資源簡介

教學設計
課程基本信息
學科 高中生物學 年級 高二 學期 秋季
課題 PCR技術
教學目標
熟悉PCR技術的原理和操作流程。 2. 了解引物設計方法和PCR技術的應用。
教學內容
教學重點： 1. PCR技術操作流程。
2. 瓊脂糖凝膠電泳的操作流程。
教學難點： 1. PCR技術與體內DNA復制的異同點。
2. PCR技術的應用。
教學過程
教學流程教學具體實施過程設計意圖一、教學實施背景1.背景： 大腸桿菌DH5ɑ菌株很容易獲取，很多實驗室均有保存。其細胞中的β-actin基因是一種高效穩定表達的基因，研究的已經非常清楚，非常容易被檢測出來； 2.問題情境： 引物怎么設計？遵循什么原則？ 通過查閱已報道的文獻獲取擴增大腸桿菌DH5ɑ菌株β-actin基因的引物或利用primer 5.0軟件自行設計β-actin基因的引物改用易獲得的大腸桿菌DH5ɑ菌株作為實驗材料，擴增高效穩定表達的β-actin基因作為檢測基因能夠更高效的完成實驗； 培養學生查閱文獻資料的習慣、提高熟練應用相關軟件的能力，有利于理解PCR擴增中引物設計需要遵循的原則及引物質量的重要性。二、教學具體流程先將本節知識點涉及的教學難點——實驗部分，進行視頻同步講解，結合視頻突破教學難點，具體內容如下： 一、材料與用具： 大腸桿菌DH5ɑ菌株、Taq DNA聚合酶、PCR反應體系（TaKaRa公司）、公司合成的β-actin引物F/R等 實驗用具： PCR儀、微量移液器、離心機等 實驗原理： PCR 全過程包括三個基本步驟,即雙鏈 DNA 模板加熱變性成單鏈(變性);在低溫下引物與單鏈DNA互補配對(退火);在適宜溫度下 Taq DNA 聚合酶以單鏈 DNA 為模板,利用4種脫氧核苷三磷酸(dNTP)催化引物引導的 DNA 合成(延伸)。這三個基本步驟構成的循環重復進行,可使特異性 DNA 擴增達到數百萬倍。 二、具體步驟： 使用微量移液器將表1所示的PCR體系各成分加入200uL已滅菌的微量離心管中，用微量移液器反復吹吸使反應液混合均勻。以 3000r/min的轉速離心30s，使反應液集中于微量離心管的底部。如圖1所示，將微量離心管放入PCR儀中進行擴增，設置反應條件見圖2所示。 表1 PCR反應體系 成分體積10x擴增緩沖液5uLdNTP2uL引物F4uL引物R4uLTaq DNA聚合酶1uL無菌水32uL大腸桿菌懸液2uL總體積50uL
圖1 PCR儀 圖2 PCR循環參數 三、疑難問題解析一、注意事項和難點突破： PCR所用的微量離心管以及吸液槍頭一定是已經滅菌的，而且每次吸取一種液體都要更換槍頭，避免用手接觸槍頭 使用微量移液器時，操作一定得規范，否側誤差較大。 二、疑難問題： 體內DNA復制和PCR技術的異同有哪些？ PCR的常見應用有哪些？ 清楚一些注意事項有利于提高實驗的成功率，以及有助于幫助學生分析實驗異常結果； 通過比較可以加強學生對PCR與體內DNA復制的理解； 在理解并熟練操作PCR技術的基礎上，能夠提高其實踐運用的能力教學設計
課程基本信息
學科 高中生物學 年級 高二 學期 秋季
課題 轉基因大腸桿菌的培養
教學目標
1. 了解以大腸桿菌為受體細胞的基因工程操作流程。 2. 掌握常見實驗器材的使用方法和使用規范。
教學內容
教學重點： 1. 基因工程操作流程。
2. 常見實驗器材的使用方法和使用規范。
教學難點： 1. 目的基因的檢測方法。
2. 常見實驗器材的使用方法和使用規范。
教學過程
以制備具有氨芐青霉素抗性的大腸桿菌為情境，通過視頻進行直觀化教學，并輔以探究性問題及練習等方法，闡明基因工程的基本操作程序。 教學流程教學具體實施過程設計意圖一、導入抗生素是常見的藥品，使用過量抗生素易導致出現拉肚子的現象，可以通過轉基因手段獲得具有Amp抗性的大腸桿菌，這一過程可通過熱激法實現。通過創設實驗情境，以問題探究的形式進行轉基因大腸桿菌培養的相關教學二、實驗突破先將本節知識點涉及的教學難點——實驗部分，進行視頻同步講解，結合視頻突破教學難點，具體內容如下： 二.表達載體導入受體細胞 感受態細胞在0℃，CaCl2的低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形，而轉化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羥基--鈣磷酸復合物，并粘附于細胞表面，經42℃短時間熱沖擊處理，可促使細胞迅速收縮，吸收DNA復合物，完成轉化。 視頻展示并同步講解 1、實驗前將水浴鍋溫度調至42℃，并提前加熱到預設溫度。 2、冰上融化感受態DH5a,，加1ug/ul的質粒1ul于10ul感受態中，冰上放置30min。 3、42℃水浴鍋中熱休克90s，迅速轉移至冰上2min-5min。 4、在無菌工作臺內向各管含質粒的感受態中加入200ulLB培養液（無抗性），然后轉移到培養管中，37℃條件下，低速培養1h。 5、將200ul懸液倒入相應抗性的LB固體培養基上，把涂布棒在酒精燈上過火滅菌然后把懸液涂布均勻，倒置于37℃恒溫孵箱中培養12-16小時，次日觀察菌落生長情況。 三.目的基因及表達產物的檢測 提出問題：獲得菌落后如何進行擴大培養？ 挑取菌落，分別將其加入到含Amp的LB液體培養基中進行震蕩培養。 挑取的菌落是否一定轉入質粒？ 不一定，可能是由于突變獲得了Amp抗性。 如何進行鑒定？ ①核酸分子雜交 ②依據質粒序列，對菌液或菌落進行PCR 先進行相關實驗材料及實驗原理的介紹，再以真實實驗視頻為載體進行直觀化教學,在實驗過程中進行相關操作的講解；同時，對于基因工程中的難點與易錯點—目的基因的檢測，讓學生進行了思考探究，幫助學生鞏固落實基因工程的基本操作流程。三、拓展延伸一、目的基因檢測和表達產物檢測的區別 二、菌落PCR時引物的選取問題 三、電泳時條帶判斷問題 選取的三個問題為本節微課的難點，同時也是學生難以理解的易錯考點，通過問題的形式進行再次辨析，讓學生能切實解決重難點。教學設計
課程基本信息
學科 高中生物學 年級 高二 學期 秋季
課題 微生物藍白斑實驗
教學目標
1. 了解以大腸桿菌為受體細胞的基因工程操作流程 2. 掌握常見實驗器材的使用方法和使用規范
教學內容
教學重點： 1. 大腸桿菌藍白斑實驗操作流程
2. 藍白斑產生的原理分析
教學難點： 1. 藍白斑產生的原理分析
2. 常見實驗器材的使用方法和使用規范
教學過程
藍白斑篩選是一種基因工程常用的細菌重組子的篩選方法，以大腸桿菌為受體細胞，通過視頻進行直觀化教學，并輔以探究性問題及練習等方法，闡明基因工程的基本操作程序。 教學流程教學具體實施過程設計意圖一、導入野生型埃希氏大腸菌（E.Coli）產生的β-半乳糖苷酶可以將無色化合物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）切割成半乳糖和深藍色的物質5-溴-4-靛藍。5-溴-4-靛藍可使整個菌落產生藍色變化。通過觀察菌落顏色判斷實驗效果。通過創設實驗情境，以問題探究的形式進行轉基因大腸桿菌培養的相關教學二、實驗突破先將本節知識點涉及的教學難點——實驗部分，進行視頻同步講解，結合視頻突破教學難點，具體內容如下： 一.構建重組質粒 目的基因和質粒通過限制性核酸內切酶和T4鏈接酶構建成重組質粒 二.轉化大腸桿菌 視頻展示并同步講解 1、將 ITPG 和 X-Gal 配制為溶液，除菌后冷凍保存，備用。 2、制備 LB 液體培養基、LB 固體培養基、含氨芐青霉素（標記為 Amp+）的 LB 固體培養基，備用。 3、重組質粒的制備： 4、將質粒轉化至大腸桿菌： 5、制備含 ITPG、X-Gal 的培養基（ 現用現制）： 取適量 ITPG、X-Gal 溶液均勻涂布于含有氨芐青霉素的 LB 固體培養基表面，晾干。 6、涂板：取 100 μL 步驟 4 獲得的轉化細菌分別涂布于添加 IPTG、X-Gal 的培養基表面，37℃恒溫培養箱倒置培養 12 h。 7、觀察： 實驗組和對照組經轉化后的大腸桿菌菌落呈現出不同的顏色， 分別統計實驗組、對照組中的藍斑和白斑數目。 三.大腸桿菌培養及藍白斑的觀察 在實驗過程中可能會出現三種可能性：（1）沒有藍斑，（2）沒有白斑，（3）無菌落生長。 讓學生分析出現上述結果的原因及改進建議。 先通過藍白斑篩選實驗， 培養基的配制、滅菌、無菌操作、DNA 的連接、 菌落的計數等不再是孤立的實驗步驟，而是服務于一個大的實驗目的“ 通過外源基因的導入，使大腸桿菌發生轉化， 最終產生白色的菌落”。 在“ 藍白斑篩選” 科技實踐活動中， 知識學習更加系統化、能力提升更加全面化。三、拓展延伸一、基因工程操作的流程如何？ 二、如何進行大腸桿菌擴大培養？ 三、菌落的觀察指標有哪些？ 四、大腸桿菌表達體系的優點 對出現的可能三種實驗結果進行分析和討論，能提高學生的思辨能力，讓學生感悟科學探究精神和構建生命觀念。教學設計
課程基本信息
學科 高中生物學 年級 高二 學期 秋季
課題 蛋白質的電泳
教學目標
熟悉SDS-PAGE凝膠電泳的原理和操作流程。 熟悉細菌總蛋白質的提取和定量。
教學內容
教學重點： 1. SDS-PAGE凝膠電泳的原理。
2. SDS-PAGE凝膠電泳的操作流程。
教學難點： 1. 細菌總蛋白的提取與定量。
2. 比較瓊脂糖核酸凝膠電泳與蛋白質凝膠電泳的異同點。
教學過程
教學流程教學具體實施過程設計意圖一、教學實施背景一、背景 大腸桿菌DH5ɑ菌株的β-actin基因表達的蛋白質非常穩定且高表達，利用SDS-PAGE凝膠電泳很容易檢測出來，成功率高。 問題情境 1.SDS-PAGE凝膠電泳的實驗原理是什么？ 2.為什么分離蛋白質常用SDS-PAGE凝膠電泳而常不用瓊脂糖凝膠？穩定高表達的蛋白質學生更容易檢測； 熟知實驗原理是實驗的前提也是實驗結果分析的依據；讓學生區分分離蛋白質與分離核酸的不同二、教學具體流程先將本節知識點涉及的教學難點——實驗部分，進行視頻同步講解，結合視頻突破教學難點，具體內容如下： 一、材料及試劑： 大腸桿菌DH5ɑ菌株、細胞裂解液、PBST緩沖液、0.5M Tris-HCl(pH6.8)、3M Tris-HCl(pH8.8)、 10%SDS、10%APS、 TEMED等 實驗用具： 垂直板電泳槽及配套的玻璃板、封膠條、梳子、恒壓恒流電泳儀、脫色搖床、全自動發光成像儀、微量移液器、離心機、PVDF膜等 二、原理： SDS（十二烷基硫酸鈉）是一種陰離子去污劑，在溶液中能與蛋白質分子的疏水部分定量結合，把大多數蛋白質拆成亞單位，并帶上陰離子。這些陰離子掩蓋了蛋白質分子本身所帶的電荷差異，所以 SDS-PAGE消除了電荷效應，只有分子篩效應，故蛋白質電泳遷移率主要取決于相對分子質量，遷移率與相對分子質量的對數呈線性關系，在電場下，按相對分子質量大小在凝膠上排列。 三、具體步驟： （一）樣品制備 1.測定大腸桿菌DH5ɑ菌液的OD600值（用水作為對照），當OD值達到0.6-0.8左右時，收集細胞至1.5ml離心管，1200 rpm旋轉離心5min； 2.棄上清，每管加入1ml預冷的1xPBS磷酸緩沖液，充分混勻，4℃ 1200 rpm離心5min； 3.加入300ul（需要根據細胞量的多少）細胞裂解液（RIPA+PI），漩渦震蕩混勻，冰上裂解30min； 4.4℃，12000 rpm，離心10min，小心吸取上清液到新的1.5ml的EP離心管中； 5.根據BCA蛋白濃度測定試劑盒測定所提取的總蛋白濃度； 6.取部分體積的蛋白液中加入與其體積相同的2×SDS蛋白上樣緩沖液（含5%的巰基乙醇），混合均勻，100℃水浴10min，立即冰浴5min； 7.瞬時離心收集，于-20℃保存備用。 （二）蛋白濃度測定 1.根據所檢測樣品數量，按BCA試劑A與試劑B體積比50:1配置BCA工作液，確保充分混勻； 2.完全稀釋蛋白質標準品(5mg/ml BSA)：取10ul蛋白質標準品，用1xPBS稀釋至100ul，使其終濃度為0.5mg/ml； 3.將0.5mg/ml的標準品按0，1，2，4，8，12，16，20ul體積加到96孔板的標準品孔中，然后加入1xPBS補齊至每孔20ul； 4.分別在96孔板的待測樣品孔中加入1ul待測蛋白樣品，再加入19ul的1xPBS補齊至20ul； 5.在各孔中加入200ul BCA工作液，37℃靜置30min； 6.測定A595nm光吸收值，以OD值為縱坐標，標準蛋白濃度為橫坐標，制作蛋白標準曲線； 7.根據標準曲線，計算待測樣品的蛋白質含量。 （三）SDS-PAGE（蛋白質凝膠電泳） 制膠：1.檢查好制膠裝置的密封性后，配制15% SDS-聚丙烯酰胺分離膠（總體積10ml）：依次向小燒杯中加入3.71ml雙蒸水、5ml 30%聚丙烯酰胺、1.3ml 3M Tris-HCl(pH8.8)、100ul 10%SDS、120ul 10%APS、12ul TEMED，用5ml的移液槍立刻混勻（但不要產生氣泡），然后用移液槍迅速灌膠至指定界面，加入雙蒸水進行液封； 2.接著配制5%SDS-聚丙烯酰胺濃縮膠（總體積6ml）：依次加入3.4ml雙蒸水、1ml 30%聚丙烯酰胺、1.5ml 0.5M Tris-HCl(pH6.8)、60ul 10%SD放到4℃冰箱保存； 3.30~60min后，當分離膠與雙蒸水的交界處出現一條明顯可見的分界線時，倒掉雙蒸水，并且用吸水紙吸干，將步驟2配制的濃縮膠中依次加入80ul TEMED 和8ul 10%AP，立即混勻后，加到分離膠上并且快速插上梳子； 4.45min后，取出凝膠板置于蛋白電泳槽中，加入1x蛋白電泳緩沖液； 加樣：輕輕將梳子拔出，用注射器吹打每個孔，以便去除碎膠，然后每孔加入20ug蛋白樣品以及蛋白Marker； 電泳：先60V恒壓電泳至分離膠界面，然后電壓調至80V，當溴酚藍距離膠底1-2cm時，關閉電源。 轉膜：1.按照檢測樣品的數量剪取1張合適大小的PVDF膜和2張濾紙，大小均要大于電泳凝膠，并且在PVDF膜的左下角處做好標記； 2.將PVDF膜放入甲醇中浸泡大約1min，然后浸泡于轉移緩沖液中，同時將濾紙也浸泡于轉移緩沖液中大約5min； 3.打開轉膜儀的蓋子，從轉膜儀的正極到負極依次疊放濾紙、PVDF膜、蛋白凝膠和濾紙，疊放的過程中需要用玻璃棒輕輕的趕走氣泡； 4.恒壓10V，轉膜120min； 抗體孵育：1.PVDF膜封閉：轉膜結束后，取出轉印膜，用ddH20洗3次，將PVDF膜浸泡于含5%脫脂奶粉的封閉液中，4℃封閉12-16小時； 2.將膜取出，用PBST緩沖液洗滌1次；將PVDF膜放在抗體孵育盒中，向膜上滴加足量的抗體（以免抗體揮發影響實驗結果），4℃孵育12-16小時； 3.孵育結束后，從抗體孵育盒中取出PVDF膜，在水平脫色搖床上用PBST緩沖液洗滌3次，每次間隔大約10min； 4.按照一抗孵育的方法孵育二抗，33℃孵育2小時； 5.如步驟3； 曝光：準備好適量的ECL發光劑，將洗好后的膜平鋪到全自動發光成像儀上，在膜上均勻滴加發光劑，進行檢測 三、疑難問題解析注意事項與難點突破： 1.樣品上樣量不能太多 2.電泳的電壓和時間需要控制合理； 疑難問題： 1.瓊脂糖核酸凝膠電泳與蛋白質凝膠電泳的異同點？ 2.蛋白質凝膠電泳有哪些應用？ 1.讓學生理解實驗的正確操作是實驗能否成功的必要條件，在熟知實驗原理的基礎上，要注意實驗操作的細節； 2.正確區分兩種凝膠電泳的異同點有利于幫助學生更好的理解分離核酸與分離蛋白質的區別；教學設計
課程基本信息
學科 高中生物學 年級 高二 學期 秋季
課題 農桿菌轉化法
教學目標
1. 理解農桿菌轉化法的基本實驗原理和實驗操作的基本流程。 2. 掌握常見實驗器材的使用方法和使用規范。
教學內容
教學重點： 1. 農桿菌轉化法操作流程。
2. 常見實驗器材的使用方法和使用規范。
教學難點： 1. 農桿菌轉化法的實驗原理。
2. 農桿菌轉化法中的具體篩選方法。
教學過程
以植物冠癭病為情境，通過視頻進行直觀化教學，并輔以探究性問題，闡明農桿菌轉化法的基本操作程序。 教學流程教學具體實施過程設計意圖一、導入農桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數雙子葉植物和裸子植物的受傷部位，通過其Ti質粒上T-DNA 編碼的酶合成植物激素生長素和細胞分裂素，使植物細胞能夠過度生長，從而形成通常由根癌農桿菌感染引起的冠癭瘤。通過創設實驗情境，以問題探究的形式進行轉基因大腸桿菌培養的相關教學二、實驗突破先將本節知識點涉及的教學難點——實驗部分，進行視頻同步講解，結合視頻突破教學難點，具體內容如下： 一、Ti質粒介紹 原始Ti質粒大體可分為兩個區域：T-DNA區段：有支配腫瘤化及維持腫瘤狀態和產生冠癭堿的基因。 T－DNA以外的區域：存在著對質粒的傳遞性、冠癭堿的透過和分解等（在細菌中表達的性狀）的基因。 提出問題：①如何利用Ti質粒實現轉基因？ ②使用原始Ti質粒進行轉基因是否可行？有何種問題存在？ 目前多使用人工改造的質粒，其上含有經改造的T-DNA區段，當其被轉化進農桿菌體內后，可通過同源重組的方式將其本身的T-DNA區段替換到原始Ti質粒上。 二、浸花法轉化擬南芥 視頻展示并同步講解 1.1重組質粒導入農桿菌 1.2浸花法轉化擬南芥 （1）選取植株健壯，生長約5周的擬南芥植株 （2）準備農桿菌液。通常先用1 ml 含抗生素的LB培養基培養已經轉化了目的表達載體的農桿菌液，然后再吸取150 μl培養過夜的菌液加入到150 ml 新鮮的液體LB培養基中28 °C環境下震蕩培養24 h。 （3）4,000 x g，20 min離心菌液，然后將菌重懸于120 ml滲透液 (10%蔗糖 + 400 μl/L Silwet-77，蘸花前充分混勻，OD600=0.8-1.0) 中。與此同時，剪掉植株上的果莢和已經完全開放的花。 （4）將植株的地上部分浸入菌液中1 min，輕微震蕩。 （5）用保鮮膜將侵染過的植株罩起來以保持濕度，暗培養1 d，然后置于正常培養條件，2~3 d后可去掉保鮮膜，轉化后1周左右方可澆水，并定期繼續侵染幾次。 （6）繼續培養至植物成熟，收種子放在干燥環境中1周左右，即可篩選轉化子。 Ti質粒的特點是這一節微課中的重難點，同時也是考試中的易考點、易錯點。平時上課過程中對該內容并不會深入講解，在本節微課中，低于Ti質粒的整體結構，做出了明確的講解，并以問題為索，引導學生理解思考如何通過Ti質粒實現轉基因；此后通過視頻的形式，展現農桿菌轉化植物的基本過程，促進學生理解農桿菌轉化法這一常見的植物轉基因手段。三、拓展延伸1.為什么不使用天然的Ti質粒？ ①含有導致植物患冠癭病的基因②沒有方便目的基因插入的集中的酶切位點③缺少標記基因 2.練苗時的環境變化 ①成功率高，效果好②機理研究清楚，方法成熟，應用廣泛③遺傳穩定性好④操作比較容易，需要的儀器設備簡單，易于推廣選取的兩個問題為本節微課的難點，同時也是學生難以理解的易錯考點，通過問題的形式進行再次辨析，讓學生能切實解決重難點。

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