資源簡介

3.2基因工程的基本操作程序教案
【教學目標】
課程標準與本節相對應的要求是：闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的獲取、基因表達載體的構建、目的基因導入受體細胞和目的基因及其表達產物的檢測鑒定等步驟。結合教材內容，確定本節的教學目標如下：
1.闡明PCR的原理，說出PCR反應所需的條件和PCR反應的過程
2.說出基因表達載體的組成
3.列舉將目的基因導入植物細胞、動物細胞和微生物細胞的方法
4.列舉檢測與鑒定目的基因在受體細胞中是否穩定維持和表達其遺傳特性的方法
5.能夠用流程圖的形式概括出基因工程的基本操作程序
6.針對人類生產或生活中的某一需求，能運用基因工程嘗試設計獲得某一轉基因產品的方案
7.能夠基于對基因工程的原理和操作流程的認識，以理性的態度對待基因工程的研發和應用，認同我國科研工作者在基因工程領域取得的成就
【教學重難點】
1.教學重點
(1)基因工程基本操作程序的四個步驟。
(2) DNA片段的擴增及電泳鑒定。
2.教學難點
(1)利用PCR獲取和擴增目的基因。
(2) DNA片段的擴增及電泳鑒定。
【新課導入】
教師利用課件展示“轉基因抗蟲棉”和“非轉基因抗蟲棉”的相關圖片，并利用教材中的“從社會中來”的文字部分，讓學生思考“轉基因抗蟲棉抗蟲的機制是什么？培育轉基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？”
通過聯系生產、生活實際，激發學生的學習興趣。
【新課講解】
第一步：目的基因的篩選與獲取
（1）目的基因：
用于改變受體細胞性狀或獲取預期表達產物等的基因，這些基因主要是指編碼蛋白質的基因。（基因通常是指有遺傳效應的DNA片段）
改變受體細胞性狀：如抗逆性、抗蟲性、抗病性、生長迅速、品質優良
獲得預期表達產物：生產藥物、毒物降解酶、工業用酶等
（2）區分抗蟲棉目的基因：
來源：蘇云金桿菌（Bt），原核生物
蘇云金桿菌伴孢晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白）：破壞鱗翅目昆蟲的消化系統
Bt抗蟲基因（Bt基因）
原理：Bt抗蟲蛋白在堿性環境中被酶分解為多肽，多肽可以和昆蟲腸上皮細胞膜上特異性受體結合，導致細胞膜穿孔，害蟲死亡。而人和牲畜胃呈酸性，Bt抗蟲蛋白不能分解為相應的多肽，腸上皮細胞膜上也沒有相應的受體。所以對人和牲畜無害。
1、篩選合適的目的基因
（1）方法：從相關的已知結構和功能清晰的基因中進行篩選
（2）實例：蘇云金桿菌常用于制成生物殺蟲劑，研究表明其殺蟲作用與Bt基因有關，科學家已經了解了Bt基因的結構、功能以及其翻譯產生的Bt抗蟲蛋白的結構與功能。
（3）三大核酸序列數據庫：GenBank（美國）、EMBL（歐洲）、DDBJ（日本）
上面有許多生物的全基因組測序數據，以及一些研究清楚的基因的結構及功能注釋，可以直接從中獲得目的基因的序列以及它在染色體上的位置。
2、利用PCR獲取和擴增目的基因
（1）獲取目的基因的方法
①人工合成法：利用DNA合成儀合成序列已知、片段較小的基因
②從基因文庫中獲取：某生物基因碎片化后連在載體上導入受體菌中保存
③PCR擴增法：提取蘇云金桿菌的DNA→設計特異性引物→體外擴增Bt基因
（2）PCR簡介
全稱：聚合酶鏈式反應（(Polymerase Chain Reaction）
原理：DNA半保留復制
實質：DNA在體外的大量復制
發明者：穆里斯（我國臺灣科學家錢嘉韻發現耐高溫酶），獲諾貝爾獎
DNA復制所需條件：
體內復制 體外復制 在DNA復制中的作用
解旋酶 高溫 打開DNA雙鏈
DNA母鏈 DNA母鏈 提供DNA復制的模版
4種脫氧核苷酸 4種脫氧核苷酸（dNTP） 合成DNA子鏈的原料（供能）
DNA聚合酶 耐高溫DNA聚合酶 （Taq DNA 聚合酶） 催化合成DNA子鏈
引物（RNA） 引物(DNA或RNA) 使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸 （DNA復制方向：5'→3'）
Mg2+緩沖溶液 激活DNA聚合酶
PCR引物：2種，各為一小段能與DNA母鏈的一段序列互補配對的短核苷酸單
鏈，常為20-30bp。
PCR過程：變性、復性、延伸
①變性：溫度升高到90℃以上，DNA雙鏈中氫鍵打開變為單鏈
②復性：溫度降為50℃左右，兩條引物通過堿基互補配對分別與DNA兩條單鏈的特定部位結合（引物序列必需緊挨目的基因，兩條分別位于目的基因的上下游）
③延伸：溫度又升高到72℃，在DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈
PCR在PCR儀中完成，一般設置30個循環，最終由1個DNA復制形成230個DNA，產生的許多Bt基因可以與載體相連。
讓學生觀看PCR過程的視頻
思考：用PCR可以擴增單鏈mRNA嗎？（不可以，需要逆轉錄形成雙鏈DNA）
過程：mRNA→逆轉錄酶合成DNA-RNA雜交鏈→核酸酶水解RNA→DNA單鏈→DNA聚合酶合成雙鏈DNA
第二步：基因表達載體的構建
構建基因表達載體的目的
（1）使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代。
（2）使目的基因能夠表達和發揮作用。
基因表達載體的組成
基因表達載體的構建
首先用一定的限制酶切割載體，使它出現一個切口，然后用同種限制酶或能產生相同末端的限制酶切割目的基因的DNA片段，再利用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體的切口處。
第三步：將目的基因導入受體細胞
轉化：目的基因進入受體細胞內，并在受體細胞內維持穩定和表達的過程。
目的基因導入受體細胞的方法
（1）目的基因導入植物細胞
①花粉管通道法
Ⅰ.用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。
Ⅱ.在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借花粉管通道進入胚囊。
②農桿菌轉化法
Ⅰ.農桿菌的特點：農桿菌自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物；農桿菌的Ti質粒上的T DNA能夠整合到所侵染細胞的染色體DNA上。
Ⅱ.轉化方法：將目的基因插入農桿菌Ti質粒的T DNA中，讓農桿菌侵染植物細胞。
（2）目的基因導入動物細胞
①常用方法：顯微注射法。
②常用受體細胞：受精卵。
（3）目的基因導入微生物細胞
①方法：用Ca2＋處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，然后將重組表達載體導入其中。
②常用受體細胞：原核細胞（使用最廣泛的是大腸桿菌）。
第四步：目的基因的檢測與鑒定
只有一部分Bt基因能成功導入棉花細胞并表達Bt抗蟲蛋白，這需要檢測和鑒定才能知道，如何進行檢測和鑒定呢
讓學生結合學過的基因表達相關的知識推出檢測與鑒定目的基因的幾個水平。思考、回答，認識到可以分別從DNA、RNA和蛋白質水平進行檢測;檢測棉花是否具有抗蟲特性最直接的辦法是觀察它是否對棉鈴蟲產生了抗性，這屬于個體水平的檢測。并介紹在其他不同水平進行檢測與鑒定的方法。
【板書】
基因工程的基本操作程序
1.目的基因的篩選和獲得
篩選合適目的基因、PCR、
2.基因表達載體的構建
目的基因、標記基因、啟動子、終止子
3.將目的基因導入受體細胞
4.目的基因的檢測和鑒定

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