資源簡介

二 微生物的選擇培養(yǎng)與計(jì)數(shù)教案
【教學(xué)目標(biāo)】
課程標(biāo)準(zhǔn)與本節(jié)相對應(yīng)的要求是：舉例說明通過調(diào)整培養(yǎng)基的配方可有目的地培養(yǎng)某種微生物；概述平板劃線法和實(shí)習(xí)涂布平板法是實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行微生物分離和純化的常用方法；概述稀釋涂布平板法和顯微鏡計(jì)數(shù)法是測定微生物數(shù)量的常用方法。據(jù)此，結(jié)合教材內(nèi)容，確定本節(jié)教學(xué)目標(biāo)：
1.能運(yùn)用生物與環(huán)境相適應(yīng)的觀點(diǎn)，解釋選擇培養(yǎng)基篩選微生物的原理
2.能按照科學(xué)探究的要求，應(yīng)用稀釋涂布平板法和微生物數(shù)量測定的方法，設(shè)計(jì)從土壤中分離分解尿素的細(xì)菌，并進(jìn)行計(jì)數(shù)的方案
3.依據(jù)設(shè)計(jì)的方案，運(yùn)用無菌操作技術(shù)和微生物分離、培養(yǎng)的方法初步分離出目標(biāo)菌
4.嘗試解決生產(chǎn)、生活中與微生物選擇培養(yǎng)、計(jì)數(shù)等有關(guān)的實(shí)際問題
【教學(xué)重難點(diǎn)】
1、教學(xué)重點(diǎn)
（1）微生物選擇培養(yǎng)的原理
（2）土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)
2、教學(xué)難點(diǎn)
（1）土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)
【新課導(dǎo)入】
生物界中微生物數(shù)量繁多，種類龐雜，要想從中分離出需要的特定微生物并不容易，尤其當(dāng)要分離的微生物在混合的菌群中不是優(yōu)勢種群時(shí)，僅通過一般的平板劃線法或稀釋涂布平板法很難實(shí)現(xiàn)，該怎么辦呢？
【新課講解】
選擇培養(yǎng)基
尋找耐高溫的DNA聚合酶
1973年，科學(xué)家從美國黃石國家公園的熱泉中篩選出水生棲熱菌，進(jìn)而從這種菌中提取出耐高溫的DNA聚合酶。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種在體外擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫的DNA聚合酶。
篩選原因：水生棲熱菌能在70-80℃高溫條件下生存，而絕大多數(shù)微生物在此條件下不能生存。
1.實(shí)驗(yàn)室中微生物篩選的原理
人為提供有利于目的菌生長的條件（包括營養(yǎng)、溫度和PH等），同時(shí)抑制或阻止其他微生物的生長。
2.選擇培養(yǎng)基的概念
在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基稱為選擇培養(yǎng)基。
3.選擇培養(yǎng)基的類型（見課件）
{思考·討論}選擇培養(yǎng)基配方的設(shè)計(jì)
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種重要的氮肥。尿素施入土壤后，會被土壤中的某些細(xì)菌分解成NH3，再被轉(zhuǎn)化為NO3-、NH4+等被植物吸收。而這些細(xì)菌之所以能分解尿素，是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕福迕复呋蛩胤纸猱a(chǎn)生NH3，NH3可以作為細(xì)菌生長的氮源。
討論：
1.如果讓你配制一種培養(yǎng)基，將土壤稀釋液中能分解尿素的細(xì)菌分離出來，培養(yǎng)基的配方該如何設(shè)計(jì)？
提示：設(shè)計(jì)一種選擇培養(yǎng)基,尿素作為唯一氮源。
2.該培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基有哪些共同點(diǎn)和不同點(diǎn)？
提示：區(qū)別：只是用尿素作為唯一氮源，培養(yǎng)基的其他營養(yǎng)成分基本相同。
微生物的選擇培養(yǎng)
1．分解尿素的細(xì)菌的分離
分解尿素的細(xì)菌能合成脲酶，該酶能催化尿素分解產(chǎn)生NH3，以此作為細(xì)菌生長的氮源。要將土壤稀釋液中能分解尿素的細(xì)菌分離出來，培養(yǎng)基的配方設(shè)計(jì)思路是培養(yǎng)基中除含有細(xì)菌必需的碳源、水、無機(jī)鹽外，只含有尿素一種氮源。
2．稀釋涂布平板法分離分解尿素的細(xì)菌
土壤中細(xì)菌的數(shù)量龐大，要想得到能分解尿素的細(xì)菌的純培養(yǎng)物，必須要對土樣進(jìn)行充分稀釋，然后再將菌液涂布到制備好的選擇培養(yǎng)基上，操作過程如下：
采集土樣→將10 g土樣加入盛有90 mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻。取1 mL上清液加入盛有9 mL無菌水的試管中，依次等比稀釋→取0.1 mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面→將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中→將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進(jìn)行涂布→用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使涂布均勻→涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，放入30～37 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)1～2 d。
播放土壤中分解尿素的分離與計(jì)數(shù)視頻回答相關(guān)問題
展示稀釋涂布平板法過程和結(jié)果的圖解，提出“如何進(jìn)行微生物的計(jì)數(shù)？”
用稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)微生物的方法
(1)稀釋涂布平板操作要求：按照平行重復(fù)原則，每一稀釋度的菌液涂布3個或3個以上的平板。
(2)計(jì)數(shù)的時(shí)機(jī)：當(dāng)各平板上菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
(3)選擇可用于計(jì)數(shù)的平板：選擇菌落數(shù)在30～300的平板(相同稀釋度的平板均符合該特點(diǎn))進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后取平均值。
(4)每克樣品中的菌株數(shù)＝某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)÷涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積×稀釋倍數(shù)。
是否還有其他微生物的數(shù)量測定方法？
微生物的數(shù)量測定
①稀釋涂布平板法——間接計(jì)數(shù)法
②顯微鏡直接計(jì)數(shù)法——直接計(jì)數(shù)法
方法1：稀釋涂布平板法
原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。
要求:
①選用一定稀釋范圍的樣品液進(jìn)行培養(yǎng)，以保證 獲得菌落數(shù)為30-300、適于計(jì)數(shù)的平板。
②同一稀釋度至少對3個平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求平均值；
缺點(diǎn): 統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目少
原因：當(dāng)兩個或多個細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個菌落。因此，統(tǒng)計(jì)的結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)表示。
如何從平板上的菌落數(shù)推測出每克（每ml）樣品中的菌落數(shù)？
統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計(jì)3個平板，計(jì)算出平板菌落數(shù)的平均值，然后按公式進(jìn)行計(jì)算。
每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M
C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。
方法2：顯微鏡直接計(jì)數(shù)法
血細(xì)胞計(jì)數(shù)板：常用于相對較大的酵母菌細(xì)胞、霉菌孢子等的計(jì)數(shù)
細(xì)菌計(jì)數(shù)板：對細(xì)菌等較小的細(xì)胞進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)；
優(yōu)點(diǎn)：快速、直觀
缺點(diǎn)：
①不能區(qū)分死菌和活菌→偏大
②不適于對運(yùn)動細(xì)菌的計(jì)數(shù)。
③個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察。
{探究 實(shí)踐：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)}
提出問題
（1）如何從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌；
（2）統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌。
基礎(chǔ)知識
絕大多數(shù)微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出分解尿素的細(xì)菌。
實(shí)驗(yàn)過程
（1）土壤取樣
①取樣地點(diǎn)要求：細(xì)菌適宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長。
②取樣過程：鏟去表層土（一般3cm左右）。細(xì)菌絕大部分分布在距地表3～8cm的土壤層。
③注意事項(xiàng)：取土樣時(shí)用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。操作完成后一定要洗手。
（2）制備培養(yǎng)基
①選擇培養(yǎng)基：以尿素為唯一氮源。
②牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：作為對照組，來判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用。
③KH2PO4和Na2HPO4的作用是：提供無機(jī)鹽；調(diào)節(jié)pH。
（3）樣品的稀釋與涂布平板
測細(xì)菌時(shí)，一般選用1×104、1×105、×106倍稀釋的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)。
在初次實(shí)驗(yàn)中，對于稀釋的范圍沒有把握，應(yīng)選擇一個比較寬的范圍，將1×103～1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布到平板上培養(yǎng)，以保證能從中選擇出菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。
注意：
①每個濃度至少設(shè)置4個平板，1、2、3平板是選擇培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)組，三個重復(fù)），4為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用以判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用）。
②如何驗(yàn)證培養(yǎng)基中是否含有雜菌？
設(shè)置2個平板作為對照：不涂布稀釋液的選擇培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。
（4）微生物的培養(yǎng)與觀察
①培養(yǎng)條件：不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間。（細(xì)菌一般在30-37℃的溫度下培養(yǎng)1-2d）
②觀察：每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果。（一般來說，在相同的培養(yǎng)條件下，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，如形狀、大小和顏色等）
操作提示
1.將涂布器從酒精中取出時(shí)，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后再放在火焰上灼燒。不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃酒精。
2.要按照前面學(xué)習(xí)過的無菌操作的方法，進(jìn)行規(guī)范操作。取土樣時(shí)用的鐵鏟和取樣紙袋在使用前都需要滅菌。操作完成后，一定要洗手。
3.本實(shí)驗(yàn)使用的平板和試管較多，為了避免混淆，最好在使用前做好標(biāo)記。例如，在標(biāo)記培養(yǎng)皿時(shí)應(yīng)該注明組別、培養(yǎng)日期和平板上培養(yǎng)樣品的稀釋度等。
4.本實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長，需要事先規(guī)劃時(shí)間，以便提高實(shí)驗(yàn)效率，在操作時(shí)有條不紊。
結(jié)果分析與評價(jià)
1.結(jié)合對照組，分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出一些菌落。
提示：如果沒有接種的培養(yǎng)基上沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。如果接種后的完全培養(yǎng)基上的菌落數(shù)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，說明選擇培養(yǎng)基篩選出了一些尿素分解菌。
2.你是否獲得了某一稀釋度下菌落數(shù)為30-300的平板？在這一稀釋度下，是否至少有2個平板的菌落數(shù)接近？
提示：如果得到了兩個或多個菌落數(shù)為30～300的平板，說明稀釋度合適，操作比較成功，能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。
3.你統(tǒng)計(jì)的每克土樣中能分解尿素的細(xì)菌的菌落數(shù)是多少？與其他同學(xué)統(tǒng)計(jì)的結(jié)果接近嗎？如果差異很大,可能是什么原因引起的？
提示：如果是用同一土樣進(jìn)行的操作，數(shù)據(jù)應(yīng)該比較接近。如果差異很大，就需要從操作是否規(guī)范、培養(yǎng)基配制是否合理等方面查找原因。
進(jìn)一步探究
本活動只是初步篩選了能分解尿素的細(xì)菌,對分離的菌種進(jìn)行鑒定還需要借助生物化學(xué)的方法。你可以查閱相關(guān)資料,進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來鑒定自己分離的菌種。
方法：在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑——鑒別培養(yǎng)基
①液體培養(yǎng)基可以直接看液體的變色情況；
②固體培養(yǎng)基上可以觀察菌落周圍是否出現(xiàn)紅色環(huán)帶。
【板書】
微生物的選擇培養(yǎng)與計(jì)數(shù)
1.選擇培養(yǎng)基：概念
2.微生物的選擇培養(yǎng)
分解尿素的細(xì)菌的分離
3.微生物的數(shù)量測定
稀釋涂布平板法、顯微鏡直接計(jì)數(shù)法

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