資源簡介

教學設計
課程基本信息
學科 高中生物學 年級 高二 學期 秋季
課題 動物細胞的培養
教學目標
1. 了解動物細胞培養的操作流程。 2. 掌握常見實驗器材的使用方法和使用規范。
教學內容
教學重點： 1. 動物細胞培養的操作流程。
2. 常見實驗器材的使用方法和使用規范。
教學難點： 1. 原代培養與傳代培養的區別。
2. 常見實驗器材的使用方法和使用規范。
教學過程
教學流程教學具體實施過程設計意圖一、教學實施背景動物細胞培養技術是指從機體中取出組織或細胞，或利用已建立的細胞系，在特定的人工條件下使細胞在培養容器中生長和生產生物制品的一門技術。通常細胞培養泛指所有的體外培養，但就培養物而言，體外培養分為細胞培養、組織培養和器官培養。 但本節課涉及的生物技術，在現有的高中實驗條件下很多學校無法完成，借助實驗視頻資料，可以化抽象為直觀，讓學生充分感受到科學技術的魅力，便于更好區分動物細胞培養的原代培養和傳代培養。明確本節涉及的要點內容，激發學習興趣。 二、教學具體流程先將本節知識點涉及的教學難點——實驗部分，進行視頻同步講解，結合視頻突破教學難點，具體內容如下： 一、教學具體流程 1.原理 細胞原代培養是直接從生物體獲取組織細胞進行培養。由于細胞剛剛從活體組織分離出來，故更接近于生物體內的生活狀態。細胞原代培養為研究生物體細胞的生長、代謝、繁殖提供有力的手段，同時也為細胞傳代培養創造條件。按照組織來源不同，我們可采用組織塊法和分散細胞法進行原代培養，例如心肌細胞、皮膚細胞可采用組織塊法，肝臟細胞、腎臟細胞、軟質腫瘤細胞可采用分散細胞法。我們主要介紹分散細胞法。分散細胞法是采用機械法或酶消化法使細胞從組織塊中解離。如脾、肝、腦、軟質腫瘤等。通注射器擠壓，篩網擠壓過濾、反復吹打等方法使細胞彼此離散，形成單細胞懸液，進行原代細胞培養。 實驗室開展的細胞培養，大多是貼壁依賴型培養細胞。貼壁細胞傳代培養就是指細胞需要貼附在一定的固相表面才能生長的細胞培養。大多數動物細胞為貼壁依賴型細胞，這些細胞緊密的貼于瓶壁，大多需要通過胰蛋白酶等消化液處理細胞，才能讓細胞與瓶壁分離。 2.材料與用具 細胞原代培養過程則主要包括取材、組織分離、解離組織塊、分離細胞，接種至培養器瓶中，C02培養箱靜置培養等步驟。用于細胞原代培的器材主要有培養瓶，培養血，離心管，解剖器材等。用于原代細胞培養的器材必須無菌，無菌包裝的器材需查看保質期以及包裝是否完整。非無菌包裝器材需要經過滅菌處理。 常用的細胞培養用液有：培養基（RPMI1640，是常用的基礎培養基，），培養基中需要添加10%的血清FBS，1%的雙抗（青霉素/鏈霉素）、PBS、Hank’s緩沖液等。無菌包裝的培養用液需要查看包裝的完整性或有無破損，自己配制的培養基或PBS等均需用0.45 um的濾膜過濾除菌，這就是用于過濾的濾器，還有培養板、培養皿，離心機等。 3.培養過程 （1）原代培養 第一步，取材分離組織，先取小鼠，將小鼠拉頸椎處死，置入70%酒精浸泡殺菌，移到超級工作臺中無菌環境取出小鼠（或乳鼠），放置在操作盤中，用手術器械逐層分離皮膚和肌肉組層，打開腹腔和胸腔。注意不同的解剖層次使用不同的消毒器械。最后取出心臟和腎臟，置于無菌平皿內。用Hanks液洗滌3次。 第二步，解離組織，用彎頭剪分別把心臟和腎臟組織剪碎，每個組織塊大約1mm3左右，用Hanks液洗滌2-3次，自然沉淀，用吸管吸去上清液。心肌組織我們采用組織塊法，就是將剪碎的組織塊中加入0.5-1 ML培養基，吸取組織塊懸液，轉入細胞培養瓶中，盡量讓組織塊鋪展開，在37℃培養箱內放置2-3h。待組織塊牢牢貼于瓶壁后，輕輕沿瓶壁補加培養基只3-5 ML，37℃ C02培養箱內靜置培養。 肝臟組織采用消化法，將肝臟組織塊放人培養皿中，加入1-2mL 0.25%的胰蛋白酶，消化5-7 min。加入1 mL培養基終止消化，用濾網過濾，取過濾液移入15 ML離心管中。加PBS到10 mL，混勻，1000 rpm離心5min，收集細胞。用PBS洗滌兩次，棄上清，加入培養基5ml，根據細胞密度，轉入細胞培養瓶中，補充培養基到5mL，37℃ C02培養箱內靜置培養。 （2）傳代培養 開始細胞傳代培養時，我們取出細胞培養皿（瓶），首先在倒置顯微鏡觀察細胞。查看細胞的生長狀態：（細胞形態、細胞活力），查看細胞密度：（鋪滿瓶壁70-90%為宜）。 第二步，分離細胞：直接棄除老培養基，加入適量PBS洗滌細胞2次，棄掉PBS液，加入1-2mL 0.25%的胰蛋白酶消化細胞，顯微鏡下觀察細胞，細胞會逐步從瓶壁上分離，變圓，加入有血清培養基終止消化，用移液器或（滴管）吸取培養基將細胞從瓶壁吹下細胞，獲得細胞懸液。注意吹打細胞時盡量不要產生氣泡。 第三步，細胞計數，取細胞懸液20uL，加入60μL臺盼藍染液，混勻，取10-15μL細胞加入細胞計數板內，在顯微鏡下觀察，計數四角大方格中的細胞數。細胞數（ml）=（4個大格細胞數之和）x104x稀釋倍數；計算細胞的存活率，細胞存活率=[4大格活細胞數/（4大格細胞總數）]x100%。因為臺盼藍只染死細胞，所以我們很容易辨識死細胞。 第四步，根據細胞計數結果，加入培養基調整細胞密度。 第五步，分瓶，取一定量的細胞懸液，加入到新的細胞培養瓶中，添加新鮮培養基3-5mL，混勻最后，細胞培養瓶放置細胞到CO2培養箱中靜置培養。 比較兩種培養的差異。 明確本知識點涉及的原理，從概念上區分原代培養和傳代培養 明確不同培養目標，培養基和實驗材料、用具的差異，通過分析資料，訓練學生的思維，提高信息處理能力 通過培養流程的學習和視頻的學習，簡述什么是原代培養 為什么用胰酶處理？ 通過培養流程的學習和視頻的學習，說出什么是傳代培養 比較原代培養和傳代培養的不同。提供資料訓練學生的思維，提高信息處理能力三、疑難問題解析1.動物細胞傳代的原因 原代培養細胞的顯微觀察，我們要每天用倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態，如果有細胞污染要及時清理。圖5是原代培養3天和7天細胞生長情況，一般5-6天，細胞會鋪滿瓶壁50%以上。原代培養期內，培養物中各種細胞成分混雜，具有明顯的異質性，各細胞的遺傳形狀互不相同，而且細胞間相互依存性強，細胞集落形成率很低，細胞獨立生存能力較差。 2.原代培養的注意事項 第一，所用動物、器械（準備至少三套）、培養基、PBS等要求嚴格無菌。第二，嚴格進行無菌操作，防止細菌、霉菌、支原體污染，避免化學物質污染。第三，從取材開始，保持所有組織細胞處于無菌條件。第四，動物組織取材時，注意不能刺破消化道等臟器，如果消化道破裂，需要更換動物，否則容易造成污染。第五，離心是在有菌的環境進行，所以，組織細胞離心時要注意蓋嚴，從有菌環境移入超凈臺時，要做表面消毒。 3.傳代培養的注意事項 要預防細菌、真菌等污染，要嚴格按照無菌操作程序進行，細胞培養環境要嚴格無菌。細胞培養操作過程要細致，避免手接觸瓶口。細胞培養用器材要嚴格與其他器材分開，避免混用，造成污染。要預防病毒污染：病毒主要來源于血清，所以血清要來源可靠。要預防支原體污染：支原體可來源于血清或新接入的細胞，一旦細胞生長特別緩慢，要檢查是否有支原體污染，支原體可用熒光染色查看，可用抗生素法去除支原體。同時進行多個細胞操作時，不能共用移液管，要預防細胞之間的交叉污染。深入探討，落實知識點的同時，理解概念，達成教學目標

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