溫
結果 合成DNA分子 合成DNA片段或基因
聯系 （1）模板：均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板 （2）原料：均為四種脫氧核苷酸 （3）酶：均需DNA聚合酶 （4）引物：都需要引物，使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸
七、將目的基因導入受體細胞的方法比較
生物類型 植物 動物 微生物
受體細胞 體細胞 受精卵 原核細胞
常用方法 農桿菌轉化法、基因槍法、花粉管通道法 顯微注射技術 感受態細胞法
轉化過程 目的基因插入Ti質粒的T-DNA上→導入植物細胞→整合到受體細胞的DNA中→表達 目的基因表達載體提純→取卵（受精卵）→顯微注射→受精卵發育→獲得具有新性狀的動物 Ca2＋處理細胞→感受態細胞→表達載體與感受態細胞混合→感受態細胞吸收DNA分子
八、農桿菌轉化法中的兩次拼接和兩次導入
第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的TDNA上；第二次拼接（非人工操作）是指插入目的基因的TDNA被拼接到受體細胞的染色體DNA上。第一次導入是將含目的基因的Ti質粒導入農桿菌；第二次導入（非人工操作）是指含目的基因的TDNA導入受體細胞。
九、目的基因的檢測與鑒定在不同方面的比較
類型 步驟 檢測內容 方法 結果顯示
分子檢測 導入檢測 目的基因是否導入受體細胞 DNA分子雜交技術（DNA和DNA之間） 是否成功顯示出雜交帶
表達檢測 目的基因是否轉錄出mRNA 核酸分子雜交技術（DNA和mRNA之間） 是否成功顯示出雜交帶
目的基因是否翻譯出蛋白質 蛋白質分子雜交（抗原和抗體之間） 是否成功顯示出雜交帶
個體生物學水平的鑒定 ①確定是否具有抗性及抗性程度 ②基因工程產品與天然產品的活性是否相同 ①抗蟲或抗病的接種實驗 ②基因工程產品與天然產品活性的比較 是否賦予了預期抗性或蛋白質活性
十、常見不同轉基因生物在個體水平上鑒定、檢測的方法
個體水平的鑒定實際上是檢測目的基因是否表達出所控制的性狀，不同的轉基因生物檢測方法不同。
轉基因生物 檢測方法 觀察目標
抗蟲植物 害蟲吞食 害蟲死亡
抗病毒（菌）植物 病毒（菌）感染 未侵染上病斑
抗鹽植物 鹽水澆灌 正常生長
抗除草劑植物 噴灑除草劑 正常生長
獲取目的基因產物的轉基因生物 提取細胞產物與天然產品進行功能活性比較 細胞產物功能活性正常
易錯辨析
1.病毒在生物學中的應用舉例：①基因工程中作載體，②動物細胞工程中作誘融合劑③在免疫學上可作疫苗用于免疫預防。
2.標記基因（通常選抗性基因）的作用是：用于檢測重組質粒是否被導入受體細胞（不含抗性）洏而選擇性培養基（加抗生素的培養基）的作用是：篩選是否導入目的基因的受體細胞。抗生素針對的不是目的基因，而是淘汰不具有抗性的沒有導入目的基因的受體細胞。
3.動物細胞融合技術的最重要用途是制備單克隆抗體，而不是培養出動物
4.基因工程中導入的目的基因通常考慮整合到核DNA中，形成的生物可看作雜合子（Aa）產生配子時，可能含有目的基因，后代會發生性狀分離。
5.重組質粒即基因表達載體的構建）在細胞外形成，而不是在細胞內。
6.質粒不是細菌的細胞器而是某些基因的載體，質粒存在于細菌細胞內的小型環狀DNA。擬核是大型環狀DNA
7.啟動子、終止子是基因的結構，在構建基因表達載體時目的基因插入兩者之間；而起始密碼、終止密碼在mRNA上。

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