資源簡介

蘇教生物一輪復習解惑練
4　PCR技術拓展應用
應用1：反向PCR測定未知DNA區域
當DNA的某些序列已知，而需要擴增已知序列兩端的未知序列時，可采用反向PCR技術。原理：用限制性內切核酸酶切割該DNA，隨后使用DNA連接酶將獲得的酶切產物環化，這樣就獲得了已知序列兩側攜帶有未知序列的環狀DNA分子。以該已知序列為模板設計一對相反方向的特異性引物，該引物對已知序列反向，但對未知序列卻是相向的，從而得以擴增出未知序列。
應用2：PCR定點突變技術
該技術要使用四條引物。其中引物2和3的突起處代表與模板鏈不能互補的突變位點，而這兩條引物有部分堿基(包括突變位點)是可以互補的。因此，分別利用引物1和2，引物3和4進行PCR后，得到的DNA片段可以通過引物2和3互補的堿基雜交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成為一條完整的DNA片段。最后，用引物1和4進行擴增得到含有突變位點的DNA片段。通過測序可以檢驗定點突變是否成功。
應用3：(實時)熒光定量PCR(RT－PCR)
先從樣本中提取RNA，RNA中可能有新冠病毒的RNA，同時也存在很多采樣患者的組織和存在于采樣部位的微生物的RNA。通過逆轉錄酶將樣本的RNA逆轉錄為cDNA，并進行PCR擴增， 在PCR反應體系中，包含一對特異性引物以及一個Taqman探針，該探針為一段特異性寡核苷酸序列，兩端分別標記了報告熒光基團和淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；若反應體系存在靶序列，PCR反應時探針與模板結合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性將探針降解，報告基團與淬滅基團分離，發出熒光。每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子產生。熒光定量PCR儀能夠監測出熒光到達預先設定閾值的循環數(Ct值)與病毒核酸濃度有關，病毒核酸濃度越高，Ct值越小(如圖)。
跟蹤訓練
1．如圖所示，在一段未知序列的突變體DNA片段中，插入了已知序列的 T－DNA，要想對 T－DNA 兩側的未知序列進行測序，下列做法正確的是(　　)
A．用引物①和引物④直接進行 PCR 擴增之后再測序
B．用引物②和引物③直接進行 PCR 擴增之后再測序
C．用 DNA 連接酶連接成環狀后，再用引物①④PCR 擴增后測序
D．用 DNA 連接酶連接成環狀后，再用引物②③PCR 擴增后測序
答案　C
解析　直接選用引物①、④組合進行PCR，引物選擇方向相反，無法完成擴增，A錯誤；用引物②和引物③可實現對已知的T－DNA序列進行擴增，但達不到預期目的，B、D錯誤；用 DNA 連接酶連接成環狀后，用引物①④PCR 擴增后測序，恰好可擴增出T－DNA兩側的未知序列，C正確。
2．重疊延伸PCR技術是采用具有互補末端的引物，使PCR產物形成重疊鏈，從而在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸，獲得想要的目的基因。某科研團隊運用重疊延伸PCR技術在水蛭素基因的特定位點引入特定突變，以實現基因的定點突變，原理如圖。下列說法錯誤的是(　　)
A．過程②需要含Mg2＋的緩沖液、DNA模板、引物、4種脫氧核苷三磷酸、熱穩定的DNA聚合酶等
B．若引物1、引物2組成的反應系統和引物3、引物4組成的反應系統中均進行一次DNA分子的復制后，一共會產生2種DNA分子
C．經過程④獲得的雜交DNA有2種，其中只有一種可以經過程⑤獲得目的基因
D．過程⑤使用熱穩定的DNA聚合酶延伸，不需要引物
答案　B
解析　過程②為PCR反應，需要在添加了Mg2＋的緩沖液中才能進行，需要提供模板DNA、分別與兩條模板鏈結合的引物、4種脫氧核苷三磷酸和熱穩定的DNA聚合酶等，A正確；兩個反應系統中各自形成兩種DNA分子，但由于引物1和引物4形成兩個與原DNA相同的DNA分子，所以含有引物1和4的DNA屬于同一種DNA，故總共形成3種DNA分子，B錯誤；過程④獲得的雜交DNA有2種，一種3′端為單鏈，一種5′端為單鏈，5′端為單鏈的雜交DNA為所需DNA，C正確；過程⑤是延伸過程，該過程使用熱穩定的DNA聚合酶進行催化，不需要引物，D正確。
3．(2023·江蘇泗洪縣高三檢測)基因定點突變是指按照特定的要求，使基因的特定序列發生插入、刪除、置換、重排等變異。下圖甲是一種PCR介導的基因定點突變示意圖，圖乙是研究人員利用基因M1構建基因表達載體的過程。請回答下列問題：
(1)進行基因定點突變的PCR反應體系中，除加入引物和模板DNA外，一般還需要加入______________________________；圖甲所示的基因定點突變技術需要________次PCR；獲得產物A需要的引物是____________。
(2)研究人員對PCR的中間產物A、B進行純化后，利用圖中相關酶對基因M和產物A、B進行充分酶切后得到不同的片段，長度(kb)如下表，則圖中基因敲除片段的長度為____________，基因M1的長度為____________。
項目 基因M A B
長度 3.24、2.8、0.15、0.13 2.8、0.09 3.24、0.05
(3)通過圖甲過程獲得的基因M1仍需要大量擴增，此時選擇的引物是____________，為了與圖乙中的Ti質粒相連，還需要分別在它們的______端引入限制酶__________的識別序列。
(4)構建基因表達載體時，M1基因必需插入到Ti質粒的______________中，原因是
________________________________________________________________________。
答案　(1)Taq酶、dNTP(緩沖液、Mg2＋)等　3′　引物1和引物3　(2)0.23 kb　6.09 kb　(3)引物1和引物2　5　HindⅢ、PstⅠ(順序應與前面的引物對應)　(4)T－DNA　Ti質粒上的T－DNA能夠轉移并整合到受體細胞的染色體上
解析　(1)進行基因定點突變的PCR反應體系中，除加入引物和模板DNA外，一般還需要加入Taq酶、dNTP(緩沖液、Mg2＋)等。從圖甲可以看到，從加入引物到獲得基因M1總共經歷了3次PCR。產物A的兩端互補的引物是引物1和3。(2)基因M上有3個酶切位點(箭頭處)，完全酶切產生4個片段，分別為3.24 kb、2.8 kb、0.15 kb、0.13 kb，共6.32 kb，A片段酶切后產生2個片段，分別為2.8 kb、0.09 kb，B片段酶切后產生2個片段，分別為3.24 kb、0.05 kb，圖中A片段和B片段的“……”是相同的，因此“……”處為0.05 kb，則基因M1的長度為2.8＋0.05＋3.24＝6.09 (kb)，因此基因敲除片段的長度為6.32－6.09＝0.23 (kb)。(3)獲得基因M1后，與M1兩條鏈兩端互補的引物是引物1和引物2。由于質粒上有三個酶切位點，切割后會出現不同的黏性末端，而基因M1兩端沒有能與黏性末端互補的序列，故需要分別在基因兩條鏈的5′端引入限制酶的識別序列，根據基因M1插入質粒的位置可知，添加的是限制酶HindⅢ、PstⅠ的識別序列。
4．“實時熒光定量qPCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在1～2 h內即可得到檢測結果。Taqman探針是實時熒光定量RT—PCR技術中的一種常用探針(如圖1)，其5′端連接熒光基團(R)，3′端連接淬滅劑(Q)。當探針完整時，R發出的熒光信號被Q吸收而不發熒光。在PCR擴增過程中，當Taq酶遇到探針時會使探針水解而釋放出游離的R和Q，R發出的熒光信號被相應儀器檢測到，熒光信號的累積與PCR產物數量完全同步(如圖2)。請據圖回答下列問題：
(1)結合圖1和圖2分析，“熒光RT—PCR技術”所用的試劑盒中通常都應該含有______________酶、______________酶、Taqman探針、引物、dNTP、Mg2＋、緩沖劑等。這種分子層面的熒光RT—PCR檢測具有特異性和靈敏性都很高的特點，主要與試劑盒中的____________、______________有關。
(2)根據Taqman探針功能分析，探針中堿基序列的設計應主要依據_____________________。新冠病毒是冠狀病毒大家庭中新的一員，其堿基序列與引起SARS的冠狀病毒堿基序列有79.5%的相似性，與流感病毒堿基相似度也較高，因此在設計Taqman探針時應篩選出該病毒特有的序列，以避免__________(填“假陰性”或“假陽性”)的出現。
(3)根據圖1和圖2，Taq酶除了能催化DNA子鏈的延伸，還能___________________。
(4)若每分子探針水解釋放的R基團熒光強度為定值a，則反應體系中某時刻熒光信號強度(Rn)主要與______________、______________有關。在檢測過程中，隨著PCR的進行，反應產物不斷累積，“雜交雙鏈”熒光信號的強度也等比例增加，增加了檢測結果的準確性，一般要達到或超過閾值時才確診。可通過熒光強度的變化監測產生量的變化從而得到一條熒光擴增曲線圖(如圖3)。“平臺期”出現的最可能的原因是試劑盒中________________等有限，超出一定的循環數后，熒光標記的“雜交雙鏈”不再增加。
(5)雖然熒光RT—PCR是當前被廣泛認可的檢測手段之一，但是不斷有“假陰性”現象報道，通過上述過程分析，“假陰性”的可能原因有__________(填字母)。
a．通過咽拭子取樣不規范或取樣所獲樣本量不足
b．在樣本運輸、檢測中出現了損壞和污染
c．病毒相應關鍵序列發生了基因突變
答案　(1)逆轉錄　Taq　引物　Taqman探針　(2)新冠病毒RNA內部的一段序列(或新冠病毒RNA逆轉錄形成的DNA的部分序列)　假陽性　(3)催化RNA(Taqman探針)的水解　(4)擴增次數　樣品中病毒初始數量(或病毒樣品模板RNA含量)　原料、引物和探針數量(或Taq DNA聚合酶活性)　(5)abc
解析　(1)圖1和圖2所示新冠檢測的基本原理：將新冠病毒RNA逆轉錄為cDNA，因此熒光PCR法所用的試劑盒中通常都應該含有逆(反)轉錄酶、熱穩定的DNA聚合酶、Taqman探針、引物、dNTP、Mg2＋、緩沖劑等。試劑盒中的引物和Taqman探針決定了這種分子層面的熒光RT—PCR檢測具有特異性和高靈敏性。(3)根據圖1和圖2可知，Taq酶除了能催化DNA子鏈的延伸，還能催化RNA(Taqman探針)的水解，Taqman探針水解釋放出游離R被儀器檢測到。(4)在PCR擴增過程中，Taq酶遇到探針時會使探針水解而釋放出游離的R，因此，擴增次數越多，樣品中病毒初始數量(病毒樣品模板RNA含量)越多，則被水解的探針越多，釋放出游離的R越多，反應體系中某時刻熒光信號強度(Rn)也越強。由圖3可知，隨著PCR的進行，反應產物不斷累積，“雜交雙鏈”熒光信號的強度也等比例增加，超出一定的循環數后，熒光標記的“雜交雙鏈”不再增加，其原因最可能是試劑盒中原料、引物和探針數量(Taq酶活性)等有限。(5)熒光RT—PCR出現“假陰性”可能是通過咽拭子取樣不規范或取樣所獲樣本量不足，使熒光信號強度(Rn)未達到或超過閾值而沒有檢測出；也可能是在樣本運輸、檢測中出現了損壞和污染，導致新冠病毒核酸破壞而無法檢測；還可能是病毒相應關鍵序列發生了基因突變，導致探針失效而無法檢測，因此a、b、c正確。

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