資源簡(jiǎn)介

(共30張PPT)
3.1 重組DNA技術(shù)的基本工具
學(xué)習(xí)目標(biāo)
1.闡明重組DNA技術(shù)所需的三種基本工具的作用。
2.認(rèn)同基因工程的誕生和發(fā)展離不開理論研究和技術(shù)創(chuàng)新。
基因工程
科技探索之路
新課導(dǎo)入
番木瓜容易受番木瓜環(huán)斑病毒的侵襲。當(dāng)番木瓜被這種病毒侵染后，產(chǎn)量會(huì)大大下降。科學(xué)家通過(guò)精心設(shè)計(jì)，用“分子工具”培育出了轉(zhuǎn)基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環(huán)斑病毒。
轉(zhuǎn)基因番木瓜
DNA雙螺旋的直徑只有2nm，對(duì)如此微小的分子進(jìn)行操作，是一項(xiàng)非常精細(xì)的工作，更需要專門的“分子工具”。
那么，科學(xué)家究竟用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？
基因工程
基因工程：是指按照人們的愿望，通過(guò)轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫 重組DNA技術(shù)
1.操作環(huán)境：
2.原理：
3.操作對(duì)象：
4.操作水平：
5.結(jié)果：
體外環(huán)境
基因
分子水平
基因重組
賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品
定向改造生物性狀；克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙
6.意義：
理論基礎(chǔ)
1.DNA的基本組成單位相同(都是四種脫氧核苷酸)
2.都遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則
3.DNA分子的空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)
理論基礎(chǔ)
1.基因是控制生物性狀的結(jié)構(gòu)與功能單位
2.遺傳信息傳遞都遵循中心法則
3.所有生物幾乎共用一套遺傳密碼
復(fù)制
基因工程的理論基礎(chǔ)
基因工程的基本工具
那么，科學(xué)家究竟用到了哪些“分子工具”？
這些“分子工具”各具有什么特征呢？
工具
分子手術(shù)刀
分子縫合針
分子運(yùn)輸車
限制性內(nèi)切核酸酶：
DNA連接酶：
載體：
準(zhǔn)確切割DNA分子
將DNA片段連接起來(lái)
將體外重組好的DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞
1.限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”
基因工程的基本工具
（大部分限制酶切割結(jié)果為黏性末端）
EcoRⅠ識(shí)別的序列
切點(diǎn)
切點(diǎn)
切點(diǎn)
來(lái)源：從微生物（主要是原核生物）體內(nèi)分離出來(lái)
功能：能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有專一性。
EcoR Ⅰ
+
1.限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”
基因工程的基本工具
1.限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”
識(shí)別序列的特點(diǎn)：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對(duì)稱，無(wú)論是奇數(shù)個(gè)堿基還是偶數(shù)個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。
基因工程的基本工具
結(jié)果:
產(chǎn)生黏性末端或平末端
基因工程的基本工具
基因工程的基本工具
推測(cè)限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
限制酶是原核生物的一種防御工具，用來(lái)切割侵入細(xì)胞的外源DNA，以保證自身安全。
為什么限制酶不切割細(xì)菌本身的DNA分子？
含某種限制酶的細(xì)菌的DNA分子不具備這種限制酶的識(shí)別序列，或者甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到了限制酶所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。
練習(xí)1、已知限制酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—GGATCC—，限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—。
（1）則能被限制酶I切割的DNA，______（能/不能）被限制酶II切割；
（2）能被限制酶II切割的DNA，____________（能/不能/不一定能）被限制酶I切割。
能
不一定能
鞏固練習(xí)
2.DNA連接酶——“分子縫合針”
(1)作用：將 “縫合”起來(lái)，恢復(fù)被 切開的兩個(gè)核苷酸之間的______________。
雙鏈DNA片段
限制酶
磷酸二酯鍵
DNA連接酶
+
基因工程的基本工具
DNA連接酶的種類：
種類 E·coli DNA連接酶 T4 DNA連接酶
來(lái)源
功能特性
相同點(diǎn) 大腸桿菌
T4噬菌體
只能將具有互補(bǔ)黏性末端的DNA片段連接起來(lái)；
既可以連接雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端；
恢復(fù)的都是磷酸二酯鍵
不能連接具有平末端的DNA片段。
又可以連接雙鏈DNA片段的平末端（但連接平末端的效率相對(duì)較低）。
基因工程的基本工具
基因工程的基本工具
E·coli DNA連接酶的縫合作用
兩個(gè)DNA片段要具有相同的黏性末端才能連接起來(lái)
把兩個(gè)DNA片段黏性末端間的縫隙“縫合”起來(lái)，
基因工程的基本工具
T4 DNA連接酶還可以把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，但效率相對(duì)較低。
T4 DNA連接酶的縫合作用
基因工程的基本工具
C
A
A
T
T
G
A
G
T
A
T
C
DNA聚合酶
以DNA母鏈為模板，連接單個(gè)脫氧核苷酸形成單鏈
DNA聚合酶作用示意圖
基因工程的基本工具
與DNA相關(guān)的幾種酶的比較
項(xiàng)目 DNA連接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用 部位 磷酸二酯鍵 磷酸二酯鍵 磷酸二酯鍵 氫鍵
作用 對(duì)象 DNA片段 DNA 單個(gè)的脫氧 核苷酸 DNA
作用 結(jié)果 將兩個(gè)DNA片段連接成完整的DNA分子 切割雙鏈DNA分子 將單個(gè)的脫氧核苷酸連接到DNA單鏈末端 將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈
RNA聚合酶
磷酸二酯鍵
DNA
將DNA片段水解為單個(gè)脫氧核苷酸
DNA酶
3.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”
載體的作用
最常用載體：質(zhì)粒
將外源基因送入受體細(xì)胞。
裸露、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA外，具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA。
在基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過(guò)人工改造的。
大腸桿菌及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)模式圖
基因工程的基本工具
目的基因是一個(gè)DNA片段，不含有復(fù)制原點(diǎn)、不含有啟動(dòng)子和終止子。
為什么需要載體
3.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”
思考：形成一個(gè)重組質(zhì)粒會(huì)形成幾個(gè)磷酸二酯鍵？
四
基因工程的基本工具
3.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”
種類：質(zhì)粒、噬菌體、動(dòng)植物病毒等。
它們的來(lái)源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差別。
載體必須具備的條件
①具一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，供外源DNA片段（基因）插入其中。
②能夠在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制。
③具有某些標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選。
標(biāo)記基因通常有
抗生素的抗性基因，如：抗氨芐青霉素基因(ampr)、抗四環(huán)素基因(tetr)。
熒光蛋白基因，如：綠色熒光蛋白基因(GFP)、紅色熒光蛋白基因(RFP)。
基因工程的基本工具
基因工程的基本工具
載體要與外源DNA片段連接，需要具備什么條件？
要使攜帶的外源DNA片段在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，載體需要具備什么條件？
我們用肉眼看不到載體是否進(jìn)入受體細(xì)胞，為了便于篩選重組DNA分子，載體需要具備什么條件？
具有一個(gè)或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，供外源DNA片段插入其中。
能在受體細(xì)胞中自我復(fù)制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制，這樣它攜帶的外源DNA片段才能在受體細(xì)胞中復(fù)制，不至于丟失。
具有標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選。
基因工程的基本工具
DNA連接酶
用一種限制酶切（單酶切）
A
T
G
C
A
A
C
G
T
T
A
T
AGCTT
A
GGATCCA
CCTAGGTTCGA
Bt基因
基因工程的基本工具
用兩種限制酶切（雙酶切）
質(zhì)粒與質(zhì)粒連接后的運(yùn)載體過(guò)大，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化難以發(fā)生，故不予考慮
避免自身環(huán)化，增大目的基因和運(yùn)載體連接的概率，
能避免反向連接
DNA連接酶
基因工程的基本工具
課堂小結(jié)
課后練習(xí)
3．基因運(yùn)輸工具——載體，必須具備的條件之一及理由均正確的是 （　 　）
A．能夠復(fù)制，以便目的基因插入其中
B．具有多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，便于目的基因的表達(dá)
C．具有某些標(biāo)記基因，便于重組DNA的篩選
D．對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害，便于重組DNA的篩選
C
課后練習(xí)
4.某細(xì)菌質(zhì)粒上有標(biāo)記基因如圖所示，通過(guò)標(biāo)記基因可以推知外源基因（目的基因）是否轉(zhuǎn)入成功。外源基因插入的位置不同，細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況也不同，如圖所示是外源基因插入位置（插入點(diǎn)有a、b、c）示意圖，請(qǐng)根據(jù)表中提供的細(xì)菌生長(zhǎng)情況，推測(cè)①②③三種重組后細(xì)菌的外源基因插入點(diǎn)，正確的一組是 （ 　 　）
插入點(diǎn) 細(xì)菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況 細(xì)菌在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況
① 能生長(zhǎng) 能生長(zhǎng)
② 能生長(zhǎng) 不能生長(zhǎng)
③ 不能生長(zhǎng) 能生長(zhǎng)
A.①是c；②是b；③是a B．①是a和b；②是a；③是b
C．①是a和b；②是b；③是a D．①是c；②是a；③是b
A
課后練習(xí)
3. 圖甲是含有目的基因的外源DNA片段，圖乙是用于將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的質(zhì)粒（陰影部分表示抗生素抗性基因），相關(guān)限制酶的作用部位如圖所示，現(xiàn)欲培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因抗病植株，回答下列問(wèn)題。
（1）在基因工程的操作中，不宜選用SmaI，原因是SmaI會(huì)破壞__________和__________________________。
（2）在基因工程的操作中，不宜選用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，________________________________________________________。
目的基因
質(zhì)粒上的抗生素抗性基因
目的基因只有一側(cè)含有黏性末端，不能插入到質(zhì)粒中
（3）由于反應(yīng)體系中含有大量的外源DNA片段和質(zhì)粒，加入PstI一種限制酶后，會(huì)得到大量的目的基因片段和質(zhì)粒片段，再加入DNA連接酶后，除了會(huì)形成目的基因與質(zhì)粒連接的環(huán)狀產(chǎn)物外，還會(huì)形成______________________連接的環(huán)狀產(chǎn)物以及_____________________連接的環(huán)狀產(chǎn)物。此外，目的基因與質(zhì)粒的連接既可以是正向連接，也可以是____________，后者可能會(huì)導(dǎo)致目的基因無(wú)法正常表達(dá)。
目的基因與目的基因
質(zhì)粒片段與質(zhì)粒片段
反向連接
課后練習(xí)

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