資源簡介

教學設計
課程基本信息
學科 高中生物學 年級 高二 學期 秋季
課題 單克隆抗體的制備
教學目標
1. 了解單克隆抗體制備的操作流程。 2. 掌握常見實驗器材的使用方法和使用規范。
教學內容
教學重點： 1. 單克隆抗體制備的操作流程。
2. 常見實驗器材的使用方法和使用規范。
教學難點： 1. 雜交瘤細胞的篩選與克隆化。
2. 常見實驗器材的使用方法和使用規范。
教學過程
教學流程教學具體實施過程設計意圖一、教學實施背景單克隆抗體可直接用于人類疾病的診斷、預防、治療以及免疫機制的研究，為人類惡性腫瘤的免疫診斷與免疫治療開辟了廣闊前景。 單克隆抗體以其特異性強、純度高、均一性好等優點，在臨床醫學的應用主要表現：①作為醫學診斷試劑，廣泛應用在病原微生物抗原、抗體的檢測；腫瘤抗原的檢測；免疫細胞及其亞群的檢測；激素測定；細胞因子的測定等。②蛋白質的提純。③腫瘤的靶向治療，即將針對某一腫瘤抗原的單克隆抗體與化療藥物或放療物質連接，利用單克隆抗體的導向作用，將藥物或放療物質攜帶至腫瘤細胞，直接殺傷腫瘤細胞。 教材中只呈現單克隆抗體制備的流程圖，簡述單抗制備的優點及應用方向。沒有要求實際操作過程，學生缺少單抗制備的感性認識。通過操作視頻熟悉單克隆抗體制備的原理，了解單克隆抗體制備的過程和鑒定方法。 通過了解單抗的在醫學上的應用，感知生物技術對人類發展的重要意義。二、教學具體流程先將本節知識點涉及的教學難點——實驗部分，進行視頻同步講解，結合視頻突破教學難點，具體內容如下： 一、原理 抗原免疫的 B 淋巴細胞能夠產生特異性抗體，但在體外不能進行無限增殖；而骨髓瘤細胞雖然可以在體外進行無限增殖，但不能產生特異性抗體。將免疫脾細胞與骨髓瘤細胞融合得到雜交瘤細胞，這種細胞具有兩種親本細胞的特性，既具有 B 淋巴細胞合成和分泌特異性抗體的能力，也具有骨髓瘤細胞無限增殖的特性。即雜交瘤細胞可在體內外長期培養，又能不斷地分泌特異性抗體。 經在 HAT 培養基中進行選擇性培養，未融合的脾細胞因不能在體外長期存活而死亡，而未融合的骨髓瘤細胞合成 DNA 的主要途徑被培養基中的氨基蝶呤阻斷，又因缺乏次黃嘌呤 - 鳥嘌呤 - 磷酸核糖轉移酶（HGPRT），不能利用培養基中的次黃嘌呤完成 DNA 的合成過程而死亡。只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了次黃嘌呤 - 鳥嘌呤 - 磷酸核糖轉移酶，因此能在 HAT 培養基中存活和增殖。經過克隆選擇，可篩選出能產生特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞，在體內或體外培養，即可無限制地大量制備單克隆抗體。 二、材料與用具 1．實驗動物 8～10 周齡，重約 20g，健康的 Balb/c 純系小鼠，雌雄均可。 2．細胞 小鼠骨髓瘤細胞（Sp2/0 細胞）。 3．試劑 50% 聚乙二醇（PEG）、無菌生理鹽水、2.5% 碘伏、75% 乙醇溶液、臺盼藍溶液、蒸餾水； R/MINI-1640 培養液、HT 培養基、HAT 選擇培養基、小牛（或胎牛）血清、10% 二甲基亞砜（DMSO）。 4．器材 解剖刀剪、細胞計數板、試管、帶刻度吸管、注射器、6cm 平皿、加樣器、CO2 培養箱、細胞培養瓶、96 孔培養板、超凈工作臺、水平式離心機、倒置顯微鏡、冰箱等。 三、具體步驟 1．免疫動物： 先選用 Balb/c 小鼠，按照預先制定的免疫方案進行免疫注射。 2．骨髓瘤細胞的制備： 在融合前 48h，用含 20% 小牛血清的 R/MINI-1640 培養液，將骨髓瘤細胞增殖培養。融合前 24h，再以同樣培養液換液一次，使細胞融合當天處于對數生長期。取數瓶骨髓瘤細胞，輕輕去除瓶內原有培養液，加入冷的無血清培養液少許，用吸管將細胞吹打均勻在培養液中，離心洗滌后懸于無血清培養液中。臺盼藍染色檢查活細胞數應大于 95%，置于37℃下備用。 3．免疫小鼠脾細胞的制備： 取末次免疫后第三天的小鼠，眼眶放血，分離血清凍存備用。頸椎脫臼處死小鼠，浸泡于 75% 乙醇溶液中 3～5min。無菌操作取出脾，置平皿內的 200 目鋼網上，加入 10mL 的 R/MINI-1640 培養液，用注射器芯將脾細胞輕輕擠壓過網，制備脾細胞懸液，用此 R/MINI-1640 培養液將脾細胞洗滌 2 次（以 1000r/min 轉速離心 10min），棄上清液，用R/MINI-1640 培養液懸浮沉淀，計數活細胞數，一般每只小鼠可得 0.5×108 個脾細胞。 4．飼養細胞準備： 將小鼠致死、體表消毒和固定后，用消毒器械從下腹掀起腹部皮膚，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。將 10mL 培養液注射至腹腔，注意避免穿入腸管。右手固定注射器，使針頭留置在腹腔內，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部 1min，隨后吸出注入的培養液。離心 10min（轉速 1000r/min），棄上清液。先用 5mL HAT 培養基將沉淀細胞懸浮，根據細胞計數結果，補加 HAT培養基，使細胞濃度為 2×108/mL，將細胞加入 96 孔細胞培養板中，每孔 0.1mL，置 CO2 培養箱備用。 5．細胞融合 （1）將準備好的骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按 1∶5～1∶10 比例混合，加入 20～50mL R/MINI-1640 液，以 1000r/min 轉速離心，棄上清液，將上清液盡量吸凈，以免影響 PEG 的濃度。 （2）用手指輕彈離心管底部，使沉淀細胞分散，將離心管置 37℃水浴中。吸 1mL 37℃預溫的 50%PEG 緩慢滴入離心管內，邊加邊輕輕搖晃，1min 內加完，37℃靜置 1min。加 R/MINI-1640 液（37℃預溫）1mL，1min 內加完，再加 R/MINI-1640 液 10mL，邊加邊輕輕搖晃 1min，然后加 R/MINI-1640 液至 50mL，使 PEG 作用終止。 （3）以 800r/min 轉速離心 10min，棄全部上清液。加入少許 HAT-R/MINI-1640 選擇培養液，用 1mL 吸管輕輕混勻，切記不可用力吹打，以免使融合在一起的細胞散開。隨后將沉淀細胞輕輕懸浮于所需容積的 HAT 培養液中，接種于 96 孔培養板（0.1mL/ 孔）。接種完畢后，將培養板放入 37℃的 CO2 培養箱中培養。每天觀察細胞培養板有無細菌污染及克隆生長情況。 6．選擇性培養： 接種 96 孔板 1 周后換 HAT 培養液，每次吸出培養孔舊液 1/2，換入新液，連續 2 周。 3～5d后未融合及自身融合的細胞逐漸死亡，1 周左右可出現克隆，并不斷增殖，當集落大于 3mm 或布滿孔底 1/2 時即可取上清做抗體活性檢測，同時補加新鮮 HAT 培養液。在一次較好的融合試驗中，70%～80% 的孔有。所有生長克隆的孔都需要取培養上清液進行抗體活性檢測。培養 3 周后即可改用普通完全培養液。 7．雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化： （1）雜交瘤陽性克隆的篩選： 常用方法有酶聯免疫吸附試（ELISA）、驗免疫熒光、放射免疫測定、間接血凝試驗、溶血空斑試驗等。首先初篩出能分泌與預定抗原起反應的 McAb 雜交瘤細胞，再進一步從中篩選出有預定特異性的雜交瘤細胞，然后選出可供實際應用具有能穩定生長和有功能特性的細胞克隆。而且應盡量多選數株細胞，以保證有足夠的候選株供實際應用。 （2）克隆化技術： 克隆化的方法包括有限稀釋法、軟瓊脂平板法、顯微操作法和熒光激活細胞分選法，最常用的方法是有限稀釋法。有限稀釋法是將需要再克隆的細胞株自培養孔內吸出并作細胞計數，計出 1mL的細胞數。用 HT 培養液稀釋，使細胞濃度為 50～60 個 /mL，于 96 孔培養板中每孔加 0.1mL（5～6 個細胞 / 孔）。接種兩排，剩余細胞懸液用 HT 培養液作倍比稀釋，再接種兩排，如此類推，直至使每孔含 0.5～1 個細胞。培養 4～5d 后，在倒置顯微鏡上可見到小的細胞克隆，補加完全培養液 200μL/ 孔。第 8～9 天時肉眼可見細胞克隆，及時進行抗體檢測。選擇單個克隆生長的陽性孔再一次進行克隆。一般需要如此重復 3～5 次，直至達 100% 陽性孔率時即可，以確保抗體由單個克隆所產生。初次克隆化的雜交瘤細胞需要在完全培養液中加 HT。 8．單克隆抗體的大量制備： 獲得穩定的雜交瘤細胞系后，即可根據需要大量生產 McAb。目前制備 McAb 主要采用動物體內誘生腹水法和體外培養法。 （1）動物體內誘生腹水法：先在小鼠腹腔注射液體石蠟或福氏不完全佐劑，一周后將雜交瘤細胞懸液注射入小鼠腹腔。接種 10～14d 后，可分次采集腹水，將收集的腹水離心去除細胞，滅活（56℃，30min），再離心，取上清液即可。 （2）體外培養法：將雜交瘤細胞置培養瓶中培養，待培養液顏色改變或細胞過多開始死亡時，收集上清液，離心去掉碎片及細胞即可。 9．單克隆抗體性質的鑒定： 為了更好地利用所獲得的單克隆抗體，需對單克隆抗體的性質進行鑒定，鑒定的內容包括特異性、免疫球蛋白的類及亞類、親和力、識別結合抗原的表位及其分子量等。 制備針對某種抗原的某一抗原表位的特異性 McAb。 分析培養原理，認識細胞融合的類型與雜交瘤細胞篩選的方法，感受生物技術的奧妙與實驗的樂趣。 抗原通過血液循環或淋巴循環進入外周免疫器官，刺激相應 B 淋巴細胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏 B 淋巴細胞。 在體外的細胞培養中，單個的或數量很少的細胞不易存活，必須加入其他活的細胞才能使其生長繁殖，加入的細胞稱為飼養細胞（feeder cell）。 只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了次黃嘌呤 - 鳥嘌呤 - 磷酸核糖轉移酶，因此能在 HAT 培養基中存活和增殖。 雜交瘤細胞在 HAT 培養液中生長形成克隆后，其中僅少數是分泌預定特異性 McAb 的細胞。 為了防止無關克隆的過度生長，需對檢測抗體陽性的雜交克隆盡早進行克隆化培養。 體內誘生法操作簡便、經濟、抗體濃度高。但腹水中常混有小鼠的其他蛋白，因此要提純后方可使用。 體外培養法所得抗體含量不高，且需要特殊儀器設備，故常用于實驗室中。三、疑難問題解析一、注意事項與難點突破 1．免疫的動物應選擇與親本骨髓瘤細胞同一品系的動物，因為免疫動物品系和骨髓瘤細胞種系越遠，融合的雜交瘤細胞越易發生免疫排斥反應，越不穩定。 2．為防止細胞污染，通常用的抗生素有青霉素（100U/mL）、鏈霉素（100μg/mL）、四環素（50μg/mL）、慶大霉素（50μg/mL），其中青霉素和鏈霉素聯合使用較為常用，俗稱“雙抗”。 3．PEG 有毒性，在細胞融合過程中作用時間不宜過長。 4．整個制備過程應嚴格無菌操作。對于細胞傳代培養應適時注意更換培養液，防止細胞死亡，避免因此而造成的損失。

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